CN112113948A - 一种病原微生物快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病原微生物快速检测方法，所述方法包括以下步骤：适配体解旋成单链，磁珠‑适配体‑目标微生物的制备，磁珠‑适配体‑目标微生物@Ag的制备，标准工作曲线的绘制、待测样品检测。通过将快速、高效的磁捕获分离技术与适配体介导合成的Ag纳米颗粒原位增强病原微生物本征拉曼信号相结合，借助便携式拉曼光谱仪实现对病原微生物的快速检测。该传感器构建过程和检测过程均不需要大型仪器，操作简单，整个过程1h内即可完成，灵敏度高、选择性好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种基于磁捕获分离技术、适配体介导-微生物表面原位合成Ag纳米颗粒构建的病原微生物无标记SERS检测方法。
背景技术
病原微生物是引起食源性疾病的首要原因，其不仅严重危害人们的生命健康，而且造成大量经济损失。因此，为减少或控制食源性疾病的发生、降低或避免其造成的严重影响与危害，在食品或农产品进入市场流通前，非常有必要及早对其进行病原微生物含量检测。
食品、农产品中常见的病原微生物主要包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等，其常见的检测方法主要有平板菌落计数法、PCR法以及ELISA法三大类。其中培养法作为微生物检测的金标方法，尽管结果准确，但通常需要经过分离、鉴定、培养以及计数等环节，操作复杂、耗时，一般需要3-5天。而PCR法和ELISA法尽管检测时间大大缩短，但需依赖昂贵的专用仪器以及专业的技术人员，且步骤繁琐，对实验环境要求高，检测结果易出现假阳性或假阴性。综上，以上方法均难以满足当前病原微生物现场快速检测的迫切需求，急需发展简单、快速、廉价、准确、高灵敏的新型病原微生物检测方法。
表面增强拉曼散射光谱(SERS)技术因操作简单、快速、谱峰窄、灵敏度高、受水影响小，可提供分子指纹信息、仪器便携等优势，近年来成为病原微生物检测的研究热点。基于SERS的病原微生物检测通常包括标记法和无标记法两种。前者需要修饰额外的信号分子，且通常需借助免疫学的手段进行微生物的检测，整个过程相对比较复杂。而无标记法反映的是微生物的本征拉曼光谱信息，也称为直接法，因步骤相对较少，在现场检测领域备受青睐。
发明内容
本发明提供了一种病原微生物快速检测方法，利用磁捕获分离技术以及适配体介导在微生物表面原位合成Ag纳米颗粒，增强病原微生物的本征拉曼信号，实现病原微生物简单、快速、准确的检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
一种病原微生物快速检测方法，包括以下步骤：
S1、将待测病原微生物的适配体溶液进行变性处理，使适配体结构中的双链解旋成单链；
S2、将处理后的适配体溶液与一系列已知浓度的待测病原微生物先孵育一段时间，然后再加入磁珠孵育，磁分离洗涤，所得产物重悬后保存，得到的产物记为磁珠-适配体-目标微生物；
S3、将S2的产物磁分离洗涤后，重悬至AgNO3溶液中孵育，再磁分离洗涤，去掉上清，重悬至NaBH4溶液中反应，所得产物避光保存，得到的产物记为磁珠-适配体-目标微生物@Ag；
S4、用毛细管取S3所得产物，在外加磁场中进行拉曼测试，以病原微生物浓度的对数为横坐标，以病原微生物的一个特征拉曼峰的强度变化值为纵坐标，绘制定量分析标准工作曲线；所述强度变化值指的是相对于空白值，即没有病原微生物存在时体系的拉曼信号强度；
S5、将未知浓度的待测病原微生物样品制备成磁珠-适配体-目标微生物@Ag，然后采用S4所述方法检测特征拉曼峰的强度变化值，并根据工作曲线计算样品中待测病原微生物的浓度。
优选的，步骤S1所述适配体的5’端修饰了生物素；步骤S2所述磁珠的表面修饰有链霉亲和素，且磁珠的粒径为30～100nm。
优选的，步骤S1所述适配体变性处理方法具体为：90～95℃下加热处理2～5min。
优选的，步骤S2所述适配体溶液与病原微生物的孵育条件为：4℃，孵育20～30min；所述磁珠的质量浓度为30mg/mL，体积为5～20μL，所述磁珠的分散液为PB缓冲液，所述加入磁珠后的孵育时间为20～30min；
优选的，所述AgNO3溶液的浓度为10mM，体积为50～400μL，室温振荡15～20min；NaBH4溶液的浓度0.1mM，体积为100～400μL，室温振荡15～20min。
优选的，所述产物磁珠-适配体-病原微生物@Ag中，Ag纳米颗粒粒径为5～20nm。
优选的，步骤S1所述适配体溶液的溶剂为PB缓冲液或去离子水，步骤S2中所述病原微生物的分散液为PB缓冲液，步骤S2所述洗涤、重悬所用溶液均为PB缓冲液，步骤S3所述洗涤用溶液为去离子水。更加优选的，所述PB缓冲液的浓度为0.01～0.1M，且pH为7.0～7.4。
优选的，步骤S4所述拉曼测试的条件为：激光波长为633nm，曝光时间为5～10s，平均测量3～5次。
优选的，所述病原微生物为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌中的一种。
本发明的有益效果为：
(1)将适配体变性处理解旋成单链后再与目标微生物作用，可以使适配体更好地缠绕在目标微生物周围，有利于后期合成的Ag纳米颗粒更贴近目标微生物表面，从而更好地增强微生物的本征信号，进而提高方法的检测灵敏度；(2)采用适配体先识别微生物再通过生物素与链霉亲和素的作用被磁珠捕获，不仅优先保障了适配体与微生物间的充分作用、使其不受磁珠位阻影响，而且有效规避了磁珠上适配体化学键合修饰导致的识别能力下降问题，间接提高了磁珠的捕获效率；(3)体系中磁珠的使用，不仅简化了操作流程、规避了离心机的使用，而且其优良的富集性能，有利于拉曼测试时微生物本征信号的进一步增强；(4)采用适配体介导，在病原微生物表面原位合成Ag纳米颗粒增强微生物本征拉曼信号构建SERS检测平台，不仅免去了额外信号分子的修饰、简化了操作流程，而且结合磁珠优良的富集能力，可以大大提高方法的检测灵敏度，其最低可检测到的病原微生物浓度可低至100CFU/mL；(5)本发明中提供的检测方法在使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，操作简单、快速，整个过程控制在1h内，有望广泛用于中小企业以及基层实验室病原微生物的快速定量检测。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。
实施例1
以金黄色葡萄球菌为例，提供了一种金黄色葡萄球菌快速检测的构建过程。
1、磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌@Ag复合结构的制备
(1)适配体的变性：
选取的金黄色葡萄球菌适配体序列为：5’-Biotin-(CH2)6-TCCCT ACGGC GCTAACCTCC CAACC GCTCC ACCCT GCCTC CGCCT CGCCA CCGTG CTACA AC-3’。
将上述适配体分散在PB溶液(0.01M，pH7.4)中，然后在95℃下加热处理2min，让其自然冷却，最后冰箱－20℃储存。
(2)磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌复合结构的合成
1mL金黄色葡萄球菌(107CFU/mL，PB(0.01M，pH7.4)配制)中加入500nM适配体溶液，混合均匀后，4℃孵育20min；接着，加入10μL链霉亲和素功能化的磁珠(30mg/mL，粒径约50nm)，室温振荡孵育30min；最后，使用上述PB溶液对产物进行洗涤2～3次，重悬至100μLPB溶液中，冰箱4℃保存备用。
(3)磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌@Ag复合结构的合成
取10μL步骤(2)合成的磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌溶液加入90μL PB溶液中，用去离子水洗涤2次后重悬至100μL 0.01M AgNO3中，室温剧烈振荡20min后，用去离子水洗涤2次、去掉上清，重悬至100μL 0.1mM NaBH4中，继续振荡15min后，将产物置于冰箱4℃避光保存。
对步骤(2)和(3)所得产物进行测试发现，步骤(3)合成的复合结构中金黄色葡萄球菌表面除了负载的磁珠外，还负载了很多<20nm的颗粒，结合EDS测试得知，其成分为银，表明目标材料已成功合成。
2、金黄色葡萄球菌的快速检测过程
取10μL步骤(1)获得的磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌@Ag至一毛细管中，在外加磁铁作用下进行拉曼测试。测试条件：激光波长633nm，曝光时间10s，平均测量3次。记录其在735cm-1处拉曼峰(该峰为微生物细胞膜的特征峰之一)的强度变化值。接着，使用系列已知浓度的金黄色葡萄球菌先合成对应的磁珠-适配体-金黄色葡萄球菌@Ag复合结构；然后，按照上述拉曼测试条件进行测试；最后根据金黄色葡萄球菌的浓度与735cm-1处拉曼峰峰强的变化情况，绘制出相应的定量标准工作曲线，根据标准工作曲线可以得知可检测到的金黄色葡萄球菌浓度低至100CFU/mL。
实施例2
金黄色葡萄球菌模拟样本的测试
首先，将超市采购回来的常温牛奶(3000rpm，5min)离心处理，除去不纯物。然后将其用PB溶液稀释10倍处理。往其中分别加入1000和10000CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准溶液，充分混匀后进行实施例1所示的金黄色葡萄球菌检测。通过测量其在735cm-1处拉曼峰强的变化值，根据实施例1获得的工作曲线，推算得知模拟样本中金黄色葡萄球菌的浓度分别为968.2和10121CFU/mL，进而得知两份样本的回收率分别为96.82％和101.21％。由此可以验证本方法在实际样本中检测中具有很好的可行性和准确性。
上述实施例只是对本发明的解释，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉市农业科学院
<120> 一种病原微生物快速检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccctacggc gctaacctcc caaccgctcc accctgcctc cgccaccgtg ctacaac 57
Claims (10)
1.一种病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待测病原微生物的适配体溶液进行变性处理，使适配体结构中的双链解旋成单链；
S2、将处理后的适配体溶液与一系列已知浓度的待测病原微生物先孵育一段时间，然后再加入磁珠孵育，最后磁分离洗涤，产物重悬保存；所得产物记为磁珠-适配体-目标微生物；
S3、将S2的产物磁分离洗涤后，重悬至AgNO3溶液中孵育，再磁分离洗涤，去掉上清，重悬至NaBH4溶液中反应，得到产物磁珠-适配体-目标微生物@Ag，将产物避光保存；
S4、用毛细管取S3所得产物，在外加磁场中进行拉曼测试，以病原微生物浓度的对数为横坐标，以病原微生物的一个特征拉曼峰的强度变化值为纵坐标，绘制定量分析标准工作曲线；
S5、将未知浓度的待测病原微生物样品制备成磁珠-适配体-目标微生物@Ag，然后采用S4所述方法检测特征拉曼峰的强度变化值，并根据工作曲线计算样品中待测病原微生物的浓度。
2.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述适配体的5’端修饰了生物素；步骤S2所述磁珠的表面修饰有链霉亲和素，且磁珠的粒径为30～100nm。
3.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述适配体变性处理方法具体为：90～95℃下加热处理2～5min。
4.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S2所述适配体溶液与病原微生物的孵育条件为：4℃，孵育20～30min；所述磁珠的分散液为PB缓冲液，所述加入磁珠后的孵育时间为20～30min，孵育温度为20～25℃。
5.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述AgNO3溶液的浓度为10mM，体积为50～400μL，室温振荡15～20min；所述NaBH4溶液的浓度0.1mM，体积为100～400μL，室温振荡15～20min。
6.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述产物磁珠-适配体-病原微生物@Ag中，Ag纳米颗粒粒径为5～20nm。
7.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S2所述病原微生物的分散液为PB缓冲液，步骤S2所述洗涤、重悬所用溶液均为PB缓冲液，步骤S3所述洗涤用溶液为去离子水。
8.根据权利要求4或7所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述PB缓冲液的浓度为0.01～0.1M，且pH为7.0～7.4。
9.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S4所述拉曼测试的条件为：激光波长为633nm，曝光时间为5～10s，平均测量3～5次。
10.根据权利要求1所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述病原微生物为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌中的一种。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN111024938A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-17 | 武汉市农业科学院 | 一种病原微生物快速检测方法 |
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2020
- 2020-08-05 CN CN202010777142.4A patent/CN112113948A/zh active Pending
Patent Citations (8)
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