CN112135838A - 分解性聚乙二醇键合物 - Google Patents

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西山伸宏
松井诚
武元宏泰
宫内和辉
野本贵大
友田敬士郎
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Tokyo Institute of Technology NUC
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Abstract

本申请提供一种键合有不会引起细胞的空泡的高分子量聚乙二醇衍生物的生物相关物质。其为键合有下式(A)：
Figure DDA0002707611730000011
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团，y为1～40。)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质。

Description

分解性聚乙二醇键合物
技术领域
本发明为涉及键合有在细胞内进行分解的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质的发明。
背景技术
使用激素、细胞因子、抗体、酶等生物相关物质的药品，通常在给药至生物体内时，由于肾脏中的肾小球过滤、肝脏或脾脏等中的巨噬细胞的摄取，迅速从生物体内被排出。因此，多存在血液半衰期短、难以获得充分的药理效果的情况。为解决该问题，已经进行了通过糖链、聚乙二醇等亲水性高分子或白蛋白等对生物相关物质化学修饰的尝试。其结果是可以通过分子量的增大、水合层的形成等而延长生物相关物质的血液半衰期。此外，通过以聚乙二醇进行修饰，可获得生物相关物质的毒性或抗原性的降低、水难溶性药剂的溶解性提高等效果也广为人知。
聚乙二醇所修饰的生物相关物质由于被由聚乙二醇的醚键与水分子的氢键所形成的水合层覆盖，分子尺寸增大，可避免肾脏中的肾小球过滤。进一步地已知有，其与调理素、构成各组织的细胞表面之间的相互作用降低，向各组织中的迁移减少。已知聚乙二醇是能够延长生物相关物质的血液半衰期的优异材料，其性能是分子量越大则效果越高。迄今为止，较多地进行了以分子量4万以上的高分子量的聚乙二醇进行修饰的生物相关物质的研究，获得了能够显著地延长该血液半衰期的结果。
聚乙二醇被作为用于生物相关物质的性能改善的修饰剂中的最佳标准，现在已经有多个聚乙二醇修饰制剂进入市场，并用于医疗现场。另一方面，2012年欧洲药品管理局(EMA)报道了，在长时间用规定的给药量以上对动物给药以分子量4万以上的高分子量的聚乙二醇修饰的生物相关物质时，一部分的组织的细胞内将产生空泡的现象(非专利文献1)。当前，考虑到尚无空泡的产生本身对人体带来不良影响的报道，此外，上述EMA的报道中所使用的给药量，相比医疗现场中通常所适用的给药量为极高的用量等，可以说目前制造销售的以分子量4万以上的聚乙二醇所修饰的治疗制剂的安全性没有问题。然而，也能够设想到在非常特殊的疾病(例如侏儒症等)的治疗中，需要采用高用量且长时间向患者给药聚乙二醇修饰制剂的治疗方案。因此，预计开发在上述特殊状况中也能够适用的、在细胞中不产生空泡的聚乙二醇修饰制剂方面存在潜在需求。
非专利文献2中，在将相比于通常的聚乙二醇修饰制剂的给药量大幅过量的聚乙二醇，长时间单独向动物给药时，在分子量2万时未发现空泡，而在分子量4万时确认到空泡的产生。作为抑制空泡的一个手段，想到降低聚乙二醇的分子量，但产生若降低分子量则不能充分改善生物相关物质的血液半衰期这一问题。
关于促进高分子量的聚乙二醇在体内分解为低分子量的聚乙二醇，从肾脏排出的技术，有报道例子。
专利文献1中记载了具有在生物体内被切断的硫醚键或肽键部位的聚乙二醇衍生物。记载了该聚乙二醇衍生物在生物体内被分解至适于从肾脏排出的分子量。然而，完全没有显示出有关具体分解的数据，也没有自肾脏的排出得到促进这样的数据。进一步地，没有关于细胞的空泡的记载。
专利文献2中记载了具有在生物体内的低pH环境下能够水解的缩醛部位的聚乙二醇衍生物。记载了该聚乙二醇衍生物在生物体内被分解至适于从肾脏排出的分子量。然而，没有具体地促进从肾脏的排出的数据，进一步也没有有关细胞的空泡的记载。此外，已知这些能够水解的缩醛部位在血液中也可缓慢分解，预计不能充分改善修饰后的生物相关物质的血液半衰期。
另一方面，存在为有效地释放药物而导入有分解性寡肽的聚乙二醇衍生物或在体内进行分解的水凝胶等的报道例子。
非专利文献3记载了具有通过酶而进行分解的寡肽部位的聚乙二醇衍生物。其中报道了，寡肽作为抗癌剂与聚乙二醇间的接头(linker)被导入，通过在肿瘤周围特异性表达的酶，寡肽分解，可高效地释放抗癌剂。其目的在于抗癌剂的释放，并非出于抑制细胞空泡的目的而向聚乙二醇赋予分解性。
非专利文献4记载了使用具有通过酶进行分解的寡肽部位的交联分子和多分支型聚乙二醇衍生物的水凝胶。其中，寡肽作为连结多分支型聚乙二醇衍生物的交联分子被使用，进一步地可以赋予水凝胶以经由酶的分解性。其目的在制备分解性的水凝胶，并非出于抑制细胞空泡的目的而向聚乙二醇赋予分解性。
专利文献3中记载了以寡肽作为骨架的分支型的聚乙二醇衍生物。其中寡肽被用作为聚乙二醇衍生物的基本骨架，而非赋予经由酶的分解性。此外，其特征在于寡肽中包含赖氨酸、天冬氨酸等在侧链具有氨基、羧基的氨基酸，其目的在于合成将这些氨基酸利用于反应的分支型的聚乙二醇衍生物。并不是以抑制细胞的空泡为目的的聚乙二醇衍生物。
如上所述地，需要一种高分子量的聚乙二醇衍生物，其在血液中稳定，可充分改善修饰的生物相关物质的血液半衰期，在被摄取至细胞中时可在细胞内特异性分解，抑制细胞的空泡的产生。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-527581号公报
专利文献2：WO2005/108463
专利文献3：WO2006/088248
非专利文献
非专利文献1：EMA/CHMP/SWP/647258/2012
非专利文献2：Daniel G.Rudmann,et al.,Toxicol.Pathol.,41,970-983(2013)
非专利文献3：Francesco M Veronese,et al.,Bioconjugate Chem.,16,775-784(2005)
非专利文献4：Jiyuan Yang,et al.,Marcomol.Biosci.,10(4),445-454(2010)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种不会引发细胞的空泡的、键合有高分子量的聚乙二醇衍生物的生物相关物质。更具体地是提供一种生物相关物质，其在生物体内的血液中稳定，并且被在细胞内分解的分解性聚乙二醇衍生物修饰，充分地改善血液半衰期。
用于解决课题的手段
本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发明了键合有具有在细胞内分解的寡肽的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
即，本发明为如下所示。
[1]一种生物相关物质，其键合有下式(A)所示的分解性聚乙二醇衍生物：
【化1】
Figure BDA0002707611710000041
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团(spacer)，y为1～40。)。
[2]根据[1]所述的生物相关物质，其为键合有下式(1)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化2】
Figure BDA0002707611710000042
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[3]根据[1]或[2]所述的生物相关物质，Q为乙二醇、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基。
[4]根据[1]或[2]所述的生物相关物质，Q为寡肽的残基，该寡肽为包含赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的任意一种、并且这些以外的氨基酸由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的4～8残基的寡肽。
[5]根据[4]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[6]根据[4]或[5]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[7]根据[1]～[6]中的任一项所述的生物相关物质，Z的寡肽为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[8]根据[1]～[7]中的任一项所述的生物相关物质，Z的寡肽为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[9]根据[1]～[8]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[10]根据[1]～[9]中的任一项所述的生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[11]根据[1]～[10]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[12]根据[1]～[11]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
[13]根据[2]所述的生物相关物质，其为键合有式(1)中的Z由Z1、A和甘氨酸残基构成的、下式(2)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化3】
Figure BDA0002707611710000061
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[14]根据[13]所述的生物相关物质，Q为乙二醇、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基。
[15]根据[13]所述的生物相关物质，Q为寡肽的残基，该寡肽为包含赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的任意一种、且这些以外的氨基酸由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的4～8残基的寡肽。
[16]根据[15]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[17]根据[15]或[16]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[18]根据[13]～[17]中的任一项所述的生物相关物质，Z1的寡肽为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[19]根据[13]～[18]中的任一项所述的生物相关物质，A的中性氨基酸是亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸。
[20]根据[13]～[19]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[21]根据[13]～[20]中的任一项所述的生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[22]根据[13]～[21]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[23]根据[13]～[22]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
[24]根据[13]所述的生物相关物质，其为键合有式(2)中的m为1的、下式(3)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化4】
Figure BDA0002707611710000071
(式中，n3和n4分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[25]根据[24]所述的生物相关物质，Q为乙二醇、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基。
[26]根据[24]所述的生物相关物质，Q为寡肽的残基，该寡肽为包含赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的任意一种、且这些以外的氨基酸由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的4～8残基的寡肽。
[27]根据[26]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[28]根据[26]或[27]所述的生物相关物质，Q的寡肽为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[29]根据[24]～[28]中的任一项所述的生物相关物质，Z1的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[30]根据[24]～[29]中的任一项所述的生物相关物质，A的中性氨基酸是亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸。
[31]根据[24]～[30]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[32]根据[24]～[31]中的任一项所述的生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[33]根据[24]～[32]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[34]根据[24]～[33]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
[35]根据[2]所述的生物相关物质，其为键合有式(1)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(4)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化5】
Figure BDA0002707611710000081
(式中，m为1～7，n5和n6分别独立地为113～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[36]根据[35]所述的生物相关物质，Z的寡肽为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[37]根据[35]或[36]所述的生物相关物质，Z的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[38]根据[35]～[37]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[39]根据[35]～[38]中的任一项所述的生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[40]根据[35]～[39]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[41]根据[35]～[40]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
[42]根据[13]所述的生物相关物质，其为键合有式(2)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(5)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化6】
Figure BDA0002707611710000091
(式中，m为1～7，n5和n6分别独立地为113～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[43]根据[42]所述的生物相关物质，Z1的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[44]根据[42]或[43]所述的生物相关物质，A的中性氨基酸是亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸。
[45]根据[42]～[44]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[46]根据[42]～[45]中的任一项所述的生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[47]根据[42]～[46]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[48]根据[42]～[47]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
[49]根据[24]所述的生物相关物质，其为式(3)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(6)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化7】
Figure BDA0002707611710000092
(式中，n7和n8分别独立地为226～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。)。
[50]根据[49]所述的生物相关物质，Z1的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[51]根据[49]或[50]所述的生物相关物质，A的中性氨基酸是亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸。
[52]根据[49]～[51]中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
[53]根据[49]～[51]中的任一项所述的生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
[54]根据[49]～[52]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
[55]根据[49]～[54]中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、***或抗体片段。
发明效果
本发明的键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质，由于该分解性聚乙二醇衍生物在生物体内的血液中稳定，在聚乙二醇链之间具有经由细胞内的酶分解的寡肽，因而在血液中稳定，可以对生物相关物质赋予与现有的不具有分解性的聚乙二醇衍生物等同的血液半衰期，因此其被摄取至细胞内时，聚乙二醇链之间的寡肽部位被迅速分解，因而可以抑制细胞空泡的产生这一悬而未决的课题。
附图说明
【图1】显示实施例1的ME-200GLFG(L)-200PA的GPC分析结果。
【图2】显示实施例15的使用细胞的分解性试验中从细胞内回收的ME-200GLFG(L)-200PA的GPC分析结果。
【图3】显示实施例16的鲑降钙素与ME-200GLFG(L)-200AL的键合物(conjugate)、鲑降钙素与甲氧基PEG(聚乙二醇)醛40kDa的键合物的RPLC分析结果。
【图4】显示实施例2中所得的ME-200GLFG(L)-200AL和实施例16中所得的ME-200GLFG(L)-200-sCT的MALDI-TOF-MS的分析结果。
【图5】显示甲氧基PEG醛40kDa和实施例16中所得的甲氧基PEG40kDa-sCT的MALDI-TOF-MS的分析结果。
【图6】显示实施例16的鲑降钙素与ME-200GLFG(L)-200AL的键合物、鲑降钙素与甲氧基PEG醛40kDa的键合物的SDS-PAGE的分析结果(左图：CBB染色、右图：碘染色)。
【图7】显示实施例17的人生长激素与ME-200GLFG(L)-200AL的键合物的MALDI-TOF-MS的分析结果。
【图8】显示实施例17的人生长激素与甲氧基PEG醛40kDa的键合物的MALDI-TOF-MS的分析结果。
【图9】显示实施例17的人生长激素与ME-200GLFG(L)-200AL的键合物、人生长激素与甲氧基PEG醛40kDa的键合物的SDS-PAGE的分析结果(左图：CBB染色、右图：碘染色)。
【图10】显示实施例19的鲑降钙素、PEG化鲑降钙素的生理活性(血液中钙浓度)的评价结果。
【图11】显示实施例20的放射性同位素标记的鲑降钙素、放射性同位素标记的ME-200GLFG(L)-200-sCT、放射性同位素标记的甲氧基PEG40kDa-sCT的体内动力学(血液中浓度)的评价结果。
【图12】显示实施例20的放射性同位素标记的鲑降钙素、放射性同位素标记的ME-200GLFG(L)-200-sCT、放射性同位素标记的甲氧基PEG40kDa-sCT在肝脏中的滞留量。
【图13】显示实施例20的放射性同位素标记的鲑降钙素、放射性同位素标记的ME-200GLFG(L)-200-sCT、放射性同位素标记的甲氧基PEG40kDa-sCT在肾脏中的滞留量。
【图14】显示实施例20的放射性同位素标记的鲑降钙素、放射性同位素标记的ME-200GLFG(L)-200-sCT、放射性同位素标记的甲氧基PEG40kDa-sCT在脾脏中的滞留量。
【图15】显示实施例20的放射性同位素标记的鲑降钙素、放射性同位素标记的ME-200GLFG(L)-200-sCT、放射性同位素标记的甲氧基PEG40kDa-sCT在肺中的滞留量。
【图16】显示实施例21的长期给药甲氧基PEG胺40kDa的小鼠的脑脉络丛的切片的图像(箭头标示空泡)。
【图17】显示实施例21的长期给药ME-200GLFG(L)-200PA的小鼠的脑脉络丛的切片的图像。
【图18】显示实施例22的长期给药PBS、甲氧基PEG胺40kDa、甲氧基PEG胺20kDa、ME-200GLFG(L)-200PA的小鼠的脑脉络丛的切片的图像(染成褐色的部分显示PEG的蓄积)。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明所涉及的键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质如下式(A)所示。
【化8】
Figure BDA0002707611710000121
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团，y为1～40。)
本发明中，与生物相关物质键合的分解性聚乙二醇衍生物的分子数由式(A)中的y表示，通常为1～40，优选为1～20，更优选为1～10，特别优选为1。
作为通过增加与生物相关物质键合的分解性聚乙二醇衍生物的分子数而获得的效果，可举出血液半衰期的延长、抗原性的降低等，但依据生物相关物质不同存在活性降低的可能性。在酶等生物相关物质中，已知即使与多个聚乙二醇衍生物相键合，活性也不会降低。
下文中，对与生物相关物质键合的分解性聚乙二醇衍生物的分子数为1的情况、即式(A)中的y为1的情况进行说明。
本发明所涉及的键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质如下式(1)所示。
【化9】
Figure BDA0002707611710000131
(式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为键合或2价间隔基团。)
本发明的式(1)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为4,000～160,000，优选为10,000～120,000，进一步优选为30,000～80,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(1)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。这里所谓的分子量是指数均分子量(Mn)。
式(1)中的n1和n2分别为聚乙二醇的重复单元数，通常分别独立地为45～682，优选分别独立地为113～568，进一步优选分别独立地为180～525。n1和n2可以不同，此外也可相同。
式(1)中的p为1～4。p为1时，式(1)中的聚乙二醇衍生物部分为直链型，p为2～4时，式(1)中的聚乙二醇衍生物部分为分支型。
式(1)中的R为碳原子数1～4的烷基，作为具体的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，优选为碳原子数1～3的烷基，更优选为甲基或乙基，进一步优选为甲基。
式(1)中的Z若是在生物体内的血液中稳定、且经细胞内的酶进行分解的寡肽，则没有特别的限制，但优选由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，更优选由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，进一步优选由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽。
此外，式(1)中的Z优选为由不包含在侧链上具有氨基或羧基的氨基酸、具体地不含赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的中性氨基酸构成的寡肽。本发明的式(1)中的聚乙二醇衍生物部分的合成中，向聚乙二醇衍生物导入寡肽时，利用于寡肽的N末端的氨基或C末端的羧基与聚乙二醇衍生物的反应。然而，若寡肽中包含在侧链上具有氨基或羧基的氨基酸，则产生聚乙二醇衍生物不仅被导入至作为目标的N末端的氨基或C末端的羧基、而且也被导入至侧链的氨基或羧基的杂质。由于该杂质难以通过通常的萃取、析晶等提纯工序去除，因而为获得纯度良好的目标物，理想的是使用由侧链上不具有氨基或羧基的氨基酸构成的寡肽。此处所使用的氨基酸为α-氨基酸，此外基本上为L型。
进一步地，由于作为中性氨基酸的半胱氨酸具有硫醇基，与其他硫醇基形成双硫键，因而理想的是式(1)中的Z为由不含半胱氨酸的中性氨基酸构成的寡肽。
进一步地，式(1)中的Z优选为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。使C末端的羧基与聚乙二醇衍生物进行反应时，基本上需要用缩合剂等使C末端的羧基活性化。已知的是在该活性化的工序中，甘氨酸以外的氨基酸易于发生差向异构化，生成副产物立体异构体。通过使寡肽的C末端的氨基酸为非手性的甘氨酸，可以得到没有立体异构体的副产物生成的高纯度的目标物。
进一步地，式(1)中的Z优选为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸具体地苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的寡肽，更优选为具有苯丙氨酸的寡肽。由凯特(Kyte)和杜利特尔(Doolittle)所完成的定量表示氨基酸的疏水性的亲水指数(hydropathy index)，其值越大，表示越为疏水性氨基酸(Kyte J&Doolittle RF,1982,JMol Biol,157:105-132.)。
式(1)中的Z若为在生物体内的血液中稳定、且具有经细胞内的酶进行分解的性能、由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8残基的寡肽，则没有特别限制，作为具体例子，为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸等，优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸，更优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸，进一步优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸。
式(1)中的Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基。作为活性氢，可举出羟基、羧基、氨基等氢(其中，本发明中，在伯氨基(-NH2)的情况时，活性氢按照1个计算。)。作为“具有2个活性氢的化合物的残基”，可举出乙二醇等的残基，作为具有3个活性氢的化合物的残基”，可举出寡肽、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油等的残基，作为“具有4个活性氢的化合物的残基”，可举出季戊四醇、双甘油等的残基，作为“具有5个活性氢的化合物的残基”，可举出木糖醇等的残基，优选为乙二醇、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基或者寡肽的残基，更优选为乙二醇、赖氨酸、谷氨酸、甘油、寡肽的残基，特别优选为乙二醇、赖氨酸的残基。
此外，作为Q的活性氢的个数的v与式(1)中的表示聚乙二醇衍生物部分的聚乙二醇链根数的p之间的关系，优选为v＝p+1，p＝1时v＝2，Q为乙二醇等的残基，p＝2时v＝3，Q为甘油、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的残基，p＝3时v＝4，Q为季戊四醇、双甘油等的残基，p＝4时v＝5，Q为木糖醇等的残基。
Q为寡肽的残基时，该寡肽若为在生物体内的血液中稳定、且具有经细胞内的酶进行分解的性能、包含赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的任意1种、且这些以外的氨基酸由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的4～8个残基的寡肽，则没有特别限制，作为具体的例子，为谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、谷氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、谷氨酸-甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、谷氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、谷氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸等，优选为谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、谷氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸，更优选为谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸。另外，该寡肽优选为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。该寡肽进一步优选为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。另外，关于该寡肽的详细说明，请参考上述Z的寡肽的说明。
式(1)中的L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团，这些间隔基团若为可形成共价键的基团则没有特别限制，但优选为单键、亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基，更优选为单键、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键、或这些键和基团与1～3个亚烷基键合而形成的基团，特别优选的方式为下述群组(I)所示的物质。酯键和碳酸酯键由于在生物体内的血液中缓慢分解因而并不合适。
群组(I)：
【化10】
Figure BDA0002707611710000171
式(式(z1)～式(z13))中，式中的s表示0～10的整数，优选表示0～6的整数，进一步优选表示0～3的整数。此外，式(z2)～式(z13)中，式中的2～3个s可相同，也可不同。
式(1)中的L1、L2、L3和L4分别独立地优选为上述群组(I)的(z1)、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z8)、(z11)，更优选为(z1)、(z2)、(z3)、、(z4)、(z5)、(z6)。
式(1)中的L5优选为上述群组(I)的(z1)、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z8)、(z9)、(z10)、(z12)、(z13)，更优选为(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z10)、(z12)、(z13)，特别优选为(z3)、(z5)、(z12)。
本发明的一个优选的实施方式中，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
本发明的其他优选的实施方式中，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基，或可包含这些键和基团的亚烷基(例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)，更优选的是，L1为单键、醚键或可包含醚键的亚烷基(例如单键、-O-、-(CH2)2-O-)，L2为羰基或可包含羰基的亚烷基(例如，-CO-、-(CH2)5-CO-)，L3为仲氨基(-NH-)，L4为可包含醚键的亚烷基(例如-(CH2)3-O-)，L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基(例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。
式(1)中的m为将聚乙二醇链与寡肽的键合物作为一个构成单元时的重复单元数，优选为1～7，更优选为1～5，进一步优选为1～3。
式(1)中的D为生物相关物质，没有特别限制，为与人或其他动物的疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防有关的物质。具体地包括蛋白质、肽、核酸、细胞、病毒等，作为适宜的蛋白质或肽，可举出激素、细胞因子、抗体、适配体、酶等。
更具体地，作为细胞因子，可举出调节免疫的干扰素I型、II型、III型，白细胞介素、肿瘤坏死因子、它们的受体拮抗剂等。作为生长因子，可举出作为造血生长因子的***、作为刺激因子的粒细胞集落刺激因子(GCSF)等，作为凝血因子，可举出第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XII因子等。作为激素，可举出降钙素、胰岛素、其类似物、激动肽、GLP-1，以及生长抑素、人生长激素等。作为抗体，作为其断片的抗体片段可举出Fab、svFV等，作为适配体，可举出DNA适配体、RNA适配体等，作为酶，可举出超氧化物歧化酶、尿酸酶等。理想的是这些蛋白质在血液中的稳定性低，以聚乙二醇进行修饰，延长血液半衰期。作为适宜的蛋白质，为干扰素、白细胞介素、***、GCSF、第VIII因子、第IX因子、降钙素、胰岛素、激动肽、人生长激素、抗体片段，更优选为胰岛素、降钙素、人生长激素、干扰素、GCSF、***、抗体片段(特别是Fab)，进一步优选为是降钙素(特别是鲑降钙素)、胰岛素、人生长激素、GCSF，特别优选为降钙素(特别是鲑降钙素)、人生长激素、GCSF。
下式(2)表示键合有适宜方式的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，该键合有适宜方式的聚乙二醇衍生物的生物相关物质是，在键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质中，寡肽Z为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽，即式(1)中的Z由Z1、A和甘氨酸残基构成。
【化11】
Figure BDA0002707611710000191
(式中，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，m、n1和n2、p、R、Q、D、L1、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
本发明的式(2)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为4,000～160,000，优选为10,000～120,000，进一步优选为30,000～80,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(2)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。此处所谓分子量是指数均分子量(Mn)。
式(2)中的Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，优选为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽，更优选为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽，此外，优选为具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸具体地为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的寡肽，更优选为具有苯丙氨酸的寡肽。
式(2)中的Z1为在生物体内的血液中稳定、且经由细胞内的酶进行分解的寡肽，作为具体的例子，为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸，优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸，更优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸，进一步更优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、缬氨酸-瓜氨酸。
式(2)中的A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，优选为亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸，具体为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸，更优选为苯丙氨酸、亮氨酸。
另外，m、n1和n2、R、Q、D、L1、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)的说明所述。
此外，下式(3)表示键合有适宜方式的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，即在键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质中，m＝1。
【化12】
Figure BDA0002707611710000201
(式中，n3和n4分别独立地为45～682，p、R、Z1、A、a、b、Q、D、L1、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
本发明的式(3)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为4,000～160,000，优选为10,000～120,000，进一步优选为30,000～80,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(3)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。此处所谓分子量是指数均分子量(Mn)。
式(3)中的n3和n4分别为聚乙二醇的重复单元数，通常分别独立地为45～682，优选分别独立地为113～568。
另外，R、Z1、A、Q、D、L1、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)和(2)的说明所述。
[键合有式(1)的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质]
下式(4)表示键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质，该键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质是，在键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质中，Q为乙二醇的残基，L1为CH2CH2O，且p为1。
【化13】
Figure BDA0002707611710000211
(式中，n5和n6分别独立地为113～682，m、R、Z、D、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
本发明的式(4)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为20,000～120,000，优选为25,000～80,000，进一步优选为30,000～60,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(1)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。此处所谓分子量是指数均分子量(Mn)。
式(4)中的n5和n6分别独立地为聚乙二醇的重复单元数，通常分别独立地为113～682，优选分别独立地为180～525。n5和n6可以不同，此外也可相同。
另外，m、R、Z、D、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)说明所述。
此外，下式(5)表示键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质，键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质是，，在键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质中，Q为乙二醇的残基，L1为CH2CH2O，且p为1。
【化14】
Figure BDA0002707611710000212
(式中，n5和n6分别独立地为113～682，m、R、Z1、A、a、b、D、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
式(5)中的n5和n6分别独立地为聚乙二醇的重复单元数，通常分别独立地为113～682，优选分别独立地为180～525。n5和n6可以不同，此外也可相同。
本发明的式(5)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为20,000～60,000，优选为25,000～55,000，进一步优选为30,000～50,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(5)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。此处所谓分子量是指数均分子量(Mn)。
另外，m、R、Z1、A、D、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)和(2)说明所述。
此外，下式(6)表示键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质，该键合有适宜方式的直链型聚乙二醇衍生物的生物相关物质是，在键合有式(3)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质中，Q为乙二醇的残基，L1为CH2CH2O，且p为1。
【化15】
Figure BDA0002707611710000221
(式中，n7和n8分别独立地为226～682，R、Z1、A、a、b、D、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
本发明的式(6)的与生物相关物质D键合的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量通常为20,000～60,000，优选为25,000～55,000，进一步优选为30,000～50,000。本发明的一个优选的实施方式中，本发明的式(3)中的聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。此处所谓分子量是指数均分子量(Mn)。
式(6)中的n7和n8分别独立地为聚乙二醇的重复单元数，通常分别独立地为226～682，优选分别独立地为340～568。n7和n8可以不同，此外也可相同。
另外，R、Z1、A、D、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)和(2)说明所述。
[键合有式(1)的分支型聚乙二醇衍生物的生物相关物质]
在键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质之中p为2～4且Q为具有3～5个活性氢的化合物的残基，这样的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质是键合有适宜方式的分支型聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
Q的具有3～5个活性氢的化合物的残基优选为赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基、或者寡肽的残基，特别优选为赖氨酸、谷氨酸的残基。此处，该寡肽的优选方式如对于上述式(1)说明所述。
另外，m、R、Z、D、L1、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)说明所述。
此外，在键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质之中p为2～4且Q为具有3～5个活性氢的化合物的残基，这样的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质是键合有适宜方式的分支型聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
Q的具有3～5个活性氢的化合物的残基优选为赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基或者寡肽的残基，特别优选为赖氨酸、谷氨酸的残基。此处，该寡肽的优选方式如对于上述式(1)说明所述。
另外，m、R、Z1、A、D、L1、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)和(2)说明所述。
进一步地，在键合有式(3)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质之中n3和n4分别独立地为113～682、p为2～4且Q为具有3～5个活性氢的化合物的残基，这样的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质是键合有适宜方式的分支型聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
n3和n4分别独立地为聚乙二醇的重复单元数，优选分别独立地为226～455。n3和n4可以不同，此外也可相同。
Q的具有3～5个活性氢的化合物的残基优选为赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基、或者寡肽的残基，特别优选为赖氨酸、谷氨酸的残基。此处，该寡肽的优选方式如对于上述式(1)说明所述。
另外，R、Z1、A、D、L1、L2、L3、L4和L5的优选方式如对于上述式(1)和(2)说明所述。
作为本发明的键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的聚乙二醇衍生物。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(1-1)]
键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n1和n2分别独立地为113～568；
p为1或2；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸)；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地，分别独立地为选自
【化16】
Figure BDA0002707611710000251
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(1-2)]
键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n1和n2分别独立地为113～568；
p为1或2；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸)；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1为单键、醚键或可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化17】
Figure BDA0002707611710000252
(式中，s为0～6的整数，(z2)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-O-、-(CH2)2-O-)；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化18】
Figure BDA0002707611710000261
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化19】
Figure BDA0002707611710000262
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化20】
Figure BDA0002707611710000263
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
作为本发明的键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(2-1)]
键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
p为1或2；
n1和n2分别独立地为113～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地为分别独立地为选自
【化21】
Figure BDA0002707611710000271
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(2-2)]
键合有式(2)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
p为1或2；
n1和n2分别独立地为113～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1为单键、醚键或可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化22】
Figure BDA0002707611710000281
(式中，s为0～6的整数，(z2)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-O-、-(CH2)2-O-)；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化23】
Figure BDA0002707611710000291
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如，-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化24】
Figure BDA0002707611710000292
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化25】
Figure BDA0002707611710000293
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
作为本发明的键合有式(3)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(3-1)]
键合有式(3)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
p为1或2；
n3和n4分别独立地为340～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地为分别独立地为选自
【化26】
Figure BDA0002707611710000301
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(3-2)]
键合有式(3)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
p为1或2；
n3和n4分别独立地为340～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
Q为乙二醇的残基或赖氨酸的残基；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L1为单键、醚键或可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化27】
Figure BDA0002707611710000311
(式中，s为0～6的整数，(z2)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-O-、-(CH2)2-O-)；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化28】
Figure BDA0002707611710000312
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化29】
Figure BDA0002707611710000321
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化30】
Figure BDA0002707611710000322
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
作为本发明的键合有式(4)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(4-1)]
键合有式(4)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n5和n6分别独立地为180～525；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸)；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地为分别独立地为选自
【化31】
Figure BDA0002707611710000331
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(4-2)]
键合有式(4)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n5和n6分别独立地为180～525；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～4个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸)；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化32】
Figure BDA0002707611710000332
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化33】
Figure BDA0002707611710000341
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化34】
Figure BDA0002707611710000342
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
作为本发明的键合有式(5)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(5-1)]
键合有式(5)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n5和n6分别独立地为180～525；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地为分别独立地为选自
【化35】
Figure BDA0002707611710000351
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(5-2)]
键合有式(5)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
m为1～3；
n5和n6分别独立地为180～525；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化36】
Figure BDA0002707611710000361
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化37】
Figure BDA0002707611710000362
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化38】
Figure BDA0002707611710000363
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
作为本发明的键合有式(6)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质的适宜的例子，可举出以下的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(6-1)]
键合有式(6)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
n7和n8分别独立地为340～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、酰胺键、醚键、仲氨基、羰基、或可包含这些键和基团的亚烷基[优选地为分别独立地为选自
【化39】
Figure BDA0002707611710000371
(式中，s为0～6的整数，(z2)、(z3)、(z5)和(z6)中的2个s可相同也可不同。)的间隔基团](例如单键、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)。
[键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质(6-2)]
键合有式(6)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质，
n7和n8分别独立地为340～568；
R为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)；
Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～3个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸)；
A为苯丙氨酸或亮氨酸；
a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1；
D为降钙素、人生长激素或粒细胞集落刺激因子；
L2为羰基或可包含羰基的亚烷基[优选地为
【化40】
Figure BDA0002707611710000381
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-CO-、-(CH2)5-CO-)；
L3为仲氨基(-NH-)；
L4为可包含醚键的亚烷基[优选地为
【化41】
Figure BDA0002707611710000382
(式中，2个s可相同也可不同，为0～6的整数。)](例如-(CH2)3-O-)；
L5为可包含单键或酰胺键的亚烷基[优选地为
【化42】
Figure BDA0002707611710000391
(式中，s为0～6的整数，(z3)中的2个s可相同也可不同。)](例如单键、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)。。
本发明的键合有式(1)的聚乙二醇衍生物的生物相关物质可以通过使下式(7)所示的分解性聚乙二醇衍生物与生物相关物质进行反应而获得。
【化43】
Figure BDA0002707611710000392
(式中，X为能够与生物相关物质反应的官能团，m、n1和n2、p、R、Z、Q、L1、L2、L3、L4和L5与上述含义相同。)
式(7)中的X若为与存在于成为化学修饰的对象的生理活性蛋白质、肽、抗体、核酸等生物相关物质中的官能团反应而形成共价键的官能团，则没有特别限制。例如，可举出“Harris,J.M.Poly(Ethylene Glycol)Chemistry；PlenumPress:New York,1992(J.M.哈里斯，聚乙二醇化学；普莱南出版社：纽约,1992)”、“Hermanson,G.T.BioconjugateTechniques,2nd ed.；Academic Press:San Diego,CA,2008(G.T.赫曼森，生物偶联技术，第二版；学术出版社：加利福尼亚州圣地亚哥，2008)”和“PEGylated Protein Drugs:BasicScience and Clinical Applications；Veronese,F.M.,Ed.；Birkhauser:Basel,Switzerland,2009(聚乙二醇化蛋白药物：基础科学和临床应用，F.M.韦罗内塞编；博克豪斯出版社：瑞士巴塞尔，2009)”等所记载的官能团。
式(7)中的X所示的“能够与生物相关物质反应的官能团”，若为能与生物相关物质具有的氨基、巯基、醛基、羧基、不饱和键或叠氮基等官能团化学键合的官能团，则没有特别限制。具体地，可举出活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧化物基、羧基、硫醇基、马来酰亚胺基、取代马来酰亚胺基、酰肼基、二硫代吡啶基、取代磺酸酯基、乙烯基砜基、氨基、氧氨基、碘乙酰胺基、烷基羰基、烯基、炔基、叠氮基、丙烯酸基、磺酰氧基(sulfonyloxy group)、α-卤代乙酰基、烯丙基、乙烯基等，优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧化物基(epoxide group)、马来酰亚胺基、乙烯基砜基、丙烯酸基、磺酰氧基、羧基、硫醇基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基、炔基、烯丙基、乙烯基、氨基、氧氨基、酰肼基和叠氮基，更优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、马来酰亚胺基和氨基，特别优选为醛基、马来酰亚胺基和氨基。
在适宜的实施方式中，这样的官能团X可分类为下述群组(II)、群组(III)、群组(IV)、群组(V)、群组(VI)和群组(VII)。
群组(II)：能够与生物相关物质所具有的氨基反应的官能团
下述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、(k)
群组(III)：能够与生物相关物质所具有的巯基反应的官能团
下述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)
群组(IV)：能够与生物相关物质所具有的醛基反应的官能团
下述(h)、(m)、(n)、(p)
群组(V)：能够与生物相关物质所具有的羧基反应的官能团
下述(h)、(m)、(n)、(p)
群组(VI)：能够与生物相关物质所具有的不饱和键反应的官能团
下述(h)、(m)、(o)
群组(VII)：能够与生物相关物质所具有的叠氮基反应的官能团
下述(l)
【化44】
Figure BDA0002707611710000411
官能团(j)中，式中的W表示氯原子(Cl)、碘原子(Br)或碘原子(I)等卤素原子，优选为Br、I，更优选为I。
此外，官能团(e)和官能团(l)中，式中的Y1、Y3分别独立地表示氢原子或碳原子数1～5的烃基，优选为碳原子数1～5的烃基。作为碳原子数1～5的烃基，具体地可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，优选为甲基、乙基。
此外，官能团(k)中，式中的Y2表示可含有氟原子的碳原子数1～10的烃基，具体地，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、己基、壬基、乙烯基、苯基、苄基、4-甲基苯基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-(三氟甲氧基)苯基等，优选为甲基、乙烯基、4-甲基苯基、2,2,2-三氟乙基。
活性酯基是指具有离去能力高的烷氧基的酯基。作为离去能力高的烷氧基，可举出衍生自硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚等的烷氧基。活性酯基优选为具有衍生自N-羟基琥珀酰亚胺的烷氧基的酯基。
活性碳酸酯基是指具有离去能力高的烷氧基的碳酸酯基。作为离去能力高的烷氧基，可举出衍生自硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚等的烷氧基。活性碳酸酯基优选为具有衍生自硝基苯酚或N-羟基琥珀酰亚胺的烷氧基的碳酸酯基。
取代马来酰亚胺基是指在马来酰亚胺基的双键之一的碳原子上键合有烃基的马来酰亚胺基。烃基具体可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，优选为甲基、乙基。
取代磺酸酯基是指在磺酸酯基的硫原子上键合有可含有氟原子的烃基的磺酸酯基。作为可含有氟原子的烃基，具体可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、己基、壬基、乙烯基、苯基、苄基、4-甲基苯基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-(三氟甲氧基)苯基等，优选为甲基、乙烯基、4-甲基苯基、2,2,2-三氟乙基。
用于本发明的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质的分解性聚乙二醇衍生物，例如，为直链型时，可通过如下的工序图(工序图(I))所示的路径而制造。
工序图(I)
【化45】
Figure BDA0002707611710000431
(工序中，PEG1、PEG2为聚乙二醇衍生物，Peptide为寡肽，X1、X2、X3为可与聚乙二醇衍生物的寡肽进行反应的官能团，Pro为保护基，R与上述含义相同。)
工序图(I)的PEG1、PEG2为聚乙二醇衍生物，各自的分子量如作为所述聚乙二醇的重复单元数n1、n2所定义地，即由于n为113～682，其分子量的范围为5000～30000。
工序图(I)的Peptide为与所述Z含义相同的寡肽。工序图(I)中，使用N末端的氨基被保护基所保护的寡肽，或者C末端的羧基被保护基所保护的寡肽。
工序图(I)的X1、X2、X3为能够与Peptide的羧基或氨基反应的聚乙二醇衍生物的官能团。
工序图(I)的Pro为保护基，此处保护基是指防止或阻止某一反应条件下分子中的能够进行特定化学反应的官能团的反应的成分。保护基根据所保护的能够进行化学反应的官能团的种类、所使用的条件和分子中的其他官能团或保护基的存在而有所改变。保护基的具体例子可以在很多通常的书籍中找到，例如如“Wuts,P.G.M.；Greene,T.W.ProtectiveGroups in Organic Synthesis,4th ed.；Wiley-Interscience:New York,2007(P.G.M.伍斯；T.W.格林，有机合成中的保护基，第四版；Wiley-Interscience:纽约，2007)”所记载。此外，保护基所保护的官能团通过使用适于各自的保护基的反应条件进行脱保护、即进行化学反应，可再次产生原有的官能团。保护基的典型的脱保护条件记载于上述文献中。
关于工序图(I)的聚乙二醇衍生物与寡肽的反应，没有特别限制，通过化学反应以共价键将聚乙二醇衍生物与寡肽键合。寡肽与聚乙二醇的键合取决于反应所使用的官能团的组合，但基本上是经由所述L1、L2、L3、L4、L5所示的作为2价间隔基团的包含氨基甲酸酯键或酰胺键的亚烷基等而键合。
工序图(I)的反应A-1为单个末端被保护基所保护的寡肽与单个末端为R的聚乙二醇衍生物的反应，通过后续的脱保护B-1，可以获得单个末端具有R、单个末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物。
工序图(I)的反应C-1为单个末端被保护基所保护的聚乙二醇衍生物与经脱保护B-1而获得的末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护D-1，可以获得2个聚乙二醇链和1个寡肽连结了的聚乙二醇衍生物。
工序图(I)的反应A-2为单个末端被保护基所保护的寡肽与经脱保护D-1而获得的2个聚乙二醇链和1个寡肽连结了的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护B-2，可以获得在末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物。
工序图(I)的反应C-2为单个末端被保护基所保护的聚乙二醇衍生物与经脱保护B-2而获得的末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护D-2，可以获得3个聚乙二醇链和2个寡肽连结的聚乙二醇衍生物。
通过重复进行工序图(I)的反应A→脱保护B→反应C→脱保护D的循环，可以获得本发明的分解性聚乙二醇衍生物。
该分解性聚乙二醇衍生物可以根据需要对末端官能团进行化学转换。用于该官能团转换的反应可以使用现有公知的方法，但必须适当选择不使寡肽、所述2价间隔基团分解的条件。
作为合成该分解性聚乙二醇衍生物的典型例子，可举出如下的工序。此处，作为工序图(I)的代表例，对使用N末端的氨基被保护基所保护的寡肽的合成方法进行说明。下文工序的间隔基团L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12与所述L1、L2、L3、L4、L5所示的2价间隔基团含义相同。
【化46】
Figure BDA0002707611710000451
反应A-1为通过缩合反应使N末端的氨基被保护基所保护的寡肽的羧基与单个末端为R的聚乙二醇衍生物(4)的氨基键合而获得聚乙二醇衍生物(5)的工序。
寡肽的N末端的氨基的保护基没有特别限制，例如可举出酰基系保护基和氨基甲酸酯系保护基，具体地可举出三氟乙酰基、9-芴基甲氧基羰基和叔丁氧基羰基等。
作为缩合反应没有特别限制，理想的是使用缩合剂的反应。作为缩合剂，可单独使用二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)等碳二亚胺系的缩合剂，也可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基苯并***(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)等试剂并用。此外，也可使用反应性更高的HATU、HBTU、TATU，TBTU、COMU、DMT-MM等缩合剂。此外为了促进反应，也可使用三乙胺和二甲基氨基吡啶等碱。
反应中副反应生成的杂质或反应中未被消耗而残留的寡肽、缩合剂等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
【化47】
Figure BDA0002707611710000452
脱保护B-1为将反应A-1中所得的聚乙二醇衍生物(5)的保护基进行脱保护而获得聚乙二醇衍生物(6)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但必须使用不使寡肽、L6的2价间隔基团不分解的条件。
脱保护反应中副反应生成的杂质等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
【化48】
Figure BDA0002707611710000461
反应C-1为通过反应使脱保护B-1中所得的聚乙二醇衍生物(6)的氨基与聚乙二醇衍生物(7)的活性酯基或活性碳酸酯基键合，而获得2根聚乙二醇链被寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(8)的工序。
聚乙二醇衍生物(7)在单个末端具有被保护基所保护的氨基，在另一个末端具有活性酯基或活性碳酸酯基等。作为活性酯基和活性碳酸酯基的离去基团，可举出琥珀酰亚胺基氧基、邻苯二甲酰亚胺基氧基、4-硝基苯氧基、1-咪唑基、五氟苯氧基、苯并***-1-基氧基和7-氮杂苯并***-1-基氧基等。此外，聚乙二醇衍生物(7)不一定必须具有活性化的官能团，在末端具有羧基时，可以与反应A-1同样地使用利用了缩合剂的反应。为促进反应进行，也可使用三乙胺和二甲基氨基吡啶等碱。聚乙二醇衍生物(7)的保护基没有特别限制，例如可举出酰基系保护基和氨基甲酸酯系保护基，具体地可举出三氟乙酰基、9-芴基甲氧基羰基和叔丁氧基羰基等。
反应中副反应生成的杂质或反应中未被消耗而残留的聚乙二醇衍生物等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
作为从聚乙二醇衍生物(8)中去除分子量、官能团不同的聚乙二醇杂质的方法，可以使用日本专利特开2014-208786、特开2011-79934所记载的提纯技术。
【化49】
Figure BDA0002707611710000471
脱保护D-1为将反应C-1中所得的聚乙二醇衍生物(8)的保护基进行脱保护而获得聚乙二醇衍生物(9)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽和L6、L7、L8的2价间隔基团分解的条件。
脱保护反应中副反应生成的杂质等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
【化50】
Figure BDA0002707611710000472
反应A-2为通过缩合反应使N末端的氨基被保护基所保护的寡肽的羧基与脱保护B-1中所得的聚乙二醇衍生物(9)的氨基键合而获得聚乙二醇衍生物(10)的工序。能够在与所述反应A-1相同条件下反应和提纯。
【化51】
Figure BDA0002707611710000481
脱保护B-2为将反应A-2中所得的聚乙二醇衍生物(10)的保护基进行脱保护而获得聚乙二醇衍生物(11)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽和L6、L7、L8的2价间隔基团分解的条件。能够在与所述脱保护B-1相同条件下进行反应和提纯。
【化52】
Figure BDA0002707611710000482
反应C-2为通过反应使脱保护B-2中所得的聚乙二醇衍生物(11)的氨基与聚乙二醇衍生物(7)的活性酯基或活性碳酸酯基键合，而获得3根聚乙二醇链被2个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(12)的工序。能够在与所述反应C-1相同条件下反应和提纯。
【化53】
Figure BDA0002707611710000483
脱保护D-2为将反应C-2中所得的聚乙二醇衍生物(12)的保护基进行脱保护而获得聚乙二醇衍生物(13)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽和L6、L7、L8的2价间隔基团分解的条件。能够在与所述脱保护D-1相同条件下进行反应和提纯。
将以上的反应总结为以下的工序图(II)。通过重复反应A→脱保护B→反应C→脱保护D的循环，可以获得(9)、(13)、(14)、(15)的分解性聚乙二醇衍生物。
工序图(II)
【化54】
Figure BDA0002707611710000501
工序图(II)中所得的(9)、(13)、(14)、(15)的分解性聚乙二醇衍生物具体地相当于如下。
聚乙二醇衍生物(9)：2根聚乙二醇链被1个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(13)：3根聚乙二醇链被2个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(14)：4根聚乙二醇链以3个寡肽连接4根的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(15)：5根聚乙二醇链被4个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
获得的(9)、(13)、(14)、(15)的分解性聚乙二醇衍生物在末端具有氨基，能够利用其将其转换为各种官能团。对该反应予以后述。
此外，通过将工序图(II)的反应C-1、反应C-2、反应C-3、反应C-4中使用的聚乙二醇衍生物(7)的氨基的保护基变更为例如作为醛基的保护基的缩醛基(具体地，3,3-二乙氧基丙基等)、作为羧基的保护基的烷基酯系保护基(具体地，甲酯、叔丁酯、苄酯等)等，可以获得具有不同官能团的分解性聚乙二醇衍生物。此时，脱保护D-1、脱保护D-2、脱保护D-3、脱保护D-4中，通过使用分别适于各自的保护基的现有公知的方法进行脱保护，可以获得目标物。
关于代替聚乙二醇衍生物(7)的聚乙二醇衍生物，例如可以举出以下结构的物质。
【化55】
Figure BDA0002707611710000511
【化56】
Figure BDA0002707611710000512
作为本发明的分解性聚乙二醇衍生物不同的制造方法，例如也可以通过如下的工序图(工序图(III))所示的路径进行制造。
工序图(III)
【化57】
Figure BDA0002707611710000521
(工序中，PEG1、PEG2、PEG3为聚乙二醇衍生物，Peptide为寡肽，X1、X2、X3、X4、X5为聚乙二醇衍生物的官能团，Pro、Pro2、Pro3为保护基，R与上述含义相同。)
工序图(III)的PEG1、PEG2、PEG3为聚乙二醇衍生物，各自的分子量如作为所述的聚乙二醇的重复单元数的n1、n2所定义，即由于n为113～682，其分子量的范围为5000～30000。
工序图(III)的Peptide为与所述Z定义相同的寡肽。工序图(III)中，使用N末端的氨基被保护基所保护的寡肽或C末端的羧基被保护基所保护的寡肽。
工序图(III)的X1、X2、X3、X4、X5为能够与Peptide的羧基或氨基反应的聚乙二醇衍生物的官能团。
工序图(III)的Pro、Pro2、Pro3为保护基，工序图(III)中Pro为在Pro2的脱保护条件下稳定的保护基，此外，Pro2为在Pro3的脱保护条件下稳定的保护基。这些保护基的组合例如可从“Wuts,P.G.M.；Greene,T.W.Protective Groups in Organic Synthesis,4thed.；Wiley-Interscience:New York,2007(P.G.M.伍斯；T.W.格林，有机合成中的保护基，第四版；Wiley-Interscience:纽约，2007)”所记载的保护基中进行选择。
关于工序图(III)的聚乙二醇衍生物与寡肽的反应，没有特别限制，可通过化学反应以共价键键合聚乙二醇衍生物与寡肽。寡肽与聚乙二醇的键合取决于反应所使用的官能团的组合，但基本上是经由所述L1、L2、L3、L4、L5所示的作为2价间隔基团的包含氨基甲酸酯键或酰胺键的亚烷基等而键合。
工序图(III)的反应E为单个末端被保护基Pro3所保护的寡肽与单个末端被保护基Pro2所保护的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护F，仅将肽侧的保护基Pro3进行脱保护，可以获得单个末端具有寡肽、单个末端具有保护基Pro2的聚乙二醇衍生物。
工序图(III)的反应G-1为单个末端被保护基Pro所保护的聚乙二醇衍生物与经脱保护F而获得的单个末端具有寡肽、单个末端具有保护基Pro2的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护H-1，仅将聚乙二醇衍生物的单侧的保护基Pro2进行脱保护，可以获得2个聚乙二醇链和1个寡肽连结的聚乙二醇衍生物。
工序图(III)的反应G-2为经脱保护H-1而获得的单个末端被保护基Pro所保护的聚乙二醇衍生物与经脱保护F而获得的单个末端具有寡肽、单个末端具有保护基Pro2的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护H-2，仅将聚乙二醇衍生物的单侧的保护基Pro2进行脱保护，可以获得3个聚乙二醇链和2个寡肽连结的聚乙二醇衍生物。
通过在反应G-1、G-2、G-3的工序中，使用工序图(III)的反应E后的经由脱保护F而获得的单个末端具有寡肽、单个末端具有保护基Pro2的聚乙二醇衍生物作为原料，重复进行反应G和脱保护H的反应，可高效地获得本发明的分解性聚乙二醇衍生物的前驱体。
工序图(III)的反应A-1和脱保护B-1，与所述工序图(I)相同地，可获得单个末端具有R、单个末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物。
工序图(III)的反应J为重复进行反应G和脱保护H的反应而获得的单个末端被保护基Pro所保护的聚乙二醇衍生物(前驱体)与经脱保护B-1而获得的单个末端具有R、单个末端具有寡肽的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护K，可以获得本发明的分解性聚乙二醇衍生物。
该分解性聚乙二醇衍生物可以根据需要对末端官能团进行化学转换。用于该官能团转换的反应可以使用现有公知的方法，但必须适当选择不使寡肽、所述2价间隔基团分解的条件。
作为合成该分解性聚乙二醇衍生物的典型例子，可举出如下的工序。此处，作为工序图(III)的代表例，对使用N末端的氨基被保护基所保护的寡肽的合成方法进行说明。
【化58】
Figure BDA0002707611710000541
反应E为通过使N末端的氨基被保护基Pro3所保护的寡肽的羧基与单个末端的羧基被保护基Pro2所保护的聚乙二醇衍生物(16)的氨基通过缩合反应而键合，而获得聚乙二醇衍生物(17)的工序。
寡肽的N末端的氨基的保护基Pro3没有特别限制，例如可举出酰基系保护基和氨基甲酸酯系保护基，具体可举出三氟乙酰基、9-芴基甲氧基羰基等。其次，聚乙二醇衍生物(16)的羧基的保护基Pro2没有特别限制，可举出叔丁基等。
能够在与所述反应A-1相同条件下进行反应和提纯。
【化59】
Figure BDA0002707611710000551
脱保护F为将反应E中所得的聚乙二醇衍生物(17)的氨基的保护基Pro3进行脱保护，而获得聚乙二醇衍生物(18)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使保护基Pro2、寡肽、L9、L10的2价间隔基团分解的条件。例如，具体地，在Pro3为9-芴基甲氧基羰基、Pro2为叔丁基时，通过使用哌啶等适当的碱化合物，可选择性地使Pro3脱保护。能够在与所述脱保护B-1相同条件下进行反应和提纯。
【化60】
Figure BDA0002707611710000552
反应G-1为使脱保护F中所得的聚乙二醇衍生物(18)的氨基与聚乙二醇衍生物(7)的活性酯基或活性碳酸酯基通过反应而键合，而获得2根聚乙二醇链被1个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(19)的工序。聚乙二醇衍生物(7)如上所述。能够在与所述反应C-1相同条件下进行反应和提纯。
【化61】
Figure BDA0002707611710000561
脱保护H-1为将反应G-1中所得的聚乙二醇衍生物(19)的羧基的保护基Pro2进行脱保护，而获得聚乙二醇衍生物(20)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使保护基Pro、寡肽、L7、L8、L9、L10的2价间隔基团分解的条件。例如，具体地，在Pro为三氟乙酰基、Pro2为叔丁基时，在使用合适的酸性化合物的条件下，可选择性地将Pro2进行脱保护。
脱保护反应中副反应生成的杂质等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
【化62】
Figure BDA0002707611710000562
反应G-2为使脱保护F中所得的聚乙二醇衍生物(18)的氨基与脱保护H-1中所得的聚乙二醇衍生物(20)的羧基进行缩合反应，获得3根聚乙二醇链被2个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(21)的工序。能够在与所述反应C-1相同条件下进行反应和提纯。
与所述反应A-1同样地，理想的是使用缩合剂的反应，为促进反应进行，也可使用三乙胺和二甲基氨基吡啶等碱。
反应中副反应生成的杂质或反应中未被消耗而残留的聚乙二醇衍生物等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
作为从聚乙二醇衍生物(21)中去除分子量或官能团不同的聚乙二醇杂质的方法，可使用如日本专利特开2014-208786、特开2011-79934记载的提纯技术。
【化63】
Figure BDA0002707611710000571
脱保护H-2为将反应G-2中所得的聚乙二醇衍生物(21)的羧基的保护基Pro2进行脱保护，而获得聚乙二醇衍生物(22)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使保护基Pro、寡肽、L7、L8、L9、L10的2价间隔基团分解的条件。
将以上的反应总结为以下的工序图(IV)。使用反应E和脱保护F中所得的聚乙二醇衍生物(18)作为原料，通过重复进行反应G→脱保护H，可获得例如4根聚乙二醇链被3个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(23)、5根聚乙二醇链被4个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(24)等本发明的分解性聚乙二醇衍生物的中间体。
工序图(IV)
【化64】
Figure BDA0002707611710000581
工序图(IV)中所得的(20)、(22)、(23)、(24)的聚乙二醇衍生物具体地相当于如下。
聚乙二醇衍生物(20)：2根聚乙二醇链被1个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(22)：3根聚乙二醇链被2个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(23)：4根聚乙二醇链被3个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
聚乙二醇衍生物(24)：5根聚乙二醇链被4个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物
接着，通过以工序图(IV)中所得的(20)、(22)、(23)、(24)的聚乙二醇衍生物作为原料，进行以下的反应J和脱保护K，可以获得分解性聚乙二醇衍生物。以下的工序显示使用聚乙二醇衍生物(24)的情况。
【化65】
Figure BDA0002707611710000591
反应J为使所述脱保护B-1中所得的聚乙二醇衍生物(6)的氨基与脱保护H-4中所得的聚乙二醇衍生物(24)的羧基进行缩合反应，而获得6根聚乙二醇链被5个寡肽连接的结构的聚乙二醇衍生物(25)的工序。能够在与所述反应C-1相同条件下进行反应和提纯。
与所述反应A-1同样地，理想的是使用缩合剂的反应，为促进反应进行，也可使用三乙胺和二甲基氨基吡啶等碱。
反应中副反应生成的杂质或反应中未被消耗而残留的聚乙二醇衍生物等优选进行提纯去除。提纯没有特别限制，能够以萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行提纯。
作为从聚乙二醇衍生物(25)中去除分子量或官能团不同的聚乙二醇杂质的方法，可以使用日本专利特开2014-208786、特开2011-79934记载的提纯技术。
【化66】
Figure BDA0002707611710000592
脱保护K为将反应J中所得的聚乙二醇衍生物(25)的保护基进行脱保护，获得聚乙二醇衍生物(26)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽或L6、L7、L8、L9、L10的2价间隔基团分解的条件。能够在与所述脱保护D-1相同条件下进行反应和提纯。
作为用于本发明的键合有聚乙二醇衍生物的生物相关物质的分解性聚乙二醇衍生物的不同制造方法，例如，在为分支型的情况时，可通过如下的工序图(工序图(V))所示的路径进行制造。此处为通过工序(I)或工序(III)中所得的分解性聚乙二醇与作为具有3～5个活性氢的化合物的残基的Q的反应，而获得分支型分解性聚乙二醇的路径。
工序图(V)
【化67】
Figure BDA0002707611710000601
(工序中，PEG1、PEG2为聚乙二醇衍生物，Peptide为寡肽，Q为具有3～5个活性氢的化合物的残基，X6、X7为官能团，Pro为保护基，p为2～4，R与上述含义相同。)
工序图(V)的PEG1、PEG2为聚乙二醇衍生物，各自的分子量如上述的作为聚乙二醇的重复单元数的n1、n2所定义，即由于n为45～682，其分子量的范围为2000～30000。
工序图(V)的Peptide为与所述Z定义相同的寡肽。
工序图(V)的Q为所述Q定义相同的具有3～5个活性氢的化合物的残基。
工序图(V)的X6为能够与Q的具有活性氢的官能团即羟基、羧基或氨基等反应的聚乙二醇衍生物的官能团，X7为能够与键合在Q上的生物相关物质反应的官能团。
关于工序图(V)的Q与分解性聚乙二醇衍生物的反应，没有特别限制，通过化学反应使Q与分解性聚乙二醇衍生物以共价键键合。Q与分解性聚乙二醇衍生物的键合取决于反应所使用的官能团的组合，但基本上是经由所述L1、L2、L3、L4、L5等所示的作为2价间隔基团的包含氨基甲酸酯键或酰胺键的亚烷基等而键合。
工序图(V)的反应L为作为具有3～5个活性氢的化合物的残基的Q的具有活性氢的1个官能团被保护基Pro所保护的Q与所述工序(I)或工序(III)中所得的单个末端为R的分解性聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护M，可将Q的保护基Pro进行脱保护，获得分支型分解性聚乙二醇衍生物。该分解性聚乙二醇衍生物可以根据需要对末端官能团进行化学转换。用于该官能团转换的反应可以使用现有公知的方法，但必须适当选择不使寡肽、所述2价间隔基团分解的条件。
作为合成该分解性聚乙二醇衍生物的典型例子，可举出如下的工序。此处，作为工序图(V)的代表例，对使用具有3个活性氢的化合物的谷氨酸的残基作为Q的情况的合成方法进行说明。
【化68】
Figure BDA0002707611710000611
反应L为例如是使脱保护D-1中所得的聚乙二醇衍生物(9)的氨基与氨基被保护基所保护的谷氨酸衍生物的两个羧基以缩合反应进行键合，而获得2根分解性聚乙二醇链被谷氨酸残基连接的结构的分支型聚乙二醇衍生物(27)的工序。能够在与所述反应G-2相同条件下进行反应和提纯。
【化69】
Figure BDA0002707611710000621
脱保护M为将反应L中所得的聚乙二醇衍生物(27)的保护基进行脱保护，而获得聚乙二醇衍生物(28)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽或L6、L7、L8的2价间隔基团分解的条件。能够在与所述脱保护D-1相同条件下进行反应和提纯。
作为本发明的分支型的分解性聚乙二醇衍生物的不同制造方法，例如可以通过如下的工序图(工序图(VI))所示的路径进行制造。此处为通过工序(I)和工序(III)中所得的单个末端具有肽的聚乙二醇衍生物与在作为具有3～5个活性氢的化合物的残基的Q上键合有聚乙二醇的分支型聚乙二醇衍生物的反应，获得分支型分解性聚乙二醇的路径。
工序图(VI)
【化70】
Figure BDA0002707611710000631
(工序中、PEG1、PEG2、PEG3为聚乙二醇衍生物，Peptide为寡肽，Q为具有3～5个活性氢的化合物的残基，X8、X9为官能团，Pro为保护基，p为2～4，R与上述含义相同。)
工序图(VI)的PEG1、PEG2、PEG3为聚乙二醇衍生物，各自的分子量如作为所述聚乙二醇的重复单元数n1、n2所定义，即由于n为45～682，其分子量的范围为2000～30000。
工序图(VI)的Peptide为与所述Z定义相同的寡肽。
工序图(VI)的X8为能够与Peptide的羧基、或氨基反应的聚乙二醇衍生物的官能团，X9为能够与在Q上键合的生物相关物质反应的官能团。
关于工序图(VI)的单个末端具有肽的聚乙二醇衍生物与在作为具有3～5个活性氢的化合物的残基的Q上键合有聚乙二醇的分支型聚乙二醇衍生物的反应，没有特别限制，这些聚乙二醇衍生物通过化学反应以共价键进行键合。分支型聚乙二醇衍生物与分解性聚乙二醇衍生物的键合，取决于反应所使用的官能团的组合，但基本上是经由所述L1、L2、L3、L4、L5等所示的作为2价间隔基团的包含氨基甲酸酯键或酰胺键的亚烷基等而键合。
为作为具有3～5个活性氢的化合物的残基的Q的具有活性氢的一个官能团被保护基Pro所保护的分支型聚乙二醇衍生物与所述工序(I)或工序(III)中所得的单个末端具有肽、另一末端为R的聚乙二醇衍生物的反应。通过后续的脱保护P，可将Q的保护基Pro进行脱保护，获得分支型分解性聚乙二醇衍生物。该分解性聚乙二醇衍生物可以根据需要对末端官能团进行化学转换。用于该官能团转换的反应可以使用现有公知的方法，但必须适当选择不使寡肽、所述2价间隔基团分解的条件。
作为合成该分解性聚乙二醇衍生物的典型例子，可举出如下的工序。此处，作为工序图(VI)的代表例，对使用Q为甘油残基的分支型聚乙二醇衍生物作为原料的合成方法进行说明。
【化71】
Figure BDA0002707611710000641
反应N为使例如依据专利文献日本特开2012-25932的实施例而获得的分支型聚乙二醇衍生物(29)的两个羧基与脱保护B-1中所得的聚乙二醇衍生物(6)的氨基以缩合反应进行键合，而获得分支型聚乙二醇衍生物(30)的工序。能够在与所述反应G-2相同条件下进行反应和提纯。
【化72】
Figure BDA0002707611710000651
脱保护P为将反应N中所得的聚乙二醇衍生物(30)的保护基进行脱保护，而获得聚乙二醇衍生物(31)的工序。作为脱保护反应，可以使用现有公知的方法，但需要使用不使寡肽或L6、L11、L12的2价间隔基团分解的条件。能够在与所述脱保护D-1相同条件下进行反应和提纯。
接着，脱保护D、脱保护K、脱保护M、脱保护P中所得的聚乙二醇衍生物在末端具有氨基，可利用其转换为各种官能团。
关于将聚乙二醇衍生物的末端的氨基转换为其他官能团的工序没有特别限制，但基本上通过使用具有能够与氨基反应的活性酯基的化合物，或酸酸酐、酰氯等通常的反应试剂，可以容易地转换为各种官能团。
例如，在希望将聚乙二醇衍生物的末端的氨基转换为马来酰亚胺基时，通过使其与如下的试剂进行反应，可以获得目标物。
【化73】
Figure BDA0002707611710000652
例如，在希望将聚乙二醇衍生物的末端的氨基转换为羧基时，通过使其与琥珀酸酐或戊二酸酐进行反应，可以获得目标物。
这些反应试剂为低分子量的试剂，由于与聚乙二醇衍生物有很大的溶解性差别，因此可以通过萃取、析晶等通常的提纯方法容易地去除。
要求经由如上所述的工序而获得的分解性聚乙二醇具有在血液中稳定、仅在细胞内进行分解的性能。为恰当地评价其性能，例如，可以实施如下所示的试验，评价分解性聚乙二醇在血液中的稳定性、以及在细胞内的分解性。
关于用于评价分解性聚乙二醇衍生物在血液中的稳定性的试验方法，没有特别限制，例如可举出使用小鼠、大鼠、人等的血清的试验等。具体地，通过在血清中溶解聚乙二醇衍生物至浓度成为1～10mg/mL，在37℃下孵育96小时后，回收血清中所含的聚乙二醇衍生物，测定GPC，可以评价分解率。分解率从稳定性试验前的聚乙二醇衍生物的GPC主馏分(main fraction)的峰面积％和稳定性试验后的聚乙二醇衍生物的GPC主馏分的峰面积％进行计算。具体使用下式。
分解率＝(试验前的峰面积％-试验后的峰面积％)÷试验前的峰面积％×100
例如，设稳定性试验前的分解性聚乙二醇衍生物的GPC主馏分的峰面积％为95％，试验后的GPC主馏分的峰面积％为90％时，分解率如下地进行计算。
分解率＝(95-90)÷95×100＝5.26(％)
若分解性聚乙二醇衍生物在血液中分解，则不能得到目标的血液半衰期，因此在稳定性试验中，96小时后的分解率优选为10％以下，进一步优选为5％以下。
关于用于评价分解性聚乙二醇衍生物在细胞内的分解性的试验方法，没有特别限制，例如可举出使用含有分解性聚乙二醇衍生物的培养基，培养细胞的试验等。此处关于使用的细胞、培养基没有特别限制，但是，具体地，可以通过在培养基RPMI-1640中溶解聚乙二醇衍生物至浓度成为1～20mg/mL，使用该培养基，在37℃下培养96小时巨噬细胞RAW264.7后，回收细胞中的聚乙二醇衍生物，测定GPC，从而评价分解率。与稳定性试验同样地，可以使用试验前后的聚乙二醇衍生物的GPC主馏分的峰面积％对分解率进行计算。
例如，设使用细胞的分解性试验前的分解性聚乙二醇衍生物的GPC主馏分的峰面积％为95％，试验后的GPC主馏分的峰面积％为5％时，分解率如下地进行计算。
分解率＝(95-5)÷95×100＝94.7(％)
由于若分解性聚乙二醇衍生物不能在细胞内高效地分解，则不能抑制作为目标的细胞的空泡，因此分解性试验中96小时后的分解率优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
作为使获得的分解性聚乙二醇衍生物与生物相关物质键合的方法，没有特别限制，例如可使用“Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques,3rd ed.；Academic Press:San Diego,CA,2013(G.T.赫曼森，生物偶联技术，第三版；学术出版社：加利福尼亚州圣地亚哥，2013)”或“Mark,Sonny S.Bioconjugate protocols,strategies and methods；2011(马克，桑尼S.，生物偶联方案、策略和方法；2011)”中记载的方法。这些之中，例如，在将作为生物相关物质的蛋白质、肽等的赖氨酸残基的氨基作为标靶(target)时，使用具有活性化酯基、活性化碳酸酯基的聚乙二醇衍生物。此外，以作为生物相关物质的蛋白质、肽等的半胱氨酸残基的硫醇基作为标靶时，使用具有马来酰亚胺基、碘乙酰胺基的聚乙二醇衍生物。由于天然的生物相关物质中所含的游离的半胱氨酸残基的数量极少，因此用该方法可进一步选择性地使聚乙二醇与生物相关物质键合。进一步地，作为产生或导入硫醇基的方法，有切断生物相关物质的双硫键的方法、通过基因工程改变生物相关物质而导入半胱氨酸残基的方法等，已知的是通过与这些技术相组合，可以在生物相关物质的目标部位键合目标个数的聚乙二醇衍生物。
接着，在以作为生物相关物质的蛋白质、肽等N末端的氨基作为标靶时，使用具有醛基的聚乙二醇衍生物。具体地，通过在低pH的缓冲溶液中，使用具有醛基的聚乙二醇衍生物和合适的还原剂，可以使聚乙二醇衍生物选择性地键合在蛋白质、肽的N末端的氨基上。
键合有这些聚乙二醇衍生物的生物相关物质可以通过作为通常方法而周知的透析、凝胶渗透色谱法(GPC)、离子交换色谱法(IEC)等进行提纯。此外，获得的生物相关物质通常可以用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、反相色谱法(RPLC)等分析方法进行评价。
关于评价键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质的生理活性的方法，没有特别限制，例如，若生物相关物质为胰岛素则测定血液中糖浓度，若为降钙素则测定血液中钙浓度等，可以通过从给药后的动物进行定期采血，用合适的分析仪器测定血液中的物质而进行评价。具体地，若为胰岛素，则可以使用葡萄糖测定试剂盒，监测给药后的葡萄糖浓度的降低，若为降钙素，则可以使用钙测定试剂盒，监测给药后的钙浓度的降低而进行评价。
关于用于评价键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质的血液半衰期、体内分布的试验方法，没有特别限制，例如可举出，以放射性同位素或荧光物质进行标记，对小鼠或大鼠给药，进行监测的试验等。
认为：导入至聚乙二醇衍生物的分解性肽赋予聚乙二醇以在细胞内的分解性，但因该肽结构而存在改变键合有聚乙二醇的生物相关物质的体内动力学的可能性。因此，为确认导入的肽结构对体内动力学的影响，对于血液半衰期及其体内分布，有必要与修饰了不具有分解性的同分子量的聚乙二醇衍生物的生物相关物质进行比较。具体地，可以在以放射性同位素标记后的生物相关物质上，分别键合不具有分解性的聚乙二醇衍生物和分解性聚乙二醇衍生物，将获得的2种生物相关物质向小鼠给药，在多个时间点测定血液、各脏器的辐射剂量，进行定量测定。
关于用于评价分解性聚乙二醇衍生物的细胞的空泡抑制的试验方法，没有特别限制，例如可举出，如非专利文献2所记载地，持续长期间、高频率、高给药量地向小鼠或大鼠给药，确认被认为易于产生空泡的脏器或器官的切片图像的试验等。
具体地，可以将聚乙二醇衍生物溶解于生理盐水至浓度成为10～250mg/m，通过小鼠尾静脉，持续每周3次、4周以上、20～100μL的给药，制作被认为易于产生空泡的器官即脑脉络丛或脾脏等的石蜡切片并进行染色后，通过病理学方法确认切片图像，进行空泡抑制的评价。
另外，本评价中，聚乙二醇的给药量相比于该技术领域中的通常的聚乙二醇的给药量，有必要给药大量过量的聚乙二醇。
非专利文献2中记载了高分子量的聚乙二醇引起的细胞的空泡化与聚乙二醇在组织中的蓄积有关。关于用于评价分解性聚乙二醇衍生物在细胞中的蓄积性的试验方法，没有特别限制，但可以通过与以上述空泡评价相同方法制作的切片图像进行评价。可以通过病理学方法确认被认为易于产生空泡的器官即脑脉络丛或脾脏等的染色后的切片图像，进行聚乙二醇的蓄积性的评价。
另外，本评价中，聚乙二醇的给药量相比于该技术领域中的通常的聚乙二醇的给药量，有必要给药大量过量的聚乙二醇。
【实施例】
下述实施例中获得的1H-NMR得自捷欧迪拓姆(JEOL DATUM)株式会社制的JNM-ECP400或JNM-ECA600。测定中使用
Figure BDA0002707611710000691
样品管，作为氘代溶剂使用D2O或含有四甲基硅烷(TMS)作为内标物的CDCl3和d6-DMSO。获得的聚乙二醇衍生物的分子量和胺纯度使用液相色谱法(GPC和HPLC)进行计算。关于液相色谱的***，GPC使用东曹株式会社制的“HLC-8320GPC EcoSEC”，HPLC使用WATERS公司制的“ALLIANCE”。以下显示GPC和HPLC的分析条件。
GPC分析(分子量测定)
检测器：示差折光仪
色谱柱：ultrahydrogel 500和ultrahydrogel 250(WATERS)
流动相：100mM乙酸盐缓冲液(Acetate buffer)+0.02％NaN3(pH5.2)
流速：0.5mL/min
样品量：5mg/mL、20μL
色谱柱温度：30℃
HPLC分析(胺纯度测定)
检测器：示差折光仪
色谱柱：TSKgel SP-5PW(东曹)
流动相：1mM磷酸钠缓冲液(Sodium phosphate buffer)(pH6.5)
流速：0.5mL/min
注射量：5mg/mL、20μL
色谱柱温度：40℃
[实施例1]
化合物(p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)的合成
【化74】
Figure BDA0002707611710000701
[实施例1-1]
【化75】
Figure BDA0002707611710000702
N末端以叔丁氧基羰基(Boc基)保护的甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-甘氨酸(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.197g、4.0×10-4摩尔、GenScript Biotech Corp.制)和N-羟基琥珀酰亚胺(57.5mg、5.0×10-4摩尔、Midori Kagaku Co.,Ltd.制)溶解于无水N,N’-二甲基甲酰胺(1.0g)后，添加N,N’-二环己基碳二亚胺(0.103g、5.0×10-4摩尔、多摩化学工业株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(3.0g)稀释后，添加末端具有丙基氨基的甲氧基PEG(2.0g、9.5×10-5摩尔、平均分子量＝约21,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT MEPA-20T”)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。然后，加入乙酸乙酯(20g)稀释反应液，使用铺有LS100滤纸的桐山漏斗进行抽滤。向滤液中加入乙酸乙酯(30g)，搅拌至变均匀后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(50g)中，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(25g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p2)(ME-200GLFG(L)-Boc)。产量为1.8g。
NMR(CDCl3)：0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.65ppm(m、约2,000H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、4.43ppm(宽(broad)、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.77ppm(宽、1H)、6.76ppm(宽、1H)、6.86ppm(宽、1H)、6.90ppm(宽、1H)、7.14ppm(宽、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例1-2]
【化76】
Figure BDA0002707611710000711
实施例1-1中所得的ME-200GLFG(L)-Boc(1.8g、8.6×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(9.0g)中，加入甲磺酸(584μL、9.0×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中，反应2小时。然后，用甲苯(18g)稀释反应液，加入离子交换水(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。向获得的水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，调节pH为12后，溶解氯化钠(4.5g)。向其中添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(36g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(0.90g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Opliite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p3)(ME-200GLFG(L)-NH2 )。产量为1.4g。
NMR(CDCl3)：0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1，70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、约1，900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、4.31ppm(宽、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(宽、1H)、7.00ppm(宽、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.98ppm(宽、1H)
[实施例1-3]
【化77】
Figure BDA0002707611710000721
将实施例1-2中所得的ME-200GLFG(L)-NH2(1.2g、5.7×10-5摩尔)溶解于氯仿(14.4g)中后，添加三乙胺(10μL、7.1×10-5摩尔、关东化学株式会社)以及单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(1.3g、6.2×10-5摩尔、平均分子量＝约19,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-200TS”)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(48g)溶解后，加入己烷(24g)在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。将获得的析出物再次溶解于乙酸乙酯(48g)，加入己烷(24g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。回收析出物后，用己烷(24g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p4)(ME-200GLFG(L)-200Boc)。产量为2.0g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(宽、1H)、6.45ppm(宽、1H)、6.93ppm(宽、1H)、7.06ppm(宽、1H)、7.13ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例1-4]
【化78】
Figure BDA0002707611710000731
将实施例1-3中所得的ME-200GLFG(L)-200Boc(1..8g、4.3×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(9.0g)中，加入甲磺酸(292μL、4.5×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，用甲苯(18g)稀释反应液，加入离子交换水(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。依据日本专利特开2014-208786记载的条件，使用1mol/L盐酸将水层的pH调节为2.0，用甲苯和氯仿的混合溶液清洗水层，去除不具有氨基的聚乙二醇杂质。接着向水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，将pH调节至12后，溶解氯化钠(4.5g)。向其中添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(27g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(0.90g)，在30℃下搅拌30分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)。产量为1.5g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度91％。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例2]
化合物(p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)的合成
【化79】
Figure BDA0002707611710000741
[实施例2-1]
【化80】
Figure BDA0002707611710000742
将使用专利第3508207号等记载的制法合成的单个末端具有3,3-二乙氧基丙基、单个末端具有羟基的杂双官能PEG(15.0g、7.5×10-4摩尔、平均分子量＝约20,000)溶解于无水二氯甲烷(75g)中后，添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.2g、4.7×10-3摩尔、东京化成工业株式会社制)和三乙胺(836μL，6.0×10-3摩尔、关东化学株式会社)，使其在室温下在氮气气氛下反应5小时。使用5A滤纸进行抽滤后，在40℃下浓缩滤液，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(150g)和2,6-二叔丁基对甲酚(30mg)搅拌至均匀。添加己烷(75g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，回收析出物，再次添加乙酸乙酯(150g)和2,6-二叔丁基对甲酚(30mg)进行溶解。添加己烷(75g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。进行4次相同的操作后，将获得的析出物用己烷(90g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤后，真空干燥而获得上述化合物(p6)。产量为11.8g。
NMR(CDCl3)：1.20ppm(t、6H、-CH2-CH2-CH(OCH2 CH3 )2)、1.90ppm(q、2H、-CH2-CH2 -CH(OCH2CH3)2)、2.84ppm(s、4H、-O-CO-O-NC4H4O2 )、3.65ppm(m、约1，900H、-O-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2CH2 O)n-CH2-)、4.46ppm(t、2H、-O-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2-)、4.64ppm(t、1H、-CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2)
[实施例2-2]
【化81】
Figure BDA0002707611710000751
将实施例1-2中所得的ME-200GLFG(L)-NH2(1.9g、9.0×10-5摩尔)溶解于氯仿(18g)中后，添加三乙胺(13μL、9.3×10-5摩尔、关东化学株式会社)和实施例2-1中所得的琥珀酰亚胺基-PEG-3,3-二乙氧基丙基(1.5g、7.5×10-5摩尔、平均分子量＝约21,000)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，依据日本专利特开2011-79934记载的条件，将获得的浓缩物溶解于甲苯和氯仿的混合溶液中，用5％食盐水清洗有机层，去除分子量约21,000的聚乙二醇杂质。在40℃下浓缩有机层，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(60g)溶解后，加入己烷(30g)在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。将获得的析出物再次溶解于乙酸乙酯(60g)，加入己烷(30g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。回收析出物后，用己烷(30g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p7)(ME-200GLFG(L)-200DE)。产量为3.1g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.20ppm(t、6H、-CH2-CH2-CH(OCH2 CH3 )2)、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、1.90ppm(q、2H、-CH2-CH2 -CH(OCH2CH3)2)、2.58ppm(m、1H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、4.29ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、4.64ppm(t、1H、-CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2)、6.38ppm(宽、1H)、6.89ppm(宽、1H)、6.99ppm(宽、1H)、7.10ppm(宽、1H)、7.29ppm(m、5H)
[实施例2-3]
【化82】
Figure BDA0002707611710000761
实施例2-2中所得的ME-200GLFG(L)-200DE(1.0g、2.4×10-5摩尔)溶解于注射用蒸馏水(20g)后，用85％磷酸(0.46g)调节pH至1.50，使其在20～25℃下反应2小时。反应后，添加400g/L的氢氧化钠水溶液0.69g，调节pH至6.70后，添加氯化钠(4.0g)使之溶解。向获得的溶液中滴加1M的氢氧化钠水溶液(1.76g)，调节pH至7.05后，添加预先溶解有2,6-二叔丁基对甲酚(1..5mg)的氯仿(15g)，室温下搅拌20分钟，将生成物萃取至有机层。分离有机层和水层，回收有机层后，向水层中再次添加预先溶解有2,6-二叔丁基对甲酚(1.5mg)的氯仿(15g)，室温下搅拌20分钟，将生成物萃取至有机层。在50℃下浓缩第1次和第2次萃取中获得的有机层，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(10g)，搅拌至均匀后、加入硫酸镁(0.25g)，在30℃下搅拌15分钟，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤，用乙酸乙酯(10g)进行清洗。向获得的液体中添加己烷(15g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用预先溶解有2,6-二叔丁基对甲酚(1.0mg)的己烷(10g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)。产量为0.65g。分子量如表1所示。醛纯度为86％(1H-NMR)。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.84ppm(m、5H)、2.68ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、4.06ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-)、4.12ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.51ppm(q、1H)、6.36ppm(宽、1H)、6.87ppm(宽、1H)、6.99ppm(宽、2H)、7.14ppm(宽、1H)、7.29ppm(m、5H)、9.80ppm(s、1H、-CH2CH2-CHO)
[实施例3]
化合物(p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)的合成
【化83】
Figure BDA0002707611710000771
[实施例3-1]
【化84】
Figure BDA0002707611710000772
用与实施例1相同的制造方法，以N末端用叔丁氧基羰基(Boc基)保护的甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-甘氨酸(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)、末端具有丙基氨基的甲氧基PEG(平均分子量＝约10,000，日油株式会社制“SUNBRIGHT MEPA-10T”)、在单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(平均分子量＝约10,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-100TS”)作为原料，获得上述化合物(p9)(ME- 100GLFG(L)-100PA)。产量为1.0g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例3-2]
【化85】
Figure BDA0002707611710000781
向实施例3-1中所得的ME-100GLFG(L)-100PA(1.0g、5.0×10-5摩尔)和Boc-Gly-Phe-Leu-Gly(0.99g、2.0×10-4摩尔、GenScript Biotech Corp.制)中添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(10g)，在30℃下加温溶解。然后，添加二异丙基乙胺(65μL、3.8×10-4摩尔、关东化学株式会社制)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐(COMU)(0.106g、2.5×10-4摩尔、Sigma-Aldrich Company Ltd.制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。反应结束后，用氯仿(100g)进行稀释，添加饱和碳酸氢钠水溶液(50g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，再次向有机层中添加饱和碳酸氢钠水溶液(50g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗，回收有机层。向获得的有机层中添加硫酸镁(1.0g)，搅拌30分钟进行脱水后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。在40℃下浓缩获得的液体，向浓缩物中添加乙酸乙酯(50g)搅拌至均匀后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(50g)中，室温下加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(25g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p10)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc)。产量为0.9g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、4H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，800H、-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(宽、2H)、6.45ppm(宽、2H)、6.93ppm(宽、2H)、7.06ppm(宽、2H)、7.13ppm(宽、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例3-3]
【化86】
Figure BDA0002707611710000791
将实施例3-2中所得的ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc(0.9g、4.5×10-5摩尔)以与实施例1-2相同的制造方法，进行Boc基的脱保护，获得上述化合物(p11)(ME-100GLFG (L)-100GLFG(L)-NH2 )。产量为0.8g。
NMR(CDCl3)：0.89ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、0.91ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.53ppm(m、4H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1，70ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.10ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.18ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、14H)、3.74ppm(m、约1，800H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-)、4.31ppm(宽、2H)、4.55ppm(t、2H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(宽、2H)、7.00ppm(宽、2H)、7.28ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.98ppm(宽、2H)
[实施例3-4]
【化87】
Figure BDA0002707611710000801
将实施例3-3中所得的ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-NH2(0.8g、4.0×10-5摩尔)以与实施例1-3相同的制造方法，与单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(平均分子量＝约10,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-100TS”)进行反应，获得上述化合物(p12)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)- 100Boc)。产量为1.0g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、10H)、3.20ppm(m、8H)、3.33ppm(m、6H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约2，700H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、4H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(宽、2H)、6.45ppm(宽、2H)、6.93ppm(宽、2H)、7.06ppm(宽、2H)、7.13ppm(宽、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例3-5]
【化88】
Figure BDA0002707611710000802
将实施例3-4中所得的ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100Boc(1.0g、3.3×10-5摩尔)以与实施例1-4相同的制造方法，进行Boc基的脱保护。获得的粗生成物用填充有阳离子交换树脂SP Sepharose FF(GE Healthcare制)的离子交换色谱进行提纯，获得上述化合物(p13)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)。产量为0.8g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、2H)、1.62ppm(t、2H)、1.71ppm(m、2H)、1.82ppm(m、4H)、3.12ppm(m、4H)、3.19ppm(d、4H)、3.34ppm(m、4H)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约2，700H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、6.46ppm(宽、2H)、6.94ppm(宽、2H)、7.08ppm(宽、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例3-6]
【化89】
Figure BDA0002707611710000811
使用实施例3-5中所得的ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA(0.8g、2.7×10-5摩尔)作为原料，按照实施例3-2、实施例3-3、实施例3-4、实施例3-5的顺序以相同的制造方法重复进行反应，由此获得上述化合物(p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)- 100PA)。产量为0.4g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度90％。NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、18H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、3H)、1.62ppm(t、3H)、1.71ppm(m、3H)、1.82ppm(m、6H)、3.12ppm(m、6H)、、3.19ppm(d、6H)、3.34ppm(m、6H)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，600H、-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、8H)、4.34ppm(m、3H)、4.50ppm(q、3H)、6.46ppm(宽、3H)、6.94ppm(宽、3H)、7.08ppm(宽、3H)、7.27ppm(m、15H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例4]
化合物(p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)的合成
【化90】
Figure BDA0002707611710000821
[实施例4-1]
【化91】
Figure BDA0002707611710000822
向N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-缬氨酰-L-瓜氨酰-甘氨酸(Fmoc-Val-(Cit)-Gly)(0.299g、5.4×10-4摩尔、GenScript Biotech Corp.制)和末端具有丙基氨基的甲氧基PEG(2.7g、1.3×10-4摩尔、平均分子量＝约21,000、日油株式会社制“SUNBRIGHTMEPA-20T”)中添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(27g)，在30℃下加温溶解。然后，添加二异丙基乙胺(172μL、1.0×10-3摩尔、关东化学株式会社制)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐(COMU)(0.289g、6.810-4摩尔、Sigma-AldrichCompany Ltd.制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。反应结束后，用氯仿(270g)进行稀释，添加饱和碳酸氢钠水溶液(108g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，再次向有机层中添加饱和碳酸氢钠水溶液(108g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗，回收有机层。向获得的有机层中添加硫酸镁(2.7g)，搅拌30分钟进行脱水后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。在40℃下浓缩获得的液体，向浓缩物中添加乙酸乙酯(108g)搅拌至均匀后，加入己烷(54g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(108g)，室温下加入己烷(54g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(54g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p15)(ME-200G(Cit)V-Fmoc)。产量为2.3g。
NMR(d6-DMSO)：0.84ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、0.85ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、1.37ppm(m、2H)、1.52ppm(m、1H)、1.63ppm(m、3H)、1.98ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-CH(CH3)2)、2.93ppm(m、4H)、、3.09ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2 -NH-CO-NH2)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.48ppm(m、约1，900H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、3.89ppm(m、2H)、4.25ppm(m、3H、-NH-CO-O-CH2-CH＜)、5.35ppm(宽、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH2 )、5.91ppm(宽、1H)、7.33ppm(t、2H、Ar)、7.41ppm(m、3H、Ar)、7.73ppm(m、3H、Ar)、7.89ppm(d、2H、Ar)、8.10ppm(d、1H)、8.20ppm(宽、1H)
[实施例4-2]
【化92】
Figure BDA0002707611710000831
向实施例4-1中所得的ME-200G(Cit)V-Fmoc(2.1g、1.0×10-4摩尔)中添加N,N’-二甲基甲酰胺(12.6g)，在30℃下加温溶解。添加哌啶(0.66g、7.8×10-3摩尔、和光纯药工业株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应结束后，加入乙酸乙酯(150g)搅拌至均匀，添加己烷(75g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(150g)，添加己烷(75g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(75g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p16)(ME-200G(Cit)V-NH2 )。产量为1.8g。
NMR(d6-DMSO)：0.77ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、0.87ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、1.35ppm(m、2H)、1.51ppm(m、1H)、1.64ppm(m、4H)、1.93ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-CH(CH3)2)、2.96ppm(m、4H)、、3.10ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2 -NH-CO-NH2)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 、)、3.48ppm(m、约1，900H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、4.21ppm(宽、1H)、5.34ppm(宽、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH2 )、5.91ppm(宽、1H)、7.73ppm(t、1H)、8.08ppm(宽、1H)、8.23ppm(t、1H)
[实施例4-3]
【化93】
Figure BDA0002707611710000841
将实施例4-2中所得的ME-200G(Cit)V-NH2(1.2g、5.7×10-5摩尔)溶解于氯仿(7.2g)中后，添加三乙胺(9.2μL、6.7×10-5摩尔、关东化学株式会社制)以及单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(1.2g、5.2×10-5摩尔、平均分子量＝约23,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-200TS”)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(120g)溶解后，加入己烷(60g)在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。将获得的析出物用己烷(12g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p17)(ME-200G(Cit)V-200Boc)。产量为2.1g。
NMR(CDCl3)：0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.59ppm(m、2H)、1.76ppm(m、3H)、1.82ppm(q、2H)、1.92ppm(m、1H)、3.09ppm(m、1H)、3.23ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2 -NH-CO-NH2)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、2H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.02ppm(宽、1H)、5.24ppm(宽、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH2 )、5.74ppm(宽、1H)、5.81ppm(d、1H)、7.05ppm(宽、1H)、7.46ppm(宽、1H)、8.30ppm(宽、1H)
[实施例4-4]
【化94】
Figure BDA0002707611710000851
将实施例4-3中所得的ME-200G(Cit)V-200Boc(2.0g、4.5×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(10g)，加入甲磺酸(291μL、4.5×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，用甲苯(20g)稀释反应液，加入离子交换水(20g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。依据日本专利特开2014-208786记载的条件，使用1mol/L盐酸将水层的pH调节为2.0，用甲苯和氯仿的混合溶液清洗水层，去除不具有氨基的聚乙二醇杂质。接着向水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，将pH调节至12后，溶解氯化钠(5.0g)。向其中添加氯仿(10g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(10g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(100g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(2.0g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的液体中加入己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(20g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)。产量为1.7g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度92％。
NMR(CDCl3)：0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、1.60ppm(m、2H)、1.75ppm(m、3H)、1.82ppm(m、2H)、1.93ppm(m、1H)、2.23ppm(m、1H)、2.82ppm(t、2H、-CH2-CH2-CH2-NH2 )、3.10ppm(m、1H)、3.30ppm(m、2H)、3..38ppm(m、4H)、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)n-CH2-CH2-)、3.95ppm(m、1H)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、1H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.24ppm(宽、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH2 )、5.79ppm(宽、1H)、5.82ppm(宽、1H)、7.06ppm(宽、1H)、7.48ppm(宽、1H)、8.31ppm(宽、1H)
[实施例5]
化合物(p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)的合成
【化95】
Figure BDA0002707611710000861
向实施例4-4中所得的ME-200G(Cit)V-200PA(0.2g、4.5×10-6摩尔)中添加甲苯(1.1g)和乙腈(0.16g)，在40℃下加温溶解。向获得的溶液中添加N-甲基吗啉(2.5μL、2.2×10-5摩尔、关东化学株式会社制)和3-马来酰亚胺基丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(1.8mg、6.8×10-6摩尔、株式会社大阪合成有机化学研究所制)，在40℃下使其在氮气气氛下反应1小时。向反应溶液中添加乙酸乙酯(6.0g)，搅拌至均匀后，在17℃下加入己烷(8.0g)，在17℃下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(8.0g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)。产量为0.12g。分子量如表1所示。马来酰亚胺纯度为88％(1H-NMR)。
NMR(CDCl3)：0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH3 )2)、1.59ppm(宽、2H)、1.76ppm(m、5H)、2.46ppm(t、2H、-CH2-CH2-CH2 -NH-CO-CH2-CH2-C4NO2H2)、3.12ppm(m、1H)、3.34ppm(m、5H)、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.02ppm(m、1H)、4.13ppm(m、1H)、4.28ppm(m、1H)、4.37ppm(m、1H)、5.86ppm(宽、1H)、6.42ppm(宽、1H)、6.68ppm(s、2H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-C4NO2H2 )、7.04ppm(宽、1H)、7.46ppm(宽、1H)、8.20ppm(宽、1H)
[实施例6]
化合物(p19)(ME-200GGG-200PA)的合成
【化96】
Figure BDA0002707611710000871
[实施例6-1]
【化97】
Figure BDA0002707611710000872
向甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(2.0g、1.1×10-2摩尔、关东化学株式会社制)中加入离子交换水(60g)和碳酸氢钠(4.5g)进行溶解后，添加四氢呋喃(60g)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)(4.6g、2.1×10-2摩尔、东京化成工业株式会社制)，在40℃下使其反应23小时。向反应溶液中添加水(120g)，冷却至5℃后，适量添加磷酸，调节pH为7，加入己烷(120g)在室温下搅拌15分钟。分离有机层和水层后，向水层中再次加入己烷(120g)在室温下搅拌15分钟。回收水层后，加入乙醇(100g)在50℃下进行浓缩，再次加入乙醇(100g)在50℃下进行浓缩。向获得的浓缩物中添加乙醇(100g)，在50℃下加温溶解后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。在50℃下浓缩获得的滤液后，真空干燥，获得Boc-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸。产量为1.5g。
NMR(D2O)：1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH3)3 )、3.78ppm(s、2H、-CH2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.84ppm(s、2H、-CO-NH-CH2 -COOH)、4.00ppm(s、2H、-CO-NH-CH2 -CO-NH-)
[实施例6-2]
【化98】
Figure BDA0002707611710000881
向Boc-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(0.174g、6.0×10-4摩尔)和末端具有丙氨基的甲氧基PEG(3.0g、1.4×10-4摩尔、平均分子量＝约21,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT MEPA-20T”)中，添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(27g)，在30℃下加温溶解。然后，添加二异丙基乙胺(191μL、1.1×10-3摩尔、关东化学株式会社制)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐(COMU)(0.321g、7.5×10-4摩尔、Sigma-AldrichCompany Ltd.制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。反应结束后，用氯仿(300g)进行稀释，添加饱和碳酸氢钠水溶液(120g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，再次向有机层中添加饱和碳酸氢钠水溶液(120g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗后、回收有机层。向获得的氯仿溶液中添加硫酸镁(3.0g)，搅拌30分钟进行脱水后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。在40℃下浓缩获得的液体，向浓缩物中添加乙酸乙酯(120g)搅拌至均匀后，加入己烷(60g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(120g)，加入己烷(60g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(60g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p21)(ME-200GGG-Boc)。产量为2.6g。
NMR(CDCl3)：1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、约1，900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)n-CH3)、3.86ppm(d、2H、-CH2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.91ppm(d、2H)、3.99ppm(d、2H)、5.69ppm(宽、1H)、7.10ppm(宽、1H)、7.44ppm(宽、2H)
[实施例6-3]
【化99】
Figure BDA0002707611710000891
将实施例6-2中所得的ME-200GGG-Boc(2.4g、1.1×10-4摩尔)溶解于二氯甲烷(12g)中，加入甲磺酸(723μL、1.1×10-2摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，将反应液用甲苯(24g)进行稀释，加入离子交换水(24g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。向获得的水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，调节pH为12后，溶解氯化钠(6.0g)。向其中添加氯仿(12g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(12g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(120g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(2.4g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的液体中加入己烷(60g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(24g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p22)(ME-200GGG-NH2 )。产量为2.2g。
NMR(CDCl3)：1.53ppm(宽、1H)、1.79ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、约1，900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、3.92ppm(d、2H)、4.01ppm(宽、1H)、7.06ppm(宽、1H)、7.24ppm(宽、1H)、7.86ppm(宽、1H)
[实施例6-4]
【化100】
Figure BDA0002707611710000892
将实施例6-3中所得的ME-200GGG-NH2(1.5g、7.1×10-5摩尔)溶解于氯仿(7.5g)后，添加三乙胺(11.6μL、8.4×10-5摩尔、关东化学株式会社制)以及单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(1.8g、7.8×10-5摩尔、平均分子量＝约23,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-200TS”)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(150g)溶解后，加入己烷(75g)在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。将获得的析出物用己烷(75g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p23)(ME- 200GGG-200Boc)。产量为3.0g。
NMR(CDCl3)：1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.78ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3)、3.23ppm(m、2H、-CH2-CH2-CH2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.35ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.65ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(宽、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、5.01ppm(宽、1H)、6.21ppm(宽、1H)、7.00ppm(宽、1H)、7.47ppm(宽、1H)、7.61ppm(宽、1H)
[实施例6-5]
【化101】
Figure BDA0002707611710000901
将实施例6-4中所得的ME-200GGG-200Boc(2.5g、5.8×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(12.5g)中，加入甲磺酸(365μL、5..6×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，将反应液用甲苯(25g)进行稀释，加入离子交换水(25g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。依据日本专利特开2014-208786记载的条件，使用1mol/L盐酸将水层的pH调节为2.0，用甲苯和氯仿的混合溶液清洗水层，去除不具有氨基的聚乙二醇杂质。接着向水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，将pH调节至12后，溶解氯化钠(6.3g)。向其中添加氯仿(12.5g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(12.5g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(125g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(2.5g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的液体中加入己烷(62.5g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(25g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p19)(ME-200GGG-200PA)。产量为2.4g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度91％。
NMR(CDCl3)：1.79ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.91ppm(宽、2H)、3.37ppm(m、5H)、3.65ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、3.90ppm(t、3H)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(宽、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、6.19ppm(宽、1H)、7.00ppm(宽、1H)、7.45ppm(宽、1H)、7.61ppm(宽、1H)
[实施例7]
化合物(p24)(ME-200GF-200PA)的合成
【化102】
Figure BDA0002707611710000911
[实施例7-1]
【化103】
Figure BDA0002707611710000921
向N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-苯丙氨酰-甘氨酸(Fmoc-Phe-Gly)(0.533g、1.2×10-3摩尔、渡边化学工业株式会社制)和末端具有丙基氨基的甲氧基PEG(6.0g、2.9×10-4摩尔、平均分子量＝约21,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT MEPA-20T”)中添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(60g)，在30℃下加温溶解。然后，添加二异丙基乙胺(383μL、2.3×10-3摩尔、关东化学株式会社制)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐(COMU)(0.642g、1.5×10-3摩尔、Sigma-Aldrich CompanyLtd.制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。反应结束后，用氯仿(600g)进行稀释，添加饱和碳酸氢钠水溶液(240g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，再次向有机层中添加饱和碳酸氢钠水溶液(240g)，在室温下搅拌15分钟进行清洗，回收有机层。向获得的氯仿溶液中添加硫酸镁(2.4g)，搅拌30分钟进行脱水后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。在40℃下浓缩获得的液体，向浓缩物中添加乙酸乙酯(240g)搅拌至均匀后，加入己烷(120g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(240g)中，加入己烷(120g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(120g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p25)(ME-200GF-Fmoc)。产量为5.1g。
NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、2.80ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.04ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.48ppm(m、约1，900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、4.20ppm(m、4H)、7.33ppm(m、9H)、7.66ppm(m、4H、Ar)、7.88ppm(d、2H、Ar)、8.27ppm(t、1H)
[实施例7-2]
【化104】
Figure BDA0002707611710000931
向实施例7-1中所得的ME-200GF-Fmoc(4.9g、2.3×10-4摩尔)中添加N,N’-二甲基甲酰胺(29.4g)，在30℃下加温溶解。添加哌啶(1.55g、1.8×10-2摩尔、和光纯药工业株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应结束后，加入乙酸乙酯(300g)搅拌至均匀，添加己烷(150g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(300g)，加入己烷(150g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(150g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p26)(ME-200GF-NH2 )。产量为3.9g。
NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、1.64ppm(宽、1H)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.48ppm(m、约1，900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(宽、1H)
[实施例7-3]
【化105】
Figure BDA0002707611710000932
将实施例7-2中所得的ME-200GF-NH2(0.98g、4.7×10-5摩尔)溶解于氯仿(4.9g)中后，添加三乙胺(7.5μL、5.4×10-5摩尔、关东化学株式会社制)以及单个末端具有以叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有碳酸琥珀酰亚胺酯基的杂双官能PEG(1.3g、6.2×10-5摩尔、平均分子量＝约23,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-200TS”)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(98g)溶解后，加入己烷(49g)在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。将获得的析出物用己烷(49g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p27)(ME- 200GF-200Boc)。产量为2.0g。
NMR(CDCl3)：1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3)、3.02ppm(m、1H)、3.21ppm(m、3H)、3.36ppm(m、4H)、3.65ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.39ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.03ppm(宽、1H)、5.55ppm(d、1H)、6.86ppm(宽、1H)、7.02ppm(宽、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例7-4]
【化106】
Figure BDA0002707611710000941
将实施例7-3中所得的ME-200GF-200Boc(1.8g、4.1×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(9.0g)中，加入甲磺酸(262μL、4.3×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，用甲苯(18g)稀释反应液，加入离子交换水(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。依据日本专利特开2014-208786记载的条件，使用1mol/L盐酸将水层的pH调节为2.0，用甲苯和氯仿的混合溶液清洗水层，去除不具有氨基的聚乙二醇杂质。接着向水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，将pH调节至12后，溶解氯化钠(4.5g)。向其中添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(90g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(1.8g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的液体中加入己烷(45g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p24)(ME-200GF-200PA)。产量为1.7g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度87％。
NMR(CDCl3)：1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.87ppm(m、2H)、3.07ppm(m、1H)、3.30ppm(m、3H)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.56ppm(宽、1H)、6.83ppm(宽、1H)、6.96ppm(宽、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例8]
化合物(p28)(ME-200GAV-200PA)的合成
【化107】
Figure BDA0002707611710000951
以与实施例4相同的制造方法，使用N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-缬氨酸-L-丙氨酸-甘氨酸(Fmoc-Val-Ala-Gly)作为原料，获得上述化合物(p28)(ME- 200GAV-200PA)。产量为1.0g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度90％。
NMR(d6-DMSO)：0.82ppm(dd、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.21ppm(d、3H、-NH-CO-CH(CH3)-)、1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、1.95ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.60ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.22ppm(m、1H)、7.24ppm(宽、1H)、7.69ppm(宽、1H)、8.10ppm(宽、2H)
[实施例9]
化合物(p29)(ME-200GFGG-200PA)的合成
【化108】
Figure BDA0002707611710000961
以与实施例4相同的制造方法，使用N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的甘氨酸-甘氨酸-L-苯丙氨酸-甘氨酸(Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly)作为原料，获得上述化合物(p29)(ME-200GFGG-200PA)。产量为1.2g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度91％。
NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.60ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.43ppm(宽、1H)、7.62ppm(宽、1H)、8.00ppm(宽、1H)、8.12ppm(宽、1H)、8.24ppm(宽、1H)
[实施例10]
化合物(p30)(ME-200GFG-200PA)的合成
【化109】
Figure BDA0002707611710000962
以与实施例4相同的制造方法，使用N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的甘氨酸-L-苯丙氨酸-甘氨酸(Fmoc-Gly-Phe-Gly)作为原料，获得上述化合物(p30)(ME- 200GFG-200PA)。产量为1.1g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度89％。
NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.60ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.34ppm(宽、1H)、7.64ppm(宽、1H)、8.10ppm(宽、1H)、8.30ppm(宽、1H)
[实施例11]
化合物(p31)(ME-200GF-200PA(amide))的合成
【化110】
Figure BDA0002707611710000971
以与实施例7相同的制造方法，使用N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-苯丙氨酰-甘氨酸(Fmoc-Phe-Gly)以及单个末端具有被叔丁氧基羰基保护的丙基氨基、另一末端具有己酸-N-琥珀酰亚胺基活性酯的杂双官能PEG(平均分子量＝约21,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT BO-200HS”)作为原料，获得用酰胺键而非实施例7的氨基甲酸酯键导入杂双官能PEG的上述化合物(p31)(ME-200GF-200PA(amide))。产量为1.0g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度91％。
NMR(d6-DMSO)：1.11ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、1.38ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、1.62ppm(m、6H、-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.02ppm(m、2H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.60ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.26ppm(宽、1H)、7.64ppm(宽、1H)、8.10ppm(宽、1H)、8.30ppm(宽、、1H)
[实施例12]
化合物(p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)的合成
【化111】
Figure BDA0002707611710000981
用与实施例1相同的制造方法，使用N末端以叔丁氧基羰基(Boc基)保护的甘氨酸-D-苯丙氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸作为原料，获得具有作为光学异构体D型的氨基酸的上述化合物(p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)。产量为1.1g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度93％。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13]
化合物(p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-PA)的合成
【化112】
Figure BDA0002707611710000991
[实施例13-1]
【化113】
Figure BDA0002707611710000992
将N末端以叔丁氧基羰基(Boc基)保护的甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-甘氨酸(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.438g、8.8×10-4摩尔、GenScript Biotech Corp.制)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.128g、1.1×10-3摩尔、Midori Kagaku Co.,Ltd.制)溶解于无水N,N’-二甲基甲酰胺(1.0g)后，添加N,N’-二环己基碳二亚胺(0.229g、1.1×10-3摩尔、多摩化学工业株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。添加无水N,N’-二甲基甲酰胺(3.0g)稀释后，添加末端具有丙基氨基的甲氧基PEG(2.0g、2.2×10-4摩尔、平均分子量＝约9,000、日油株式会社制“SUNBRIGHT MEPA-10T”)，使其在室温下氮气气氛中反应1小时。然后，加入乙酸乙酯(20g)稀释反应液，使用铺有LS100滤纸的桐山漏斗进行抽滤。向滤液中加入乙酸乙酯(30g)，搅拌至均匀后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(50g)中，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(25g)清洗，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p35)(ME-100GLFG(L)-Boc)。产量为1.8g。
NMR(CDCl3)：0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH3)3 )1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.65ppm(m、约820H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、4.43ppm(宽、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.77ppm(宽、1H)、6.76ppm(宽、1H)、6.86ppm(宽、1H)、6.90ppm(宽、1H)、7.14ppm(宽、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-2]
【化114】
Figure BDA0002707611710001001
将实施例13-1中所得的ME-100GLFG(L)-Boc(1.8g、2.0×10-4摩尔)溶解于二氯甲烷(9.0g)中，加入甲磺酸(1.3mL、2.0×10-2摩尔、关东化学株式会社制)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。然后，用甲苯(18g)稀释反应液，加入离子交换水(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。向获得的水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，调节pH为12后，溶解氯化钠(4.5g)。向其中添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(18g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(36g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(0.90g)，在30℃下搅拌15分钟后，使用在5A滤纸上铺有Opliite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p36)(ME-100GLFG(L)-NH2 )。产量为1.4g。
NMR(CDCl3)：0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH2 -CH(CH3)2)、1，70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、约820H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3)、4.31ppm(宽、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(宽、1H)、7.00ppm(宽、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.98ppm(宽、1H)
[实施例13-3]
【化115】
Figure BDA0002707611710001011
将使用非专利文献(Bioconjugate Chem.，21(2010)，pp.248-254)等记载的制造方法合成的单个末端具有四氢吡喃基、单个末端具有羟基的杂双官能PEG(5g、6.0×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(12g)后，添加碳酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯(0.513g、2.0×10-3摩尔、东京化成工业株式会社制)和吡啶(243μL、3.0×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，在27℃氮气气氛下使其反应7小时。然后，将反应液以二氯甲烷(20g)进行稀释，使用5A滤纸进行抽滤，向获得的液体中加入2,6-二叔丁基对甲酚(4.3mg)搅拌5分钟。然后，加入5wt％氯化钠水溶液(6g、pH5)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，向有机层中加入硫酸镁(1.0g)，在室温下搅拌30分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。将获得的滤液在35℃下进行浓缩后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(50g)进行溶解。溶解后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌30分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。向获得的析出物中加入己烷(25g)搅拌30分钟，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p37)(THP-10TS)。产量为4.3g。
NMR(CDCl3)：1.52ppm(m、2H、-四氢吡喃基(tetrahydropyranyl))、1.59ppm(m、2H、-四 氢吡喃基)、1.73ppm(m、1H、-四氢吡喃基)、1.85ppm(m、1H、-四氢吡喃基)、2.85ppm(t、4H、- 琥珀酰亚胺)、3.64ppm(m、约820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、3.80ppm(m、2H)、3.88ppm(m、2H、-四氢吡喃基)、4.47ppm(m、2H)、4.64ppm(t、1H、-四氢吡喃基)
[实施例13-4]
【化116】
Figure BDA0002707611710001021
将实施例13-2中所得的ME-100GLFG(L)-NH2(3.64g、3.4×10-4摩尔)溶解于氯仿(17g)中后，添加三乙胺(56.5μL、4.1×10-4摩尔、关东化学株式会社)、实施例13-3中所得的THP-10TS(2.80g、3.1×10-4摩尔)，使其在室温下氮气气氛中反应2小时。反应后，在40℃下浓缩，向获得的浓缩物中加入0.1mol/L柠檬酸钠水溶液(120g、pH2.5)溶解后，室温下氮气气氛下使其反应4小时。反应后，加入氯仿(50g)和2,6-二叔丁基对甲酚(5.0mg)搅拌10分钟。分离水层和有机层后，向有机层中加入硫酸镁(3.2g)，在40℃下搅拌30分钟后、使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。浓缩获得的滤液后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(50g)进行溶解。溶解后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。向获得的析出物中加入己烷(25g)搅拌15分钟，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥获得上述化合物(p38)(ME-100GLFG(L)-100HO)。产量为5.30g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.48ppm(宽、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-5]
【化117】
Figure BDA0002707611710001031
将实施例13-4中所得的ME-100GLFG(L)-100HO(5.0g、2.8×10-4摩尔)溶解于二氯甲烷(12g)中后，添加碳酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯(0.285g、1..1×10-3摩尔、东京化成工业株式会社制)和吡啶(135μL、1.7×10-3摩尔、关东化学株式会社制)，在27℃下氮气气氛下使其反应7小时。然后，用二氯甲烷(20g)稀释反应液，使用5A滤纸进行抽滤，向获得的液体中加入2,6-二叔丁基对甲酚(4.3mg)搅拌5分钟。然后，加入5wt％氯化钠水溶液(6g、pH5)，在室温下搅拌15分钟进行清洗。分离水层和有机层后，向有机层中加入硫酸镁(1.0g)，在室温下搅拌30分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。将获得的滤液在35℃下浓缩后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(50g)进行溶解。溶解后，加入己烷(25g)，在室温下搅拌30分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤。向获得的析出物中加入己烷(25g)搅拌30分钟，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p39)(ME-100GLFG(L)- 100TS)。产量为4..2g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH3)3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、2.85ppm(t、4H、-琥珀酰亚胺)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(宽、1H)、6.45ppm(宽、1H)、6.93ppm(宽、1H)、7.06ppm(宽、1H)、7.13ppm(宽、1H)、、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-6]
【化118】
Figure BDA0002707611710001041
将实施例13-5中所得的ME-100GLFG(L)-100TS(3.6g、2.0×10--4摩尔)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(7.0g)中，加入L-赖氨酸乙酯·二盐酸盐(26mg、1.1×10-4摩尔、Sigma-Aldrich Company Ltd.制)、三乙胺(73mg、7.2×10-4摩尔)，氮气气氛下在40℃使其反应5小时。将反应液用乙酸乙酯(36g)稀释后，使用铺有5A滤纸的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p40)(LY-(ME- 100GLFG(L)-100)2-CE)。产量为3.1g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、1.28ppm(t、3H、-CO-O-CH2-CH3 )、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(宽、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(q、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、6H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(宽、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-7]
【化119】
Figure BDA0002707611710001051
将实施例13-6中所得的LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-CE(1.8g、5.0×10-5摩尔)溶解于0.13mol/L氢氧化钠水溶液(18g)中，在氮气气氛下室温下使其反应3小时。向反应液中溶解氯化钠(4.5g)后，使用85％磷酸将水层的pH调节至8.5，向其中添加二氯甲烷(11g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加二氯甲烷(11g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(36g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸镁(0.90g)，在30℃下搅拌30分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p41)(LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-C2)。产量为1.4g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(宽、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(宽、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-8]
【化120】
Figure BDA0002707611710001061
将实施例13-7中所得的LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-C2(1.5g、4.0×10-5摩尔)和2,6-二叔丁基对甲酚(1.2mg)溶解于甲苯(6.0g)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(16mg、1.4×10-4摩尔)、1,3-二环己基碳二亚胺(20mg、1.0×10-4摩尔)，在氮气气氛下40℃下使其反应4小时。接着，加入N-(叔丁氧基羰基)-1,3-二氨基丙烷，在氮气气氛下40℃下使其反应4小时。将反应液用甲苯(12g)稀释后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。获得的滤液用乙酸乙酯(18g)稀释后，加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p42)(LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-Boc)。产量为1.1g。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、、1.36ppm(m、2H)、1.44ppm(s、9H)、1.48ppm(宽、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、4H)、3.19ppm(d、2H)、3.29ppm(m、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.08ppm(宽、1H)、5.56ppm(d、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[实施例13-9]
【化121】
Figure BDA0002707611710001071
将实施例13-8中所得的LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-Boc(0..90g、2.5×10-5摩尔)溶解于二氯甲烷(4.5g)，加入甲磺酸(162μL、2.5×10-3摩尔)，在氮气气氛下室温使其反应2小时。将反应液用甲苯(9.0g)稀释后，加入离子交换水(23g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至水层。然后，用甲苯和氯仿的混合溶液清洗水层，去除不具有氨基的聚乙二醇杂质。接着向水层中适量添加1mol/L氢氧化钠水溶液，将pH调节至12后，溶解氯化钠(2.3g)。向其中添加氯仿(9.0g)，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。分离水层和有机层后，向水层中再次添加氯仿(9.0g)，，在室温下搅拌15分钟，将生成物萃取至有机层。在40℃下浓缩第1次和第2次萃取中所得的有机层后，向获得的浓缩物中添加乙酸乙酯(36g)。向获得的乙酸乙酯溶液中，加入硫酸钠(0.90g)，在30℃下搅拌30分钟后，使用在5A滤纸上铺有Oplite的桐山漏斗进行抽滤。向获得的滤液中加入己烷(18g)，在室温下搅拌15分钟使生成物析出，使用5A滤纸进行抽滤后，用己烷(18g)清洗析出物，使用5A滤纸进行抽滤，真空干燥而获得上述化合物(p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-PA)。产量为0.8g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度92％。
NMR(CDCl3)：0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3 )2)、、1.37ppm(m、2H)、1.48ppm(宽、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、2.84ppm(m、2H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.64ppm(m、约1，600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.58ppm(宽、1H)、6.46ppm(宽、1H)、6.94ppm(宽、1H)、7.08ppm(宽、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )
[比较例1]
化合物(p33)(ME-200F-200PA)的合成
【化122】
Figure BDA0002707611710001081
以与实施例4相同的制造方法，使用N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe)为原料，获得上述化合物(p33)(ME-200F-200PA)。产量为1.8g。分子量如表1所示。HPLC：胺纯度92％。
NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH3 )、3.60ppm(m、约3，800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)n-CH2-CH2-)、3.95ppm(m、2H)、4.13ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 )、7.38ppm(宽、1H)、、7.91ppm(宽、1H)
以下表示实施例1～13和比较例1中所得的聚乙二醇衍生物的平均分子量。
【表1】
Figure BDA0002707611710001091
[实施例14]
在血清中的稳定性试验
向1.5mL的微型离心管中加入小鼠或人血清1mL，添加各种聚乙二醇衍生物至浓度成为5.0mg/mL。在37℃下孵育96小时后，取样200μL，向其中添加乙腈，用涡旋器搅拌1分钟，使血清中的蛋白质析出，离心分离后，回收上清液。接着为去除脂肪酸等疏水性物质，向回收液中添加己烷，用涡旋器搅拌1分钟，离心分离后，回收下层。将该溶液在真空条件下进行浓缩，从血清中回收聚乙二醇衍生物。然后，进行GPC分析，计算分解性聚乙二醇衍生物的分解率。
分解率按下式进行计算。
分解率＝(试验前的40kDa的峰面积％-试验后的40kDa的峰面积％)÷(试验前的40kDa的峰面积％)×100
结果如下表2所示。
【表2】
Figure BDA0002707611710001101
根据本试验可知，任一分解性聚乙二醇衍生物在96小时后的分解率均为20％以下，特别是GLFG(L)、G(cit)V等的分解率低，在血液中稳定。
[实施例15]
使用细胞的分解性试验
使用培养基RPMI-1640(10％FBS Pn/St)10mL，向100mm培养皿中接种10×106cell的RAW264.7，在37℃下培养24小时后，更换为溶解有各种聚乙二醇衍生物至浓度成为10mg/mL的培养基，在37℃下培养96小时。培养后，将细胞溶解于1％SDS溶液中，用PBS进行稀释，向其中添加乙腈，用涡旋器搅拌1分钟，使细胞溶解液中的蛋白质析出，离心分离后，回收上清液。接着为去除脂肪酸等疏水性物质，向回收液中添加己烷，用涡旋器搅拌1分钟，离心分离后，回收下层。将该溶液在真空条件下进行浓缩，从细胞内回收聚乙二醇衍生物。
此外，为了确认细胞培养中使用的培养基中的分解，在37℃下仅在溶解有各种聚乙二醇衍生物至浓度成为10mg/mL的培养基中培养96小时，以与上述相同操作进行聚乙二醇衍生物的回收。
然后，进行回收的各种聚乙二醇衍生物的GPC分析，以与实施例14相同的计算式，计算分解性聚乙二醇衍生物的分解率。
结果如下表3所示。此外，细胞实验前后的GPC图谱如图1和图2所示。
【表3】
Figure BDA0002707611710001111
在具有寡肽作为分解性接头的聚乙二醇衍生物中，可以确认到在细胞内有效地分解，从分子量4万分解至2万。此外，使用天然存在较少的D型氨基酸的ME-200GLFG(D)-200PA中虽然分解率低，但也确认到进行了分解。另一方面，使用比较例1的苯丙氨酸作为接头的聚乙二醇衍生物和非分解性的甲氧基PEG胺40kDa不能确认到细胞内的分解。
[实施例16]
鲑降钙素(sCT)的PEG化
将氨基酸序列：
将CSNLSTCVLG KLSQELHKLQ TYPRTNTGSG TP(序列号：1)的鲑降钙素(sCT)(5mg、1.5×10-6摩尔、PH Japan Co.,Ltd制)溶解于100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中，加入实施例2中所得的ME-200GLFG(L)-200AL或甲氧基PEG醛40kDa(180mg、4.5×10-6摩尔)和还原剂2-吡啶甲基硼烷(2-picolyl borane)(2.0×10-5摩尔)，调节sCT浓度至1.0mg/mL，在4℃下使其反应24小时。然后，使用10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)对反应液进行透析，以使用HiTrap SP HP(5mL、GE Healthcare制)的离子交换色谱进行提纯，获得ME-200GLFG(L)-200-sCT或甲氧基PEG40kDa-sCT。摩尔收率为44％。
RPLC分析
装置：Waters Corporation制“ALLIANCE”
检测器：UV(280nm)
色谱柱：Inertsil WP300 C18(GL Sciences)
流动相A：0.05％TFA-H2O
流动相B：0.05％TFA-ACN
梯度：B30％(0min)→B40％(5min)→B50％(15min)→B100％(16min)→B100％(20min)
流速：1.0mL/min
色谱柱温度：40℃
按照上述RPLC分析条件，计算PEG化sCT的纯度。结果如图3所示。
ME-200GLFG(L)-200-sCT的RPLC纯度99％
甲氧基PEG 40kDa-sCT的RPLC纯度99％
MALDI-TOF-MS分析
装置：Bruker Corporation制“autoflex3”
样品：0.5mg/mL、PBS溶液
基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)饱和溶液(0.01％TFA-H2O：ACN＝2：1)
混合样品(1μL)和基质(19μL)，取1μL作为标靶(target)的斑点(spot)
在上述MALDI-TOF-MS分析条件下，测定原料PEG和PEG化sCT的分子量。
图4中，将作为原料的ME-200GLFG(L)-200AL和ME-200GLFG(L)-200-sCT的MALDI-TOF-MS的结果一并显示。
ME-200GLFG(L)-200-sCT的分子量46,289
ME-200GLFG(L)-200AL的分子量43,210
图5中，将作为原料的甲氧基PEG醛40kDa和甲氧基PEG40kDa-sCT的MALDI-TOF-MS的结果一并显示。
甲氧基PEG 40kDa-sCT的分子量46,427
甲氧基PEG醛40kDa的分子量43,303
确认到：PEG化sCT的分子量，相比作为原料的PEG衍生物的分子量，大致仅sCT的分子量的部分增加了。
SDS-PAGE分析
试剂盒：Thermo Fisher Scientific Inc.制NuPAGE(注册商标)Bis-Tris PrecastGel(凝胶浓度4-12％)
染色液：考马斯亮蓝溶液(CBB溶液)或碘染色溶液(BaCl2+I2溶液)
依据上述SDS-PAGE试剂盒的推荐测定条件，进行PEG化sCT的评价。结果如图6所示。在PEG化sCT中，在使蛋白质和肽选择性染色的CBB染色下，可观察到条带，进一步地，在使聚乙二醇染色的碘染色中，也可观察到条带。在两种染色下观察到条带，确认到聚乙二醇衍生物与sCT键合。
[实施例17]
人生长激素(hGH)的PEG化
将氨基酸序列：
MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIPTPSNREETQQ KSNLELLRIS LLLIQSWLEP VQFLRSVFAN SLVYGASDSN VYDLLKDLEE GIQTLMGRLEDGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF(序列号：2)的人生长激素(hGH)(4mg、1.8×10-7摩尔、Shenandoah Biotechnology公司制)溶解于100mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入实施例2中所得的ME-200GLFG(L)-200AL或甲氧基PEG醛40kDa(36mg、9.0×10-7摩尔)和作为还原剂的氰基硼氢化钠(9.0×10-6摩尔)，将hGH浓度调节至1.0mg/mL，在25℃下使其反应24小时。然后，使用10mM乙酸钠缓冲液(pH4.7)对反应液进行透析，以使用HiTrap SP HP(5mL、GE Healthcare制)的离子交换色谱进行提纯，获得ME-200GLFG(L)-200-hGH或甲氧基PEG40kDa-hGH。摩尔收率为30％。
RPLC分析
装置：WATERS CORPORATION制“ALLIANCE”
检测器：UV(280nm)
色谱柱：Inertsil WP300 C18(CL SCIENCES)
流动相A：0.05％TFA-H2O
流动相B：0.05％TFA-ACN
梯度：B40％(0min)→B80％(25min)→B90％(27min)→B40％(27.1min)
流速：1.0mL/min
色谱柱温度：40℃
在上述RPLC分析条件下，计算PEG化hGH的纯度。
ME-200GLFG(L)-200-hGH的RPLC纯度90％
甲氧基PEG40kDa-hGH的RPLC纯度97％
MALDI-TOF-MS分析
装置：Bruker Corporation制“autoflex3”
样品：0.5mg/mL、PBS溶液
基质：肉桂酸(SA)饱和溶液(0.01％TFA-H2O：ACN＝2：1)
混合样品(1μL)和基质(19μL)，取1μL作为标靶(target)的斑点(spot)
在上述MALDI-TOF-MS分析条件下，测定PEG化hGH的分子量。结果如图7和图8所示。
ME-200GLFG(L)-200-hGH的分子量65,153
甲氧基PEG40kDa-hGH的分子量65,263
确认到：PEG化hGH的分子量，相比作为原料的PEG衍生物(参考图4和图5)的分子量，大致仅hGH的分子量的部分增加了。
SDS-PAGE分析
试剂盒：Thermo Fisher Scientific Inc.制NuPAGE(注册商标)Bis-Tris PrecastGel(凝胶浓度4-12％)
染色液：考马斯亮蓝溶液(CBB溶液)或碘染色溶液(BaCl2+I2溶液)
依据上述SDS-PAGE试剂盒的推荐测定条件，进行PEG化hGH的评价。结果如图9所示。在PEG化hGH中，在使蛋白质和肽选择性染色的CBB染色下，可观察到条带，进一步地，在使聚乙二醇染色的碘染色下，也可观察到条带。在两种染色下观察到条带，确认到聚乙二醇衍生物与hGH键合。
[实施例18]
粒细胞集落刺激因子(GCSF)的PEG化
将氨基酸序列：
TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPALQPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP(序列号：3)的粒细胞集落刺激因子(GCSF)(100μg、5.3×10-9摩尔、PeproTech,Inc.制)溶解于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.6、含5％山梨糖醇)，加入实施例2中所得的ME-200GLFG(L)-200AL和作为还原剂的氰基硼氢化钠(5.3×10-7摩尔)，调节GCSF浓度至2.0mg/mL，在4℃下使其反应24小时。然后，使用10mM乙酸钠缓冲液(pH4.6)稀释反应液，以使用HiTrap SP HP(5mL、GE Healthcare制)的离子交换色谱进行提纯，获得ME-200GLFG(L)-200-GCSF。摩尔收率为64％。
RPLC分析
装置：WATERS CORPORATION制“ALLIANCE”
检测器：UV(280nm)
色谱柱：Inertsil WP300 C18(CL SCIENCES)
流动相A：0.1％TFA-H2O
流动相B：0.1％TFA-ACN
梯度：B40％(0min)→B70％(25min)→B90％(27min)→B40％(29min)
流速：1.0mL/min
色谱柱温度：40℃
在上述RPLC分析条件下，计算PEG化GCSF的纯度。
ME-200GLFG(L)-200-GCSF的RPLC纯度97％
MALDI-TOF-MS分析
装置：Bruker Corporation制“autoflex3”
样品：0.5mg/mL、PBS溶液
基质：肉桂酸(SA)饱和溶液(0.01％TFA-H2O：ACN＝2：1)
混合样品(1μL)和基质(19μL)，取1μL作为标靶(target)的斑点(spot)
在上述MALDI-TOF-MS分析条件下，测定PEG化GCSF的分子量。ME-200GLFG(L)-200-GCSF的分子量62,266。确认到：PEG化GCSF的分子量，相比作为原料的PEG衍生物的分子量，大致仅GCSF的分子量的部分增加了。
SDS-PAGE分析
试剂盒：Thermo Fisher Scientific Inc.制NuPAGE(注册商标)Bis-Tris PrecastGel(凝胶浓度4-12％)
染色液：考马斯亮蓝溶液(CBB溶液)或碘染色溶液(BaCl2+I2溶液)
依据上述SDS-PAGE试剂盒的推荐测定条件，进行PEG化GCSF的评价。结果如图9所示。在PEG化GCSF中，在使蛋白质和肽选择性染色的CBB染色下，可观察到条带，进一步地，在使聚乙二醇染色的碘染色下，也可观察到条带。在两种染色下观察到条带，确认到聚乙二醇衍生物与GCSF键合。
[实施例19]
PEG化鲑降钙素(sCT)的生理活性评价
对于实施例16中所得的键合有分子量4万的分解性聚乙二醇衍生物的sCT的ME-200GLFG(L)-200-sCT、键合有非分解性的甲氧基PEG40kDa的甲氧基PEG40kDa-sCT、未修饰的sCT、以及生理盐水的4组，用动物实验对它们的生理活性进行对比评价。小鼠种类为Balb/c(8周龄、雄)，sCT溶液和PEG化sCT溶液分别使用生理盐水配制为以sCT浓度计成为0.5mg/mL，进行给药至以sCT的给药量计成为40μg/kg。在1、3、6、24小时时从小鼠中采集微量的血液，使用钙E-Test Wako(和光纯药工业株式会社制)测定钙浓度。其结果如图10所示。
相比于生理盐水(PBS)的组，全部sCT均使钙浓度显著降低。给药后6小时中，可观察到未修饰的sCT中钙浓度的上升，但在ME-200GLFG(L)-200-sCT和甲氧基PEG40kDa-sCT中，可知继续维持较低的钙浓度。显示通过PEG化，sCT的血液半衰期变长，生理活性得以延长。
[实施例20]
经由动物实验进行的体内动力学试验(放射性同位素)
将实施例16中所得的键合有分子量4万的分解性聚乙二醇衍生物的sCT即ME-200GLFG(L)-200-sCT、键合有非分解性甲氧基PEG40kDa的甲氧基PEG40kDa-sCT分别溶解于50mM碳酸氢钠水溶液中至浓度成为0.1mg/mL，向其中添加Bolton-Hunter试剂(0.4625MBq)，用涡旋器进行搅拌后，在室温下使其反应一夜。用PD-10色谱柱分离反应溶液，对于各馏分，使用聚乙二醇呈色试剂(硫氰酸铵和硝酸钴)和伽玛计数器，确认包含125I的馏分，进行回收。
使用获得的放射性同位素标记的两种PEG化sCT和同样地进行标记的sCT，用动物实验评价体内动力学。小鼠种类为Balb/c(8周龄、雄)，PEG化sCT溶液使用生理盐水分别将未标记的PEG化sCT配制为成为50mg/mL的浓度，微量添加放射性同位素标记的PEG化sCT，经由小鼠尾静脉给药20μL。然后，在1、3、6、48小时时，从小鼠中取出血液、各脏器(肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、心脏、胃、胰脏、肠、睾丸、甲状腺等)，使用伽玛计数器测定标记后的PEG化sCT的滞留量。
作为放射性同位素标记的、键合有分解性聚乙二醇衍生物的sCT即ME-200GLFG(L)-200-sCT和键合有非分解性甲氧基PEG40kDa的sCT即甲氧基PEG40kDa-sCT的体内动力学试验的结果，图11中显示了血液中浓度，图12～15中显示了在代表性脏器的肝脏、肾脏、脾脏、肺中的滞留量。
由该结果可证明，ME-200GLFG(L)-200-sCT相比于通常不具有分解性的甲氧基PEG40kDa-sCT，显示出相同程度的血液半衰期，此外在体内的分布趋向也相同。
[实施例21]
经由动物实验的空泡形成评价试验
使用实施例1中所得的末端具有氨基的分子量4万的分解性聚乙二醇衍生物ME-200GLFG(L)-200PA、非分解性的甲氧基PEG胺40kDa，进行经由动物实验的空泡形成评价。小鼠种类为Balb/c(8周龄、雄)，聚乙二醇溶液使用生理盐水配制为聚乙二醇衍生物的浓度成为100mg/mL，经由小鼠尾静脉给药20μL。持续进行每周3次、4周的连续给药，给药完成后，用4％多聚甲醛水溶液对小鼠进行灌注固定，制作石蜡切片。进行HE染色以及经由抗PEG抗体的免疫染色，评价脑的脉络丛上皮细胞中的空泡形成。作为免疫染色，使用免疫染色试剂盒(BOND Refine Polymer Detection Kit、莱卡公司制)和抗PEG抗体(B-47抗体、Abcam Inc.制)进行实施。进行经由抗PEG抗体的免疫染色后的脑的脉络丛切片的图像如图16和图17所示。
其结果，相比于甲氧基PEG胺40kDa，分解性聚乙二醇ME-200GLFG(L)-200PA显著地抑制了空泡的形成。
另外，本实施例中给药的聚乙二醇的量终归是为评价空泡化而优化后的量，相比于该技术领域中的通常的聚乙二醇的给药量，为极大的量。
[实施例22]
经由动物实验的聚乙二醇的蓄积性评价试验
使用末端具有氨基的分子量4万的分解性聚乙二醇衍生物ME-200GLFG(L)-200PA、非分解性的甲氧基PEG胺20kDa、甲氧基PEG胺40kDa、作为对照的PBS，进行经由动物实验的聚乙二醇的蓄积性评价。小鼠种类为Balb/c(8周龄、雄)，聚乙二醇溶液为使用生理盐水配制至聚乙二醇衍生物的浓度成为62.5mg/mL，通过小鼠尾静脉给药100μL。持续进行每周3次、4周的连续给药，给药完成后，用4％多聚甲醛水溶液对小鼠进行灌注固定，制作石蜡切片。进行经由抗PEG抗体的免疫染色，评价脑的脉络丛上皮细胞中的蓄积性。进行免疫染色后的各个脑的脉络丛切片的图像如图18所示。
给药不含聚乙二醇的PBS的小鼠的脉络丛切片中未发生染色，与此相对，非分解性的甲氧基PEG胺40kDa中的结果是切片在大范围被染色为褐色。该染色部分表示PEG发生蓄积。另一方面，在分解性聚乙二醇ME-200GLFG(L)-200PA的切片中，被染成褐色的部分少，显示出与分子量为其一半的甲氧基PEG胺20kDa相同的蓄积。作为结果，分解性聚乙二醇由于其分解性，相比于相同分子量的非分解性甲氧基PEG胺40kDa，显著地抑制了聚乙二醇在组织中的蓄积。
为了对这些蓄积进行定量化，使用以下的分析软件进行图像分析，计算分数。
装置：All in one microscopy BZ-X710
分析软件：BZ-X Analyzer
具体地，使用分析软件提取图像中的脉络丛组织的面积，以及显示出蓄积的褐色的染色部分的面积，通过以下的计算式实施评分。计算出的分数如表4所示。
蓄积率＝褐色的染色部分的面积/脉络丛组织的面积
分数＝蓄积率/PBS的蓄积率
其结果，显示分解性聚乙二醇可以显著地抑制聚乙二醇在组织中的蓄积。
另外，本实施例中给药的聚乙二醇的量终归是为评价蓄积性而优化后的量，相比于该技术领域中的通常的聚乙二醇的给药量，为极大的量。
【表4】
分数
PBS 1.0
甲氧基PEG胺40kDa 35.9
甲氧基PEG胺20kDa 2.3
ME-200GLFG(L)-200PA 4.2
【产业上的可利用性】
本发明的键合有分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质由于该分解性聚乙二醇衍生物在生物体内的血液中稳定，在聚乙二醇链之间具有经细胞内的酶而进行分解的寡肽，因而在血液中稳定，可对生物相关物质赋予与现有的不具有分解性的聚乙二醇衍生物相同的血液半衰期，因此，在被摄取至细胞内时，聚乙二醇链之间的寡肽部位被迅速分解，因而可以抑制迄今成为课题的细胞的空泡的产生。
本申请以在日本申请的日本专利特愿2018-064306作为基础，该内容全部包含在本说明书中。
序列表
<110> 日油株式会社（NOF CORPORATION）
国立大学法人东京工业大学（TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY）
<120> 分解性聚乙二醇键合体
<130> 092887
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 大西洋鲑（Salmo salar）
<400> 1
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu
1 5 10 15
His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro
20 25 30
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 3
<211> 174
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170

Claims (16)

1.一种生物相关物质，其键合有下式(A)所示的分解性聚乙二醇衍生物：
Figure FDA0002707611700000011
式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团，y为1～40。
2.根据权利要求1所述的生物相关物质，其为键合有下式(1)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
Figure FDA0002707611700000012
式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
3.根据权利要求1或2所述的生物相关物质，Q为乙二醇、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘油、季戊四醇、双甘油或木糖醇的残基。
4.根据权利要求1或2所述的生物相关物质，Q为寡肽的残基；该寡肽是包含赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的任意一种、且这些以外的氨基酸由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的4～8个残基的寡肽。
5.根据权利要求4所述的生物相关物质，Q的寡肽是具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
6.根据权利要求4或5所述的生物相关物质，Q的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的生物相关物质，Z的寡肽是具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
8.根据权利要求1～7中的任一项所述的生物相关物质，Z的寡肽是具有至少1个亲水指数为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
9.根据权利要求1～8中的任一项所述的生物相关物质，与D键合的分解性聚乙二醇衍生物的1分子的分子量为30,000以上。
10.根据权利要求1～9中的任一项所述的生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键、亚苯基、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、羰基、脲键、三嗪基、马来酰亚胺与硫醇的键、肟键，或可包含这些键和基团的亚烷基。
11.根据权利要求1～10中的任一项所述的生物相关物质，D的生物相关物质为激素、细胞因子、抗体、适配体或酶。
12.根据权利要求2所述的生物相关物质，其为键合有式(1)中的Z由Z1、A和甘氨酸残基构成的、下式(2)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
Figure FDA0002707611700000021
式中，m为1～7，n1和n2分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
13.根据权利要求12所述的生物相关物质，其为键合有式(2)中的m为1的、下式(3)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
Figure FDA0002707611700000031
式中，n3和n4分别独立地为45～682，p为1～4，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，Q为具有2～5个活性氢的化合物的残基，D为生物相关物质，L1、L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
14.根据权利要求2所述的生物相关物质，其为键合有式(1)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(4)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
Figure FDA0002707611700000032
式中，m为1～7，n5和n6分别独立地为113～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～8个残基的寡肽，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
15.根据权利要求12所述的生物相关物质，其为键合有式(2)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(5)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
Figure FDA0002707611700000033
式中，m为1～7，n5和n6分别独立地为113～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
16.根据权利要求13所述的生物相关物质，其为键合有式(3)中的Q为乙二醇的残基、L1为CH2CH2O、且p为1的、下式(6)所示的分解性聚乙二醇衍生物的生物相关物质：
【化7】
Figure FDA0002707611700000041
式中，n7和n8分别独立地为226～682，R为碳原子数1～4的烷基，Z1为由不包括半胱氨酸的中性氨基酸构成的2～6个残基的寡肽，A为不包括半胱氨酸的中性氨基酸，a和b分别独立地为0或1，且(a+b)≥1，D为生物相关物质，L2、L3、L4和L5分别独立地为单键或2价间隔基团。
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