CN112143711B - 重组痘瘤病毒、药物组合物及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组痘瘤病毒、药物组合物及其构建方法和应用，在痘瘤痘苗病毒中***编码CD3和CD19的外源基因制备得到CD19 BITE重组痘瘤病毒，得到的CD19 BITE重组痘瘤病毒可有效抑制肿瘤细胞增殖活性，将该CD19 BITE重组痘瘤病毒结合其他药用物质可制备得到用于***的药物。

Description

重组痘瘤病毒、药物组合物及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种携带CD19 BITE基因的重组痘瘤病毒及其构建方法，该携带CD19 BITE基因的重组痘瘤病毒配合其他可药用辅料制备得到药物组合物，可被用于治疗淋巴瘤。
背景技术
病毒治疗(Virotherapy)是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗新方法，其是用分子生物学手段改造一些种类的病毒如腺病毒等成为溶瘤病毒，用于杀伤癌细胞，关于病毒治疗的研究已取得一些令人鼓舞的成果，其中有些在国际上正进行Ⅰ期和Ⅱ期临床研究，该治疗方法的安全性和成效均已得到证实。
溶瘤痘苗病毒(Oncolytic Poxvirus)是病毒治疗的新型载体，其优点在于：病毒稳定性好、致病性低、基因转染效力高、安全性良好。具体的，溶瘤痘苗病毒能选择性感染肿瘤细胞并在细胞内复制、杀死肿瘤细胞，而对正常组织和细胞的毒性很小，且溶瘤痘苗病毒基因组能容纳较大的外源性基因***，便于应用分子生物学手段构建携带外源性抗肿瘤基因的溶瘤病毒，增强病毒抗肿瘤作用。为了增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应，国际上采用的主要策略是“基因 -病毒治疗”，即将外源性治疗基因导入溶瘤病毒,比如研究已表明携带TRAIL基因能够显著增强痘瘤病毒杀伤结肠癌，基因改构溶瘤腺病毒H101可用于治疗头颈部肿瘤，然而目前国内外未看到关于溶瘤痘苗病毒在治疗淋巴瘤中的报道和研究。而中国的淋巴瘤患者数量或淋巴瘤发病率一直在不断增加，且淋巴瘤患者的5年的生存率仅为38.3％，故目前构建一种可用于治疗淋巴瘤的“基因- 病毒治疗”策略，这也是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组痘瘤病毒、药物组合物及其构建方法和应用，在痘瘤痘苗病毒中***编码CD3和CD19的外源基因制备得到CD19 BITE重组痘瘤病毒，得到的CD19 BITE重组痘瘤病毒可有效抑制肿瘤细胞增殖活性，将该CD19 BITE重组痘瘤病毒结合其他药用物质可制备得到用于***的药物。
本申请人首次提出将CD19和CD3同时对痘瘤痘苗病毒进行编码，使得溶瘤病毒可以分泌表达双特异性抗体，将CD3阳性的T细胞在空间上与CD19阳性的肿瘤细胞拉近，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力；此外，还可以增加T细胞在实体瘤中的浸润，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，招募更多的免疫细胞，以增强对肿瘤的杀伤作用，将抗病毒的免疫反应转变为抗肿瘤免疫反应，使得该构建得到的重组CD19 BITE痘瘤病毒具有病毒和抗体的双重抗体作用。
具体的，B淋巴细胞抗原CD19(Cluster of Differentiation 19)，是一种I型膜蛋白，包含两个免疫球蛋白样结构域，CD19是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原，分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B 细胞、滤泡树状细胞上，CD19与CD21和CD81一起充当B细胞共受体。激活后， CD19的胞质尾部被磷酸化，从而导致Src家族激酶结合并募集PI-3激酶。与在T 细胞上一样，几个表面分子形成抗原受体并在B淋巴细胞上形成复合物。CD19 阳性细胞升高常见于B淋巴细胞***的恶性肿瘤，如CD19在95％急性前B淋巴细胞白血病细胞和94％急性成熟B淋巴细胞白血病细胞表达，也见于慢性淋巴细胞性白血病和Burkitt淋巴瘤等，故CD19检测可对上述疾病进行明确的病因诊断，并为鉴别诊断提供依据。此外由于CD19广泛存在于B淋巴细胞***恶性肿瘤细胞表面，故可在白血病及淋巴瘤的免疫疗法中作为细胞表面的靶点。因此是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B细胞最好的标记。本方案的重组痘瘤病毒特别针对CD19阳性的B***系肿瘤，比如针对淋巴瘤或者白血病有较好的治疗效果。
CD3仅存在于T细胞表面，由6条肽链组成，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合物。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致CD3 的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如 ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。CD3ε或γ链基因缺陷可致T细胞信号传导缺陷。
根据本方案的第一方面，提供一种重组痘瘤病毒，该重组痘瘤病毒的基因组中***CD3和CD19序列,其中CD3序列和CD19序列分别表达CD3和CD19。
其中，CD3和CD19的核苷酸序列如SEQ ID NO：1。值得一提的是，CD3和 CD19通过linker相连，为一个序列。
其中，CD3和CD19序列***痘瘤病毒的胸苷激酶TK基因中组成重组痘瘤病毒。
其中CD3和CD19序列装载于pCB上得到pCB-CD19 BITE，pCB-CD19 BITE 和痘瘤病毒同源重组，将CD3和CD19序列***痘瘤病毒的胸苷激酶TK基因中。
其中，CD19 BITE的外源基因能够分泌表达CD19 BITE，CD19 BITE能够分泌表达具有抑制肿瘤细胞增殖活性的CD19 BITE。
其中，CD19 BITE外源基因的编码序列是任何能够编码CD19 BITE的任何 DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO：1或其互补序列，此时，本发明所述的CD19 BITE外源基因的编码序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制肿瘤细胞增值活性的CD19 BITE的多核苷酸或其互补序列。
除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用***设定的默认参数进行计算时，与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、 88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、 99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。其中核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发 (Altschul SF,et al:JMol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的***可设定默认参数值。也就是说与SEQ ID NO：1具有同源性和互补性的都可以。
严紧条件指的是：为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt 液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt 液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt 液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。
其中，重组痘瘤病毒的基因组中修饰有治疗淋巴瘤的蛋白活性成分，示例性的，在本方案中用于表达的治疗淋巴瘤的蛋白活性成分是p53。
值得一提的是，在本方案中，CD3和CD19序列间通过linker相连，相当于是一个序列，并且序列也没有特别长，故其可较容易地重组到痘苗病毒中。另外，由于CD3和CD19序列间通过linker相连，只要通过一个启动子就可以同时表达两个蛋白。且本方案的重组痘瘤病毒主要是局部注射，不会引起全身性免疫反应，并且只要有少量的病毒，就可以无限扩增，价格自然不会特别贵。
根据本方案的第二方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的如上所述的重组痘瘤病毒，药学上可接受的载体以及***的可药用辅料。示例性地，其中所述的***的可药用辅料是紫杉醇。
药学可接受的载体包括促进本发明的重组痘瘤病毒加工成制剂的赋形剂和助剂，即，该药物组合物可被制备成适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，若制备无菌注射液，则载体中可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，若制备无菌混悬剂，则载体中包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
示例性地，所述的药物组合物是固体或注射液的形式。优选的，所述的药物组合物是包装在药盒中的；更优选的，所述药盒还含有所述药物组合物的使用说明书。
本发明的活性成分的有效量可为治疗淋巴肿瘤、或缓解淋巴瘤症状或抑制淋巴肿瘤细胞的任何量，其可以是相当于约1x1011-1x1012v.p重组痘瘤病毒。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。
本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。
特别值得一提的是，本方案的重组痘瘤病毒以局部注射的方式往用户体内注射，可靶向针对病毒细胞，不会引起全身性免疫反应，并且只要有少量的病毒，就可以无限扩增，控制了药物组合物的成本。
根据本方案的第三方面，提供以上所述重组痘瘤病毒在制备***和/或癌症的药物中的应用，其中肿瘤或癌症指的是CD19阳性的B细胞系肿瘤，可以是白血病、淋巴瘤。
根据本方案的第四方面，提供上述重组痘瘤病毒的构建方法，该构建方法为在溶瘤痘苗病毒中***CD3和CD19核苷酸序列制得重组痘瘤病毒，具体的，将CD3和CD19的核苷酸序列装载于pCB粒子中，得到pCB-CD19 BITE；将质粒 pCB-CD19 BITE与野生型痘苗病毒发生同源重组，将CD3和CD19序列***野生型痘苗病毒的胸苷激酶(TK)基因中。
本方案相较现有技术，具有以下特点：
独创地将CD3和CD19编码至痘瘤痘苗病毒中，使其内部整合得到CD19 BITE 外源基因，该CD19 BITE外源基因可表达具有抑制肿瘤细胞增殖活性效果的CD19 BITE，即可同时分泌表达CD3和CD19的双特异性抗体，将抗病毒的免疫反应转换为抗肿瘤免疫反应。且该重组痘瘤病毒中整合治疗淋巴瘤的蛋白活性成分，可将基因治疗和病毒治疗有效结合起来，发挥了较好的抗肿瘤或癌症的效果。
附图说明
图1是WB检测携带CD19 BITE的重组溶瘤痘苗病毒感染Hela S3细胞后，上清中CD3和CD19的表达水平。
图2a和2b是ELISA检测携带CD19 BITE的重组溶瘤痘病毒上清与CD3和 CD19蛋白的亲和力。
图3a-d是流式细胞术检测携CD19 BITE的重组溶瘤痘苗病毒上清与CD3或 CD19阳性细胞的结合力。
图4是流式检测OVV-CD19 BITE上清对T细胞增殖的影响。
图5a-h是流式检测OVV-CD19 BITE上清对T细胞分型及活化的影响。
图6是流式细胞术检测在T细胞与Raji细胞共培养体系中，加入OVV-CD19 BITE上清后T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
图7a和7b是MTT检测OVV-CD19 BITE病毒对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤***”、“癌***”涵盖本领域通常认为的含义。如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如淋巴瘤)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。除特别说明外，本发明可采用本领域常规技术。
本方案提供一种重组痘瘤病毒，该重组痘瘤病毒通过在溶瘤痘苗病毒中***编码CD3和CD19抗体的外源基因获得，
实施例1：重组痘瘤病毒的制备：
选择野生型痘苗病毒，优选经过减毒后的野生型痘苗病，不影响病毒的生长；利用基因合成方法得到CD3和CD19抗体的核苷酸序列，其中核苷酸序列如SEQ ID NO：1；来自于人胚肾细胞系的HEK293细胞，该HEK293细胞购自中国科学院细胞库；
制备pCB-CD19 BITE：准备PCB粒子，将CD3和CD19抗体的核苷酸序列装载于pCB粒子中，得到pCB-CD19 BITE；在该步骤中，本实施例选用穿梭质粒 pCB粒子,穿梭质粒pCB粒子的具体制备为现有技术。
制备重组痘瘤病毒：在HEK293细胞中，质粒pCB-CD19 BITE与野生型痘苗病毒发生同源重组，CD3和CD19序列***野生型痘苗病毒的胸苷激酶(TK) 基因中，以得到整合CD19BITE外源基因的重组痘瘤病毒。
筛选：经霉酚酸药物筛选后，得到纯化的重组溶瘤痘苗病毒OVV-CD19 BITE。
实施例2：利用WB法检测携带CD19 BITE的重组溶瘤痘苗病毒感染Hela S3(人子***腺癌上皮细胞，购自上海中科院细胞库)细胞后上清中CD19 BITE的表达水平。
具体的实验过程如下：六孔板中分别接种5×105个/mL的Hela S3细胞，分别加入0.5MOI的携带CD19 BITE重组溶瘤痘苗病毒(OVV-CD19 BITE)，对照组中加入等量的OVV-GFP，于37℃、5％CO2的环境下培养。于24h，48h和 72h后分别收集细胞上清。利用WesternBlot技术检测上清中CD19 BITE的表达(CD19 BITE序列上携带Flag标签，WB利用Flag抗体检测)，蛋白大小在 50KDa左右。
结果见图1，编号1表示的是24h OVVGFP上清的样品，编号2表示的是 24h OVVCD19BITE上清；编号3表示的是48h OVVGFP上清；编号4表示的是48h OVVCD19 BITE上清；编号5表示的是72h OVVGFP上清；编号6 表示的是72h OVVCD19 BITE上清。可见随着时间的增加，上清中CD19 BITE 的表达水平随之增加，表明重组溶瘤痘苗病毒感染细胞后可以分泌CD19BITE，并且呈现时间依赖性。
实施例3：ELISA检测携带CD19 BITE的重组溶瘤痘病毒上清与CD3或 CD19蛋白的亲和力。
CD3或CD19蛋白(100ng/ml)4℃包被过夜，第二天，5％BSA，37℃封闭2h，加入不同体积的(25μl，50μl和100μl)的OVV-CD19 BITE上清，37℃孵育2h；加入Flag二抗(1:1000)37℃孵育2h，加入显色液100μl，室温孵育30min，加入终止液50μl，在Thermo VarioskanFlash全自动酶标仪上选择波长450nm测定各孔吸光值(A值)。
结果见图2a和2b，OVV-CD19 BITE上清与CD3或CD19蛋白都有较好的亲力。
实施例4：流式细胞术检测携CD19 BITE的重组溶瘤痘苗病毒上清与CD3 或CD19阳性细胞的结合力。
K562(CD3-CD19-细胞)，Raji，CD19/K562，Pfeiffer，Nalm-6，Farage (均为CD3-CD19+细胞)，Jurkat，CEM(CD3+CD19-细胞)，取1*10^5细胞于流式管，加入OVV-CD19 BITE上清10μl，20μl和40μl(CD3-CD19+细胞)，加入浓缩30倍后的OVV-CD19 BITE上清50μl，100μl和150μl (CD3+CD19-细胞)。于4℃冰箱中孵育30min，之后加入Flag-APC抗体 (1:200)，置于4℃冰箱中孵育30min。PBS洗涤两遍，最后用100μlPBS重悬，上机检测。
结果见图3a-d，OVV-CD19 BITE上清可以与CD3阳性或CD19阳性的细胞结合，并且呈现浓度依赖性。
实施例5：流式检测OVV-CD19 BITE上清对T细胞增殖的影响
Raji细胞在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640(购自Gibco)中培养 (37℃、5％CO2、饱和湿度)，按1×105/ml的浓度接种1ml于24孔培养板，同时加入1×105个T细胞(E:T＝1：1)后，分别加入浓缩30倍后的OVV-GFP和 OVV-CD19 BITE上清25μl和50μl，每组均做3复孔。于24h，48h和72h分别检测T细胞的增殖。
结果见图4，加入OVV-CD19 BITE上清后，能明显促进T细胞的增殖。
实施例6：流式检测OVV-CD19 BITE上清对T细胞分型及活化的影响
Raji细胞在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640(购自Gibco)中培养 (37℃、5％CO2、饱和湿度)，按1×105/ml的浓度接种1ml于24孔培养板，同时加入5×105个PBMC细胞(E:T＝5:1)后，分别加入浓缩30倍后的OVV-GFP 和OVV-CD19 BITE上清25μl，每组均做3复孔。于24h，48h和72h分别检测 CD4+T和CD8+T细胞的比例以及CD4+T和CD8+T的活化。
结果见图5a-h，CD4+T和CD8+T细胞比例与OVV-GFP组相比，明显增加；且OVV-CD19BITE上清可以明显诱导T细胞上CD25(T细胞活化标记)和 CD69(T细胞干性标记)的表达上调。
实施例7：流式细胞术检测在T细胞与Raji细胞共培养体系中，加入OVV- CD19BITE上清后对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响
Raji细胞在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640(购自Gibco)中培养 (37℃、5％CO2、饱和湿度)，按1×105/ml的浓度接种1ml于24孔培养板，同时加入1×105个T细胞(E:T＝1：1，事先染上CFSE染料)后，分别加入浓缩30 倍后的OVV-GFP和OVV-CD19 BITE上清25μl和50μl，每组均做3复孔。于 24h，48h和72h分别检测T细胞对Raji细胞的杀伤能力。
结果见图6，OVV-CD19 BITE上清可以诱导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
实施例8：利用MTT检测OVV-CD19 BITE病毒对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响，实验选用的Raji细胞是黑人Burkitt淋巴瘤细胞。
不同MOI的OVV-GFP和OVV-CD19 BITE病毒感染Raji细胞24h后，洗涤两遍，弃去多余病毒，按1×105/ml的浓度接种1ml于24孔培养板，同时按照分别加入或不加2×105个T细胞(E:T＝2:1)，分别于24h和48h利用MTT检测细胞存活率。上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。
结果见图7a-b，与OVV-GFP相比，OVV-CD19 BITE可以明显促进T细胞杀伤Raji的能力。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州荣谷生物科技有限公司
<120> 重组痘瘤病毒、药物组合物及其构建方法和应用
<130> HZPZL1200928
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggctgga gctgcatcat cctgttcctg gtggcaaccg caacaggagt gcactctgag 60
gtgaagctgc aggagagcgg accaggactg gtggcaccat cccagtctct gagcgtgacc 120
tgtacagtgt ctggcgtgag cctgccagac tacggcgtga gctggatcag gcagccacct 180
agaaagggcc tggagtggct gggcgtgatc tggggctccg agaccacata ctataacagc 240
gccctgaagt cccggctgac catcatcaag gataactcca agtctcaggt gtttctgaag 300
atgaatagcc tgcagaccga cgatacagcc atctactatt gcgccaagca ctactattac 360
ggcggcagct atgccatgga ctactggggc cagggcacct ccgtgacagt gagctccgga 420
ggaggaggaa gcggcggagg aggctccggc ggcggcggct ctgatatcca gatgacacag 480
accacatcta gcctgagcgc ctccctgggc gacagggtga ccatctcttg tcgcgccagc 540
caggatatct ccaagtatct gaattggtac cagcagaagc ctgacggcac cgtgaagctg 600
ctgatctatc acacatctcg gctgcacagc ggcgtgccat ccagattctc tggcagcggc 660
tccggcaccg actactctct gacaatcagc aacctggagc aggaggatat cgccacctat 720
ttctgccagc agggcaatac cctgccctac acatttggcg gcggcaccaa gctggagatc 780
accggaggag gaggatccca ggtgcagctg cagcagtctg gagcagagct ggcaaggcct 840
ggagcatccg tgaagatgtc ttgtaaggcc agcggctata ccttcacaag gtacacaatg 900
cactgggtga agcagaggcc aggacagggc ctggagtgga tcggctatat caaccctagc 960
cgcggctata ccaactacaa tcagaagttt aaggacaagg ccaccctgac caccgataag 1020
tcctctagca cagcctacat gcagctgtcc tctctgacct ccgaggactc tgccgtgtat 1080
tactgcgccc ggtattacga cgatcactat tgtctggatt attggggaca gggcaccaca 1140
ctgacagtga gcagcggcgg aagcggagga tccggaggct ctggcggcag cggaggacag 1200
atcgtgctga cccagtcccc tgccatcatg tctgccagcc caggcgagaa ggtgaccatg 1260
acatgcagcg cctctagctc cgtgtcctat atgaactggt atcagcagaa gtccggcaca 1320
tctccaaagc ggtggatcta tgacacctcc aagctggcat ctggagtgcc agcacacttt 1380
agaggatccg gatctggcac cagctactcc ctgacaatca gcggaatgga ggcagaggat 1440
gcagcaacct attactgtca gcagtggtct agcaaccctt tcacctttgg ctccggcaca 1500
aagctggaga tcaatagagg aggctccgga ggatccggag gatctggagg ctcctctagc 1560
gattacaagg acgatgacga taag 1584

Claims (7)

1.一种重组痘瘤病毒，其特征在于，该重组痘瘤病毒的基因组中***CD3抗体序列和CD19抗体序列，其中CD3抗体序列和CD19抗体序列分别表达CD3抗体和CD19抗体，CD3抗体和CD19抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的重组痘瘤病毒，其特征在于，CD3抗体和CD19抗体序列装载于pCB上得到pCB-CD19 BITE，pCB-CD19 BITE和痘瘤病毒同源重组。
3.根据权利要求1所述的重组痘瘤病毒，其特征在于，该重组痘瘤病毒的基因组中修饰有治疗淋巴瘤的蛋白活性成分。
4.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1到3任一所述的重组痘瘤病毒，药学上可接受的载体以及***的可药用辅料。
5.权利要求1到3任一所述的重组痘瘤病毒在制备治疗CD19阳性的B***肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CD19阳性的B***肿瘤包括白血病、淋巴瘤。
7.一种制备权利要求1到3任一所述的重组痘瘤病毒的方法，其特征在于，在溶瘤痘苗病毒中***CD3抗体和CD19抗体核苷酸序列制得重组痘瘤病毒。
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