CN112143654B - 一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用 - Google Patents

一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物病害生物防治技术领域，公开了一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用。该菌株名称为拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)TJ5，于2020年8月8日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:61129。本发明菌株为从荔枝上筛选到的拮抗菌，由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，利用其来防治荔枝病害，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠；该菌株对荔枝炭疽病菌具有效果极佳的抑制作用，抑菌能力强，对于防治荔枝炭疽病具有重要的现实意义。

Description

一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，特别涉及一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用。
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是亚热带四季常绿植物，也是重要的亚热带经济作物，属于无患子科。我国的荔枝最初产于南部地区，包括广东、广西、福建、海南等省区。荔枝作为水果中的佳品，其果肉多汁液，并且香味浓郁、柔嫩爽口，早已拥有“中华之珍果”的美称，具有极高的商业价值。但是由于荔枝果实成熟大多是在高温高湿的季节，导致采后的果实容易褐变和腐烂变质，而荔枝炭疽病是引起荔枝果实腐烂变质的主要原因。荔枝炭疽病是荔枝生产上非常重要的一种真菌病害，其采前和采后都可造成巨大的经济损失。目前，在对荔枝炭疽病的防治中，主要是以化学防治为主，化学防治在短时间内虽然可以起到一定的效果，但是化学药剂的连续使用易增加病原菌的耐药性甚至抗药性，同时还伴有农药残留和环境污染等问题。而生物防治不易增加病原菌的耐药性，具有环保的优点，因此，加强对荔枝炭疽病的生物防治，逐渐成为人们关注的焦点和热点，这对荔枝产业的发展具有重大意义。
木霉属(Trichoderma spp.)真菌广泛存在于土壤及其他基物中，其具有生存能力强、适应性广及不污染环境等属性，是一种广谱性拮抗菌。利用木霉防治植物病害的研究起源于1932年，Weindling首次发现木素木霉(Trichoderma lignorum)对植物病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌丝有重寄生作用，接着便有许多利用木霉来进行植物病害生物防治的研究相继发表。张文军等研究发现深绿木霉(Trichoderma atroviride)T2菌株及其发酵液对苹果霉心病的主要病原菌粉红单端孢(Trichothecium roseum)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)和苹果链格孢(Alternaria mali)均具有较强的抑制作用；梁晓洁等报道了拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)TkonT1菌株对尖孢镰孢菌具有很好的抑菌效果，且菌株TkonT1可缠绕在尖孢镰孢菌菌丝体上或穿入菌丝体内营寄生生长，吸收病菌菌丝体养分进而导致病菌菌丝体破裂和细胞原生质消解；曹翠玲等研究发现康氏木霉对向日葵菌核病菌具有较强的拮抗作用。目前已有一些木霉成分的微生物菌剂得到应用，且效果显著，如以色列的哈茨木霉T39及美国的哈茨木霉T-22。因此，拟康宁木霉菌作为一类重要的自然资源，已引起广泛关注，具有开发生物农药的潜力。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，开发拟康宁木霉菌的应用，本发明的首要目的在于提供一株拟康宁木霉菌，命名为拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)TJ5，该菌株以荔枝枯枝落叶上的微生物为筛选对象而分离得到，对荔枝炭疽菌具有显著的抑制作用，为生物防治替代化学防治提供新的资源与方向，未来可作为生物农药进行开发利用。
本发明另一目的在于提供一种基于上述拟康宁木霉菌制备得到的生物制剂。
本发明再一目的在于提供上述拟康宁木霉菌在防治荔枝炭疽病中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一株拟康宁木霉菌，将其命名为拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)TJ5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:61129，保藏时间为2020年8月8日。
所述的拟康宁木霉菌在PDA培养基上28℃培养，其生长速度很快，3d后菌落已经长满整个培养皿，菌丝初为白色，蛛丝状，有大量的气生菌丝，随着培养时间的延长，菌丝开始形成同心圆环，且颜色逐渐变绿。分生孢子梗主枝较长，次级分支近直角分支，分生孢子为绿色，单孢，长椭圆形或椭圆形。
一种生物制剂，基于上述拟康宁木霉菌制备得到。
所述的生物制剂由上述拟康宁木霉菌经液体发酵制备得到，优选包含以下步骤：将上述拟康宁木霉菌接种至PDB培养液中培养，即可获得生物制剂。
所述PDB培养液的pH值为7.0。
所述的培养指在28℃，摇床震荡速率为180rpm条件下培养5d。
本发明还提供上述生物制剂在防治荔枝炭疽病中的应用。
本发明还提供上述拟康宁木霉菌在防治荔枝炭疽病中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明是从荔枝上筛选到的拮抗菌，由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，利用其来防治荔枝病害，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
(2)本发明的拟康宁木霉菌对荔枝炭疽病菌具有效果极佳的抑制作用，抑菌能力强，且其生物来源环保无毒性，对生态环境影响小，对于防治荔枝炭疽病具有重要的现实意义。
(3)本发明得到的拟康宁木霉菌，培养条件要求低，生存能力强，适应性广，作为生防菌具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为拟康宁木霉菌TJ5在PDA培养基平板上的单菌落图。
图2为拟康宁木霉菌TJ5分生孢子梗及分生孢子图。其中，A为分生孢子梗图，B为分生孢子图。
图3为拟康宁木霉菌TJ5对荔枝炭疽菌的抑制效果图。其中，A为荔枝炭疽菌正常生长的菌落形态图，B为拟康宁木霉菌对荔枝炭疽菌的抑制效果图。
图4为拟康宁木霉菌TJ5的生物制剂对荔枝炭疽菌的抑制效果图。其中，A为荔枝炭疽菌正常生长的菌落形态图，B为拟康宁木霉菌的生物制剂对荔枝炭疽菌的抑制效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：拟康宁木霉菌的分离、纯化和保藏
(1)PDA培养基的配制：先将马铃薯洗净去皮，后称取200g马铃薯，将之切碎放入锅中，加水800mL煮沸0.5h，用八层纱布过滤，再加入20g葡萄糖，加水定容至1000mL，用玻璃棒搅拌混匀，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装至250mL三角瓶中，121℃湿热灭菌20min，保存备用。
(2)木霉菌株样品分离自华南农业大学园艺学院荔枝基地中荔枝的枯枝落叶上的绿色霉层，参照方中达等的方法进行菌种的分离和纯化，并稍作修改：用接种针挑取些许绿色霉层于PDA培养基平板上，置于28℃培养箱中培养，待绿色分生孢子长出后，倒入适量灭菌水冲洗孢子，制得孢子悬浮液，再从中吸取1mL，加入9mL无菌水，充分混匀，如此反复稀释，直到将其孢子悬液浓度稀释至10-4为止，后吸取20μL的稀释后的孢子悬液均匀涂布于含PDA培养基的平板上，28℃培养2～3d后。挑取单菌落，获得单孢培养的纯分离物。
将分离纯化所得到的菌株进行ITS序列分析，确定为拟康宁木霉菌(Trichodermakoningiopsis)，命名为拟康宁木霉菌TJ5。其与GenBank中登陆号为MT102394.1的Trichoderma koningiopsis isolate Tkois1同源性达100％，证实其分类命名为拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)，命名为拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)TJ5。序列片段如下所示：
CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA。
拟康宁木霉菌在PDA培养基上28℃培养，其生长速度很快，3d后菌落已经长满整个培养皿，菌丝初为白色，蛛丝状，有大量的气生菌丝，随着时间的延长，菌丝开始形成同心圆环，且颜色逐渐变绿(图1)。分生孢子梗主枝较长，次级分支近直角分支，分生孢子为绿色，单孢，长椭圆形或椭圆形(图2)。
(3)拟康宁木霉TJ5的保藏：将该菌株于2020年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:61129。
实施例2：对峙培养法测定拟康宁木霉的活性
(1)PDA培养基的配制同实施例1。
(2)拟康宁木霉菌单菌落和菌碟的制备：用灭菌牙签挑取拟康宁木霉菌丝于PDA培养基平板上，28℃培养3～4d，即得单菌落；用打孔器在拟康宁木霉菌菌落边缘打孔，即可获得圆形菌碟。
(3)荔枝炭疽菌的培养和菌碟的制备：将保存于-20℃中的荔枝炭疽菌株接种至PDA培养基平板上活化，待其菌落长满平板后用直径为5mm的打孔器打取菌落的边缘，即可获得圆形的菌碟。
(4)活性测定：在9cm的PDA平板培养基上相距5cm处分别接入步骤(2)制备得到的拟康宁木霉菌菌碟和步骤(3)制得的荔枝炭疽菌菌碟作对峙培养，实验中以单独接种的荔枝炭疽菌作为对照，每处理设3次重复，置于25℃条件下恒温培养，从第2d开始，每天观察菌落的生长情况，待对照组菌落长满培养皿(6d)后测量菌落的生长直径。计算出抑菌率。结果表明，拟康宁木霉菌对荔枝炭疽菌的菌落生长具有明显的抑制效果，抑制率达到了70.73％，且在后期能完全覆盖或部分覆盖病原真菌，并在其上产生大量的分生孢子(图3)。
抑制率(％)＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100
实施例3：生长速率法测定拟康宁木霉菌生物制剂的活性
(1)PDA培养基的配制同实施例1；PDB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与PDA固体培养基的配方相同，将称得的药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶装入100mL培养液)，加塞、包扎，121℃湿热灭菌20min，冷却后贮存备用。
(2)拟康宁木霉菌无菌发酵滤液(生物制剂)的制备：取实施例2步骤(2)制备得到的拟康宁木霉菌菌碟接入步骤(1)制备得到装有100mL的PDB培养液锥形瓶中，置于28℃，摇床速率为180rpm条件下避光振荡培养5d后于5000rpm离心10min，吸取上清液，再用孔径为0.2μm的过滤器滤除菌体，即可获得拟康宁木霉无菌滤液。
(3)荔枝炭疽菌的培养和菌碟的制备同实施例2。
(4)活性测定：将步骤(2)制备得到的拟康宁木霉菌的生物制剂和PDA培养基按1：9的体积比进行混合，之后倒板，每皿倒入15mL。分别在平板中央接直径为5mm的拟康宁木霉菌菌碟和荔枝炭疽菌菌碟，置于25℃条件下恒温培养至对照组长满培养皿，对照组用PDB替代拟康宁木霉菌的生物制剂，每处理重复三次。待对照组菌落长满培养皿后测得实验组直径，计算出抑菌率。结果表明，拟康宁木霉菌TJ5的生物制剂对荔枝炭疽病菌具有明显的抑制作用，抑菌率为27.5％(图4)。
抑制率(％)＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株拟康宁木霉菌及其在防治荔枝炭疽病中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 583
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)TJ5的ITS序列
<400> 1
cctgcggagg gatcattacc gagtttacaa ctcccaaacc caatgtgaac cataccaaac 60
tgttgcctcg gcggggtcac gccccgggtg cgtcgcagcc ccggaaccag gcgcccgccg 120
gagggaccaa ccaaactctt tctgtagtcc cctcgcggac gttatttctt acagctctga 180
gcaaaaattc aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 240
aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300
tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc 360
aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg gaacccctaa gacgggatcc 420
cggccccgaa atacagtggc ggtctcgccg cagcctctcc tgcgcagtag tttgcacaac 480
tcgcaccggg agcgcggcgc gtccacgtcc gtaaaacacc caactttctg aaatgttgac 540
ctcggatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcatatc aaa 583

Claims (6)

1.一株拟康宁木霉菌（Trichoderma koningiopsis）TJ5，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:61129，保藏时间为2020年8月8日。
2.一种生物制剂，其特征在于由包含以下步骤方法制备得到：将权利要求1所述的拟康宁木霉菌TJ5接种至PDB培养液中培养，获得生物制剂。
3.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于所述PDB培养液的pH值为7.0。
4.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于所述的培养指在28℃，摇床震荡速率为180rpm条件下培养5d。
5.权利要求2-4任一项所述的生物制剂在防治荔枝炭疽病中的应用。
6.权利要求1所述的拟康宁木霉菌TJ5在防治荔枝炭疽病中的应用。
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