CN112156112A - 一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用，该方法中的原料为牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼包含的新鲜骨髓，其中主要以马骨髓有效成分的制备方法及其骨质疏松病症中的应用，该方法将马骨髓通过液氮冷冻、研磨粉碎并过筛分离、石油醚脱脂处理，用水作为溶剂，对其有效成分进行提取，提取液经离心、浓缩、无水乙醇沉淀、离心、真空冷冻干燥制备出粗提物。对粗提物分别通过透析、离子交换树脂等分离纯化制备马骨髓有效成分。该有效部位被验证具有改变血液流变学、改善微循环、减小疼痛及自由基有清除能力等活性。本研究可为动物骨髓有效成分作为治疗或预防各种关节僵硬为病症的骨质疏松保健品的开发及其在治疗氧化应激介导绝经后骨质疏松症药物中的应用提供参考。

Description

一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及动物骨髓有效部位的制备方法及其应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量减少，骨微观结构退化骨密度降低为特征的全身代谢性的慢性骨骼疾病，当骨变得更加多孔和脆弱时，骨折的风险便大大增加。当细胞遭受干扰，致使其氧化还原反应失衡时，大量的自由基和过氧化物便会产生，累积过多的自由基会与体内的大分子物质发生氧化还原反应，从而致使细胞结构和功能的改变，引发各类疾病的产生。有研究证实，氧化应激与骨质疏松的发生存在一定的联系，而拥有抗氧化作用的物质，能对骨质疏松症的发生起到预防和治疗的作用。
对动物骨骼提取物的药理活性研究发现，其具有祛风止痛，治疗骨质疏松和增生，促进骨折愈合和成骨细胞的增值等骨保护方面具有较好的功能。动物骨骼蛋白是安全有效的骨质疏松防治药物和补钙制剂，具有潜在的应用价值。新疆特殊的地理环境、气候以及饮食习惯等造成了新疆膝骨性关节炎多发。膝骨性关节炎在新疆的高发病率，导致了诸多患者致残、丧失劳动力，又因治疗过程漫长费用较高，由此频繁出现因病致贫因病返贫的现象。综上所述，研究新疆膝骨关节炎的致病因素，早期诊断治疗，研究新的预防措施，研发新的康复方式和方案都是新疆防治膝骨关节炎的研究热点和难点。
中医药在治疗和防治骨关节疾病方面具有特殊功能，中医药治疗除了传统的手工复位外，还有一些特色药物配比治疗方法，这些药物主要以活血化瘀、软坚散结为主，具有很大治疗优势与潜力。其中木拉合复方软膏将马骨髓为基质，加羊乳香、秋水仙等药物按药性、药效功能等配合而制成的典型处方，具有消炎退肿、软肌松肌、润肤防腐和化脓愈伤的功能，治疗骨折僵硬、关节炎、风湿及骨质疏松等疾病具有显著疗效。
新疆是我国重要的畜牧业基地。伊犁马骨髓是一味当地民间传统中药，疆内已有以马骨髓为原料的医院制剂用于祛风止痛、消炎退肿、软筋松肌及治疗骨病等。马骨髓具有补肾、填髓作用。中药里骨髓具有治疗骨折僵硬、关节炎等功效，常见于治疗骨折的处方中常见于治疗骨折的处方中。但由于现有制备方法陈旧、活性弱、有效成分尚未确定及质量控制不规范等缺点，马骨髓制剂未能受到全面推广应用。同时，对马骨髓具有医疗保健与功能食品价值的多糖的针对性研究报道鲜见，未能起草相关质量标准，阻碍了含马骨髓类保健功能食品的标准化及产业化步伐。加之，食药加工业一般均使用全骨，未能将两者有效地分离开发应用，导致资源浪费。因此开发动物骨髓资源具有现实意义。
禽畜骨骼自古以来就有壮筋骨,延年益寿的记载。骨骼由骨膜、骨质、骨髓等构成,是蛋白质和钙质组成的网状结构,管内充满了含多种营养物质的骨髓。骨髓中不仅含有大量的蛋白质、脂肪、磷、铁、锌、铜及锶等微量元素,还有磷蛋白、磷脂质、软骨素、黏多糖、生长素、各种氨基酸及多种维生素等健康有益因子,是十分宝贵的天然药食资源。有关牛骨髓、马骨髓化学成分的提取分离和结构鉴定及其相关的药理学研究尚处于初始阶段，尤其是多糖、蛋白质等大分子化合物。同时，研究发现多糖具有抗氧化，抗肿瘤，抗凝血及免疫调节等多种功能。对马骨髓可应用于作为治疗或预防的各种关节僵硬保健品中的用途以及在制备抗氧化生物活性的药物中的用途研究不仅具有很大的学术价值，而且对马骨髓工业化生产以及开发应用具有现实意义。
新疆动植物资源丰富，畜牧业发达，马类动物也逐渐成为其中资源最为丰富的畜产。以马骨髓作为生产原料，与现代生物技术相结合进行生物制药，可变废为宝，将新疆得天独厚的生物资源转化为产业优势，因此寻找一种能快速、有效提取马骨髓有效部位的方法对治疗骨关节僵硬和防止骨疏松质具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于，提供一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用，该方法将动物骨髓经液氮冷冻、研磨粉碎、过筛分离杂质、石油醚脱脂后用水作溶剂进行提取，将提取液离心、浓缩、无水乙醇沉淀、再离心、将沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出粗提物，再将粗提物进行纯化，分别通过脱蛋白、透析及离子交换树脂分离纯化即得到中性及酸性组分有效部位。该有效部位被验证多具有改变血液流变学、改善微循环、改善心肌缺血、抗血栓、减小疼痛、抗氧化，自由基有清除能力等活性。该方法得到的有效部位得率高，易于放大中试，而其在保留原有的物理和化学性质以及营养成分基础上，通过利用低温或真空或冷冻干燥干技术，避免了传统烘干或减压抽滤等导致有些化合物失去活性的缺点。本研究为马骨髓有效部位作为治疗或预防各种骨质疏松保健品及其在抗氧化生物活性药物中的应用开发提供参考。
本发明所述的一种动物骨髓有效部位的制备方法，该方法以动物骨髓为原料，用水作为溶剂，沉淀、脱蛋白、透析、分离纯化，具体操作按下列步骤进行：
a、取动物骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使骨髓硬化成块，便于富集，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗3-5次，去除血瘀和杂物之后收集骨髓，其中动物骨骼为牛骨骼或马骨骼；
b、将步骤a得到的骨髓，用刀具切成小块，按1:6g/mL将小块骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存,得到骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:5-1:15，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000rpm，10min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000rpm，10min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20min，7000rpm，离心5min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为12000-14000Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的动物骨髓有效部位
所述方法获得的动物骨髓有效部位在制备抗氧化生物活性的药物中的用途。
所述的方法获得的动物骨髓有效部位在制备治疗或预防各种关节僵硬的药物中的用途。
本发明所述的一种动物骨髓有效部位的制备方法，通过该方法得到的牛骨髓所得组分命名为牛骨髓组分-1(FFY-1-1)、牛骨髓组分-2(FFY-1-2)；马骨髓所得组分命名为马骨髓组分-1(FFY-2-1)、马骨髓组分-2(FFY-2-2)及马骨髓组分-3(FFY-2-3)。
通过本发明所述方法得到马骨髓有效部位，其纯度高、生物活性强，而且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，更好的保留了其有效部位的活性成分，本研究为马骨髓有效部位作为治疗或预防骨质僵硬为病症的骨质疏松保健品及其在抗氧化生物活性药物中的应用开发提供参考。
附图说明
图1为本发明牛骨髓、马骨髓有效部位及常规成分的提取分离总路线图；
图2为本发明牛骨髓的紫外光谱图谱，其中牛骨髓的A.FFY-1-1；B.FFY-1-2；C.FFY-1-3；
图3为本发明马骨髓的紫外光谱图谱，其中马骨髓的A.FFY-2-1；B.FFY-2-2；C.FFY-2-3；
图4为本发明SEM-EDX图，其中A为牛骨髓的FFY-1-1；B.FFY-1-2；
图5为本发明SEM-EDX图，其中A为马骨髓的FFY-2-1；B.FFY-2-2；
图6为本发明粗提物对DPPH自由基的清除能力；
图7为本发明膝关节肌肉组织病例分析结果；
图8为本发明膝关节滑膜组织的形态学观察结果。
具体实施方式
实施例1
a、取马腿骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使马骨髓硬化成块，便于富集，将马骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗3次，去除血瘀和杂物之后收集马骨髓；
b、取步骤a得到的马骨髓，用刀具切成小块，按1:6g/mL将小块马骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存,得到马骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的马骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:5，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000rpm，10min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000rpm，10min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20min，7000rpm，离心5min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为12000Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的马骨髓有效部位，马骨髓所得部位命名为FFY-2-1、FFY-2-2及FFY-2-3。
实施例2
a、取牛骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使牛骨髓硬化成块，便于富集，将牛骨质和牛骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗5次，去除血瘀和杂物之后收集牛骨髓；
b、取步骤a得到的牛骨髓，用刀具切成小块，按1:6g/mL将小块牛骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存,得到牛骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的牛骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:10，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000rpm，10min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000rpm，10min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20min，7000rpm，离心5min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为14000Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的牛骨髓有效部位，命名为FFY-1-1、FFY-1-2、FFY-1-2。
实施例3
a、取马骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使马骨髓硬化成块，便于富集，将马骨质和马骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗4次，去除血瘀和杂物之后收集马骨髓；
b、取步骤a得到的马骨髓，用刀具切成小块，按1:6g/mL将小块马骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存，得到马骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的马骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:10，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000rpm，10min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000rpm，10min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20min，7000rpm，离心5min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为14000Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的马骨髓有效部位，马骨髓所得部位命名为FFY-2-1、FFY-2-2及FFY-2-3。
实施例4
a、取牛骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使牛骨髓硬化成块，便于富集，将牛骨质和牛骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗3次，去除血瘀和杂物之后收集牛骨髓；
b、取步骤a得到的牛骨髓，用刀具切成小块，按1:6g/mL将小块牛骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存,得到牛骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的牛骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:15，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000rpm，10min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000rpm，10min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20min，7000rpm，离心5min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为12000Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的牛骨髓有效部位，牛骨髓所得部位命名为FFY-1-1、FFY-1-2、FFY-1-2。
实施例5
将实施例1-4任意一种获得的牛骨髓或马骨髓有效部位经紫外光谱图分析结果显示：牛骨髓粗提物FFY-1在280nm处有较弱吸收峰，说明其含有少量蛋白质；FFY-1-1和FFY-1-2在260nm和280nm处均无吸收峰，说明纯化后的组分均不含有核酸和蛋白质等杂质；马骨髓粗提物FFY-2在280nm处有较强的吸收峰，说明其含有蛋白质；FFY-2-1和FFY-2-2在260nm和280nm处均无吸收峰，说明纯化后的组分均不含有核酸和蛋白质等杂质(图2)。
实施例6
SEM-EDX分析
将牛骨髓FFY-1-1和FFY-1-2不同放大倍数的SEM图显示两种有效部位均有不一样的形态结构，颗粒大多以不规则形状存在；中性部位FFY-1-1有块状形态；酸性部位FFY-1-2是吸附在离子交换树脂上的酸性组分，是带电荷的，其表面形态与中性组分不一样；酸性组分有类球状、块状和条状的混合形状；两者颗粒大小均不一样，说明分子中聚合程度也不同，这可能是由于分子之间相互作用力、结合的强度及分子之间连接紧密度也都不一样，除此，FFY-1-1颗粒间有微小的空隙，说明分子间存在排斥力，分子间吸引力较弱；而FFY-1-2颗粒间几乎无空隙，说明其分子间完全聚合，相互排斥力较弱，吸引力较强；元素分析结果说明中性部位FFY-1-1由45.17％的C和50.71％的O组成；酸性部位FFY-1-2由69.45％的C和29.89％的O组成，同时还含有少量的Na，Ca和S等元素(图3)。
实施例7
将实施例1-4任意一种获得的牛骨髓或马骨髓有效部位的抗氧化活性试验：
将牛骨髓或马骨髓有效部位样品配成浓度为0.125、0.25、0.375、0.5、0.75、1.0mg/mL的溶液，进行清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的抗氧化活性试验；
将分别取不同浓度的样品溶液2.0mL，加入2.0mL、0.2mmol/L的DPPH-甲醇溶液，混匀，温度37℃避光反应30min，在517nm下测吸光度值Ai，DPPH溶液加蒸馏水的吸光度值为A0，无水甲醇加样品溶液吸光度值为Aj，以蒸馏水作为空白，清除率按下面公式计算：
Figure BDA0002678908030000061
生命活动的氧化代谢过程不断产生各种活性氧自由基，如DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基等。这些活性氧自由基除参与细胞的生理代谢过程外，还会引起细胞膜和DNA的损伤，导致生物膜脂质过氧化和通透性降低，引发多种疾病如癌症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等。尽管机体存在氧化防御和修复机制，但并不能完全有效的阻止过量自由基造成的机体损伤，因此补充外源抗氧化剂就显得十分必要。然而许多合成抗氧化剂存在诸多的安全问题，所以天然抗氧化剂的研究与开发引起人们的广泛关注。
结果：通过本发明所述方法获得的牛骨髓或马骨髓抗氧化活性分析表明：牛骨髓或马骨髓有效部位具有清除DPPH自由基的能力；马骨髓有效部位FFY-2有较强的DPPH自由基清除能力，并呈现一定的浓度依赖关系，随着浓度的提高，样品对DPPH自由基的清除能力也增强；当浓度为1mg/mL时，清除率分别为87.90％，其半抑制浓度IC50值为0.285mg/mL(图4)和(图5)；因此该有效部位可以当成一个潜在的抗氧化剂，在食品、医药及保健品领域有广阔的应用前景；在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
实施例8
获得的动物骨髓有效部位在制备治疗或预防各种关节僵硬的药物中的用途：
以马骨髓为原料，通过其他活血化瘀药材科学配合而制成，为了验证药效，建立实验小白兔关节挛缩动物模型，观察该药对骨质疏松关节挛缩动物模型的实验白兔血清微量元素和关节活动度(ROM)的影响进行了初步研究，并对牛骨髓复方进行了对比研究，对后期临床试验和基础研究提供试验依据；
牛骨髓复方中水分较多，这对储藏时间带来麻烦，不易在常温下保存使用，一般中药复方制剂水分控制3.0％以下，因此进行优化后水分控制1％左右，牛骨髓复方中脂肪酸成分中不饱和脂肪酸含量不多，软膏涂抹性不好，换用马骨髓和其他药物科学配比后脂肪酸含量有所下降表1；
表1为两种提取物药常规成分含量
Figure BDA0002678908030000071
马骨髓复方常微量元素总量高于牛骨髓复方，治疗骨病有关的Ca、P、Fe、Mn等元素含量增大趋势较为明显，其中给软骨提供营养和生理作用的Fe元素多于将近7倍，这可能是入药的其它植物成分所堆积增加有关见表2，表3；
表2为两种提取物常量元素含量
Figure BDA0002678908030000072
表3为两种提取物微量元素含量
Figure BDA0002678908030000073
对每只大鼠拍X片子并用X片机子来测量动物左膝关节关节活动度：
正常组8只，造模组32只，根据两个独立样本t检验结果显示，模型组动物的ROM比正常组动物ROM小，即模型组大鼠关节活动受限，差异具有统计学意义(P<0.05)见表4；
表4为正常对照组和模型组ROM比较
Figure BDA0002678908030000074
干预4周后，通过配对t检验结果得出：与模型对照组相比，给药组和给药组+运动组的目标角度的差值均有统计学意义(P<0.05)，运动组和模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；给药组和给药组+运动组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，给药组和给药组+运动组两组之间干预是没有统计学差异的，给药组+运动组干预前后的目标角度差值均数大于给药组；
微量元素变化主要表现在钙离子含量上，其中给药+运动组Ca含量明显高于其它组，未出现显著性差异，综上，马骨髓复方药常规成分指标较高，同时具有较好的改善关节挛缩模型的效果见表5；
表5为各组干预前后目标角度ROM比较
Figure BDA0002678908030000081
注：*与模型对照组比较，P<0.05；#与运动组比较，P<0.05。
表6为血清中微量元素含量变化
Figure BDA0002678908030000082
实施例9
考虑到关节长期制动时，使关节周围肌肉，滑膜组织延展性丧失，合理的药物治疗和运动疗法相结合的康复护理不仅提高关节ROM，而且对周围组织起较好的恢复，马骨髓软膏在临床上已应用，借用此药，将关节挛缩的动物(Wistar大鼠)作为研究对象，采用药物组、运动训练结合药物康复护理组等模式，观察复方对关节活动度、肌肉组织、关节滑膜等影响和效果，这对建立关挛缩模动物模型和康复护理对关节挛缩治疗的作用机制研究提供科学依据；
复制大鼠膝关节挛缩模型及分组40只雄性，4-6周龄，SPF级，体重在199±3g之间的Wistar大鼠，普通饲料正常饲养。动物随机分为正常对照组和造模组，正常对照组8只，造模组32只；造模组：固定左膝关节3周复制关节挛缩模型，将造模组大鼠手术前一天左下肢脱毛，晚间开始禁水禁食，次日腹腔注射3％的戊巴比妥钠(40g/kg)麻醉，仰卧位，头部及四肢固定，左腿消毒，铺巾；0.8mm的克氏针旋入股骨和胫骨，用量角器使膝关节屈曲约45±5°，用钢丝和牙托粉固定；复制关节挛缩模型3周后，再将成功建立的造模组大鼠随机分为4组，分别为模型对照组，马骨髓组，运动组及康复护理组，每组8只；马骨髓+运动组定义为综合康复护理干预组，干预周期为4周，方法如下：
1)运动组：将动物置于跑步机(定制改装)上，跑步机为四跑道，同时可以干预四只大鼠，将大鼠置于改装后的跑步机跑道上，速度设定在1km/h，时间设定为15分钟，启动跑步机，迫使大鼠运动，20分钟后跑步机停止，将动物放回鼠笼中，每日进行一次，一周五次；
2)马骨髓组：将动物的造模侧肢体的被毛剃除干净，裸露膝关节周围皮肤，涂抹马骨髓复方软膏，药物涂抹范围为腘窝处，膝关节内外侧以及膝盖上下部分(大腿下方和小腿上方1/3段)，涂抹完毕后将动物放回鼠笼中，药物在肢体上停留时间为24小时，每日进行一次，一周五次；
3)康复护理组(K马骨髓复方组+运动组)：将动物置于跑步机(定制改装)上，速度设定在1km/h，时间设定为20分钟，改装跑步机为四跑道，可以同时干预四只大鼠，完成规定的运动量后予以马骨髓复方软膏涂抹，方法同马骨髓复方组，涂抹完毕后将动物放回鼠笼中，药物在肢体上停留时间为24小时，每日进行一次，一周五次；
干预注意事项：每周(或按照实际需要)给大鼠剃除被毛，以免被毛生长而影响药物与皮肤的直接接触，不利于药物的吸收；
实施干预前正常对照组和模型组膝关节活动度(ROM)范围的变化，结果得出正常组8只，造模组32只，根据两独立样本t检验结果显示，造模组大鼠的ROM与正常组大鼠相比减小，即造模组大鼠关节活动受限，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表7；
表7为正常对照组和造模组ROM比较
Figure BDA0002678908030000091
表8为血清中微量元素含量变化
Figure BDA0002678908030000092
Figure BDA0002678908030000101
注：*与正常对照组比较，P<0.05；#与模型对照组比较，P<0.05。
微量元素的检测结果如表8所示：干预4周后，微量元素变化主要表现在钙离子方面，与模型组相比，正常对照组、给药组和给药组+运动组均有统计学差异(P<0.05)；与正常对照组相比，给药组和康复护理组有统计学差异(P<0.05)；运动组和模型组相比，有略微的提高，但无显著差异；正常对照组、用药组和康复护理组干预前后的标准钙值均具有统计学差异(P<0.05)，pH值也大小也有一定的波动，与模型组相比有一定的差距；
实施干预后各组大鼠形态学指标结果如下：
1)膝关节肌肉组织病例分析：(1)正常对照组肌肉表面平滑，有光泽，肌肉无断裂，肌肉纤维长度排列均匀，无炎症细胞浸润；(2)模型对照组肌肉：可发现肌肉平面严重损失，导致平面严重凹凸不平，表面不光泽，肌肉纤维长度排列不齐，肌肉组织断裂，炎症细胞浸润，也可发现大量的瘢痕组织；(3)马骨髓复方组肌肉组织：可发现肌肉组织表面轻度凹凸不平，表面带光泽，无间接片状出血，肌肉纤维排列接近正常肌肉组织，少量炎症细胞，少量瘢痕组织；(4)运动组肌肉组织：可发现肌肉组织表面也严重凹凸不平，表面不光泽，间质片状出血，肌肉断裂，肌肉纤维排列不齐，炎症细胞浸润，也可发现瘢痕组织；(5)康复护理干预组肌肉组织：组织表明，光泽度同用药组肌肉组织，虽肌肉纤维排列已接近正常组但还是两组之间有差别，少量炎症细胞和瘢痕组织(图5)；
2)每组膝关节滑膜组织的形态学观察结果正常对照组滑膜无炎性细胞浸润，无滑膜细胞和纤维组织增生，细胞排列整齐，关节滑膜光泽，纤维组织中未见滑膜细胞滑膜粘连形成，而模型对照组和各干预组均有滑膜细胞和纤维组织原增生明显，排列较紊乱，关节滑膜内壁可发皱缩、增厚、成角及萎缩等改变(图6)；
3)实施干预后各组膝关节活动范围变化结果：干预4周后，通过配对t检验的结果得出：同模型对照组相比，马骨髓复方组和KERUTI组+运动组的目标角度的差值均有统计学意义(P<0.05)，运动组和模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；马骨髓复方组和马骨髓复方组组+运动组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。根据表下表，马骨髓复方组和康复护理干预组之间干预是没有统计学差异的，康复护理干预组干预前后的目标角度差值均数大于KERUTI组,见表9；
表9各组大鼠干预前后目标角度ROM比较
Figure BDA0002678908030000102
Figure BDA0002678908030000111
注：*与模型对照组比较，P<0.05；#与运动组比较，P<0.05。
结论：药物对关节挛缩的预防和治疗具有一定的药效，但它在人类身上广泛应用之前，需要探索在动物模型实验上。通过对关节挛缩大鼠模型的4周干预，马骨髓复方组组和康复护理组实验动物的造模侧膝关节活动度(ROM)均有增大，马骨髓复方组改善关节活动在动物模型上也验证了其疗效，单纯运动并没有改善模型动物的关节活动范围，根据这些结果，马骨髓复方组软膏在扩大挛缩关节的关节活动范围上发挥了关键作用，即用药结合运动训练疗效比单纯用药好，但对于有运动禁忌或限制的患者来说，单纯使用药物能够改善其关节活动度无疑是十分有利的。
综上所述，本发明澄清肢体一旦发生关节挛缩时就会引起周围肌肉组织发生形态学病变，早期的康复护理干预对肌肉组织和关节活动度(ROM)的改善起一定的疗效，表明马骨髓有效成分针对骨质疏松的发病的防治，寻找多靶点、多环节、多途径作用的有效的干预药效物质具有十分重要的科学和临床医用意义。

Claims (3)

1.一种动物骨髓有效部位的制备方法，其特征在于该方法以动物骨髓为原料，用水作为溶剂，沉淀、脱蛋白、透析、分离纯化，具体操作按下列步骤进行：
a、取动物骨骼样品先存于温度-4℃冰箱致使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗3-5次，去除血瘀和杂物之后收集骨髓，其中动物骨骼为牛骨骼或马骨骼；
b、取步骤a得到的骨髓，用刀具切成小块，按1:6 g/mL将小块骨髓置捣药罐，加入液氮冷冻研磨粉碎成细粉末后，置冰箱温度-4℃保存, 得到骨髓粉末；
c、将步骤b中得到的骨髓粉末用热水回流进行提取，料液比1:5-1:15，提取温度90℃，提取2次，合并提取液，离心7000 rpm，10 min，取上清液，浓缩，体积比1:4乙醇沉淀，温度4℃放置过夜，离心7000 rpm，10 min，沉淀加水复溶，冻干，得到粗提物；
d、将步骤c中得到的粗提物称取500mg，加100mL蒸馏水复溶，用Sevage法进行脱蛋白，Sevage试剂为体积比4:1的氯仿:正丁醇混合物，将复溶的溶液中加入1/3体积的Sevage试剂，摇床震荡20 min，7000 rpm，离心5 min，去除氯仿层，将上层溶液继续反复操作至两相液面无白色泡泡为止，得到提取液；
e、将步骤d中得到的提取液用截留分子量为12000-14000 Da的透析袋蒸馏水透析48h，浓缩，真空冷冻干燥，得到初步纯化的有效部位；
f、将步骤e得到的初步纯化的有效部位用离子交换树脂DEAE-52进行纯化，即得到一种中性、两种酸性的动物骨髓有效部位。
2.一种如权利要求1所述方法获得的动物骨髓有效部位在制备抗氧化生物活性的药物中的用途。
3.一种权利要求1所述的方法获得的动物骨髓有效部位在制备治疗或预防各种关节僵硬的药物中的用途。
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