CN112111002B - 一种司美格鲁肽制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。本发明的方法采用了特殊的试剂组合进行结晶，晶体颗粒均匀，夹杂杂质少，能够通过过滤的方式进行分离。

Description

一种司美格鲁肽制备方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种司美格鲁肽制备方法，尤其涉及结晶方法。
背景技术
司美格鲁肽(Semaglutide)，商品名Ozempic，由丹麦诺和诺德公司研发，Ozempic被指定为饮食和运动的辅助手段，以改善2型糖尿病患者的血糖控制，注射剂于2017年12月05日在美国上市，2019年，FDA又批准口服司美格鲁肽上市，作为首款口服的GLP-1类似物糖尿病药物，该药的市场前景被广泛看好。
司美格鲁肽也是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有94％的序列同源性，是诺和诺德开发的第二代脂肪链修饰GLP-1类似物，与第一代脂肪链修饰GLP-1类似物利拉鲁肽相比，其半衰期更长，剂量更低。司美格鲁肽保持了利拉鲁肽良好的安全性和降糖有效性，且减轻体重效果优于前两者。
司美格鲁肽化学表述为Aib8,Arg34Lys26-[N-ε-ODA-ODA-(γ-Glu(N-α-18-十八烷酸-1-酰基))]-GLP-1(7-37)分子式为C187H291N45O59，相对分子质量为4113.58，CAS号为910463-68-2，序列信息如下：
H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH
目前，诺和诺德公司主要通过基因重组技术，利用酵母生产司美格鲁肽主链Arg34-GLP-19-37，然后连接上His-Aib；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-19-37，还需要利用化学手段和His-Aib反应，生成司美格鲁肽主链Aib8,Arg34-GLP-17-37；然后在Lys26的侧链氨基上接上长效修饰基团。由于Aib8,Arg34-GLP-17-37的侧链及N端氨基均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。
现有技术中，提供了合成司美格鲁肽(Semaglutide)的Fmoc化学固相合成方法。US8129343和US8536122中采用Mmt、Mtt、ivDde和Dde保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再脱掉侧链保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；CN106928344采用Alloc保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再利用Pd(PPh3)4脱掉保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；而CN106478806则采用Dde-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，先顺序偶联完成Lys26的侧链长效修饰基团，然后再脱掉Lys26的α氨基保护基Dde，完成主链的偶联；在上述合成方法中均存在侧链修饰步骤繁多，工艺复杂，粗品的纯化难度较大等困难。专利CN108059666则采用Alloc-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，以CTC树脂为固相载体，用固相法合成得到单体Alloc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH,然后再作为单体固相合成得到司美格鲁肽。
在树脂切割，粗品结晶工艺方基本都是采用裂解试剂对树脂进行切割、***沉淀得到粗肽；RP-HPLC制备得到粗肽。
目前没有发现司美格鲁肽的结晶沉淀专利，本发明人研究了司美格鲁肽制备过程中的沉淀方法，发现用***作为溶剂存在一些问题，***沉淀的晶型不好，只能通过离心得到粗品，离心过程会包裹杂质到粗品中，影响后一阶段的纯化以及产品质量，根据本领域常规采用方法都是采用***作为溶剂当选用***等醚类溶剂时，结晶基本比较粘稠，晶型不均一，过滤比较慢，所以一般只能采用离心方法得到产品，由于晶型不均一、离心不易过滤掉杂质，两者都会产生杂质包裹等因素，实例显示经过一次纯化后，其中一个主要杂质会明显偏大，需要更多次纯化才能得到更纯的成品，影响生产效率，也影响产品质量。同时***属于易燃易爆危险化学品，生产操作过程中存在一定风险，如果采用更环保的乙酸乙酯等有机溶剂进行沉淀结晶，通过过滤方式，会更好的控制粗品中的杂质，同时该方式具有可控性强、重现性好、能量消耗低、绿色环保等特点，较传统工艺具有明显的优势。
发明内容
针对现有司美格鲁肽合成技术的需求，提供一种司美格鲁肽的结晶制备方法。
有鉴于上述司美格鲁肽合成过程中结晶沉淀的一些缺点，本发明旨在提供一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：
1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；
2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；
3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；
4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。
在本发明的实施方案中，步骤3)中结晶时裂解液，乙酸乙酯和环己的混合溶液的温度为2-25℃，优选为10-15℃。
在本发明的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂解液体积的8-12倍，优选为10倍。
在本发明的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解液过程中搅拌速度为100rmp，结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp-130rmp。
在本发明的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中的乙酸乙酯和环己烷比例为1:2-2:1，优选为1:1。
在本发明的实施方案中，步骤3)中结晶的时间为15-60分钟，优选为25-35分钟。
在本发明的实施方案中，步骤4)中过滤的方法为减压过滤，优选采用减压漏斗进行过滤。
在本发明的实施方案中，步骤4)中过滤时采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液洗涤滤饼2-5次。
在本发明的实施方案中，步骤2)所述的裂解剂为TFA、TIS、EDT、PhOH和H2O的混合物，优选地TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5(体积比)；TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5(体积比)；裂解时间为1.5-3.5小时。
在本发明的实施方案中，步骤1)中可以采用任意的方法制备全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物，例如，在固相合成树脂上从C端向N端依次合成主链，然后脱除Lys的侧链保护基，并偶联侧链。合成主链和侧链的方法可以为依次偶联氨基酸或多个氨基酸形成的多肽片段。也可以采用先合成主链的一部分，然后延伸生成主链，然后再完成主链的方法。采用已知的任意方法制成的全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物均可。
在本发明的一个而具体实施方案中，步骤1)包括以下步骤：
1-1)中Wang树脂上偶联Fmoc-Gly-OH，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；
1-2)依照司美格鲁肽的肽序，采用合适的偶联体系，在Fmoc-Gly-Wang树脂上，依次偶联Fmoc氨基酸，具体顺序为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH；
1-3)脱除Lys(Alloc)中的Alloc保护基团；
1-4)依次偶联侧链残基：Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯。
上述步骤(1)中所述Wang树脂的替代度范围为0.3～1.0mmol/g，更优选0.4～0.6mmol/g；Fmoc-Gly-Wang树脂的制备，具体是Fmoc-Gly-OH和合适替代度的Wang Resin，采用合适的偶联体系进行氨基酸的偶联，偶联体系如HOBt/DIC/DMAP，HOBt/DCC/DMAP，HOAt/DIC/DMAP，HBTU/HOBt/DIPEA，TBTU/HOBt/DIPEA，PyBOP/HOBt/DIPEA；优选是HOBt/DIC/DMAP；
在本发明的一个优选的具体实施方案中，上述步骤1-2)和步骤1-4)偶联过程使用的偶缩合剂为DIC+A或B+A+C，其中A为HOBt或HOAt中的至少一种，B为HBTU、HATU或PyBOP中的至少一种，C为DIEA、TMP或DMAP中的至少一种。偶联体系中缩合剂的用量为氨基酸当量的0.8-3.0倍。反应时间为1-4小时。
在本发明的一个优选的具体实施方案中，上述步骤1-3)选择Pd0(Ph3P)4/Me2NH·BH3或Pd0(Ph3P)4/PhSiH3在DCM溶剂进行，其中Pd0(Ph3P)4的用量为合成规模的0.05-1.0当量，优选为0.1-0.5当量，Me2NH·BH3或PhSiH3的用量为合成规模的10-100个当量，优选为20-60当量，反应时间为0.5-4小时，优选为1-2小时。反应完后用0.2M的铜试剂清洗肽树脂30分钟。
在本发明的一个优选的具体实施方案中，将结晶过滤获得司美格鲁肽后还包括进一步纯化的方法，例如采用HPLC方法进行纯化。
有益效果
1)本发明采用的结晶方法获得的晶体大小均匀适中，能够采用过滤的方法获得，避免了使用离心方法时包裹杂质的问题。
2)以本发明的结晶试剂加入到裂解液中，当晶体出现后，会匀速逐步形成结晶晶体，保证结晶的晶体大小均一，有利于后续的过滤。本发明的结晶实际克服了传统方法采用***、异丙醚或甲基叔丁基醚作为结晶试剂加入裂解液时，导致裂解液局部结晶速度快，形成杂质包裹，而且晶体大小不一，很难过滤的问题。
3)环己烷有利于析出溶剂中更多的产品，与乙酸乙酯配合后能够降低粗品中的杂质含量。
4)本发明克服了现有技术的偏见，即温度越低，结晶效果越好，发现采用现有技术中的冰冻***析出结晶时，由于温度过低，形成的晶体颗粒过小，不利于过滤，导致过滤速度很慢，效率低下，而如果采用室温析出结晶，会导致结晶颗粒过大，形成杂质包裹，同时温度高会导致溶剂对产品有部分溶解，收率会降低。本发明采用10-15℃结晶温度提高结晶效率的同时保证了晶体的颗粒粒度以及产品的纯度。
5)本发明采用的结晶溶剂优选了乙酸乙酯/环己烷体积比为1:1的混合溶剂，相比于***、异丙醚、甲基叔丁基醚，乙酸乙酯和环己烷更为环保。
6)本发明提供的司美格鲁肽的结晶沉淀方法，采用最简单和经济的方法可以轻松完成司美格鲁肽的合成并且取得很好的合成效果，该制备方法具有操作简单、生产成本低、收率高、绿色环保等优点。
附图说明
图1：实例6结晶后样品粗品色谱分析结果(纯度：87.72％、关键杂质(RT＝21.100)含量：2.77％)。
图2：实例11结晶后样品粗品色谱分析结果(纯度：92.72％、关键杂质(RT＝21.164)含量：1.54％)。
图3：实例6样品经过一次HPLC纯化后色谱分析结果(关键杂质(RT＝20.835)含量：1.13％)。
图4：实例11样品经过一次HPLC纯化后色谱分析结果(关键杂质(RT＝20.927)含量：0.73％)。
图5：实例6成品色谱分析结果(纯度：98.79％、关键杂质(RT＝20.837)含量：0.68％)。
图6：实例11成品色谱分析结果(纯度：99.12％、关键杂质未检测到)。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
Figure BDA0002705989900000051
Figure BDA0002705989900000061
Figure BDA0002705989900000071
本发明提供的多肽及其制备方法和用途中所用原料、辅料和试剂均可由市场购得或者本自行生产。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
称取替代度为0.8mmol/g的Wang树脂100克于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Gly-OH 29.8克(100mmol)，HOBt 16.2克(120mmol)，DMAP 1.2克(10mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入20.3mL DIC(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应1.5小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Gly-Wang Resin共108克，检测替代度为0.35mmol/g。
实施例2司美格鲁肽主链肽树脂制备
称取将实施例1中得到的Fmoc-Gly-Wang树脂(Sub＝0.35mmol/g)28.6克(10mmol)于反应柱中，用DCM清洗3次，再用DMF溶胀30分钟。然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，然后用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 19.35克(30mmol)，HOBt 4.86克(36mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入6.1mL DIC(36mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用DBLK脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH；反应结束后，用DMF清洗肽树脂。
实施例3 Lys侧链保护基团的脱除
将实施例4中得到的全保护肽树脂，用DCM清洗3次。称取24.5克的二甲胺硼烷，量取800mL的DCM，加入反应柱中，反应10分钟之后，加入1.21克的Pd0(Ph3P)，反应2小时。然后用DCM清洗3次树脂，用0.2M铜试剂的DMF溶液清洗肽树脂30分钟，DMF清洗树脂3次，再用DCM清洗树脂3次，得到选择性脱除Alloc的肽树脂，备用。
实施例4司美格鲁肽侧链的偶联
称取Fmoc-AEEA-OH 12.0克(20mmol)，HOAt 4.86克(36mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入6.1mL DIC(36mmol)，活化5分钟，加入实施例10中的肽树脂，反应2小时，然后用DBLK脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸叔丁酯；反应结束后，用DMF清洗6次，再次用DCM清洗3次，然后加入甲醇清洗3×10分钟，用真空抽干，得到司美格鲁肽的肽树脂121.6克。
实施例5司美格鲁肽的裂解
将实施例16得到的121.6克肽树脂加入到2000mL单口烧瓶中，预先配制裂解液1200mL的TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:3:2:2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用50mL TFA洗涤，合并滤液。
实施例6司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，通过分液漏斗缓慢加入***，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗过滤，再用适量***洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.6g，收率为85.7％，收率低于实例11。结晶后，呈粘稠状，过滤时间90分钟，过滤速度远慢于实例11，结晶后粗品纯度为87.7％，关键杂质(RT＝21.100)含量为2.77％(见图1)，对比于实例11，纯度低5％，关键杂质含量明显偏高。二次HPLC纯化条件见实施例17。实例6样品经过一次HPLC纯化后关键杂质(RT＝20.835)含量为1.13％(见图3)，实例6样品经两次HPLC纯化后成品纯度：98.79％、关键杂质(RT＝20.837)含量为0.68％(见图5)。
虽然通过HPLC的方法可以进行纯化，并且经过多次HPLC可以降低杂质含量，但是不但纯化效率极低，产品的产量也会受到影响，而且也不环保。
实施例7司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，通过分液漏斗缓慢加入异丙醚，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗过滤，再用适量异丙醚洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.7g，收率为88.1％，结晶后，呈粘稠状，过滤时间80分钟，结晶后粗品纯度为85.86％、关键杂质含量为2.55％。
实施例8司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，通过分液漏斗缓慢加入甲基叔丁基醚，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗过滤，再用适量甲基叔丁基醚洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.5g，收率为83.3％，收率远低于实例11，结晶后，呈粘稠状，过滤时间85分钟，过滤速度远慢于实例11，结晶后粗品纯度为80.86％、关键杂质含量为2.87％，粗品纯度偏低、关键杂质含量偏高。
实施例9司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.8g，收率为90.4％，裂解收率低于实例11，结晶后，晶型较好，过滤时间40分钟，过滤速度略慢于实例11，结晶后粗品纯度为90.86％、关键杂质含量为1.97％，粗品纯度略有偏低、关键杂质含量略有偏高。
实施例10司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，通过分液漏斗缓慢加入环己烷，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗过滤，再用适量环己烷洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.9g，收率为92.8％，裂解收率低于实例11，结晶后，呈粘稠状，晶体不成形，过滤时间75分钟，过滤速度远慢于实例11，结晶后粗品纯度为88.35％、关键杂质含量为2.08％，粗品纯度偏低、关键杂质含量偏高。
实施例11司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，预先1:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品4.1克，收率为97.6％，收率高于其它实例，结晶后，晶体均匀，过滤速度较快，过滤时间30分钟，过滤速度显著快于其它实例，结晶后粗品纯度为92.72％，关键杂质关键杂质(RT＝21.164)含量为1.54％(见图2)，对比其它实例，纯度高，关键杂质含量低。二次HPLC纯化条件件实施例17。经过一次HPLC纯化后关键杂质(关键杂质(RT＝20.927)含量为0.73％(见图4)，相比于实例11关键杂质含量少；经两次HPLC纯化后成品纯度为99.12％、关键杂质没有检出(见图6)，对比实例6，纯度高，关键杂质没有检出。
实施例12司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，预先2:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.9克，收率为92.8％，裂解收率低于实施例11，过滤时间45分钟，过滤速度略慢于实例11，结晶后粗品纯度为90.38％、关键杂质含量为1.88％，对比与实例11，粗品纯度略有偏低、关键杂质含量略有偏高。
实施例13司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温10-15℃，预先1:2体积比混合乙酸乙酯和环己烷，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品4.0克，收率为95.2％，裂解收率略低于实施例11，结晶后，呈粘稠状，过滤时间60分钟，过滤速度远慢于实例11，结晶后粗品纯度为87.38％、关键杂质含量为2.07％，对比与实例11，粗品纯度偏低、关键杂质含量偏高。
实施例14司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温5-10℃，预先1:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品4.0g，收率为95.2％，裂解收率略低于实施例11，结晶后，呈粘稠状，过滤时间90分钟，过滤速度远慢于实例11，结晶后粗品纯度为90.38％、关键杂质含量为1.85％，对比与实例11，粗品纯度偏低、关键杂质含量偏高。
实施例15司美格鲁肽的结晶
取裂解液100mL加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温15-20℃，预先1:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷，通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.4g，收率为80.9％，收率远低于实施例11。结晶后，过滤时间35分钟，过滤速度远略慢于实例11，结晶后粗品纯度为90.88％、关键杂质含量为1.74％，对比与实例11，粗品纯度略偏低、关键杂质含量略偏高。
实施例16司美格鲁肽的结晶
取1000mL预先1:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷加入圆底烧瓶，控制圆底烧瓶溶液内温15-20℃，将100mL裂解液通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液中，边加边搅拌，搅拌速度为100rmp，加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120-130rmp，共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤，再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼三次，抽干，干燥得到司美格鲁肽粗品3.5克，收率为83.3％，收率远低于实施例11，结晶呈块状，不易搅拌散开，过滤时间80分钟，过滤速度远略慢于实例11，结晶后粗品纯度为86.88％、关键杂质含量为2.16％，对比与实例11，粗品纯度偏低、关键杂质含量偏高。
实施例17司美格鲁肽的二次HPLC纯化
取粗品，用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，第一步纯化：流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液；第二步纯化对纯品转盐：流动相A相为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两步纯化均为梯度洗脱：洗脱梯度为B相10％～60％，C18制备柱(50×250mm，10μm)，洗脱时间为60min，流速为80mL/min，紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到司美格鲁肽成品。
实施例18司美格鲁肽结晶产物的检测条件
过滤后样品检测方法如下：1.仪器：DIONEX170，2.色谱柱：Welch-C18-120A-5μm4.6×250mm,3.流动相：A相：2％三乙胺水溶液用磷酸调pH至3.0，B相：色谱纯乙腈，4.流速：1mL/min,5.波长：220nm，6.梯度(B％)：22％——42％(40min)。
由以上实施例可知，采用不同的试剂进行结晶，所得到得到产物状态非常不同。即使是相同种类的有机试剂也可能产生不同的产品状态。而不同的产品状态对于产品最终的分离、纯度以及后处理都存在较大影响。例如结晶颗粒小或者不成型的产品会导致无法过滤或者过滤速度太慢，无法在商业上使用，严重影响了该方案的实施，而只能采用离心的方法进行分离，进而导致杂质的带入。本发明的方法简单，能够获得很好的结晶状态，所以可以通过减压过滤迅速获得产品，且纯度很高。本发明的方法过滤速度是其他方法过滤速度的至少2倍，更重要的是，在RT＝20-21min附近的关键杂质，如果采用本发明的结晶条件，可以显著减低该杂质的含量，进而通过HPLC能够完全去除。虽然HPLC是纯化的重要手段，通过HPLC多次纯化能够去除大部分杂质，但是HPLC纯化时间长、耗费有机溶剂，同时也降低了产率。本发明采用调整结晶条件的方法，意外地发现本发明的结晶条件能够在结晶步骤进行初步纯化，纯化方法简单、采用的设备简单、效率更高。

Claims (12)

1.一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：
1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；
2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；
3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；
4)将结晶过滤获得司美格鲁肽；
步骤3)中结晶时裂解液，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的温度为10-15℃；
步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中的乙酸乙酯和环己烷比例为1:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂解液体积的8-12倍。
3.根据权利要求2所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂解液体积的10倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解液过程中搅拌速度为100rmp，结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp-130rmp。
5.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中结晶的时间为15-60分钟。
6.根据权利要求5所述的制备方法，步骤3)中结晶的时间为25-35分钟。
7.根据权利要求1所述的制备方法，步骤4)中过滤的方法为减压过滤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，步骤4)中过滤的方法为采用减压漏斗进行过滤。
9.根据权利要求1所述的制备方法，步骤4)中过滤时采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液洗涤滤饼2-5次。
10.根据权利要求1所述的制备方法，步骤2)所述的裂解剂为TFA、TIS、EDT、PhOH和H2O的混合物。
11.根据权利要求10所述的制备方法，步骤2)所述的裂解剂为TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5；裂解时间为1.5-3.5小时。
12.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1)中，在固相合成树脂上从C端向N端依次合成主链，然后脱除Lys的侧链保护基，并偶联侧链获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物。
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