CN112098643B

CN112098643B - 一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用

Info

Publication number: CN112098643B
Application number: CN202010841034.9A
Authority: CN
Inventors: 贝锦龙; 廖明; 魏文康; 陈琴苓; 王志林; 俞婷; 张晓爱; 于深浩; 王蕾
Original assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-08-20
Also published as: CN112098643A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用。该方法是包括以下步骤：以已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白为探针，来捕获待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白；用固定的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域，来捕获步骤(1)中未发生结合的探针；通过检测已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域是否能捕获到未发生结合的探针，来判断待测冠状病毒的刺突蛋白能否与步骤(1)中已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白结合，进而评估待测冠状病毒通过ACE2受体感染上述脊椎动物物种的风险。本发明的检测对象不限于某种指定的冠状病毒，只要能与ACE2蛋白发生有效结合的，即可被检测到。

Description

一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MARS)与新型冠状病毒肺炎(COVID-19)相继于2002年、2008年与2019年暴发。引起这三种严重呼吸道传染病的病原体——SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2均属于冠状病毒。除MERS-CoV通过结合人二肽基肽酶(DPPs)感染人体外，SARS-CoV、SARS-CoV-2及另一种的冠状病毒HCoV-NL63，均通过其表面刺突蛋白的S1结构域与其天然功能受体——人血管紧张素转化酶2(ACE2)结合来引发呼吸道症状感染。因此冠状病毒通过结合ACE2受体来感染人体被多次证明是一个有效的捷径。

SARS与MARS均已确定中间动物宿主：SARS通过果子狸、MARS通过骆驼传染人类。COVID-19的中间宿主虽然尚未找到，但也已基本明确同样来自于动物。目前已在多种脊椎动物如人、鸡、犬、狼、牛、禽类等中发现各种冠状病毒。更值得注意的是冠状病毒属于基因组为复制错误率较高的线性单股正链RNA，容易发生跨物种传播突变。因此未来再次出现能通过结合ACE2受体来感染人体的未知冠状病毒的概率较大。

与传统的传染病防治思路不同，提前研究野生动物携带的未知冠状病毒，可以前瞻性地预警新发传染病，特别是储备相关特异性诊断试剂与防治知识，有助于采取早期应对措施，及时控制传染源，防止发生类似COVID-19这样的全球性暴发事件。但同样由于冠状病毒基因组复制错误率高导致的易突变性，不同种的冠状病毒刺突蛋白一级序列与三级结构差异很大；例如SARS-CoV与SARS-CoV-2虽然都通过ACE2受体来实现入侵，但它们刺突蛋白序列相似度只有79％，结构分析更证明它们刺突蛋白结构存在很大差异，从而导致对ACE2蛋白的结合力相差很远(新冠病毒较强)。因此通过直接观察未知冠状病毒刺突蛋白与人ACE2蛋白是否结合，来定性评估其感染人类的风险性具有重要的意义。

现有的以评估未知冠状病毒跨物种传播风险为目的的各种实验方法与检测手段，都有各自的缺陷：

1、基于伦理，禁止实施未知冠状病毒人体实验，无法用人体来进行跨物种感染实验；

2、限于生物实验室安全等级，细胞感染实验或动物体转染实验也只可能在极少数有条件的机构实施，无法普及推广；

3、核酸检测技术，结合生物信息学与结构生物学，只能非直接地计算预测未知冠状病毒潜在危害性，缺乏实验证据；

4、基于抗体抗原特异性结合的免疫检测方案，其核心均为针对已知冠状病毒蛋白来特异性设计抗体，无法实现评估未知冠状病毒的感染风险；

5、以人为例，将纯化的未知动物冠状病毒S蛋白与人ACE2蛋白，通过SPR(表面等离子体共振)、BLI(生物膜层表面干涉技术)或ITC(等温量热滴定)进行结合动力学与(或)热力学测定，可以精确量化两种蛋白的互作，从而评估跨物种传播风险但每次均需要对未知冠状病毒S蛋白进行外源表达与多步骤精纯，周期长，成本高，步骤复杂。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法；该方法是一种非传统免疫检测的通用方法，即不通过使用针对某种特定冠状病毒的完整或部分蛋白的抗体介导的抗原抗体反应，而是使用某特定物种的完整或部分ACE2蛋白，捕获非特定冠状病毒的完整或部分刺突蛋白，来达到定性评估未知冠状病毒感染某特定物种风险的目的(原理见图1)。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述方法评估冠状病毒跨物种传染风险的试纸条。

本发明的再一目的在于提供一种上述试纸条的应用，可以应用于直接检测含未知冠状病毒的动物样品，或检测外源表达的经过纯化或未经过纯化的未知冠状病毒S1蛋白。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法，包含如下步骤：

(1)以已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白为探针，来捕获待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白，其中，该未知冠状病毒的完整或部分刺突蛋白包含预测受体结合区域(RBD)；

(2)用固定的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域，来捕获步骤(1)中未发生结合的探针，其中，该已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域可结合步骤(1)中已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白；通过检测已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域是否能捕获到未发生结合的探针，来判断待测冠状病毒的刺突蛋白能否与步骤(1)中已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白结合，进而评估待测冠状病毒通过ACE2受体感染上述脊椎动物物种的风险；

所述某脊椎动物为人类、果子狸、猫类、犬类或鼬类；

所述的标记优选为胶体金包被标记、荧光标记、时间分辨荧光标记、反斯托克斯发光标记、有色乳胶标记、以吖啶酯为代表的化学发光剂标记、以三联吡啶钌为代表的电化学发光剂标记或基于碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶(HPR)等的酶联标记、生物素标记等；

所述的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白、待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白和已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域均来自天然、真核外源表达、原核外源表达或人工合成；

一种利用上述方法评估冠状病毒跨物种传染风险的试剂盒，包括试纸条和配套试剂，其中，试纸条包括衬板；其中，在衬板上依次设有加样垫、多肽垫、检测层和吸收垫，加样垫上设有点样区，检测层为硝酸纤维素膜；在加样垫和检测层之间设有含金标链霉亲和素的多肽垫；在检测层上包被有已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域形成的检测线和质检线；

所述的吸收垫的目的就是提供一个毛细吸液的趋势，让滴加的生物素化ACE2蛋白尽快进入多肽垫，并往前渗透；

所述的质检线用于检测金标是否有效，优选包被生物素化BSA；

所述的配套试剂为生物素化某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白溶液；

所述的生物素化某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白溶液的浓度优选为1-100μg/ml；

所述的利用上述方法评估冠状病毒跨物种传染风险的试剂盒在评估冠状病毒跨物种传染风险中的应用；

所述的应用，优选包含如下步骤：

将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白(需包含预测受体结合区域)溶液与配套试剂混合后滴加在点样区；通过检测检测线上的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域能否结合到被金标亲和素结合的生物素化某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染该脊椎动物的风险，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标亲和素，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效；

所述的配套试剂为生物素化的人ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV的S1或SARS-CoV-2的S1蛋白形成，其对应的应用，具体包含如下步骤：将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区；通过检测检测线上的SARS-CoV的S1或SARS-CoV-2的S1蛋白能否结合到被金标亲和素结合的生物素化人ACE2PD从而发生显色，来定性评估待测冠状病毒感染人类的风险，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

所述的配套试剂为生物素化的果狸子ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV的S1蛋白形成；其对应的应用，具体包含如下步骤：将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV的S1蛋白能否结合到被金标亲和素结合的生物素化果子狸ACE2PD从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染果子狸的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

所述的配套试剂为生物素化的猫ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV-2的S1蛋白形成；在其对应的应用，具体包含如下步骤：待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV-2的S1蛋白，能否结合到被金标亲和素结合的生物素化猫ACE2PD从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染猫类的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

所述的配套试剂为生物素化犬ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV-2的S1蛋白形成；在其对应的应用，具体包含如下步骤：待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV-2的S1蛋白，能否结合到被金标亲和素结合的生物素化犬ACE2PD从而发生显色，来定性评估待测冠状病毒感染犬类的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

本发明的原理：

本发明通过检测待测冠状病毒完整刺突蛋白或任何包括其完整受体结合区域(Receptor Binding Domain)的天然或外源表达或人工合成的多肽序列，与包含人ACE2蛋白胞外部分的天然或外源表达或人工合成的多肽序列是否结合来评估非特定的、跨物种传染性未知的冠状病毒通过ACE2受体感染该物种的风险；其中，本发明的检测对象不限于某种指定的冠状病毒，只要能与ACE2发生有效结合的，即可被检测到。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)特异性针对某种或几种(当存在表位交叉的情况时)冠状病毒的传统免疫学检测方法不同，本发明由于突破性地使用目标物种的完整或部分ACE2蛋白为探针，只要刺突蛋白能与其发生结合的冠状病毒都可以做风险评估，具备检测对象的相对广谱性(如果是通过结合其他受体发生感染的冠状病毒不在其中)。

(2)除简易移液设备外，只需肉眼即可初步定性评估某冠状病毒通过ACE2来感染某特定物种的风险，因此可以在野外使用本发明的检测板。由于不涉及活细胞或动物，对实验室安全要求较低(使用后的检测板与移液耗材等可通过消毒液例如84消毒液进行消毒处理)。可以不直接使用病毒本体，通过检测外源表达的待测冠状病毒的包含RBD区域的S蛋白片段(其序列由测序结果获知)，来做风险评估。其结果直接真实地反映S蛋白(片段)与ACE2蛋白胞外部分的结合能力，可信度高。

因此本发明为相关风险评估提供了普及性：降低了主动搜寻具备跨物种传染能力(尤其是对人)的冠状病毒的专业与条件门槛，使得筛查评估一体化行为下沉到动物检验检疫或治疗收容基层单位或个人成为可能；特别有利于现场操作。提供了安全性：实施本发明无需进行活体实验，或基层单位或个人通过提交样品进行常规宏基因组测序，向具备外源表达能力的实施单位提供相关S蛋白的基因序列；即可获得非病毒来源的S蛋白进行检测与风险评估；最大程度的避免了病毒扩散与泄露的可能性。

附图说明

图1为待测冠状病毒传染特定物种的风险定性评估原理图。

图2为检测板结构示意图，其中A为衬板，B为加样垫，C为多肽垫，D为检测层，E为检测线，F为质检线，G为吸收垫，O为点样区。

图3为SARS-CoV S1蛋白瞬时表达重组质粒的构建图。

图4为SARS-CoV-2S1蛋白瞬时表达重组质粒的构建图。

图5为待测冠状病毒传染人的风险定性评估原理图。

图6为BSA、SARS-CoV S1与SARS-CoV-2S1蛋白的试纸条检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)基因合成

以一种包含SARS-CoV刺突蛋白RBD区的多肽(SARS-CoV S1)与一种包含SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区的多肽(SARS-CoV-2S1)为例进行如下试验，其中，SARS-CoV S1和SARS-CoV-2S1氨基酸序列分别如SEQ ID No 1与SEQ ID No 2所示(序列来源：GenBank No:AAX16192.1与NC_045512)。

(1)对SARS-CoV S1和SARS-CoV-2S1的氨基酸序列(SEQ ID No 1与SEQ ID No 2)进优化，其中，C端为链接序列“GGGGS”+人Fc亲和标签，N端添加人血清白蛋白的信号肽，得到SEQ ID No 3和SEQ ID No 4；

(2)在SEQ ID No 3和SEQ ID No 4基础上，进一步在序列两端设计酶切位点，并在信号肽前增加kozak序列“GCCACC”，得到SEQ ID No 5和SEQ ID No 6，然后合成后测序验证正确。

1、SARS-CoV S1(SEQ ID No 1)

SGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFDNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDTWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQK

2、SARS-CoV-2 S1(SEQ ID No 2)

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR

3、Taged SARS-CoV S1(SEQ ID No 3)

MKWVTFISLLFLFSSAYSSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFDNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDTWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKGGGGSE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

其中，下划线+加粗部分为人血清白蛋白的信号肽的氨基酸序列，下划线+灰色底纹部分为链接序列“GGGGS”+人Fc亲和标签；

4、Taged SARS-CoV-2S1(SEQ ID No 4)

MKWVTFISLLFLFSSAYSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK

5、Target SARS-CoV S1(SEQ ID No 5)

GAATTCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCTCCGCCTACAGCAGCGGAAGCGATCTGGACAGGTGCACCACCTTTGACGACGTGCAGGCCCCTAACTACACACAGCACACCTCCAGCATGAGGGGCGTGTACTACCCCGACGAGATCTTTAGGTCCGATACCCTGTACCTGACCCAGGATCTGTTCCTGCCCTTCTACAGCAACGTGACAGGCTTCCACACCATCAACCACACCTTTGACAATCCTGTGATCCCTTTTAAGGACGGCATCTACTTCGCCGCCACAGAGAAGTCCAATGTGGTGAGGGGCTGGGTGTTCGGCAGCACCATGAACAACAAGAGCCAGAGCGTGATCATCATCAACAATTCCACAAACGTGGTCATTAGAGCCTGTAACTTCGAGCTGTGCGATAATCCCTTCTTCGCCGTGTCCAAGCCTATGGGCACCCAGACACACACCATGATCTTCGACAATGCCTTTAACTGCACCTTTGAGTACATCAGCGACGCCTTCTCCCTGGACGTGAGCGAGAAGAGCGGCAACTTTAAGCACCTGAGAGAGTTTGTGTTTAAGAATAAGGACGGCTTCCTGTACGTGTACAAGGGCTACCAGCCTATCGACGTGGTGAGAGATCTGCCTAGCGGCTTCAACACCCTGAAGCCCATCTTTAAGCTGCCCCTGGGCATCAACATCACAAACTTTAGGGCCATCCTGACCGCCTTCAGCCCTGCCCAGGATACCTGGGGCACAAGCGCCGCCGCCTACTTCGTGGGCTACCTGAAGCCCACCACCTTCATGCTGAAGTACGATGAGAACGGCACCATCACAGACGCCGTGGATTGCTCCCAGAACCCCCTGGCCGAGCTGAAGTGTTCCGTGAAGAGCTTTGAGATCGACAAGGGCATCTACCAGACATCCAATTTTAGGGTGGTGCCCAGCGGCGACGTGGTGAGGTTCCCTAATATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTTAACGCCACAAAGTTCCCCTCCGTGTACGCCTGGGAGAGGAAGAAGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACAGCACATTCTTTAGCACCTTCAAGTGTTACGGCGTGTCCGCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTTCCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGGTGAAGGGCGATGATGTGAGGCAGATCGCCCCTGGCCAGACCGGCGTGATCGCCGATTACAATTACAAGCTGCCCGACGATTTCATGGGCTGTGTGCTGGCCTGGAACACCAGGAACATCGATGCCACATCCACCGGCAATTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACACGGCAAGCTGAGGCCTTTTGAGAGAGATATCTCCAATGTGCCTTTCAGCCCCGACGGCAAGCCTTGCACCCCCCCTGCTCTGAATTGCTACTGGCCCCTGAATGACTACGGCTTCTACACAACCACAGGCATCGGCTACCAGCCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGAATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCCAAGCTGAGCACAGATCTGATCAAGAACCAGTGCGTGAATTTCAATTTTAACGGCCTGACAGGCACAGGCGTGCTGACCCCTAGCTCCAAGAGATTTCAGCCTTTTCAGCAGTTCGGCAGAGACGTGAGCGACTTTACCGATAGCGTGAGGGACCCCAAGACCTCCGAGATCCTGGACATCAGCCCCTGTTCCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCTGGCACCAACGCCTCCTCCGAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGCACCGACGTGAGCACAGCCATCCACGCCGACCAGCTGACACCCGCCTGGAGAATCTACAGCACCGGCAACAATGTGTTTCAGACCCAGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCTGAGCACGTGGACACAAGCTACGAGTGCGATATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTACCACACCGTGTCCCTGCTGAGAAGCACATCCCAGAAGGGCGGCGGCGGATCTGAGCCTAAGTCCTGTGATAAGACACACACCTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAATAGCACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGAGACGAGCTGACAAAGAATCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACACCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCTGGCAAGTGATGAGGATCC

其中，斜体部分分别为EcoR I和BamH I酶切位点，下划线+加粗部分为kozak序列

6、Target SARS-CoV-2S1(SEQ ID No 6)

GAATTCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCTCCGCCTACAGCCAGTGCGTGAACCTGACAACCAGGACACAGCTGCCTCCCGCCTACACAAATAGCTTCACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGGAGCTCCGTGCTGCACTCCACCCAGGATCTGTTTCTGCCCTTTTTCTCCAACGTGACATGGTTTCACGCCATCCACGTGTCCGGCACAAACGGCACCAAGAGGTTCGACAATCCCGTGCTGCCCTTCAACGATGGCGTGTACTTTGCCTCCACAGAGAAGAGCAATATCATCAGGGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGATTCCAAGACACAGAGCCTGCTGATCGTGAATAACGCCACAAATGTGGTCATTAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGCAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAATAACAAGTCCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTGTACAGCAGCGCCAACAATTGTACCTTTGAGTACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTTAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTTAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAATCTGGTGAGAGACCTGCCTCAGGGCTTTAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCTATCGGCATCAATATCACAAGGTTTCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGGAGCTACCTGACACCCGGCGATAGCTCCAGCGGCTGGACCGCTGGCGCCGCTGCTTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCCAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAATGAGAATGGCACAATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCTCTGTCCGAGACAAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACAAGCAACTTTAGAGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAATCTGTGCCCTTTCGGCGAGGTGTTTAATGCCACAAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGATTCCTTTGTGATCAGAGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCCCCCGGCCAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGATGACTTTACAGGCTGTGTGATCGCCTGGAATAGCAACAACCTGGATTCCAAAGTGGGCGGCAATTACAATTACCTGTACAGACTGTTTAGAAAGTCCAACCTGAAGCCCTTTGAGAGAGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACACCTTGTAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCTACAAACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACAAATCTGGTGAAGAATAAGTGTGTGAACTTTAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAATAAGAAGTTCCTGCCTTTTCAGCAGTTTGGCAGAGACATCGCCGATACAACAGATGCCGTGAGGGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGATATCACCCCCTGTTCCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACAAACACAAGCAATCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGCACCGAGGTGCCTGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTGACACCTACCTGGAGAGTGTACTCCACAGGCTCCAACGTGTTTCAGACAAGGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCATGTGAACAACAGCTACGAGTGTGACATCCCTATCGGCGCCGGCATCTGCGCCTCCTACCAGACCCAGACAAACTCCCCCAGAAGGGCCAGAGGCGGCGGCGGATCTGAGCCTAAGTCCTGTGATAAGACACACACCTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAATAGCACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGAGACGAGCTGACAAAGAATCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACACCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCTGGCAAGTGATGAGGATCC

(2)质粒构建

①设计"GGATCTCTAGC"+EcoR I+Kozak+HSA信号肽+Hpa I+TAA+BamH I+"CCCGACCTCGAC"的核酸序列：“GGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCTCCGCCTACAGCGTTAACTAAGGATCCCCCGACCTCGAC”并将该合成片段通过PCR反应加T后，连接入pcDNA3.4-TOPO质粒(美国热电，货号：A14697)，获得pcDNA3.4-E质粒；连接后获得的pcDNA3.4-E质粒，转化大肠杆菌DH5ɑ菌株感受态，氨苄板子挑克隆测序验证，即为目标克隆。

②将SEQ ID No 5和SEQ ID No 6均分别用EcoR I与BamH I酶切后***同样双酶切后的pcDNA3.4-E载体，生成瞬时表达重组质粒(图3-图4)。连接后获得的瞬时表达重组质粒，转化大肠杆菌TOP10菌株感受态，氨苄板子挑克隆测序验证，即为目标克隆，然后采用无内毒素质粒中量提取试剂盒-DP108(天根生物)进行质粒抽提。

(3)转染

①培养293F细胞(美国热电，货号：R79007)处于对数生长期，活力大于95％，细胞处1.8-2.2×10⁶cell/ml。

②PEI(聚醚酰亚胺)需提前37度预热，DNA(步骤(2)抽提的质粒)提前室温预热10min，转染缓冲液(转染缓冲液：每30ml转染体积，3mL OPM-CD Trans293Glutamine(+)培养基(上海奥浦迈)+30μg质粒+150μg转染试剂PEI)37℃预热。

③转染体系如表1所示：

表1转染体系

转染体积	摇瓶规格	细胞体积	培养基	DNA	293(PEI)
						每30mL	125mL	27mL	3mL	30μg	150μg

④将所需质粒及PEI添加入转染缓冲液里面，将两者混合一起充分摇匀，37℃孵育7min。

⑤将孵育好的质粒添加到细胞中，37℃悬浮培养。

⑥转染24h以后补充N源(3％TN1)。

⑦第6天计数细胞，观察细胞状态及死亡率，收获细胞上清。

⑧12000rpm 15min，取上清用于下游纯化。

(4)亲和纯化重组表达的SARS-CoV或SARS-CoV-2的S1蛋白

①准备Protein A纯化柱，用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子。

②将PBS平衡过的Protein A柱加入到收集的上清中，在旋转孵育器上4℃孵育3h。

③用PBS缓冲液以0.5mL/min的流速洗杂，至流出液OD280值到达基线。

④洗杂至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱。

⑤用Elution-Buffer(0.1M NaCl,0.1M甘氨酸，pH 3.0)以1mL/min流速洗脱带Fc标签的S1蛋白，收集流出液，并用1M Tris-HCL pH9.0使其pH值恢复至中性，将收集的蛋白进行SDS-PAGE纯度分析后，将含目的蛋白组分加入透析袋中，用PBS(pH7.4)透析过夜，分别得到SARS-CoV S1蛋白和SARS-CoV-2S1蛋白(浓度分别为0.3与0.25mg/ml)；

实施例2可定性评估待测冠状病毒通过ACE2传染人风险的检测板的制备

(1)胶体金的制备

取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、浓度为1％(质量百分比)的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到15-50纳米的胶体金溶液；

(2)链霉亲和素的胶体金标记

取2支1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL胶体金加入每管中，每管加入4μL0.2M碳酸钾，分别向管中加入20μg链霉亲和素，混匀后反应10min。向每管中加入40μL封闭液反应10min，11000r/min转速下离心20min。弃去上清，用500μL金复溶液(20mM tris、1％BSA、0.5％PVP、5％蔗糖)将沉淀复溶后铺在6mm×150mm金垫上，进行干燥。

(3)检测线与质检线

在检测板的检测层(图2中的D)上有含SARS-CoV-2S1蛋白的检测线(图2中的E)，与含生物素化BSA的质检线(图2中的F)。其制备方法是取实施例1纯化后的SARS-CoV-2S1蛋白，调浓度为0.25mg/ml，按1ul/cm设置喷膜量用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线；再取生物素化BSA调浓度为0.25mg/ml，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，按1μl/cm设置喷膜量作为质控线包被在NC膜上；室温，低湿度进行干燥。

所得检测板的结构如图2所示：在衬板(图2中的A)上依次设有加样垫(图2中的B)、检测层(硝酸纤维素膜)(图2中的D)和吸收垫(图2中的G)，在检测层和加样垫之间设有含金标亲和素的多肽垫(图2中的C)；在检测层上包被有由SARS-CoV-2S1蛋白形成的检测线(图2中的E)和含生物素化BSA的质检线(图2中的F)。

(4)生物素化人ACE2探针的准备

用10mM PBS，PH7.4的样品稀释液将人ACE2PD-Biotin(0.2mg/mL，市售)按1:80(体积比)稀释。

(5)结果判定标准

通过检测板定性评估待测冠状病毒传染人风险的判定标准见图5，具体操作如下：含待测冠状病毒S1结构域的样品液与生物素化人ACE2探针混合后滴加在点样区；通过检测检测线上的SARS-CoV-2S1蛋白，能否结合到被金标亲和素结合的生物素化人ACE2PD从而发生显色，来定性评估待测冠状病毒感染人类的风险，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效

实施例3：风险评估(示例)

待测病毒感染人的风险评估

分别取含1μg BSA、SARS-CoV S1与SARS-CoV-2S1蛋白的溶液与各1份50μL稀释后的人ACE2PD-Biotin探针溶液混合，滴加至检测板加样垫上，等待5-15分钟后，观察检测线与质检线。结果显示：三个检测板的质检线均出现显色条带，证明它们的风险评判结果均有效；由于滴加BSA的检测板上的检测线出现显色条带，因此评估BSA无风险；由于滴加SARS-CoV S1与SARS-CoV-2S1蛋白的检测板上的检测线不出现显色条带，因此评估SARS-CoV与SARS-CoV-2为高风险(图6)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心

<120> 一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 661

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CoV S1 氨基酸序列

<400> 1

Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala

1 5 10 15

Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro

20 25 30

Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe

35 40 45

Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr

50 55 60

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65 70 75 80

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Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val

100 105 110

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Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn

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Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe

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Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile

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210 215 220

Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala

225 230 235 240

Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp

245 250 255

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Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln

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Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr

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Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val

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Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu

545 550 555 560

Asp Ile Ser Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys

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Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp

595 600 605

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<210> 2

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CoV-2 S1氨基酸序列

<400> 2

Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr

1 5 10 15

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Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn

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Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln

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Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu

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Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser

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Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser

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Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr

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Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys

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Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

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Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

435 440 445

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<210> 3

<211> 916

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Taged CoV S1氨基酸序列

<400> 3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val

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Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr

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His Thr Phe Asp Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe

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Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser

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Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys

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Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe

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580 585 590

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915

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Taged CoV-2 S1氨基酸序列

<400> 4

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala

20 25 30

Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe

35 40 45

Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe

50 55 60

Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly

65 70 75 80

Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr

85 90 95

Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala

115 120 125

Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro

130 135 140

Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser

145 150 155 160

Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val

165 170 175

Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys

180 185 190

Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile

195 200 205

Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly

210 215 220

Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile

225 230 235 240

Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro

245 250 255

Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val

260 265 270

Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly

275 280 285

Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr

290 295 300

Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr

305 310 315 320

Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

325 330 335

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

340 345 350

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

355 360 365

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

370 375 380

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

385 390 395 400

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

405 410 415

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

420 425 430

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

435 440 445

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

450 455 460

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

465 470 475 480

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

485 490 495

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

500 505 510

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

515 520 525

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val

530 535 540

Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser

545 550 555 560

Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp

565 570 575

Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile

580 585 590

Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn

595 600 605

Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu

610 615 620

Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val

625 630 635 640

Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile

645 650 655

Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly

660 665 670

Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg

675 680 685

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

690 695 700

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

705 710 715 720

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

725 730 735

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

740 745 750

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

755 760 765

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

770 775 780

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

785 790 795 800

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

805 810 815

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

820 825 830

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

835 840 845

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

850 855 860

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

865 870 875 880

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

885 890 895

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

900 905 910

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

915 920 925

<210> 5

<211> 2772

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Target CoV S1核苷酸序列

<400> 5

gaattcgcca ccatgaagtg ggtgaccttc atcagcctgc tgttcctgtt cagctccgcc 60

tacagcagcg gaagcgatct ggacaggtgc accacctttg acgacgtgca ggcccctaac 120

tacacacagc acacctccag catgaggggc gtgtactacc ccgacgagat ctttaggtcc 180

gataccctgt acctgaccca ggatctgttc ctgcccttct acagcaacgt gacaggcttc 240

cacaccatca accacacctt tgacaatcct gtgatccctt ttaaggacgg catctacttc 300

gccgccacag agaagtccaa tgtggtgagg ggctgggtgt tcggcagcac catgaacaac 360

aagagccaga gcgtgatcat catcaacaat tccacaaacg tggtcattag agcctgtaac 420

ttcgagctgt gcgataatcc cttcttcgcc gtgtccaagc ctatgggcac ccagacacac 480

accatgatct tcgacaatgc ctttaactgc acctttgagt acatcagcga cgccttctcc 540

ctggacgtga gcgagaagag cggcaacttt aagcacctga gagagtttgt gtttaagaat 600

aaggacggct tcctgtacgt gtacaagggc taccagccta tcgacgtggt gagagatctg 660

cctagcggct tcaacaccct gaagcccatc tttaagctgc ccctgggcat caacatcaca 720

aactttaggg ccatcctgac cgccttcagc cctgcccagg atacctgggg cacaagcgcc 780

gccgcctact tcgtgggcta cctgaagccc accaccttca tgctgaagta cgatgagaac 840

ggcaccatca cagacgccgt ggattgctcc cagaaccccc tggccgagct gaagtgttcc 900

gtgaagagct ttgagatcga caagggcatc taccagacat ccaattttag ggtggtgccc 960

agcggcgacg tggtgaggtt ccctaatatc acaaacctgt gcccctttgg cgaggtgttt 1020

aacgccacaa agttcccctc cgtgtacgcc tgggagagga agaagatcag caattgcgtg 1080

gccgactact ccgtgctgta caacagcaca ttctttagca ccttcaagtg ttacggcgtg 1140

tccgccacca agctgaacga tctgtgtttt tccaacgtgt acgccgacag cttcgtggtg 1200

aagggcgatg atgtgaggca gatcgcccct ggccagaccg gcgtgatcgc cgattacaat 1260

tacaagctgc ccgacgattt catgggctgt gtgctggcct ggaacaccag gaacatcgat 1320

gccacatcca ccggcaatta caactacaag tacaggtacc tgagacacgg caagctgagg 1380

ccttttgaga gagatatctc caatgtgcct ttcagccccg acggcaagcc ttgcaccccc 1440

cctgctctga attgctactg gcccctgaat gactacggct tctacacaac cacaggcatc 1500

ggctaccagc catacagggt ggtggtgctg tccttcgagc tgctgaatgc ccctgccaca 1560

gtgtgcggcc ccaagctgag cacagatctg atcaagaacc agtgcgtgaa tttcaatttt 1620

aacggcctga caggcacagg cgtgctgacc cctagctcca agagatttca gccttttcag 1680

cagttcggca gagacgtgag cgactttacc gatagcgtga gggaccccaa gacctccgag 1740

atcctggaca tcagcccctg ttccttcggc ggcgtgagcg tgatcacccc tggcaccaac 1800

gcctcctccg aggtggccgt gctgtaccag gacgtgaatt gcaccgacgt gagcacagcc 1860

atccacgccg accagctgac acccgcctgg agaatctaca gcaccggcaa caatgtgttt 1920

cagacccagg ccggctgcct gatcggcgct gagcacgtgg acacaagcta cgagtgcgat 1980

atccccatcg gcgccggcat ctgtgcctcc taccacaccg tgtccctgct gagaagcaca 2040

tcccagaagg gcggcggcgg atctgagcct aagtcctgtg ataagacaca cacctgtccc 2100

ccttgccccg cccctgagct gctgggagga cctagcgtgt tcctgttccc ccctaagccc 2160

aaggataccc tgatgatctc caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc 2220

cacgaggacc ccgaggtgaa gtttaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc 2280

aagaccaagc ccagggagga gcagtacaat agcacataca gggtggtgag cgtgctgacc 2340

gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 2400

ctgcctgccc ctatcgagaa gacaatcagc aaggccaagg gccagcctag ggagccccag 2460

gtgtacaccc tgcccccctc cagagacgag ctgacaaaga atcaggtgtc cctgacatgt 2520

ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc 2580

gagaacaact acaagacaac accccccgtg ctggacagcg acggcagctt tttcctgtac 2640

agcaagctga cagtggataa gtccagatgg cagcagggca acgtgtttag ctgcagcgtg 2700

atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtccctgag ccctggcaag 2760

tgatgaggat cc 2772

<210> 6

<211> 2805

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Target CoV-2 S1核苷酸序列

<400> 6

gaattcgcca ccatgaagtg ggtgaccttc atcagcctgc tgttcctgtt cagctccgcc 60

tacagccagt gcgtgaacct gacaaccagg acacagctgc ctcccgccta cacaaatagc 120

ttcaccagag gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcagga gctccgtgct gcactccacc 180

caggatctgt ttctgccctt tttctccaac gtgacatggt ttcacgccat ccacgtgtcc 240

ggcacaaacg gcaccaagag gttcgacaat cccgtgctgc ccttcaacga tggcgtgtac 300

tttgcctcca cagagaagag caatatcatc aggggctgga tctttggcac cacactggat 360

tccaagacac agagcctgct gatcgtgaat aacgccacaa atgtggtcat taaggtgtgc 420

gagtttcagt tctgcaatga tcctttcctg ggcgtgtact atcacaagaa taacaagtcc 480

tggatggaga gcgagttcag agtgtacagc agcgccaaca attgtacctt tgagtacgtg 540

agccagcctt tcctgatgga cctggagggc aagcagggca attttaagaa cctgagggag 600

ttcgtgttca agaacatcga cggctacttt aagatctaca gcaagcacac ccctatcaat 660

ctggtgagag acctgcctca gggctttagc gccctggagc ccctggtgga cctgcctatc 720

ggcatcaata tcacaaggtt tcagaccctg ctggccctgc acaggagcta cctgacaccc 780

ggcgatagct ccagcggctg gaccgctggc gccgctgctt actacgtggg ctacctgcag 840

cccaggacct tcctgctgaa gtacaatgag aatggcacaa tcaccgacgc cgtggactgc 900

gccctggacc ctctgtccga gacaaagtgt acactgaaga gctttaccgt ggagaagggc 960

atctaccaga caagcaactt tagagtgcag cccaccgagt ccatcgtgag gttccccaac 1020

atcaccaatc tgtgcccttt cggcgaggtg tttaatgcca caaggttcgc ctccgtgtac 1080

gcctggaaca ggaagaggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtacaactcc 1140

gccagcttca gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta caaagctgaa tgacctgtgc 1200

ttcacaaacg tgtacgccga ttcctttgtg atcagaggcg atgaggtgag acagatcgcc 1260

cccggccaga caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgatga ctttacaggc 1320

tgtgtgatcg cctggaatag caacaacctg gattccaaag tgggcggcaa ttacaattac 1380

ctgtacagac tgtttagaaa gtccaacctg aagccctttg agagagacat cagcaccgag 1440

atctaccagg ccggcagcac accttgtaac ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc 1500

ctgcagagct acggctttca gcctacaaac ggcgtgggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgtcct ttgagctgct gcacgccccc gccaccgtgt gtggaccaaa gaagagcaca 1620

aatctggtga agaataagtg tgtgaacttt aacttcaacg gcctgaccgg cacaggcgtg 1680

ctgaccgaga gcaataagaa gttcctgcct tttcagcagt ttggcagaga catcgccgat 1740

acaacagatg ccgtgaggga ccctcagacc ctggagatcc tggatatcac cccctgttcc 1800

ttcggcggcg tgagcgtgat cacccccggc acaaacacaa gcaatcaggt ggccgtgctg 1860

taccaggacg tgaattgcac cgaggtgcct gtggccatcc acgccgacca gctgacacct 1920

acctggagag tgtactccac aggctccaac gtgtttcaga caagggccgg ctgcctgatc 1980

ggcgccgagc atgtgaacaa cagctacgag tgtgacatcc ctatcggcgc cggcatctgc 2040

gcctcctacc agacccagac aaactccccc agaagggcca gaggcggcgg cggatctgag 2100

cctaagtcct gtgataagac acacacctgt cccccttgcc ccgcccctga gctgctggga 2160

ggacctagcg tgttcctgtt cccccctaag cccaaggata ccctgatgat ctccaggacc 2220

cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagtttaac 2280

tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 2340

aatagcacat acagggtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 2400

aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaagacaatc 2460

agcaaggcca agggccagcc tagggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctccagagac 2520

gagctgacaa agaatcaggt gtccctgaca tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 2580

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac aacacccccc 2640

gtgctggaca gcgacggcag ctttttcctg tacagcaagc tgacagtgga taagtccaga 2700

tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 2760

acccagaagt ccctgtccct gagccctggc aagtgatgag gatcc 2805

<210> 7

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 质粒构建合成片段

<400> 7

ggatctctag cgaattcgcc accatgaagt gggtgacctt catcagcctg ctgttcctgt 60

tcagctccgc ctacagcgtt aactaaggat cccccgacct cgac 104

Claims

1.一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)以已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白为探针，来捕获待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白，其中，该待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白包含预测受体结合区域；

编码所述的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示。

2.根据权利要求1所述的一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法，其特征在于：所述某脊椎动物为人类、果子狸、猫类、犬类或鼬类。

3.根据权利要求1所述的一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法，其特征在于：所述的标记为胶体金包被标记、荧光标记、时间分辨荧光标记、反斯托克斯发光标记、有色乳胶标记、以吖啶酯为代表的化学发光剂标记、以三联吡啶钌为代表的电化学发光剂标记或基于碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶的酶联标记、生物素标记。

4.根据权利要求1所述的一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法，其特征在于：所述的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白、待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白和已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域均来自天然、真核外源表达、原核外源表达或人工合成。

5.一种利用权利要求1所述的方法评估冠状病毒跨物种传染风险的试剂盒在评估冠状病毒跨物种传染风险中的应用，其特征在于：

利用权利要求1所述的方法评估冠状病毒跨物种传染风险的试剂盒，包括试纸条和配套试剂，其中，试纸条包括衬板；其中，在衬板上依次设有加样垫、多肽垫、检测层和吸收垫，加样垫上设有点样区，检测层为硝酸纤维素膜；在加样垫和检测层之间设有含金标链霉亲和素的多肽垫；在检测层上包被有已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域形成的检测线和质检线；所述的配套试剂为生物素化某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白溶液；

编码所述的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示；

所述应用包含如下步骤：将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区；通过检测检测线上的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域能否结合到被金标亲和素结合的生物素化某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染该脊椎动物的风险，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标亲和素，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的配套试剂为生物素化的人ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV的S1或SARS-CoV-2的S1蛋白形成，其对应的应用，具体包含如下步骤：将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区；通过检测检测线上的SARS-CoV的S1或SARS-CoV-2的S1蛋白能否结合到被金标亲和素结合的生物素化人ACE2PD从而发生显色，来定性评估待测冠状病毒感染人类的风险，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的配套试剂为生物素化的果狸子ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV的S1蛋白形成；其对应的应用，具体包含如下步骤：将待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV的S1蛋白能否结合到被金标亲和素结合的生物素化果子狸ACE2PD从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染果子狸的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的配套试剂为生物素化的猫ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV-2的S1蛋白形成；在其对应的应用，具体包含如下步骤：待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液与配套试剂混合后滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV-2的S1蛋白，能否结合到被金标亲和素结合的生物素化猫ACE2PD从而发生显色，来评估待测冠状病毒感染猫类的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的配套试剂为生物素化犬ACE2PD蛋白溶液时，检测线由SARS-CoV-2的S1蛋白形成；在其对应的应用，具体包含如下步骤：待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白溶液滴加在点样区，通过检测检测线上的SARS-CoV-2的S1蛋白，能否结合到被金标亲和素结合的生物素化犬ACE2PD从而发生显色，来定性评估待测冠状病毒感染犬类的风险，其中，显色为低风险，不显色为高风险，不完全显色为中等风险；通过质检线能否结合到金标，来评判风险判断是否有效，显色为有效，不显色为无效。