CN112107739A - 一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料及制作方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料及制作方法属纳米材料及医用材料表面改性技术领域,本发明以硅片为基板的材料,在基板表面刻蚀有呈正方形排列的圆柱状结构,具有纳米针状结构的纳米氧化锌、二氧化钛涂覆层涂覆于圆柱状结构表面。本发明利用纳米结构物理杀菌的原理来杀死材料表面粘附的细菌,不会带来任何产生细菌耐药性的风险,且制备氧化锌纳米柱超高的长径比,使其具有高达99%以上的杀菌率;利用多级微纳米结构共存的表面,不仅可有效杀死细菌,同时微米尺度阵列的存在,能很大程度增加正常细胞在材料表面的粘附面积,并可有效促进正常细胞的增殖分化,与平面相比,其细胞增殖数量得到大幅度提升。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料及医用材料表面改性技术领域,具体涉及一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料及制作方法。
背景技术
过去的50年中,材料科学技术的进步提高了人们的生活品质,延长了人类的寿命。很多情况下,对人体的不可挽回的损害不再必然意味着功能损失或生活质量的下降,永久植入的生物材料和器械(例如各类导管、心脏起搏器、肺部辅助装置和髋关节植入物等)的使用实现了人体的功能恢复、促进组织再生和伤口愈合。然而细菌在其表面的粘附与增殖所引发的感染给患者带来了极大的痛苦,故上述植入材料和器械的应用也面临了极大挑战。
据统计,细菌在生物医用材料表面的增殖所引发感染的患病率在发达国家通常为4-10%(在重症监护病房达到30%),使其成为第六大死因,而发展中国家的患病率通常更高(大于15%)。技术上成功的手术并不能防止材料表面细菌增殖引发的感染,在没有皮肤穿透性创伤的情况下,造成植入物表面增殖而引发感染的生物体,可能在手术期间(手术期污染)或伤口闭合前的住院期间(术后早期污染)进入伤口部位或附着于植入物。即便有些依附于医疗器械进入人体内的病原体在短时间内处于休眠状态,不易被免疫***发现,但在手术后多年仍会造成临床上显著的感染。因此引起的长期住院或二次手术不仅给患者带来了极大的痛苦,而且造成了严重的经济后果。在美国,近期医疗保健相关感染的直接费用估计在1年内花费从280亿美元到450亿美元不等,其中60%以上与医疗设备有关。
细菌对固体基质的污染一般起始于初始的可逆粘附,然后是在固体表面定植进而形成三维网状的生物膜组织。生物膜的形成为细菌的生长增殖提供了极佳的环境,它不仅可以帮助细菌抵挡免疫细胞的捕获,而且降低了大部分抗生素对细菌的杀害作用。抗生素的发现及使用确实在过去的近百年中为人类做出了极大的贡献,但是随着抗生素的过度使用,越来越多的细菌对抗生素的敏感性变得逐渐钝化,其效应在临床上已然逐渐表现出颓式,特别是面对超级细菌的出现传统的抗生素更是束手无策。一款新型抗生素从研制到真正投入使用,一般需要经过数年甚至数十年的时间,而相关研究表明一种细菌在适宜的环境下,发展产生出对某一特定抗生素的耐药性仅需数十天。由此可见,新型抗生素的开发远远赶不上细菌耐药性产生的速度。面对这一窘境,开发新型抗菌手段被认为是目前对抗细菌感染研究中极为重要的研究途径。
2012年澳大利亚研究学者Ivanova等人率先报道,具有纳米柱状结构的蝉翼表面具有良好的杀菌效应,并且指出其杀菌原理主要是源自于表面密集的纳米柱状结构对于粘附于表面的细菌的物理撕裂作用。相对于传统的杀菌剂对于细菌的化学灭活效应,这种只通过纳米柱对细菌的物理作用而使细菌死亡的方法,不存在任何引发细菌耐药性产生的可能性。这个发现无疑为抗细菌感染所引发的抗生素耐药性新提供了新思路。然而,如何将这一新发现的自然界模型应用于实际抗菌治疗上目前依然是一个待解决的问题,因为这首先涉及到如何在材料表面制备出均一的纳米尺度,且具有较好杀菌长径比的阵列,另外如果是将这一改性表面应用到可移植体内的医疗器械表面时,往往还要求这样的表面在拥有良好杀菌性的同时,还要具有良好的促进人体正常细胞在其表面的可粘附性,以减少人体组织的排异效应。
发明内容
本发明的目的在于设计一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料及制作方法,通过多尺度微纳兼具的表面构建,同时实现对细菌的杀死与细胞粘附的促进功能。在这一体系中,纳米尺度的最外层氧化锌纳米针通过物理撕裂的方式将粘附于表面的细菌杀死;而具有更大尺度的微米级表面可以给具有更大尺度的细胞粘附,提供更为广阔的表面积,以此来促进正常细胞在其表面的粘附。这两种尺度的功能彼此不受任何影响,相互促进,能实现同一表面杀菌与促进正常细胞粘附的双功能。相较于传统的单一的物理结构杀菌表面或单一的促细胞粘附的微米表面,又或者是化学杀菌与促细胞粘附的表面,本发明的设计整合了结构杀菌、促细胞粘附与避免细菌耐药性产生多功能为一体,这样的设计更加贴近于实际应用,为可移植医疗器械的表面改性提供了一个崭新方法。
本发明的具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料,由基板A和涂覆层B组成,其中基板A的材料为硅片;基板A的厚度H为1-5毫米,基板A表面刻蚀有圆柱状结构1,圆柱状结构1中每个圆柱的高为10-20微米,直径为5-10微米,且圆柱状结构1的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:15-25微米;涂覆层B涂覆于基板A的圆柱状结构1表面,涂覆层B的厚度为1-5微米;涂覆层B为具有纳米针状结构2的纳米氧化锌、二氧化钛。
本发明的具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料的制作方法,包括下列步骤:
2.1用硅片作为基板A;
2.2用通量为190sccm的C4F8和通量为450sccm的SF6,对步骤2.1的硅片进行交替刻蚀,刻蚀速率为5微米/分钟,得到圆柱状结构1,圆柱状结构1中每个圆柱的高为10-25微米,直径为5-18微米,圆柱状结构1的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:20-30微米;
2.3将氢氧化钠的甲醇溶液Ⅰ50mL,逐滴加入醋酸锌的甲醇溶液Ⅱ50mL中,然后放入油浴锅中60℃搅拌2h,得到混合溶液;其中:甲醇溶液Ⅰ为0.03M甲醇溶液,甲醇溶液Ⅱ为0.01M甲醇溶液;
2.4采用旋涂的方式将步骤2.3得到的混合溶液,旋涂于步骤2.2中经过交替刻蚀的硅片表面,再放入马弗炉中350℃退火30min,得到具有纳米针状结构2的纳米氧化锌种子的基底;
2.5将步骤2.4所得到的具有纳米针状结构2的纳米氧化锌种子的基底,放入含有2M的六水合硝酸锌和2M的氢氧化钠的混合溶液中,50℃保温1h,得到具有杀菌和促进人体细胞粘附的仿生材料。
本发明的优点在于:
1.利用纳米结构物理杀菌的原理对材料表面粘附的细菌进行杀死,不会带来任何产生细菌耐药性的风险,并且制备氧化锌纳米柱超高的长径比使其具有很高的杀菌率,可达到99%以上(图8)。
2.利用多级微纳结构共存的表面,不仅可以有效杀死细菌,同时微米尺度阵列的存在很大程度增加了正常细胞在材料表面的粘附面积,并且可以有效促进正常细胞的增殖分化过程,与平面相比,其细胞增殖数量得到大幅度提升(图9)。
附图说明
图1为具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料的结构示意图
图2为图1中a所指的放大图
图3为具有杀菌和促进人体细胞粘附的仿生材料的主视图
图4为底板A的俯视图
图5为刻蚀后底板的主视图
图6为刻蚀后底板的俯视图
图1至图6中:A.基板B.涂覆层1.圆柱状结构2.纳米针状结构;
图7为不同结构扫描电镜图
其中:(a1、a2)为一级微米结构硅基底,(b1、b2)为二级结构氧化锌修饰表面,(c1、c2)为一级纳米结构氧化锌;
图8为对四种不同样品进行抗菌实验的扫描电镜得到的表面杀菌情况图
其中:(a)平面硅片,(b)一级微米材料,(c)一级纳米材料,(d)二级材料;
图9为促细胞粘附增殖测试四种不同样品的表面细胞粘附情况统计图
其中:(a)平面硅片,(b)一级微米材料,(c)一级纳米材料,(d)二级材料;
图10为具有杀菌和促进人体细胞粘附的仿生材料的第一种制作方法流程图
图11为具有杀菌和促进人体细胞粘附的仿生材料的第二种制作方法流程图
具体实施方式
如图1至图6所示,本发明的具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料,由基板A和涂覆层B组成,其中基板A的材料为硅片;基板A的厚度H为1-5毫米,基板A表面刻蚀有圆柱状结构1,圆柱状结构1中每个圆柱的高为10-20微米,直径为5-10微米,且圆柱状结构1的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:15-25微米;涂覆层B涂覆于基板A的圆柱状结构1表面,涂覆层B的厚度为1-5微米;涂覆层B为具有纳米针状结构2的纳米氧化锌、二氧化钛。
本发明的具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料的制作方法,包括下列步骤:
2.1用硅片作为基板A;
2.2用通量为190sccm的C4F8和通量为450sccm的SF6,对步骤2.1的硅片进行交替刻蚀,刻蚀速率为5微米/分钟,得到圆柱状结构1,圆柱状结构1中每个圆柱的高为10-25微米,直径为5-18微米,圆柱状结构1的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:20-30微米;
2.3将氢氧化钠的甲醇溶液Ⅰ50mL,逐滴加入醋酸锌的甲醇溶液Ⅱ50mL中,然后放入油浴锅中60℃搅拌2h,得到混合溶液;其中:甲醇溶液Ⅰ为0.03M甲醇溶液,甲醇溶液Ⅱ为0.01M甲醇溶液;
2.4采用旋涂的方式将步骤2.3得到的混合溶液,旋涂于步骤2.2中经过交替刻蚀的硅片表面,再放入马弗炉中350℃退火30min,得到具有纳米针状结构2的纳米氧化锌种子的基底;
2.5将步骤2.4所得到的具有纳米针状结构2的纳米氧化锌种子的基底,放入含有2M的六水合硝酸锌和2M的氢氧化钠的混合溶液中,50℃保温1h,得到具有杀菌和促进人体细胞粘附的仿生材料。
由图7.a1、a2可以看出通过离子刻蚀的方法,可以得到具有均一尺度的微米柱状阵列修饰的硅基板表面。图7.b1、b2、c1、c2显示,通过水热合成的方法,不管基板是平面还是具有一定结构的表面,都可以生长出具有较大长径比且尺寸均一的氧化锌纳米柱。图7证明通过本发明设计的方法确实可以得到尺寸均一,形貌可控的多级材料。
图8表明,经过3小时的细菌液浸泡以后,平面基板(图8.a)或者是表面具有微米尺度的基板(图8.b)都粘附了一定量的细菌,并且这些细菌形态保持完好,与原始的棒状结构无明显差别,表明平面硅基底以及微米结构基底无明显杀菌作用。而经历过氧化锌纳米柱修饰过的一级氧化锌结构抑或是二级结构,其表面粘附的细菌都呈现出了由于细胞内溶物外流而引起的偏平、透明的变形形态,完全失去了原始的饱满棒状形态,其状态与其它结构杀菌表面所造成的细菌变形形态一样,证明其已经被杀死,表明了所有被氧化锌纳米柱的所修饰表面都具有很好的物理结构杀菌的功效。
图9表明,经过7天表面细胞培养以后,含有多级结构的样品表面(图9.d)粘附了较其他样品更多的细胞,这主要是因为多级材料相对表面积更大,细胞的可粘附点更多,更加利于细胞的粘附、分化与增殖。因此,具有多级结构的修饰的材料表面,更加适合植入类医疗器械表面的改性处理。
实施例1
1.1利用C4F8(通量190sccm)SF6(通量450sccm)对硅片进行交替刻蚀,刻蚀速率为5微米/分钟,得到高10微米直径5微米的微米级柱状阵列,如图7中a1、a2所示;
1.2氢氧化钠的甲醇溶液(0.03M)50mL,逐滴地加入50mL醋酸锌的甲醇溶液中(0.01M)然后放入油浴锅中60℃搅拌2小时。将得到的溶液采用旋涂的方式旋涂1.1得到的微米柱基底表面,放入马弗炉中350℃退火30分钟,得到带有氧化锌纳米种子的基底。作为对照,平面硅片表面也做同样处理;
1.3将1.2所得到的带有氧化锌种子的基底放入含有2M六水合硝酸锌和2M氢氧化钠的混合溶液中50℃保温1小时,如图7中b1、b2、c1、c2所示;
1.4将得到的样品浸泡在2mL浓度为108CFUmL-1的菌液中3小时进行样品杀菌测试,将与细菌共培养之后的样品,进行荧光染色和固定处理,以便进行激光共聚焦显微镜和扫面电镜检测,测试结果如图8所示;
1.5为测试样品表面对于细胞粘附增殖的影响,本设计采用将大鼠的骨髓间充质干细胞接种在不同的样品表面,放在37℃恒温培养箱中培养7天,将表面用PBS缓冲液轻轻冲洗后,将样品放在DMSO溶液中,用微型振荡器振荡5分钟,取振荡液检测其OD值,样品表面细胞粘附增殖情况如图9所示。
实施例2
2.1利用C4F8(通量190sccm)SF6(通量450sccm)对FTO玻璃进行交替刻蚀,刻蚀速率为4微米/分钟得到高10微米直径5微米的微米级柱状阵列;
2.2将5mL质量分数为36.5%的盐酸加入至55mL去离子水中搅拌均匀后,将1mL钛酸四丁酯加入到上述盐酸溶液中并搅拌15分钟;
2.3将2.1得到的含有微米柱的FTO玻璃及平面玻璃放入到2.2得到溶液中,在高压釜中120℃加热6小时后,自然冷却,便可得到含有纳米二氧化钛柱的阵列表面;
2.4将得到的样品浸泡在2mL浓度为108CFUmL-1的菌液中3小时进行样品杀菌测试,并对与细菌共培养之后的样品进行细菌表面形态固定处理,以便进行扫面电镜检测;
2.5同实施例1中的1.5。
Claims (2)
1.一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料,其特征在于,由基板(A)和涂覆层(B)组成,其中基板(A)的材料为硅片;基板(A)的厚度H为1-5毫米,基板(A)表面刻蚀有圆柱状结构(1),圆柱状结构(1)中每个圆柱的高为10-20微米,直径为5-10微米,且圆柱状结构(1)的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:15-25微米;涂覆层(B)涂覆于基板(A)的圆柱状结构(1)表面,涂覆层(B)的厚度为1-5微米;涂覆层(B)为具有纳米针状结构(2)的纳米氧化锌、二氧化钛。
2.按权利要求1所述具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料的制作方法,其特征在于,包括下列步骤:
2.1用硅片作为基板(A);
2.2用通量为190sccm的C4F8和通量为450sccm的SF6,对步骤2.1的硅片进行交替刻蚀,刻蚀速率为5微米/分钟,得到圆柱状结构(1),圆柱状结构(1)中每个圆柱的高为10-25微米,直径为5-18微米,圆柱状结构(1)的圆柱呈正方形排列,相邻两圆柱的中心距L为:20-30微米;
2.3将氢氧化钠的甲醇溶液Ⅰ50mL,逐滴加入醋酸锌的甲醇溶液Ⅱ50mL中,然后放入油浴锅中60℃搅拌2h,得到混合溶液;其中:甲醇溶液Ⅰ为0.03M甲醇溶液,甲醇溶液Ⅱ为0.01M甲醇溶液;
2.4采用旋涂的方式将步骤2.3得到的混合溶液,旋涂于步骤2.2中经过交替刻蚀的硅片表面,再放入马弗炉中350℃退火30min,得到具有纳米针状结构(2)的纳米氧化锌种子的基底;
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