CN112111411B - 一种环境响应型淡紫拟青霉微珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种环境响应型淡紫拟青霉微珠及其制备方法与应用,属于农用微生物开发技术领域。本发明提供的环境响应型淡紫拟青霉微珠,可根据土壤中水分含量刺激外壳中的聚乙烯醇溶解,使得土壤中的水流入微珠内部;微珠内部的纤维素纳米纤维吸水膨胀,堵住外壳中的小孔,导致孢子无法流出;孢子遇水,同时利用微珠内部的营养物质萌发、繁殖,繁殖过程中,淡紫拟青霉分泌的蛋白酶和几丁质酶可降解外壳中的明胶与壳聚糖,一定时间后即可达到释放效果。在雨水较多地区,或是灌溉后的土壤中,此微珠可增加菌株释放数量,提高肥料利用效率。
Description
技术领域:
本发明涉及一种环境响应型淡紫拟青霉微珠及其制备方法与应用,属于农用微生物开发技术领域。
背景技术:
淡紫拟青霉属于半知菌亚门、丝孢纲、拟青霉属的一种有效中植物病原线虫的卵寄生真菌,目前发现的已有50多种,均属于昆虫病原菌或线虫病原菌。研究发现淡紫拟青霉不仅能够促进多种植物的生长,还可以防治很多植物病害,其具有安全、无污染、高效、寄主范围广等多种优点。
近年来气候变化严重,有些地区出现持续性大范围降雨,导致出现了不同区域、时段的降水增减、阴雨高湿的现象,对区域农作物病虫害的时段消长与成灾产生了显著影响。现阶段生物肥料主要有液剂、粉剂和颗粒剂三种,这些类型的生物肥料在农田中只能起短时间的效应,并且大部分菌种随着储存时间的增长而不断失活或者流失,导致最终到达农作物根部的菌种较少,因此无法改善农作物的生长环境、有效抑制病原害微生物的生长。
发明内容:
本发明旨在克服现有技术的不足,提供一种环境响应型淡紫拟青霉微珠,本发明提供的一种环境响应型淡紫拟青霉微珠,可根据土壤中水分含量刺激外壳中的聚乙烯醇溶解,使得土壤中的水流入微珠内部;微珠内部的纤维素纳米纤维吸水膨胀,堵住外壳中的小孔,导致孢子无法流出;孢子遇水,同时利用微珠内部的营养物质萌发、繁殖,繁殖过程中,淡紫拟青霉分泌的蛋白酶和几丁质酶可降解外壳中的明胶与壳聚糖,一定时间后即可达到释放效果。在雨水较多地区,或是灌溉后的土壤中,此微珠可增加菌株释放数量,提高肥料利用效率。
为了达到上述目的,本发明提供一种环境响应型淡紫拟青霉微珠,所述的微珠包括囊芯和囊壁,在囊芯中添加孢子粉、植物油、葡萄糖、蛋白胨、纤维素纳米纤维、柠檬酸钠、表面活性剂形成乳油型囊芯;囊壁中添加壳聚糖、明胶、聚乙烯醇、甘油、水形成水响应型外壳。
进一步地,囊芯原料中各组分的组成如下:淡紫拟青霉孢子粉20-30份,植物油40-60份,柠檬酸钠2-3份,表面活性剂1-1.5份,葡萄糖1-1.5份,蛋白胨0.5-1份,纤维素纳米纤维3-5份;
进一步地,囊壁原料中各组分的组成如下:壳聚糖1.5-2份,明胶8-10份,聚乙烯醇3-5份,甘油6-10份,水60-100份;
更进一步地,所述聚乙烯醇的聚合度为500-600。
本发明还提供所述环境响应型淡紫拟青霉微珠的制备方法,具体如下:
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉、植物油、柠檬酸钠按照比例混合均匀,随后按比例添加表面活性剂,形成乳油后添加葡萄糖、蛋白胨、纤维素纳米纤维,得到芯材溶液;
进一步地,所述的植物油为玉米油、大豆油或菜籽油等;
进一步地,所述的表面活性剂为阴离子乳化剂或非离子乳化剂;
优选地,所述表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚和十二烷基硫酸钠的混合物,质量比2:2:1;
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖、明胶、聚乙烯醇、甘油、水按照比例在95-100℃加热混合均匀后,95-96℃保温,即得到壁材溶液;
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,调节滴入速度控制二者比例,滴入冷凝液体石蜡中;
进一步地,所述的滴入速度为30-60毫升/分,滴管管口内、外径为1-8.0mm和1.5-8.5mm;
进一步地,步骤(3)中芯材和壁材的比例为4-5:2-3;
(4)除去步骤(3)得到的微珠表面的冷凝剂,然后恒温20-30℃、恒湿30%-40%滚筒干燥即可得到淡紫拟青霉微珠;
优选地,干燥后,芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%。
有益效果:
1、本发明首次将聚乙烯醇(PVA)添加到微珠外壳中,制备环境响应型外壳;芯材采用乳油型油相包埋淡紫拟青霉孢子粉,并且添加葡萄糖等营养物质及纤维素纳米纤维,得到环境响应型淡紫拟青霉微珠,减少了菌种与氧气的接触,避免菌种的提前复苏,最大程度上在储藏、运输过程中保护菌种活性;
2、基于聚乙烯醇(PVA)遇水可溶解特性,获得水响应型淡紫拟青霉微珠;在水分含量较多的土壤内(灌溉或雨后),聚乙烯醇遇水溶解,使得水分进入微珠内部,促使内部孢子萌发,进一步生长繁殖,分泌蛋白酶和几丁质酶,从微珠内部瓦解外壳,达到缓慢释放、持续释放、增大释放菌种数量的目的;
3、微珠内核中的纤维素纳米纤维易吸水粘壁,阻止乳油内包埋的淡紫拟青霉孢子泄露,固定淡紫拟青霉在微珠内部生长繁殖,避免外界环境对菌株产生不利影响,保护菌株活性;
4、本发明采用柠檬酸钠交联明胶和壳聚糖,增大了凝胶强度,保护了微珠在运输、储藏过程中,外界不利因素对它的影响,提高其储藏稳定性;
5、本发明利用菌株在微珠内部生长繁殖,分泌蛋白酶和几丁质酶降解外壳,达到释放目的,对微珠内核菌株添加量要求较低,但可达到高菌活释放要求,进而减少了生产成本。
附图说明:
图1:产品结构及作用示意图;
图2:柠檬酸钠交联壳聚糖和明胶示意图。
具体实施方案:
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本专利进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利,并不用于限定本发明。
本发明提供的环境响应性微珠结构图如图1和图2所示,以下将结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1:一种水响应型淡紫拟青霉微珠
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉250g、玉米油600g、柠檬酸钠20g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后加入表面活性剂十二烷基酚聚氧乙烯醚、月桂醇聚氧乙烯醚和十二烷基硫酸钠的混合物10g(质量比2:2:1),形成乳油后,依次添加葡萄糖15g、蛋白胨10g、纤维素纳米纤维40g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖1.5g、明胶10g、聚乙烯醇4g(聚乙烯醇的聚合度为500-600)、甘油8g加入80mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,95-96℃保温,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为40毫升/分、囊壁的滴入速度为30毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%的水响应型淡紫拟青霉微珠。
对比例1:一种水响应型淡紫拟青霉微珠(纤维素纳米纤维缺失组)
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉250g、玉米油600g、柠檬酸钠20g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后加入表面活性剂十二烷基酚聚氧乙烯醚、月桂醇聚氧乙烯醚和十二烷基硫酸钠的混合物10g(质量比2:2:1),形成乳油后,依次添加葡萄糖15g、蛋白胨10g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖1.5g、明胶10g、聚乙烯醇4g(聚乙烯醇的聚合度为500-600)、甘油8g加入80mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,保温95-96℃,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为40毫升/分、囊壁的滴入速度为30毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%的水响应型淡紫拟青霉微珠。。
对比例2:一种水响应型淡紫拟青霉微珠(聚乙烯醇缺失组)
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉250g、玉米油600g、柠檬酸钠20g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后加入表面活性剂十二烷基酚聚氧乙烯醚、月桂醇聚氧乙烯醚和十二烷基硫酸钠的混合物10g(质量比2:2:1),形成乳油后,依次添加葡萄糖15g、蛋白胨10g,纤维素纳米纤维40g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖1.5g、明胶10g、甘油8g加入80mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,保温95-96℃,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为40毫升/分、囊壁的滴入速度为30毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%的水响应型淡紫拟青霉微珠。。
对比例3:一种水响应型淡紫拟青霉微珠(表面活性剂缺失组)
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉250g、玉米油600g、柠檬酸钠20g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后依次添加葡萄糖15g、蛋白胨10g、纤维素纳米纤维40g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖1.5g、明胶10g、聚乙烯醇4g(聚乙烯醇的聚合度为500-600)、甘油8g加入80mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,保温95-96℃,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为40毫升/分、囊壁的滴入速度为30毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%的水响应型淡紫拟青霉微珠。
案例效果检测:
(1)水环境下微珠变化及活菌释放量
取实施例1,及对比例1-3方案制备的微珠各30g,平均分成三份,置于含有少量无菌水的培养皿内,28℃放置5天,每天观察微珠内部和外部结构变化,并且测定微珠内部菌种数量,结果见表1。
表1
检测结果如表1所示,根据实施例1所述方法制备的环境响应型淡紫拟青霉微珠可根据水分含量,调节包埋活菌的释放速度和释放量,当外壳中加入聚乙烯醇时,微珠外壳遇水导致外壳中的聚乙烯醇溶解,从而使得外部水分进入微珠内部,促进菌体萌发;当外壳中不加聚乙烯醇时,少量水分存在时,外界水分不能进入微珠内部;当芯材添加纤维素纳米纤维时,纤维素纳米纤维吸水粘壁,使得内部乳油包裹的菌株无法泄露,菌株在内部生长繁殖,从而达到缓慢释放的效果。当使用乳油型囊芯时(同时添加植物油和表面活性剂),菌株可以正常生长繁殖;当囊芯仅为非乳油型油相时,菌株被包裹在油相内部,暂时无法接触到外部环境,因此暂时无法正常繁殖,导致菌株短时间内无法发挥作用。
(2)检测储藏时间对菌种活性的影响:
将实施例1及对比例1-3制作的样品置于室温下密封储藏0-180天,并在贮藏后取样品15g稀释于100g生理盐水中加入0.5wt%吐温80,并置于锥形瓶中用玻璃珠(平铺瓶底)在摇床(200rpm)中进行震荡摇晃45min。随后按照菌株活性和数目以生理盐水进行稀释,稀释液在孟加拉红培养基上进行涂布,并在28摄氏度培养箱中进行培养48h,并计数。结果如表2所述,显示实施例1制备的产品在储藏过程中的菌种活性保持很好,说明该方法制得的微珠能够更好的在储藏期间保护菌体。对比例3制备的产品在储藏过程中微量损失,由于对比例3采用非乳油型油相作为囊芯,孢子存在非乳油型油相中会有损失。
表2
(3)田间试验
针对根结线虫防治效果进行肥效实验,并对实验样本进行数据采集和分析。实验共设计四个处理(处理一:实施例1;处理二:对比例1;处理三:对比例2;处理四:对比例3)和一个未处理对照。供试植株为黄瓜,在移栽前,每个土坑中加入5g制备好的样品,其他栽培措施统一正常操作,确保植株生长环境一致。定植30d后,统计产量,采收后期,将根系挖出,调查根结指数,评价防治效果。防治效果如表3所示,显然实施1可以有效防治根结线虫,提高黄瓜产量。
根结线虫分级标准:
0级:根系健康、无根结
1级;少量根结,根结%<25%
2级:根结数量中等,根结%约25%-50%
3级:根结数量较多,根结%约50%-75%
4级:根结数量很多,根结%>75%
表3
实施例2一种水响应型淡紫拟青霉微珠
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉200g、大豆油400g、柠檬酸钠25g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后加入表面活性剂辛基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇硫酸钠的混合物12g(质量比2:1),形成乳油后,依次添加葡萄糖10g、蛋白胨5g、纤维素纳米纤维30g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖1.5g、明胶8g、聚乙烯醇3g(聚乙烯醇的聚合度为500-600)、甘油6g加入60mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,保温95-96℃,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为40毫升/分、囊壁的滴入速度为20毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的80%,壁材占微珠质量的20%的水响应型淡紫拟青霉微珠。
实施例3一种水响应型淡紫拟青霉微珠
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉300g、菜籽油500g、柠檬酸钠30g加入烧杯中,室温搅拌30min,混合均匀,随后加入表面活性剂蓖麻油聚氧乙烯醚、苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚和十二烷基苯磺酸钙的混合物12g(质量比3:1:1),形成乳油后,依次添加葡萄糖12g、蛋白胨8g、纤维素纳米纤维50g,室温搅拌30min,得到芯材溶液。
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖2.0g、明胶10g、聚乙烯醇5g(聚乙烯醇的聚合度为500-600)、甘油10g加入100mL蒸馏水中,加热至95-100℃,混合均匀,保温95-96℃,即得到壁材溶液。
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,囊芯的滴入速度为50毫升/分、囊壁的滴入速度为30毫升/分,滴入冷凝液体石蜡中,除去微珠表面的冷凝剂,25℃恒温、35%恒湿滚筒干燥得到芯材占微珠质量的90%,壁材占微珠质量的10%的水响应型淡紫拟青霉微珠。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本专利构思的前提下,上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进,这些都属于本专利的保护范围。因此,本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (10)
1.一种环境响应型淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)微珠,其特征在于,所述的微珠包括囊芯和囊壁,在囊芯中添加淡紫拟青霉孢子粉、植物油、葡萄糖、蛋白胨、纤维素纳米纤维、柠檬酸钠、表面活性剂形成乳油型囊芯;囊壁中添加壳聚糖、明胶、聚乙烯醇、甘油、水形成水响应型外壳。
2.如权利要求1所述的一种环境响应型淡紫拟青霉微珠,其特征在于,囊芯原料中各组分的组成如下:淡紫拟青霉孢子粉20-30份,植物油40-60份,柠檬酸钠2-3份,表面活性剂1-1.5份,葡萄糖1-1.5份,蛋白胨0.5-1份,纤维素纳米纤维3-5份。
3.如权利要求1所述的一种环境响应型淡紫拟青霉微珠,其特征在于,囊壁原料中各组分的组成如下:壳聚糖1.5-2份,明胶8-10份,聚乙烯醇3-5份,甘油6-10份,水60-100份。
4.权利要求1-3任意一项所述淡紫拟青霉微珠的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)制备芯材溶液:将淡紫拟青霉孢子粉、植物油、柠檬酸钠按照比例混合均匀,随后按比例添加表面活性剂,形成乳油后添加葡萄糖、蛋白胨、纤维素纳米纤维,得到芯材溶液;
(2)制备壁材溶液:将壳聚糖、明胶、聚乙烯醇、甘油、水按照比例在95-100℃加热混合均匀后, 95-96℃保温,即得到壁材溶液;
(3)将步骤(1)(2)得到的芯材和壁材溶液分别注入滴丸机中,调节滴入速度控制二者比例,滴入冷凝液体石蜡中;
(4)除去步骤(3)得到的微珠表面的冷凝剂,恒温、恒湿滚筒干燥即可得淡紫拟青霉微珠。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的植物油为玉米油、大豆油或菜籽油。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的表面活性剂为阴离子乳化剂或非离子乳化剂。
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述的表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚和十二烷基硫酸钠的混合物,质量比2:2:1。
8.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中芯材和壁材的比例为4-5:2-3。
9.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,干燥后,芯材占微珠质量的85%,壁材占微珠质量的15%。
10.权利要求1-3任意一项所述淡紫拟青霉微珠在生物肥料领域中的应用。
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