CN112138166B

CN112138166B - 一种纳米药物、其制备方法及用途

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Publication number: CN112138166B
Application number: CN202011033917.3A
Authority: CN
Inventors: 王永安; 杨军; 李尧; 黄静宜; 邢欢纯; 章子男; 隋昕; 骆媛
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112138166A

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种纳米药物，其以球状的磷脂酰丝氨酸类材料为载体，所述载体内含有乙酰胆碱酯酶重活化剂。本发明还涉及该纳米药物的制备方法及用途。本发明纳米药物能有效透过血脑屏障向中枢神经***迅速释放药物，对乙酰胆碱酯酶的重活化率高，成药性好，性能稳定、安全，制备简便，可用于迅速救治中枢神经***有机磷化合物中毒。

Description

一种纳米药物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种纳米药物，还涉及该纳米药物的制备方法及用途。

背景技术

在中枢神经***(central nervous system，CNS)中，血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)是最为重要的生理屏障，由血管内皮细胞(ECs)、星形神经末梢和基底膜之间形成的紧密连接(TJ)所构成。由于BBB的存在，使得近100％的大分子无法进入大脑，只有部分小分子可以通过BBB到达大脑。BBB阻止了绝大部分的异源型物质进入大脑，保护脑部免受外部环境的影响，维持大脑内环境的稳定。为使药物有效穿透血脑屏障向中枢给药，既往研究多集中在新型药物分子的设计和结构改构上，以改变所带电荷、提高亲脂性等。但是，改变分子结构的步骤繁琐，且可能影响药物分子与靶点的结合，导致其无法发挥药效。因此，分子结构改构的研究方案仍不能有效实现药物中枢给药。

神经性毒剂中毒救治最重要的措施之一是重活化，即与神经性毒剂分子结合的乙酰胆碱酯酶重新恢复水解乙酰胆碱的功能。这类可恢复乙酰胆碱酯酶的活性和功能的药物简称为重活化剂。以梭曼为例进行说明，梭曼(Soman，化学名：甲氟膦酸特己酯)是一种神经性毒剂，也是最难防难治的神经性毒剂。目前临床普遍应用的重活化剂如氯解磷定、双复磷等，对梭曼中毒的乙酰胆碱酯酶无良好的重活化效果；而以HI-6为代表的双季胺单肟类重活化剂，尽管对梭曼外周中毒的乙酰胆碱酯酶有良好重活化效果，但由于其分子具有强亲水性且带正电荷，使这类重活化剂难以穿透血脑屏障(BBB)而进入中枢，因此无法有效实现对中枢梭曼中毒的乙酰胆碱酯酶的重活化。

目前，现有的治疗中枢神经***疾病的纳米药物能有效携带药物分子穿透血脑屏障进入中枢，但大多是以治疗脑部肿瘤等为目标的缓释型纳米结构。但是，神经性毒剂中毒的救治则与此不同，其需要纳米药物在中枢迅速释放药物以迅速起效，这是由于神经性毒剂对乙酰胆碱酯酶的活性有极强烈的抑制作用，导致乙酰胆碱在体内迅速过量蓄积，引起外周和中枢胆碱能神经***功能严重紊乱，最终引发中毒人员出现惊厥、脑损伤甚至死亡。因此，需要救治药物能快速在中枢***释放以发挥疗效，但目前还缺乏能穿透血脑屏障并迅速释药的纳米药物。

有研究人员将人血清白蛋白制备成纳米颗粒后，利用静电吸附作用在颗粒表面挂载HI-6药物，模拟体外血脑屏障模型，进行生物学药效评价。从药效评价上看，药物穿透血脑屏障的能力有一定的提升，但是效率低、结构不稳定，依然不能满足神经性毒剂(例如梭曼)中毒救治的需求。

另外，现有的中枢靶向纳米药物，基本是在纳米颗粒上修饰相应的靶向成分制成，不仅需要较多的添加剂、偶联剂等，还需要苛刻的合成条件，这使得药物的制备变得复杂、繁琐，例如携带药物的纳米多孔硅球需在强碱条件下高温反应，合成步骤复杂、耗时长。基于以上原因，现有的纳米药物大部分成药性差，不利于药物的中试、放大。

因此，面对神经毒剂中毒无药可治的急迫的现实需求，亟需开发出一种能迅速释放药物、载药量高、成药性好、制备简便的用于治疗中枢***有机磷中毒的重活化剂。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种纳米药物，其采用球状的磷脂酰丝氨酸类材料(例如POPS)为载体装载乙酰胆碱酯酶重活化剂，其载药率高，能有效穿透血脑屏障并在中枢迅速释放药物，对乙酰胆碱酯酶的重活化率高，成药性好，性能稳定，安全可靠，制备简便。本发明又一目的在于提供了该纳米药物的制备方法及用途。

为实现上述目的，本发明第一方面涉及一种纳米药物，其以球状的磷脂酰丝氨酸类材料为载体，所述载体内含有乙酰胆碱酯酶重活化剂。

本发明第一方面的一些实施方式中，“球状”指圆球形或类似圆球形。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述磷脂酰丝氨酸类材料选自1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)和二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)，优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)。

本发明第一方面的一些实施方式中，“含有”指载体内装填有或包裹有乙酰胆碱酯酶重活化剂。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂为有机磷化合物(例如梭曼)中毒的乙酰胆碱酯酶的重活化剂。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂为双季胺单肟类重活化剂。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂选自酰胺磷定、氯解磷定和双复磷，优选为酰胺磷定(HI-6)。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述纳米药物的平均粒径为80～200nm，优选为100～200nm，例如110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述纳米药物的包封率为70％～85％，优选为75％～85％，例如76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述纳米药物的载药率为12％～23％，优选为14％～20％，例如15％、16％、17％、18％、19％。

本发明第一方面的一些实施方式中，球状的载体由双分子层环绕形成，其中，内分子层为亲水性，外分子层为疏水性。

本发明第一方面的一些实施方式中，纳米药物的聚合物分散系数(PDI)为0.1～0.2，例如0.13±0.02。

本发明第一方面的一些实施方式中，纳米药物的平均电位为-40～-28mv，例如-32.67±2.51mv。

本发明第二方面涉及一种制备纳米药物的方法，包括如下步骤：

(1)将磷脂酰丝氨酸类材料的溶液中的有机溶剂旋转蒸发掉，得到膜；

(2)将乙酰胆碱酯酶重活化剂的溶液与膜以1:(3～16)ml/mg(例如1:5ml/mg、1:8ml/mg、1:10ml/mg、1:15ml/mg)的比例混合，得到混合物；

(3)在不低于磷脂酰丝氨酸类材料相变温度的温度下，将所述混合物通过脂质体挤出器往复挤压5～40次(优选为10～30次，例如11次、13次、15次、16次、17次、18次、20次、22次、25次、28次、35次)，得到纳米药物；其中，所述脂质体挤出器中聚碳酸酯膜的孔径为80～200nm(优选为100～200nm，例如110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm)。

本发明第二方面的一些实施方式中，步骤(2)中，在超声条件下混合。

本发明第二方面的一些实施方式中，步骤(3)中，在磷脂酰丝氨酸类材料相变温度下通过脂质体挤出器进行往复挤压。

本发明第二方面的一些实施方式中，所述方法具有如下A至J中的一项或多项特征：

A.步骤(1)中，所述磷脂酰丝氨酸类材料选自1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸和二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸，优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸；

B.步骤(1)中，所述有机溶剂选自氯仿、丙酮和乙醇中至少一种，优选为氯仿；

C.步骤(1)中，所述溶液中磷脂酰丝氨酸类材料和有机溶剂的比例为0.01～18mg/ml，例如5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml；

D.步骤(1)中，旋转蒸发的温度为室温；

E.步骤(2)中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂选自氯解磷定、双复磷和酰胺磷定，优选为酰胺磷定；

F.步骤(2)中，所述溶液的溶剂为PBS和/或灭菌生理盐水；

G.步骤(2)中，所述溶液的浓度为1～5mg/ml，例如2mg/ml、2.2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml；

H.步骤(2)中，混合的时间为0.5～20分钟，例如1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18分钟；

I.步骤(3)中，磷脂酰丝氨酸类材料相变温度为0℃～60℃，例如6℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、41℃、45℃、50℃、55℃；

J.纳米药物为本发明第一方面所述的纳米药物。

本发明第二方面的一些实施方式中，室温一般理解为10℃～30℃。

本发明第三方面涉及本发明第一方面所述纳米药物在制备治疗中枢神经***有机磷化合物中毒的药物中的用途。

本发明第三方面的一些实施方式中，所述有机磷化合物选自梭曼、沙林和诺维乔克，优选为梭曼。

本发明第三方面的一些实施方式中，所述中毒选自轻度中毒、中度中毒和重度中毒。

本发明中，如无特殊说明，其中：

术语“BBB”是指血脑屏障。

术语“FLU”是指荧光素钠。

术语“PBS”是指磷酸盐缓冲溶液。

术语“BMECs”是指鼠脑微血管内皮细胞。

术语“PDI”是指聚合物分散系数。

术语“POPS”是指1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。

术语“DMPS”指二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸。

术语“DPPC”指二棕榈酸磷脂酰胆碱。

术语“MPPC”指1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂。

术语“DMPC”指二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱。

术语“SOPC”指1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂。

术语“TJ”是指紧密连接。

术语“CNS”是指中枢神经***。

术语“AChE”是指乙酰胆碱酯酶。

术语“HI-6”是指重活化剂酰胺磷定。

术语“ATCH”是指碘代硫代乙酰胆碱。

术语“DTNB”是指5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。

术语“OD值”是指通过酶标仪检测得到的吸光度值。

术语“KM小鼠”是指我国生产量、使用量最大的远交群昆明小鼠，来源于swiss小鼠。

术语“Ellman法”是指通过底物碘代硫代乙酰胆碱(ATCH)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解生成硫代胆碱，硫代胆碱与显色剂5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)迅速作用，生成在415nm处有光吸收的黄色物质，其OD值可以反应AChE的活性。

术语“胆碱酯酶提取液”是指用于提取小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的试剂。

本发明取得的有益效果：

1、本发明纳米药物的载药率高。

2、本发明纳米药物能有效透过血脑屏障(BBB)向中枢神经***(例如脑)迅速释放药物，适用于迅速救治中枢神经***有机磷化合物(例如梭曼)中毒。

3、本发明纳米药物对乙酰胆碱酯酶的重活化率高，对梭曼中毒乙酰胆碱酯酶的重活化率高达40％以上，实现了有机磷中毒救治工作质的飞跃。

4、本发明纳米药物的成药性好，性能稳定，制备简便，其磷脂酰丝氨酸类载体材料可在体内降解、安全可靠。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例1中制备方法的流程图；

图2为实施例2中的TEM照片；

图3为实施例2中的粒径分布图；

图4为实施例2中的HI-6和纳米药物的药物体外累积释放率曲线；

图5为实施例4中BMECs在不同时间摄取同一浓度FLU和FLU-LPs的荧光强度图；

图6为实施例4中BMECs在相同时间摄取不同浓度FLU和FLU-LPs的荧光强度图；

图7为实施例5中的HI-6和纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图8为实施例5中的HI-6和纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全脑AChE的重活化率；

图9为实施例6中的HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图10为实施例6中的HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全脑AChE的重活化率；

图11为实施例8中的HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图12为实施例8中的HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全脑AChE的重活化率；

图13为实施例10中的HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图14为实施例10中的HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全脑AChE的重活化率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：装载HI-6的POPS纳米药物(HI-6-POPS-LPs)的制备

本实施例所使用的目标药物为HI-6(1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate)，由军事医学研究院毒物药物研究所合成，纯度95％以上；POPS(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine)由广州粤基盖华生物科技有限公司提供，纯度99％以上。

制备流程如图1所示。

(1)精密称取160mg POPS于100ml圆底烧瓶中，加入20ml氯仿振荡混匀，得到POPS氯仿溶液，在室温下通过旋转蒸发仪蒸干氯仿，得到均匀的磷脂薄膜；

(2)精密称取44mg HI-6，加入20ml PBS溶解，得到2.2mg/ml的HI-6溶液；取20mlHI-6溶液加入步骤(1)所制磷脂薄膜中，HI-6溶液和薄膜的比例为1:8ml/mg，在超声仪中超声处理1-2min，得到纳米药物混悬液；

(3)在冰浴条件下，将步骤(2)得到的纳米药物混悬液通过聚碳酸酯膜孔径为100nm的脂质体挤出器进行往复挤压，往复挤压次数为11次，得到粒径分布均匀的装载HI-6的POPS纳米药物。

实施例2：装载HI-6的POPS纳米药物(HI-6-POPS-LPs)的表征

(1)形态观察：取实施例1所制备的纳米药物50μl，采用PBS稀释至适宜倍数，滴至铜网上固定约10min，吸去多余液体，然后吸取1％的醋酸双氧铀于铜网上静置2min，吸去多余液体，自然晾干。将样品置于透射电镜(TEM)下检测，照片如图2所示。

由图2可以观察到，纳米药物直径在100nm左右，明显为双层结构。

(2)粒径和电位测定：取实施例1所制备的纳米药物500μl注入粒径分析仪的吸收池中，得到粒径分布图如图3所示。

由图3可知，纳米药物粒径分布比较集中，其平均粒径为139.38±1.82nm，聚合物分散系数(PDI)为0.13±0.02，纳米药物平均电位为-32.67±2.51mv，较高的电位降低了微粒间凝聚的机会，同时提升了纳米药物自身稳定性。

(3)体外累积释放率曲线的测定：

高效液相色谱条件：色谱柱为资生堂C18，规格250×4.6mm；流动相为乙腈、含5mM正庚烷磺酸钠和1.2‰(w/w)三氟醋酸的水溶液；洗脱程序为以乙腈和水溶液体积比为15:85等度洗脱；检测波长为300nm；出峰时间为7.4min；流速为2mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL。

标准曲线的建立：精密称取10mg HI-6，采用超纯水配制浓度为1mg/mL的HI-6溶液，采用超纯水依次稀释到200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，按照上述条件采用高效液相色谱检测，以峰面积(A)为纵坐标，浓度(c，μg/ml)为横坐标，做线性回归并绘制标准曲线。结果表明：准曲线方程为：A＝12.74c+5.387，r²＝0.9997；HI-6在1-200μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积之间线性关系较好。

将实施例1所制备的纳米药物振荡均匀，以PBS为释放介质，吸取1ml纳米药物和1ml HI-6分别装入两个透析袋中，分别置于37℃的800ml PBS中，在预设时间点每次取3mL透析袋外的样品同时补充3ml PBS，以保证透析袋外溶液体积不变，将样品按照上述条件采用高效液相色谱检测，将测得的峰面积代入标准曲线中计算HI-6浓度，进而计算出HI-6体外累积释放率，绘制成的药物体外累积释放率曲线如图4所示。

由图4可知，HI-6和纳米药物的药物体外累积释放率曲线表明，HI-6释放速度较快，45min时基本释放完全，而相同时间内纳米药物仅释放约45％。

(4)包封率和载药率的测定：

取实施例1所制备的纳米药物500μl置于超滤离心管中(10K)，在4℃以4000g转速离心30min，记录超滤管下室液体体积，稀释100倍后，将样品注入高效液相色谱仪中按照第(3)项中的条件进行检测，将测得的峰面积代入第(3)项中的标准曲线中计算HI-6浓度，然后根据下述公式计算药物包封率(EE％)和载药率(DE％)：

药物包封率(EE％)＝纳米载体装载药物的量/药物投入的总量×100％

载药率(DE％)＝纳米载体装载药物的量/(纳米载体装载药物的量+纳米载体的量)×100％

计算得到：装载HI-6的POPS纳米药物的药物包封率为77.29±2.54％(w/w)，载药率为16.54±0.03％(w/w)，表明该纳米药物对HI-6具有高的载药量。

实施例3：装载荧光素钠(FLU)的POPS纳米药物(FLU-LPs)的制备

本实施例采用水溶性荧光染料荧光素钠(FLU)标记POPS纳米药物，以FLU代替实施例1中装载的水溶性药物HI-6，然后利用其荧光强度检测该纳米药物是否具有将药物输运至脑部和在脑部的残留情况。

装载水溶性染料荧光素钠(FLU)的POPS纳米药物(FLU-LPs)的制备：

精密称取5mg FLU，溶解于50ml PBS，得到0.1mg/ml的FLU溶液。精密称取40mgPOPS，加入5ml氯仿得到POPS氯仿溶液，转移至圆底烧瓶中，在室温下通过旋转蒸发仪蒸干溶剂，加入5ml FLU溶液，超声处理1min，所得纳米药物混悬液通过聚碳酸酯膜孔径为100nm的脂质体挤出器进行往复挤压，往复挤压次数为11次，得到的纳米药物置于4℃保存。

实施例4：体外评价POPS纳米药物的中枢靶向性

BMECs对FLU-LPs摄取的定量评价：

将BMECs以5×10³个/ml的密度接种到96孔板中，培养24h，用PBS分别将FLU(荧光素钠)和FLU-LPs(脂质体，实施例3制备)稀释到指定浓度(312.5ng/ml、625ng/ml、1250ng/ml、2500ng/ml、3750ng/ml、5000ng/ml、6250ng/ml、7500ng/ml、8750ng/ml、10000ng/ml)，将稀释后的各溶液分别加入各孔板中，放入CO₂培养箱中孵育1h，孵育结束后，吸去液体，用PBS冲洗2次，用4％多聚甲醛固定15min，再次吸去液体，用PBS冲洗2次，用DAPI染色5min，第三次吸去液体，用PBS冲洗2次。

采用5000ng/ml的FLU和FLU-LPs分别与细胞孵育0.5h、2h、3h、4h，其它均与上述相同。

将制得的各样品通过高内涵成像分析***检测细胞摄取的荧光强度，结果如图5-6所示。

由图5-6可知，采用5000ng/ml的FLU和FLU-LPs分别与细胞孵育不同时间时，FLU-LPs组的细胞内荧光强度显著高于FLU组。孵育时间为1小时的结果表明，BMECs对FLU摄取的趋势随药物浓度的升高在变缓，FLU-LPs组在浓度为3750、5000、6250、7500和8750ng/ml时，细胞摄取量分别是FLU组的1.44、1.33、1.17、1.32和1.27倍。上述结果表明，POPS能有效地携带FLU进入BMECs。

实施例5：装载HI-6的POPS纳米药物对梭曼中度染毒小鼠AChE的重活化效果

(1)实验分组：昆明小鼠，雄性，按体重随机分为4组(每组15只)包括：正常组(不给药不染毒)、染毒组(只染毒不给药)、对照组(染毒并给药2.2mg/ml HI-6溶液)、纳米药物组(染毒并给药实施例1制备的HI-6-POPS-LPs纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)。

(2)实验方法：

①给药。以100μg/kg剂量对染毒组、对照组和纳米药物组小鼠皮下注射梭曼，随后立即向对照组和纳米药物组小鼠尾静脉注射相应药物，每只小鼠按10μl/g剂量给药；

②取血及脑。给药10min后取各组小鼠的血和全脑，用于乙酰胆碱酯酶活性测定；

③酶活性测定(Ellman法)。

a.将各组小鼠的全血用蒸馏水稀释成(1:100v/v)待测；

各组小鼠的全脑称重，加入乙酰胆碱酯酶提取液1.3ml，匀浆，离心(4℃，10000rpm，10min)，取上清液，用PBS稀释成(1:25v/v)待测；

b.将各组小鼠稀释的全血和脑上清液分别吸取20μl加入酶标板，试验孔加入30μlATCh(3mM)和50μl PBS,空白对照孔加入80μl PBS,空白对照孔和试验孔均设置3个复孔，最后各孔用PBS加至100μl；

c.37℃恒温箱反应30min；

d.各孔加入20μl DTNB(0.03％)；

e.在415nm波长下测定吸光值X(OD)；

f.根据所测得到的吸光值计算相应各组的重活化率，计算公式：

q_重活化率＝(X_给药组-X_染毒组)/(X_正常组-X_染毒组)

X_给药组为对照组或纳米药物组的实验孔吸光值的平均值减去空白对照孔吸光值的平均值；

X_正常组为正常组的实验孔吸光值的平均值减去空白对照孔吸光值的平均值；

X_染毒组为染毒组的实验孔吸光值的平均值减去空白对照孔吸光值的平均值。

(3)实验结果：

图7为HI-6和纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图8为HI-6和纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全脑AChE的重活化率。

由图7可知，HI-6和纳米药物均能使梭曼中度染毒小鼠全血的乙酰胆碱酯酶重活化率达到50％左右，证明该纳米载体能有效释放所装载的HI-6，能达到与同剂量自由药物相近的治疗效果。

由图8可知，由于单独的HI-6不能穿透血脑屏障，致使其对梭曼中度染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率仅能达到17％；而纳米药物能有效穿透血脑屏障，携带药物进入中枢，有效实现了中枢中毒酶的重活化，其对梭曼中毒染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率达到了45％，为目前所有报道中的最高值。根据已有文献的记载，小鼠脑部乙酰胆碱酯酶重活化率达到10％即可有效地对抗毒剂；而本发明首次实现了梭曼中枢中毒的乙酰胆碱酯酶重活化率超过25％，实现了梭曼中毒救治工作质的飞跃。

实施例6：装载HI-6的POPS纳米药物对梭曼重度染毒小鼠AChE的重活化效果

(1)实验分组：具体方法同实施例5。

(2)实验方法：给药。以120μg/kg剂量对染毒组、对照组和纳米药物组小鼠皮下注射梭曼，随后立即向对照组和纳米药物组小鼠尾静脉注射相应药物，每只小鼠按10μl/g剂量给药；

其余与实施例5中相同；

(3)实验结果：

图9为HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图10为HI-6和纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全脑AChE的重活化率。

由图9可知，HI-6和纳米药物均能使梭曼重度染毒小鼠全血的乙酰胆碱酯酶重活化率达到20％左右，由于是梭曼重度染毒，与实施例5相比，全血的乙酰胆碱酯酶重活化率降低了30％。

由图10可知，HI-6对梭曼重度染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率仅能达到1％；而纳米药物能有效穿透血脑屏障，携带药物进入中枢，即使是梭曼重度染毒情况下，也能有效实现脑部乙酰胆碱酯酶的重活化，重活化率达到了40％。

实施例7：装载HI-6的DMPS纳米药物(HI-6-DMPS-LPs)的制备

本实施例所使用的目标药物为HI-6(1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate)由军事医学研究院毒物药物研究所合成，纯度95％以上；DMPS购买自北京中成谨念科技有限公司。

(1)精密称取140mg DMPS于100ml圆底烧瓶中，加入20ml氯仿振荡混匀，得到DMPS氯仿溶液，在室温下通过旋转蒸发仪蒸干氯仿，得到均匀的磷脂薄膜；

(2)精密称取44mg HI-6，加入20ml PBS溶解，得到2.2mg/ml的HI-6溶液；取20ml上述HI-6溶液加入步骤(1)所制磷脂薄膜中，二者的比例为1:8ml/mg，在超声仪中超声处理1-2min，得到纳米药物混悬液；

(3)在35℃条件下，将步骤(2)得到的纳米药物混悬液通过聚碳酸酯膜孔径为100nm的脂质体挤出器进行往复挤压，往复挤压次数为11次，得到粒径分布均匀的装载HI-6的DMPS纳米药物。

实施例8：装载HI-6的DMPS纳米药物对梭曼重度染毒小鼠AChE的重活化效果

(1)实验分组：昆明小鼠，雄性，按体重随机分为4组(每组15只)包括：正常组(不给药不染毒)、染毒组(只染毒不给药)、对照组(染毒并给药2.2mg/ml HI-6溶液)、纳米药物组(染毒并给药实施例7制备的HI-6-DMPS-LPs纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)。

(2)实验方法：

①给药。以120μg/kg剂量对染毒组、对照组和纳米药物组小鼠皮下注射梭曼，随后立即向对照组和纳米药物组小鼠尾静脉注射相应药物，每只小鼠按10μl/g剂量给药；

③酶活性测定。具体方法同实施例5；

(3)实验结果：

图11为HI-6和HI-6-DMPS-LPs纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图12为HI-6和HI-6-DMPS-LPs纳米药物对梭曼重度染毒小鼠全脑AChE的重活化率。

由图11可知，HI-6和纳米药物均能使梭曼重度染毒小鼠全血的乙酰胆碱酯酶重活化率达到23％左右。

由图12可知，HI-6对梭曼重度染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率仅能达到7％，HI-6-DMPS-LPs对梭曼重度染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率也仅能达到14％，未见统计学差异，表明HI-6-DMPS-LPs不具有中枢靶向性。

实施例9：装载HI-6的磷脂酰胆碱类(PC类)纳米药物的制备

本实施例所使用的目标药物为HI-6(1-[[(4-carbamoyl-pyridinio)methoxy]methyl]-2-(hydroxyimino-methyl)dichloride monohydrate)由军事医学研究院毒物药物研究所合成，纯度95％以上，DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、MPPC(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)、DMPC(1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine-3-sn-Phosphatidylcholine)和SOPC(1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)均由东京化成工业株式会社提供，纯度均为99％以上。

(1)分别精密称取147mg DPPC、141mg MPPC、136mg DMPC和158mg SOPC于100ml圆底烧瓶中，分别加入20ml氯仿振荡混匀，得到各药物载体的氯仿溶液，在室温下通过旋转蒸发仪蒸干氯仿，得到均匀的各磷脂薄膜；

(2)精密称取44mg HI-6，加入20ml PBS，得到2.2mg/ml的HI-6溶液；分别取20mlHI-6溶液加入步骤(1)所制的各磷脂薄膜中，HI-6和薄膜的比例为1:8ml/mg，在超声仪中超声1-2min，得到纳米药物混悬液；

(3)将步骤(2)得到的纳米药物混悬液分别在对应的药物载体相变温度下(DPPC41℃、MPPC35℃、DMPC23℃、SOPC6℃)通过聚碳酸酯膜孔径为100nm的脂质体挤出器进行往复挤压，往复挤压次数均为11次，得到粒径分布均匀的纳米药物。

实施例10：装载HI-6的磷脂酰胆碱类纳米药物对梭曼中度染毒小鼠AChE的重活化效果

(1)实验分组：昆明小鼠，雄性，按体重随机分为7组(每组15只)包括：正常组(不给药不染毒)、染毒组(只染毒不给药)、对照组(染毒并给药2.2mg/ml HI-6溶液)、纳米药物1组(染毒并给药实施例9制备的装载HI-6的DPPC纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)，纳米药物2组(染毒并给药实施例9制备的装载HI-6的MPPC纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)，纳米药物3组(染毒并给药实施例9制备的装载HI-6的DMPC纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)，纳米药物4组(染毒并给药实施例9制备的装载HI-6的SOPC纳米药物，所装载HI-6的含量为2.2mg/ml)。

(2)实验方法：

①给药。以100μg/kg剂量对染毒组、对照组和纳米药物1-4组小鼠皮下注射梭曼，随后立即向对照组和纳米药物1-4组小鼠尾静脉注射相应药物，每只小鼠按10μl/g剂量给药；

③酶活性测定。具体方法同实施例5；

(3)实验结果：

图13为HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全血AChE的重活化率；

图14为HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全脑AChE的重活化率。

由图13可知，HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全血的乙酰胆碱酯酶重活化率未见统计学差异。

由图14可知，HI-6和各组纳米药物对梭曼中度染毒小鼠全脑的乙酰胆碱酯酶重活化率也未见统计学差异，表明上述纳米药物不具有中枢靶向性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种纳米药物，其以球状的磷脂酰丝氨酸类材料为载体，所述载体内含有乙酰胆碱酯酶重活化剂。

2.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，磷脂酰丝氨酸类材料选自1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸和二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸。

3.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，磷脂酰丝氨酸类材料为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。

4.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂为双季胺单肟类重活化剂。

5.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂选自酰胺磷定、氯解磷定和双复磷。

6.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂为酰胺磷定。

7.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，所述纳米药物的平均粒径为80～200nm。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米药物，其载药率为12％～23％。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米药物，其药物包封率为70％～85％。

10.一种制备纳米药物的方法，包括如下步骤：

(2)将乙酰胆碱酯酶重活化剂的溶液与膜以1:(3～16)ml/mg的比例混合，得到混合物；

(3)在不低于磷脂酰丝氨酸类材料相变温度的温度下，将所述混合物通过脂质体挤出器往复挤压5～40次，得到纳米药物；其中，所述脂质体挤出器中聚碳酸酯膜的孔径为80～200nm。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤(2)中，在超声条件下混合。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于如下A至J中的一项或多项：

A.步骤(1)中，所述磷脂酰丝氨酸类材料选自1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸和二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸；

B.步骤(1)中，所述有机溶剂选自氯仿、丙酮和乙醇中至少一种；

C.步骤(1)中，所述溶液中磷脂酰丝氨酸类材料和有机溶剂的比例为0.01～18mg/ml；

D.步骤(1)中，旋转蒸发的温度为室温；

E.步骤(2)中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂选自氯解磷定、双复磷和酰胺磷定；

F.步骤(2)中，所述溶液的溶剂为PBS和/或灭菌生理盐水；

G.步骤(2)中，所述溶液的浓度为1～5mg/ml；

H.步骤(2)中，混合的时间为0.5～20分钟；

I.步骤(3)中，磷脂酰丝氨酸类材料相变温度为0℃～60℃；

J.纳米药物为权利要求1至9中任一项所述的纳米药物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，第A项中，步骤(1)中，所述磷脂酰丝氨酸类材料为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，第E项中，步骤(2)中，所述乙酰胆碱酯酶重活化剂为酰胺磷定。

15.权利要求1至9中任一项所述纳米药物在制备治疗中枢神经***有机磷化合物中毒的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述有机磷化合物选自梭曼、沙林和诺维乔克。

17.根据权利要求15所述的用途，其中，所述有机磷化合物为梭曼。