CN112135913A - 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过使用等温核酸扩增对生物组织进行三维核酸成像诊断的方法。根据本发明的用于生物组织的三维核酸成像诊断的方法允许通过使所述组织透明化而在组织中准确地观察特定的分子生物标志物，可以三维方式重构所述组织，可视化生物组织整体内部，从而提高了诊断的准确性，并且可以通过等温核酸扩增步骤在生物组织中容易地对保留人类遗传信息的分子生物标志物(例如DNA或RNA)进行三维成像，从而获得有效地用于诊断包括癌症在内的各种疾病的应用。

Description

使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法

技术领域

本发明涉及通过使用等温核酸扩增对组织进行三维核酸成像诊断的方法。

背景技术

在用于疾病诊断的测试方法中，使用蛋白质的免疫化学或成像诊断难以诊断少量的生物标志物，因为对抗体的特异性反应较低，并且不能扩增生物标志物。

因此，为了克服上述问题，为了诊断包括癌症在内的各种疾病，正在广泛地进行利用在人体中携带遗传信息的DNA和RNA检测疾病的分子生物标志物的研究。DNA和RNA生物标志物通过诸如PCR、微芯片和NGS之类的方法用于各种疾病的诊断，在这种情况下，聚合酶链反应(PCR)是检测和分析少量核酸的核酸扩增技术中使用最广泛的技术，其是通过重复以下步骤来实施：在高温下将双链DNA变性为单链DNA，在较低温度下将引物与所述单链结合，以及使用Taq聚合酶(热稳定酶)将其延伸为双链DNA。然而，DNA和RNA生物标志物的缺点在于，在组织中表达的细胞及其位置是未知的。

为了解决该问题，可以通过诸如FISH之类的杂交方法来获知组织中DNA和RNA生物标志物的存在和位置，但是该方法难以诊断，因为该方法不能扩增DNA或RNA，并且由于组织渗透性低而观察受限。

同时，环介导的等温扩增(LAMP)是Notomi等人在2000年发明的检测方法，它与常规PCR相似，但不需要进行PCR或实时PCR中DNA变性、引物退火和聚合酶延伸所需的温度变化，并且可以在接近60℃的温度下扩增。

LAMP的最大特征是基因的等温扩增，并且由于不需要温度控制，与需要温度梯度的PCR相比，LAMP的反应时间相对较短。因此，该方法使得能够在较短时间内扩增基因，并且通过使用LAMP，先前报道了在一小时之内(不包括电泳时间)可以扩增基因。另外，由于没有温度变化引起的DNA损失和损伤，因此扩增效率非常高，并且在等温条件下的扩增表明LAMP与其他检测方法相比具有实用性。由于LAMP仅需要保持恒定的温度，因此它不需要昂贵的设备，并且仅通过简单的设备例如水浴即可促进反应。因此，根据LAMP，即使不在实验室环境中，在实践中也可以检测特定基因。

但是，对使用等温扩增法的诊断方法的相关研究还不够。

发明内容

[技术问题]

作为认真尝试解决使用生物标志物的诊断方法的上述问题的结果，发明了一种用于组织的三维核酸成像诊断的方法，该方法可以通过光透射使组织透明化(clearing)以清楚地看到组织中的特定分子生物标志物，并在组织中利用等温扩增法促进了生物标志物的三维成像来提高诊断准确性，从而完成了本发明。

[技术方案]

为了实现上述目的，提供了一种用于组织的三维核酸成像诊断的方法，该方法包括：(a)使组织样品透明化；

(b)通过将酶反应混合溶液和引物添加到步骤(a)中获得的透明化的组织样品中，等温扩增待检测的生物标志物；和

(c)检测在步骤(b)中扩增的生物标志物。

在本发明的一实施方式中，步骤(b)中使用的引物可以是待扩增的生物标志物的引物。

在本发明的另一实施方式中，引物可以包含探针。

在本发明的又一实施方式中，组织可以是脑，肝，肺，肾，肠，心脏，肌肉或血管。

在本发明的又一实施方式中，步骤(a)中的透明化方法可以包括：(i)通过将组织样品添加到固定溶液中来固定组织样品；

(ii)使固定的样品在组织透明化溶液中反应；和

(iii)将在组织透明化溶液中反应的样品添加到洗涤溶液中，以洗涤附着在样品上的有机材料。

在本发明的另一实施方式中，固定溶液可包含蔗糖。

在本发明的又一实施方式中，蔗糖的浓度可以为20％至100％(w/v)。

在本发明的又一实施方式中，组织透明化溶液可包含一种或多种选自由3-[((3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)，尿素和氯化钠(NaCl)组成的组。

在本发明的另一实施方式中，NaCl的浓度可以为0.001％至1.0％(w/v)。

在本发明的另一实施方式中，洗涤溶液可以包含磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)和叠氮化钠。

在本发明的另一实施方式中，叠氮化钠的浓度可以为0.001％至0.5％(w/v)。

在本发明的另一实施方式中，生物标志物可以是分子生物标志物。

在本发明的另一实施方式中，分子生物标志物可以是DNA或RNA。

[有益效果]

根据本发明的使用等温核酸扩增的用于组织的三维核酸成像诊断的方法可以允许通过使组织透明化而在组织中清楚地看到特定的分子生物标志物，通过三维重构组织，由于所述组织的整体内部可视化，从而提高诊断准确性，并且通过在组织中的等温核酸扩增促进了对分子生物标志物(例如人体中包含遗传信息的DNA或RNA)的三维成像，因此有望有效地用于诊断包括癌症的各种疾病。

附图简要说明

图1是显示根据本发明的一实施方式的小鼠脑组织中的Thy-1mRNA的等温核酸扩增的结果的图。

图2是显示根据本发明的一实施方式的小鼠脑组织中GAD-67mRNA的等温核酸扩增的结果的图。

具体实施方案

[发明的方式]

由于本发明可以具有各种修改和实施方式，因此下面将更详细地描述本发明的特定实施方式。然而，本发明不限于特定实施方式，并且应当理解，本发明包括涵盖在本发明的技术思想和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。在本发明的描述中，当确定相关技术的详细描述可能使本发明的主旨不清楚时，将省略其详细描述。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明提供了用于组织的三维核酸成像诊断的方法，其包括：(a)使组织样品透明化；

(b)通过将酶反应混合溶液和引物添加到步骤(a)中获得的透明化的组织样品中，等温扩增待检测的生物标志物；和

(c)检测在步骤(b)中扩增的生物标志物。

步骤(b)中使用的引物可以是待扩增的生物标志物的引物，并包含探针。

步骤(a)中的组织可以是脑，肝，肺，肾，肠，心脏，肌肉或血管，但是本发明不限于此。

另外，步骤(a)中的透明化方法可以包括：(i)通过将组织样品添加到固定溶液中来固定组织样品；

(ii)使固定的样品在组织透明化溶液中反应；和

(iii)将在组织透明化溶液中反应的样品添加到洗涤溶液中，以洗涤附着在样品上的有机材料。

固定溶液可包含蔗糖，并且在此，蔗糖的浓度可为20至100％(w/v)。根据本发明的一实施方式，蔗糖浓度可以为20至80％(w/v)，20至60％(w/v)，20至40％(w/v)，20至30％(w)/v)，60至100％(w/v)，或80至100％(w/v)，但是当蔗糖浓度为20％(w/v)或更高时，蔗糖浓度不限于此。

该组织透明化溶液可包含选自由3-[((3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、尿素和氯化钠(NaCl)组成的组中的一种或多种，并且在此，NaCl的浓度可以为0.001至1.0％(w/v)，并且根据本发明的一实施方式，NaCl浓度可以为0.01至0.7％(w/v)，0.01至0.5％(w/v)，0.1至0.7％(w/v)，0.1至0.5％(w/v)，0.1至0.3％(w/v)，或0.3至0.5％(w/v)，但是NaCl浓度不限于此。

洗涤溶液可包含磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)和叠氮化钠。在此，叠氮化钠的浓度可以为0.001至0.5％(w/v)，并且根据本发明的一实施方式，叠氮化钠的浓度可以为0.01至0.4％(w/v)，0.01至0.3％(w/v)，0.01至0.2％(w/v)，或0.1％(w/v)，但是叠氮化钠浓度不限于此。

步骤(b)中的“生物标志物”是来源于DNA，RNA，代谢产物，蛋白质或蛋白质片段的分子信息，以及是可以检测由疾病发作引起的人体变化的指示剂。生物标志物与疾病的发作和进展相关，因此被广泛用于开发新药，和开发用于体外早期检测疾病并观察其预后的体外分子诊断技术，用于识别对特定药物有反应的生物标志物的个性化特征的个性化医疗技术，以及建立患者友好型治疗环境的普遍医疗保健***。由于生物标志物根据疾病的类型及其发作和进展而在活有机体中出现的不同，因此生物标志物是用作血液或体液中指示剂的材料，可以客观地检测特定的疾病或药物反应状态，并起到通过仅分析血液或体液来及早确定疾病。

在本发明中，生物标志物可以是分子生物标志物，特别是DNA或RNA，但是本发明不限于此。

在本发明的一实施方式中，在透明化组织样品后(参见实施例1)，使用等温核酸扩增来确认组织的三维核酸图像(参见实施例2)。

实施例

在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。

实施例1.使组织样品透明化

从小鼠中取出大脑，切成3毫米的碎片，然后将碎片化的大脑样品添加到固定溶液(fixing solution)中，并在4℃下反应12小时。

之后，样品在组织透明化溶液中于37℃反应6小时。

在组织透明化溶液中反应的样品被添加到洗涤溶液中，并在室温下反应6小时以进行透明化。

下表1中显示了用于使组织样品透明化的溶液的成分。

[表格1]

	成分
		固定溶液	蔗糖(20％(w/v)或更高)
组织透明化溶液	CHAPS(20％(w/v)),尿素(50％(w/v)),NaCl(0.1至0.5％(w/v))
		洗涤溶液	PBS,叠氮化钠(0.1％(w/v))

实施例2.使用等温核酸扩增确认组织的三维核酸图像

2-1.小鼠脑中Thy-1mRNA等温核酸扩增结果的确认

将含有Bst DNA聚合酶和逆转录酶的酶反应混合溶液添加到实施例1中透明化的小鼠脑样品中，并在4℃下摇动24小时，以确定在组织中是否可以进行等温扩增，作为神经元、胸腺细胞、T细胞和干细胞的标志物，在小鼠脑组织中高度表达的胸腺细胞分化抗原1(Thy-1)mRNA等温扩增。

具体而言，将Thy1引物(包括探针)添加到小鼠脑样品中，并在4℃下摇动12小时，然后在室温下用2x缓冲液洗涤6小时。下表2中显示了本文使用的Thy1引物(包括探针)。

洗涤后，在诸如2x含脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的缓冲液之类的反应缓冲液中，样品在4℃下反应1小时，然后在58℃下孵育5至20分钟。

孵育后，将样品在室温下在洗涤溶液中反应6小时，然后在37℃在封固溶液(mounting solution)中反应6小时，然后使用光片照明显微镜(light sheet microscopy)检测Thy-1mRNA。

下表3中显示了用于Thy-1mRNA的等温核酸扩增的溶液的成分。

结果，如图1所示，通过对Thy-1mRNA进行等温核酸扩增，可以确认绿色荧光清楚地显示了Thy-1mRNA在小鼠脑中的位置。

[表2]

[表3]

2-2.小鼠脑中GAD-67mRNA的等温核酸扩增结果的确认

通过与实施例2-1中描述的方法相同的方法，等温扩增小鼠脑样品的谷氨酸脱羧酶67(GAD-67)mRNA。下表4中显示了本文使用的GAD67引物(包括探针)。

结果，如图2所示，通过等温核酸扩增GAD-67mRNA，可以确认GAD-67mRNA在小鼠脑中的位置清楚地显示为红色。

[表4]

从以上实施例的结果，通过使用根据本发明的用于三维核酸成像诊断的方法，证实了通过使组织透明化和等温扩增来确认生物标志物在组织中的位置，可以进行准确诊断。

本领域普通技术人员应该理解，本发明的以上描述是示例性的，并且在不改变本发明的技术精神或必要特征的情况下，可以容易地将本文公开的示例实施方式修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述示例实施方式在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。

[工业实用性]

期望通过在组织中等温核酸扩增来促进分子生物标志物(例如人体中包含遗传信息的DNA或RNA)的三维成像，根据本发明的使用等温核酸扩增的用于组织的三维核酸成像诊断的方法被有效地用于诊断包括癌症的各种疾病。

<110> 株式会社百义纳理

<120> 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法

<130> MPO20-088CN

<150> KR 10-2018-0057465

<151> 2018-05-18

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<170> KoPatentIn 3.0

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-A F3引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-B B3引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-C FIP引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-D BIP引物

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<212> DNA

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<223> Thy1-E LF引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-F LB引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy1-HEX 荧光引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Thy-1-BHQ1 淬灭剂引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> gad67-A F3引物

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<223> gad67-B B3引物

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> gad67-D BIP引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> gad67-E LF引物

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<223> gad67-F LB引物

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<223> gad67-Cy5 荧光引物

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<213> 人工序列

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<223> gad67-BHQ3 淬灭剂引物

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Claims (13)

1.一种用于组织的三维核酸成像诊断的方法，其包括：

(a)使组织样品透明化；

(b)通过将酶反应混合溶液和引物添加到步骤(a)中获得的透明化的组织样品中，等温扩增待检测的生物标志物；和

(c)检测在步骤(b)中扩增的所述生物标志物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中使用的所述引物是待扩增的生物标志物的引物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述引物包括探针。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织是脑，肝，肺，肾，肠，心脏，肌肉或血管。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中的透明化方法包括：

(i)通过将组织样品添加到固定溶液中来固定组织样品；

(ii)使所述固定的样品在组织透明化溶液中反应；和

(iii)将在所述组织透明化溶液中反应的所述样品添加到洗涤溶液中，以洗涤附着在所述样品上的有机材料。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述固定溶液包括蔗糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蔗糖的浓度为20％至100％(w/v)。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述组织透明化溶液包含选自由以下组成的组中的一种或多种：3-[((3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)，尿素和氯化钠(NaCl)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述氯化钠(NaCl)的浓度为0.001％至1.0％(w/v)。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述洗涤溶液包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)和叠氮化钠。

11.权利要求10所述的方法，其中所述叠氮化钠的浓度为0.001％至0.5％(w/v)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物标志物是分子生物标志物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述分子生物标志物是DNA或RNA。

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