CN112076211A - 糖胺聚糖组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖胺聚糖组合物及其制备方法和应用，所述组合物从反刍动物肝素副产物糖胺聚糖提取制备，由快速移动肝素和硫酸皮肤素组成，具有抗凝抗抗栓作用，依赖于抗凝血酶Ⅲ的抗－Ⅹa活性为60~100 U/mg，依赖于肝素辅因子Ⅱ抗凝活力为100~200 U/mg，绵羊血浆法抗凝活力为50~80 U/mg。该组合物可开发为药物或保健品，并具有清真性。且本发明提供原料的羊、牛等反刍动物器官或肝素生产的副产物糖胺聚糖，简便易得，经济效果显著。

Description

糖胺聚糖组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种糖胺聚糖组合物及其制备方法。

背景技术

糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAG），是一种天然的不分支的长链多糖聚合物，由含己糖醛酸和己糖胺成分的重复二糖单位构成，广泛分布于动物体及人体内的各器官中。糖胺聚糖是酸性粘多糖，在糖链上带有负电荷的羧基或硫酸基。糖胺聚糖主要包括肝素（Heparin，HP）、硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate，HS）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）以及硫酸皮肤素（Determa Sulfate，DS）等几类，它们在单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置各不相同。糖胺聚糖具有极为重要的生理作用。在高等动物或人体内，硫酸皮肤素是血管壁外层蛋白多糖的主要成分，肝素则广泛存在于血管壁、肠粘膜、肺脏等各种组织和脏器中，是天然的抗凝血物质。

本发明主要涉及快速移动肝素（Fast Moving Heparin，FMH）和硫酸皮肤素组合物。

快速移动肝素（FMH），属于天然来源肝素的一种，肝素在以钡盐-丙二胺凝胶电泳***分离时，又可分为快速移动肝素和慢速移动肝素（Slow Moving Heparin，SMH）。在商业化的未分级肝素（Unfractional Heparin，UFH）中，快速移动肝素存在较少，其电泳时移动速度快[P. Bianchini etc., J. Chomat, 196, 455 (1980)]，主要由低-中等分子量肝素（Mw ~7000Da）构成。相比于未分级肝素和慢速移动肝素，快速移动肝素的硫酸化程度低，乙酰化程度较高，抗凝活力较低。快速移动肝素主要依赖于与抗凝血酶-Ⅲ（Antithombin Ⅲ，AT-Ⅲ）结合而产生一定的抗-Ⅹa活性。

硫酸皮肤素，属于硫酸软骨素家族，主要由-IdoA-GalN4S-重复二糖单元构成，平均分子量在25,000 Da。硫酸皮肤素偶尔在GalNAc的6-位和IdoA的2-位存在硫酸化，为相对更不均一的糖结构。硫酸皮肤素的此种特殊化学结构，带来了其更强力的抗栓作用。硫酸皮肤素主要依赖于与肝素辅因子Ⅱ（Heparin Cofactor Ⅱ，HCⅡ）产生作用，而不依赖于抗凝血酶-Ⅲ。

众所周知，肝素主要应用于防治静脉血栓，但临床使用常伴有明显的出血副作用，根源在于肝素依赖于抗凝血酶-Ⅲ直接抑制凝血因子，因此肝素难以应用于临床抗栓治疗。如上所述，硫酸皮肤素不同于肝素，不依赖于抗凝血酶-Ⅲ，而是通过肝素辅因子Ⅱ来作用，出血副作用小，抗栓作用强。快速移动肝素与硫酸皮肤素由于作用原理不同可以在抗凝和抗栓上协同增效。在体内，两者还可以引起其他重要的生理作用，如可以促脂蛋白酯酶的释放、抗炎症、抗血管增生等。

所述快速移动肝素和硫酸皮肤素的结构式如下所示，

另一方面，临床医用的糖胺聚糖，包括肝素等，主要来源于猪，但一直存在着供应 不足的矛盾，同时由于来源单一，始终存在着巨大的不可控风险。

以肝素为例，目前各主流药典（欧洲药典（EP）、美国药典（USP）、中国药典（ChP）和日本药典（JP）等等），均规定或提倡肝素与低分子肝素是猪肠粘膜来源，这是有明显缺陷的。如当前的美国市场，其肝素制品（新药、仿制药、器械等）均来自猪肠黏膜，然而，其中75%用于生产精品肝素的粗品来自中国，单一动物和地区来源，存在着严重的不可控风险（如猪蓝耳病等流行病、战争、贸易争端等，尤其是近期中国大规模爆发的非洲猪瘟疫情），从而严重影响肝素制品的质量或供应。另外，肝素这些糖胺聚糖类产品的供应链极为复杂，存在着大量的养殖散户，提取1亿单位的肝素需要1500头以上生猪的肠粘膜，供应和生产链涉及到养殖户、屠宰厂、粗品肝素生产厂、粗品肝素经销商、精品肝素生产厂和精品肝素经销商等一系列的环节，各个环节都容易出风险。2008年中国供美的肝素就发生过严重的污染事件，揭示猪肝素这种单一供应是极其脆弱的。

反观羊、牛等反刍动物，尤其是家养的羊、牛等反刍动物，包括牛、绵羊、和山羊等，其体内或器官同样存在着丰富的肝素或快速移动肝素和硫酸皮肤素，牛肠粘膜、羊肠粘膜和牛肺都已被实际应用于肝素的提取生产。众所周知，牛羊与猪不同，多为集约化的大规模养殖和集中屠宰，相比与猪主产在中国的散养散屠宰等，风险控制上的差异显而易见。

临床应用上，快速移动肝素和硫酸皮肤素在特定临床适应症尤其是在抗栓抗凝疾病防治上的应用，可能会有着极好的疗效。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种糖胺聚糖组合物及其制备方法与应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种糖胺聚糖组合物，所述组合物从反刍动物肝素副产物糖胺聚糖提取制备，由快速移动肝素和硫酸皮肤素组成，具有抗凝抗抗栓作用，依赖于抗凝血酶Ⅲ的抗－Ⅹa活性为60~100 U/mg，依赖于肝素辅因子Ⅱ抗凝活力为100~200 U/mg，绵羊血浆法抗凝活力为50~80U/mg。所述快速移动肝素和硫酸皮肤素组分可以利用琼脂糖凝胶电泳分析和核磁氢谱分析得出。

优选地，所述糖胺聚糖组合物中的快速移动肝素，其中二糖单元由己糖醛酸-己糖胺构成，所述己糖醛酸为艾杜糖醛酸（IdoA-）或葡萄糖醛酸（GlcA-），且己糖醛酸的2-O位有40%以上被硫酸酯基化（IdoA2S），己糖胺是葡萄糖胺（GlcN），在6-O位有45%~55%的组分被硫酸酯基化（GlcN6S），在N-位有（GlcNS）或乙酰化（GlcNAc），其中15%~25%的组分被乙酰化。利用SAX-HPLC分析肝素酶酶解后糖胺聚糖组合物样品的二糖，可以清晰地归类出糖胺聚糖组合物的以上糖单元特征。

以上所述的快速移动肝素虽然也是肝素中的一种，但其与药典规定的肝素如USP肝素钠在二糖组成上有着显着特征的不同。在肝素酶酶解后的SAX-HPLC分析中，糖胺聚糖组合物的快速移动肝素与USP肝素钠二者中主要的酶解二糖产物，均是IdoA-GlcNAc、IdoA-GlcNS、IdoA-GlcNAc6S、IdoA2S-GlcNAc、IdoA-GlcNS6S、IdoA2S-GlcNS和IdoA2S-GlcNS6S等二糖，种类相同，但是组成百分比却有极显着的差别，如IdoA-GlcNAc、IdoA-GlcNAc6S和IdoA2S-GlcNS6S这三种二糖在快速移动肝素与USP肝素钠中百分比平均值分别是18% vs1%、7% vs 3%和34% vs63%。

糖胺聚糖组合物中另外一个成分为硫酸皮肤素，属于硫酸软骨素家族，由艾杜糖醛酸-6-硫酸酯基-半乳糖胺（-IdoA-GalN4S-）重复二糖单元构成，平均分子量在25,000Da，其偶尔在GalNAc的6-位和IdoA的2-位存在硫酸化，为相对更不均一的糖结构。

优选地，以人血浆考察作为体外试验，所述糖胺聚糖组合物对APTT和TT均有显著的延长作用，对纤维蛋白原含量有降低作用。具体是指将人血液分离血浆后，按自动凝血仪和试剂盒方法，考察糖胺聚糖组合物对血凝常规的影响，包括APTT、TT和PT等。所述糖胺聚糖组合物对APTT、TT和复钙时间均有显著的延长作用，对PT有一定的延长，可以降低纤维蛋白原的含量水平，这些都提示所述糖胺聚糖组合物具有一定的抗凝抗栓作用。

优选地，以上所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、选取反刍动物器官提取肝素后的副产物糖胺聚糖作为原料进行，所述反刍动物为家养绵羊、牛、山羊。

S2、病毒灭活步骤，将肝素副产物糖胺聚糖溶解，加入碱作用，之后调节pH，再加入氧化剂进行进一步的病毒灭活和脱色，最后加助滤剂过滤，制得反应液。

S3、重金属去除步骤，将S2中病毒灭活后的反应液，加入金属离子螯合剂作用，调节pH，最后有机溶剂沉淀出糖胺聚糖组合物粗品。

S4、糖胺聚糖组合物的精制纯化步骤，将S3中的粗品复溶，以有机溶剂分级沉淀，收获沉淀物，脱水，最终干燥制得糖胺聚糖组合物。

优选地，所述步骤S1中，羊、牛等反刍动物器官提取肝素后的副产物糖胺聚糖，包括肝素提取后剩余的糖胺聚糖，如肝素分级醇沉精制时清液中未沉淀的部分，该部分被以更高浓度的有机溶剂沉淀出来，是糖胺聚糖混合物。

优选地，所述步骤S1中的原料也可以是羊、牛等反刍动物器官提取的粗品肝素，以及因为这些原料改变而增加的处理步骤。该处理步骤是指使用常规的肝素或黏多糖分离纯化方式，优选包括盐的分级沉淀、有机溶剂的分级沉淀，以及离子交换树脂纯化；所述盐优选包括氯化钠、醋酸铵、醋酸钾，更优选为氯化钠；所述有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮，更优选为乙醇；所述离子交换树脂优选包括强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂，更优选为强阴离子交换树脂。

优选地，所述S2中肝素副产物糖胺聚糖溶解指以质量浓度在0%~10%之间的盐水对质量浓度在1%~30%之间的肝素副产物糖胺聚糖进行复溶。所述盐优选氯化钠，所述盐水为5%的氯化钠溶液，肝素副产物糖胺聚糖质量浓度优选为10%。

优选地，所述S2中碱为氢氧化钠，浓度在0.01~5 mol/L之间，更优选为浓度1 mol/L的氢氧化钠；所述调节pH指调节至7-11之间，优选8-10之间；所述氧化剂为双氧水或高锰酸钾。

优选地，所述S2中的助滤剂为硅藻土。

优选地，所述S3中金属离子螯合剂为EDTA，且所述金属离子螯合剂的终浓度优选0.1~50mmol/L之间，作用温度优选10~50℃之间，作用时间优选0.1~10h之间。

优选地，所述S3中金属离子螯合剂终浓度为20 mmol/L的EDTA，且在30℃下作用4h。

优选地，所述S3中调节pH指调节至4~6之间，有助于螯合剂去除重金属。

优选地，所述S3中有机溶剂为终浓度为30% ~ 43%的丙酮。

优选地，所述S4中粗品复溶，是将糖胺聚糖组合物粗品溶解于盐水中，盐水是浓度为0%-10%的氯化钠溶液，粗品糖胺聚糖的浓度为1%-30%。

优选地，所述S4中分级沉淀的有机溶剂为终浓度为40%~60%之间的乙醇，沉淀时温度为4~35℃之间，时间为1-48h之间。

优选地，所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法包括如下步骤，将反刍动物的快速移动肝素组份和硫酸皮肤素组份进行分别提纯，将分别提取的快速移动肝素组份和硫酸皮肤素组份进行混合制备得到糖胺聚糖组合物。以上分别提纯所使用的制备方法，是指使用常规的肝素或黏多糖分离纯化方式，优选包括盐的分级沉淀、有机溶剂的分级沉淀，以及离子交换树脂纯化；所述盐优选包括氯化钠、醋酸铵、醋酸钾，更优选为氯化钠；所述有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮，更优选为乙醇；所述离子交换树脂优选包括强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂，更优选为强阴离子交换树脂。

一种药物组合物，包括如以上任一项所述糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体组成。所述药物组合物形式为以注射用水制备成无菌注射液或胶囊或片剂。

以上任一项所述的糖胺聚糖组合物在制备预防和治疗凝血栓塞疾病、血管病变疾病以及有血栓形成危险的血管疾病药物或保健品或清真产品中的应用。

本发明中涉及各制备步骤中的干燥，包括自然烘干、真空烘干或冷冻干燥以及其他干燥方式。优选采用真空烘干或冷冻干燥；所述干燥过程中，可优选进行翻料、研磨打粉等，以提高干燥效果。

本发明的有益效果体现在：提供了一种新的糖胺聚糖组合物，它是由羊、牛等反刍动物而来，具有一定的抗凝抗栓作用，低出血风险，也具有预防和修复血管病变的作用，可开发为药物或保健品，并具有清真性。本发明提供原料的羊、牛等反刍动物器官或肝素生产的副产物糖胺聚糖，简便易得，经济效果显著。

附图说明

图1：糖胺聚糖组合物样品经肝素酶酶解后的二糖SAX-HPLC图谱。

图2：糖胺聚糖组合物的琼脂糖凝胶电泳分析示意图。

图3：糖胺聚糖组合物样品的¹H-NMR示意图。

具体实施方式

以下结合实施例具体阐述本发明的技术方案，本发明揭示了一种新糖胺聚糖组合物及其制备方法与应用。

实施例一：糖胺聚糖组合物1的制备

羊肠粘膜肝素副产物糖胺聚糖，在纯化制备羊肠粘膜肝素过程中获得。具体包括如下步骤，粗品羊肝素钠（厂家：山东绅联生物科技有限公司，批号：20150326，由羊肠粘膜提取所得），肝素提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH弱碱后，以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀制备得到羊肝素，而羊肝素副产物糖胺聚糖，则是在肝素分离后的上清液，再补加乙醇至终质量浓度70%，回收沉淀，干燥制得。

称取上述羊肠粘膜肝素副产物糖胺聚糖800g，以8000mL的5%盐水搅拌溶解，再加入400g氢氧化钠，室温下反应0.5小时。用稀盐酸调节pH至9.0，加入1.3L的双氧水，搅拌反应6h。再加入800g的硅藻土，搅拌5min后过滤。滤液中加入40g ETDA，室温反应6h。控制pH在5.5，加入冷丙酮至终浓度为42%，搅拌15 min再静置过夜。小心排尽上清液，沉淀以5000mL的5%的氯化钠溶液复溶，调pH 6.1，加入乙醇至终浓度为46%，室温沉淀过夜。沉淀再以乙醇脱水，并真空干燥，获得产品糖胺聚糖组合物430g，干燥失重5.3%。

实施例二：糖胺聚糖组合物2的制备

取牛肠粘膜肝素纯化中的副产物糖胺聚糖，该副产物糖胺聚糖是在由粗品牛肠粘膜肝素精制纯化时获得（粗品牛肠粘膜肝素，提取自中国东北肉牛屠宰后的小肠粘膜），为肝素过程中富含糖胺聚糖的清液，以终浓度为70%乙醇获得沉淀并干燥制得。

称取牛肠粘膜肝素副产物糖胺聚糖100g，以1000mL的2%盐水搅拌溶解，再加入40g氢氧化钠，25℃反应2小时。用稀盐酸调节pH至7.0，加入1g的高锰酸钾，搅拌反应30min。再加入100g的硅藻土，搅拌5min后滤纸过滤。滤液中加入2.2g ETDA，室温反应4h。控制pH在5.0，加入冷丙酮至终浓度为40%，搅拌5min再静置过夜。小心排尽上清液，沉淀以1000mL的5%的氯化钠溶液复溶，调pH6.2，加入甲醇至终浓度为63%，室温沉淀20h。沉淀再以乙醇脱水，并真空干燥，获得产品糖胺聚糖组合物47.8g，干燥失重3.7%。

实施例三：糖胺聚糖组合物3的制备

取牛肺肝素的副产物糖胺聚糖30g，以500mL的3%盐水搅拌溶解，再加入3 g氢氧化钠，35℃反应2小时。用稀盐酸调节pH至7.8，加入10 mL的双氧水，搅拌后静置脱色5h。加入30g硅藻土，搅拌5min后滤纸过滤。滤液中加入1.3g ETDA，室温反应3.5h。调节pH至5.5，加入冷丙酮至终浓度为41%，充分搅拌后离心，收取沉淀。沉淀以300mL的5%的氯化钠溶液溶解，调pH5.8，加入乙醇至终浓度为48%，室温静置过夜。离心弃去上清液，沉淀以95%乙醇脱水，真空烘干，获得产品糖胺聚糖组合物14.2g，干燥失重7.1%。

实施例四：糖胺聚糖组合物4的制备

分别取上述实施例一至实施例三制得的糖胺聚糖组合物各5g，混合打粉均质，即得一种混合的糖胺聚糖组合物。

实施例五：糖胺聚糖组合物5的制备

称取实施例一中的羊肠粘膜肝素副产物糖胺聚糖20g，以1000mL的1%盐水搅拌溶解，0.45µm过滤，上样至已处理好的1000mL柱体积的DEAE-FF阴离子交换柱。上样结束后，以1%氯化钠溶液平衡柱子6个柱体积，再以0%到100%的15%氯化钠溶液线性梯度洗脱10个柱体积，每500mL收集一份。收集的各洗脱液中均补氯化钠至15%，再加入1250ml甲醇，搅拌5分钟后静置，最后离心收集沉淀，沉淀甲醇脱水，再烘干。各组分经电泳检测，合并制得纯品的快速移动肝素4.3g，以及纯品的硫酸皮肤素5.6g。准确称取4.0g快速移动肝素和0.5g硫酸皮肤素，以50mL纯化水溶解，调pH 6.5，冻干，制得糖胺聚糖组合物~4.5g。

实施例六：糖胺聚糖组合物的抗凝抗栓活力分析

抗-Ⅹa活性测定遵照EP9.0肝素钠的方法进行，全绵羊血浆法活性测定遵照肝素领域所熟知的方法（等同于USP32肝素钠的活性测定方法）进行，肝素辅因子Ⅱ（HCⅡ）抗凝活力以发色底物法测定进行。

来源于实施例一至实施例五中各样品活性如表1所示。

表1：糖胺聚糖组合物样品的生物学活力比较

名称	全绵羊血浆法抗凝（U/mg）	抗-Ⅹa（U/mg）	肝素辅因子Ⅱ抗凝（U/mg）
				糖胺聚糖组合物样品1	61.7	86.2	143.2
糖胺聚糖组合物样品2	56.2	78.6	137.1
				糖胺聚糖组合物样品3	74.5	92.3	178.4
糖胺聚糖组合物样品4	67.2	89.1	170.4
				糖胺聚糖组合物样品5	62.4	85.2	151.5

结果显示：五组糖胺聚糖组合物样品，均具有一定的抗凝抗栓活力，且活力相近。

实施例七：糖胺聚糖组合物的肝素酶酶解二糖分析

肝素酶酶解后SAX-HPLC的方法，参照USP39附录 “依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”，但不进行二糖硼氢化钠的还原。糖胺聚糖组合物中，能被肝素酶酶解的快速移动肝素部分的二糖，分析结果如图1所示，结果表明：主要的酶解二糖产物有IdoA-GlcNAc（18.4%）、IdoA-GlcNS（10.8%）、IdoA-GlcNAc6S（6.9%）、IdoA2S-GlcNAc（1.4%）、IdoA-GlcNS6S（8.9%）、IdoA2S-GlcNS（8.7%）和IdoA2S-GlcNS6S（33.6%）等；己糖胺（葡萄糖胺，GlcN）的N-位被硫酸酰化或乙酰化，其中乙酰化占~20%，即含乙酰基的组分占~20%；己糖胺的6-O位按积分计算有50%的组分被硫酸酯基化；己糖醛酸（酶解后为艾杜糖醛酸，IdoA），2-O位有40%以上被硫酸酯基化；己糖胺中，通常被认为与抗凝血活性有关的葡萄糖胺3-O位硫酸酯基约占1.5%，显著小于USP肝素2.4%的平均水平，但也提示其应具有一定的抗凝血活性。

实施例八：糖胺聚糖组合物的琼脂糖凝胶电泳分析

参照文献[P. Bianchini etc., J. Chomat, 196, 455 (1980)]记载的方法进行，0.5%的琼脂糖凝胶，分别以醋酸钡缓冲溶液和二胺基丙烷分别电泳分离，电泳结束后CTAB固定，干胶并染色脱色，并扫描记录图谱。标准对照品包括硫酸软骨素、肝素（或慢速移动肝素SMH）、快速移动肝素（FMH）和硫酸皮肤素（DS）。电泳结果如图2所示，其中图2中泳道1，快速移动肝素标准品；泳道2，快速移动肝素标准品+硫酸皮肤素标准品（浓）；泳道3，快速移动肝素标准品+硫酸皮肤素标准品（稀）；泳道4，硫酸皮肤素标准品；泳道5，糖胺聚糖组合物样品1；泳道6，糖胺聚糖组合物样品2。糖胺聚糖组合物均由快速移动肝素和硫酸皮肤素组成，几乎没有慢速移动肝素和硫酸皮肤素。

实施例九：糖胺聚糖组合物的核磁氢谱分析

来源于实施例一样品的核磁氢谱分析，设备用苏州大学分析测试中心的400MHz核磁共振谱仪，以3-三甲基硅基丙酸钠-d4（TSP）定零点。分析结果如图3所示，结果显示：糖胺聚糖组合物核磁氢谱的主要出峰位置是δ2.05 ppm、δ2.08 ppm、δ3.27 ppm、δ3.38 ppm、δ3.54ppm、δ3.80 ppm、δ4.05 ppm、δ4.20 ppm、δ4.34 ppm、δ4.68 ppm、δ4.73 ppm、δ5.22 ppm和δ5.42 ppm；其中δ2.04 ppm、3.27 ppm、δ4.34 ppm、δ5.22 ppm和5.42 ppm是快速移动肝素的主要特征氢峰；而δ2.08 ppm、δ3.38 ppm、δ3.54 ppm、δ3.80 ppm、δ4.05 ppm、δ4.20 ppm、δ4.68 ppm和δ4.73 ppm，则是硫酸皮肤素的主要特征氢峰，充分说明糖胺聚糖组合物是快速移动肝素和硫酸皮肤素的混合物。

实施例十：糖胺聚糖组合物的人血体外抗凝抗栓试验

实验方法：每次采用5人份外周静脉血3mL，用3.8%枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，3000转/分离心5分钟，分离出贫血小板血浆（PPP）。按试剂盒方法，上机（全自动血凝仪，StagoCompact）检测。实验组别如下：羊肠粘膜糖胺聚糖组合物样品组（实施例一所述）、牛肠粘膜糖胺聚糖组合物样品组（实施例二所述）、牛肺糖胺聚糖组合物样品组（实施例三所述）和糖胺聚糖组合物样品组（实施例五所述），所有组别的终浓度为2mg/L，实验设生理盐水为空白对照。

结果与分析：

1）APTT、PT和TT

实验结果如表2所示：

表2：体外对APTT、PT和TT的影响

组别	APTT	PT	TT
				糖胺聚糖组合物样品1	134.1±16.7 s	12.9±0.5 s	70.3±13.2 s
糖胺聚糖组合物样品2	127±7.9 s	13.5±0.7 s	71.9±9.6 s
				糖胺聚糖组合物样品3	144.3± 20.4 s	12.9±0.5 s	67.3±14.2 s
糖胺聚糖组合物样品4	114.1±18.4 s	12.4±0.6 s	65.3±11.5 s
				糖胺聚糖组合物样品5	134.6± 20.4 s	13.1±0.9 s	71.3±12.6 s
空白对照	38.1±6.4 s	11.6±0.6 s	16.6±3.7 s

由表2可知，在体外，5组糖胺聚糖组合物样品均可以显著延长APTT和TT，对PT也有一定的延长作用，糖胺聚糖组合物样品对APTT、TT和PT的影响作用类似，相互之间没有显著的差异。

APTT、PT和TT是临床重要的凝血指标，以上数值均延长，显示糖胺聚糖组合物均有一定的抗凝抗栓作用。

2）纤维蛋白原和复钙时间：

实验结果如表3所示：

表3：外对纤维蛋白原和复钙时间的影响

组别	纤维蛋白原	复钙时间
			糖胺聚糖组合物样品1	1.98±0.44 g/L	31.00±0.00 s*
糖胺聚糖组合物样品2	2.11±0.36 g/L	31.00±0.00 s*
			糖胺聚糖组合物样品3	2.09±0.41 g/L	31.00±0.00 s*
糖胺聚糖组合物样品4	2.07±0.53 g/L	31.00±0.00 s*
			糖胺聚糖组合物样品5	2.22±0.27 g/L	31.00±0.00 s*
空白对照	2.57±0.25 g/L	9.95±0.40 s

*：均已超出检测范围

由表3可知，在体外，五组糖胺聚糖组合物样品均对纤维蛋白原有一定的降低，而复钙时间均大大延长，超出检测范围。

纤维蛋白原参与形成血栓，纤维蛋白原的水平还与血液的粘滞度有关，糖胺聚糖组合物通过降低纤维蛋白原的水平，有助于干预血栓形成、降低血液粘度和改善血流量。复钙时间大大延长，提示试验组血浆中抗凝物质增多，影响了血液的凝固，也即说明糖胺聚糖组合物具有抗凝抗栓作用。

所有以上数据揭示，糖胺聚糖组合物在体外有着良好的抗凝抗栓效果。

当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种糖胺聚糖组合物，其特征在于，所述组合物从反刍动物肝素副产物糖胺聚糖提取制备，由快速移动肝素和硫酸皮肤素组成，具有抗凝抗抗栓作用，依赖于抗凝血酶Ⅲ的抗－Ⅹa活性为60~100 U/mg，依赖于肝素辅因子Ⅱ抗凝活力为100~200 U/mg，绵羊血浆法抗凝活力为50~80 U/mg。

2.如权利要求1所述的一种糖胺聚糖组合物，其特征在于，所述糖胺聚糖组合物中的快速移动肝素，其中二糖单元由己糖醛酸-己糖胺构成，所述己糖醛酸为艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸，且己糖醛酸的2-O位有40%以上被硫酸酯基化，己糖胺是葡萄糖胺，在6-O位有45%~55%的组分被硫酸酯基化，在N-位有硫酸化或乙酰化，其中15%~25%的组分被乙酰化；所述糖胺聚糖组合物中的硫酸皮肤素，由艾杜糖醛酸-6-硫酸酯基-半乳糖胺重复二糖单元构成，平均分子量在25,000Da。

3.如权利要求1或2所述的一种糖胺聚糖组合物，其特征在于，以人血浆考察作为体外试验，所述糖胺聚糖组合物对APTT和TT均有显著的延长作用，对纤维蛋白原含量有降低作用。

4.如权利要求1所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、选取反刍动物器官提取肝素后的副产物糖胺聚糖作为原料，所述反刍动物包括牛、绵羊或山羊；

S2、病毒灭活步骤，将肝素副产物糖胺聚糖溶解，加入碱作用，之后调节pH，再加入氧化剂，进行进一步的病毒灭活和脱色，最后加助滤剂过滤，制得反应液；

S3、重金属去除步骤，将S2中病毒灭活后的反应液，加入金属离子螯合剂作用，调节pH，最后有机溶剂沉淀出糖胺聚糖组合物粗品；

S4、糖胺聚糖组合物的精制纯化步骤，将S3中的粗品复溶，以有机溶剂分级沉淀，收获沉淀物，脱水，最终干燥制得糖胺聚糖组合物。

5.如权利要求4所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法，其特征在于，所述S2中肝素副产物糖胺聚糖溶解指以质量浓度在0%~10%之间的盐水对质量浓度在1%~30%之间的肝素副产物糖胺聚糖进行复溶；所述碱作用指采用浓度为0.01-5 mol/L氢氧化钠进行处理；所述调节pH是指调节pH至7-11；所述氧化剂包括双氧水或高锰酸钾；所述助滤剂为硅藻土。

6.如权利要求4所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法，其特征在于，所述S3中金属离子螯合剂指浓度为0.1-50 mmol/L的EDTA；所述调节pH指调节至4-6之间；所述有机溶剂沉淀指用终浓度为30% - 43%的丙酮沉淀出糖胺聚糖组合物粗品。

7.如权利要求4所述的一种糖胺聚糖组合物的制备方法，其特征在于，所述S4中粗品复溶指将糖胺聚糖组合物粗品溶解于盐水中，盐水是浓度为0%-10%的氯化钠溶液，粗品糖胺聚糖的浓度为1%-30%；所述有机溶剂分级沉淀，指使用终浓度为40%-60%之间的乙醇或甲醇或丙酮进行沉淀。

8.如权利要求1所述糖胺聚糖组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，将反刍动物的快速移动肝素组份和硫酸皮肤素组份进行分别提纯，将分别提取的快速移动肝素组份和硫酸皮肤素组份进行混合制备得到糖胺聚糖组合物。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体组成。

10.如要求1-3任一项所述的糖胺聚糖组合物在制备预防和治疗凝血栓塞疾病、血管病变疾病以及有血栓形成危险的血管疾病药物或保健品或清真产品中的应用。

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