CN112074612A - 一种具有更高特异性的核酸扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用特异性寡核苷酸引物和对照物核苷酸来扩增核酸的具有更高特异性的方法。其中在第一扩增中，对照寡核苷酸使得能够序列特异性地打开扩增产物中的链。本发明还涉及一种用于实施本发明方法的相应试剂盒。

Description

一种具有更高特异性的核酸扩增方法
本发明涉及一种具有更高特异性的核酸扩增方法。
本申请要求下列申请的优先权：欧洲专利申请EP18158722.1，2018年2月26日；EP18195312.6，2018年9月18日；EP 18159337.7，2018年2月28日；德国专利申请10 2018001586.7，2018年2月28日。本文提及的这些和所有其他专利文件应被视为通过引用并入本说明书中(通过引用并入)。
背景技术
核酸链的合成在当今的生物技术中具有核心地位。PCR等方法极大地推动了研究领域和工业应用领域(例如诊断学和食品工业)的发展。PCR与测序、实时检测、微阵列技术、微流控管理等技术的结合促进了技术的发展，并部分地克服了原有PCR的缺点。此外还开发了其他扩增方法，例如等温扩增技术。它们尤其适用于POCT(point-of-care-testing，即时检验)。尽管上述领域已取得了巨大进展，但PCR仍起着核心作用并因此确定了与其应用有关的各个技术壁垒。
在所述扩增程序期间，在PCR中没有控制位于引物之间的扩增序列区段。PCR方法优化的重点是引物结合。在PCR的开始及其过程中，主要产物和副产物的合成例如是通过引物的非特异性结合或延伸而不断启动的。在发生反向合成反应的情况下，非特异性延伸的引物被读取为模板，由此通常形成完整的引物结合位点。因此，错误的序列信息从一合成循环传递到下一合成循环，这不仅导致最初的合成，而且首先导致副产物的指数式增长。
此类副反应可能导致干扰主反应(靶序列的扩增)的片段呈指数式增长，并分别导致对后续分析步骤的干扰。此类副产物通常包含左、右引物序列，因此它们的扩增可以与主反应并行进行。然而，这种副产物不包含靶序列，而是包含另一种核酸靶序列。
首先，PCR扩增的特异性是通过优化引物与靶序列的结合来实现的。例如，可使用附加寡核苷酸，其部分地与引物结合，因此可竞争性地参与到引物与其他核酸链的结合中。
这种探针通常与引物的序列区段结合，而使单链序列区段不被占据，从而使具有所述区段的引物可以与靶核酸结合并引发合成反应。引物模板错配可被此类寡核苷酸竞争性地置换，由此提高了引发的特异性。这种附加寡核苷酸不与在两个引物之间的部分中的待扩增核酸链相互作用。然而，由于引物的摩尔过量，在扩增过程中可能发生引物与模板之间的非特异性相互作用，由此通过副产物的互补链的合成而形成功能齐全的引物结合位点。副产物中这种功能齐全的引物结合位点的存在导致此类附加寡核苷酸对引物结合的竞争效应的丧失。因此，通过这种寡核苷酸来控制引物与模板结合的特异性只会降低副反应的发生几率，而一旦形成副产物，就几乎不影响其指数式扩增。
PCR的副反应随着所进行的合成循环的次数增加而增加，其中通常进行多达40个PCR循环。PCR扩增后，可以链接其他方法，例如检测、文库构建、克隆、测序等。所述方法只能一定程度上耐受在PCR扩增过程中生成的副产物或序列偏差。通常，这类方法的特异性也会受到PCR过程中副反应问题的影响。
提高扩增方法的合成特异性以及减少副产物的出现和共扩增有助于改进诊断方法。
本发明的一目的是提供用于改善核酸链的酶促扩增的特异性的方法和手段。
本发明的另一目的是提供一种扩增方法与PCR扩增的组合，其中在进行信号的采集(分别监测或检测)或靶序列的扩增时，首先使用对照寡核苷酸和相应的特异性引物组进行受控扩增，然后进行PCR，尤其是使用PCR特异性引物。
本发明的又一目的是减少获得足够数量的PCR产物所需的PCR合成循环的次数。
本发明的再一目的是提供用于合成和扩增核酸链的新酶促方法和组分，其中进行连续的(在线)信号采集，其中所述信号采集(监测/检测)是由序列特异性探针寡核苷酸介导或支持的。
所述目的是通过如独立权利要求所述的方法和试剂盒来实现的。在从属权利要求和以下说明中列出了本发明的其他有利实施方式。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种用于扩增核酸的方法，包括下列步骤：
a)第一扩增，包括下列步骤：
-使第一寡核苷酸引物(P1.1)与包含靶序列的待扩增核酸杂交，其中所述第一寡核苷酸引物(P1.1)包含下列区域：
·第一区域(P1.1.1)，其可序列特异性地与待扩增核酸的区域结合，其中所述待扩增核酸的区域至少包含所述靶序列的5’末端或位于所述靶序列的5’方向；
·第二区域(P1.1.2)，其与第一区域的5’端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被所用的聚合酶复制；
-通过第一聚合酶延伸所述第一寡核苷酸引物(P1.1)，以获得第一引物延伸产物(P1.1-Ext)，所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)除了第一寡核苷酸引物(P1.1)之外，还包含与待扩增核酸或靶序列基本互补的合成区域，其中所述第一引物延伸产物和所述待扩增核酸以双链形式存在；
-对照寡核苷酸(C1.1)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)结合，其中所述对照寡核苷酸(C1.1)包含下列区域：
·第一区域(C1.1.1)，其可以与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的第二区域(突出端)结合；
·第二区域(C1.1.2)，其与所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的第一区域基本互补；以及
·第三区域(C1.1.3)，其与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的合成区域的至少一部分基本互补；
其中所述对照寡核苷酸(C1.1)不用作所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的引物延伸的模板，并且第一对照寡核苷酸(C1.1)与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的第一和第二区域结合，同时置换(与第一和第二区域互补的区域)待扩增核酸；
-使第二寡核苷酸引物(P2.1)与所述第一引物延伸产物杂交，其中所述第二寡核苷酸引物(P21)包含区域(P2.1.1)，该区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的合成区域结合，该合成区域至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向；
-通过第一聚合酶延伸所述第二寡核苷酸引物(P2.1)，以获得第二引物延伸产物(P2.1-Ext)，所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)除了第二寡核苷酸引物(P2.1)之外，还包含与待扩增核酸或靶序列基本相同的合成区域，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第二引物延伸产物(P2.1)形成第一双链扩增产物；
b)第二扩增，包括下列步骤：
-使第三寡核苷酸引物(P3.1；P3.2)与第一扩增产物的第二引物延伸产物(P1.1-Ext)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物(P3.1；P3.2)具有第一区域(P3.1.1)，该第一区域可序列特异性地与第二引物延伸产物(P1.1-Ext)的区域结合，且至少包含所述靶序列的5’末端或位于其5’方向；
-通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物(P3.1；P3.2)，以获得第三引物延伸产物(P3.1/2-Ext)，该第三引物延伸产物(P3.1/2-Ext)除了第三寡核苷酸引物(P3.1；P3.2)之外，还包含与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)或靶序列基本互补的合成区域，其中所述第二引物延伸产物(P2.1)和第三引物延伸产物(P3.1)以双链形式存在；
-使第四寡核苷酸引物(P4.1；P4.2)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)杂交，其中所述第四寡核苷酸引物(P4.1；P4.2)具有第一区域(P4.1.1)，该区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的合成区域结合，该合成区域至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向；
-通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物(P4.1；P4.2)，以获得第四引物延伸产物(P4.1/2-Ext)，该第四引物延伸产物(P4.1/2-Ext)除了第四寡核苷酸引物之外，还包含与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)基本互补或与靶序列基本相同的合成区域，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和第四引物延伸产物(P4.1/2-Ext)以双链形式存在；
-将第一引物延伸产物(P1.1-Ext)与第四引物延伸产物(P4.1/2-Ext)构成的双链分开，以及将第二引物延伸产物(P2.1)与第三引物延伸产物(P3.1)构成的双链分开；
-使所述第三寡核苷酸引物(P3.2)与第四引物延伸产物(P4.2-Ext)杂交，并通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物(P3.2)；以及
-使所述第四寡核苷酸引物与第三引物延伸产物(P3.2-Ext)杂交，并通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物(P4.1；P4.2)。
或者，本发明一方面也可表述为一种用于扩增核酸的方法(图1、55-56)，其中样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及与M1互补的序列M1’]，其中M在5'-3’方向包含连续的序列区段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1。
在第一扩增步骤中与下列组分接触：
i.第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(例如Mg盐)；
ii.第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5'-3’方向包含连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补[可基本上序列特异性地结合]的[杂交]序列，而序列区段P1.1.2不能与M1[或相对于序列M1紧随3’方向上M1.1的序列]结合；
其中P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
iii.第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同[并且可序列特异性地与M1的反链上的M1.5的反向互补序列或P1.1的延伸产物P1.1-Ext(该处称为P1.1E1)结合]；
iv对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与M1的区段M1.2相同，且区段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3可以与引物P1.1-Ext的聚合产物结合]，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；
其中C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
其中所述样品在第二扩增步骤中与下列组分接触：
v.第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且与M1的M1.1(反向)互补[可以与P2.1-Ext互补地结合]；
vi.第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且与M1的M1.5相同和/或基本相同[可以与P1.1-Ext互补地结合]；
vii.第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。
在第一扩增步骤中获得了第一引物延伸产物P1.1-Ext，其在5’-3’方向上除了序列区域P1.1.2和P1.1.1之外，还包括在5’-3’方向上包含序列区段P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2和P1.1E1的合成区域，其中P1.1E4与靶序列M1的序列区段M1.2基本互补，P1.1E3与M1.3基本互补，P1.1E2与M1.4基本互补，P1.1E1与M1.5基本互补。同样，获得了第二引物延伸产物P2.1-Ext，其除了序列区域P2.1.1之外，还包含合成区域P2.1-Ext.，该合成区域P2.1-Ext与在3’方向上M1.5之后区域中的靶序列M1基本相同。选择第一扩增步骤的P1.1.2以及(可选地)M1.4、M1.3、M1.2和M1.1的反应条件和/或长度或解链温度，使得P1.1-Ext可以与M1或P2.1-Ext形成双链，且P1.1-Ext可以与C1.2形成双链，并且P1.1-Ext与C1.2形成的双链优选于其与P2.1-Ext形成的双链。
更一般地，本发明也可表述为一种用于扩增核酸的方法，其中在第一扩增步骤中，使包含第一核酸聚合物(所述第一核酸聚合物包含第一靶序列M1)的样品与下列组分接触：
a.第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是第一DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子；
b.第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1的至少3’区段能够(基本上)序列特异性地与M1的区段结合，而序列区段P1.1.2不能与M1结合；其中P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
c.第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其包含至少一个3’区段，该3’区段与位于P1.1结合位点的5’方向上的M1序列区段(基本)相同；或者其包含结合位点，该结合位点能够与M1的反链上的反向互补序列或P1.1的延伸产物[在此称为P1.1-Ext，也即P1.1E1]结合；
d.对照寡核苷酸C1.2，其在5'-3’方向包含连续的序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1：
i.对照寡核苷酸的第三区域(C1.2.3)，其与在扩增反应期间形成的第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的合成区域的至少一部分基本互补，换言之，第三区域与区段M1相同，该区段M1相对于被读取[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取]的链的极性位于第一引物结合位点的5’方向上，对照物的第三区域因此能够与结合到第一引物[P1.1-Ext]的聚合产物上的寡核苷酸的至少一部分结合；
ii.对照寡核苷酸的第二区域(C1.2.2)，其与第一寡核苷酸引物(P1.1)的第一区域基本互补(并且至少部分地与靶序列M1上的第一引物的结合位点相同)；
iii.对照寡核苷酸的第一区域(C1.2.1)，其可以与第一引物的序列区段P1.1.2或在扩增反应期间形成的第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的5’末端区域结合；
其中C1.2含有至少在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
在允许第一扩增的条件下，将样品与上述组分一起孵育，其中形成了包括第一寡核苷酸引物的引物延伸产物(P1.1-Ext)和第二寡核苷酸引物的引物延伸产物(P2.1-Ext)的扩增产物，其包含靶序列M或至少其部分和相应的互补序列；其中所述样品随后或同时在第二扩增步骤中与下列组分接触：
e.第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且其与在第一扩增步骤中形成的扩增产物(反向)互补，换言之，其具有序列特异性，且能够与在第一扩增反应中形成的第二引物延伸产物的3’末端区域结合；
f.第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且其能够与在第一扩增步骤中形成的扩增产物(反向)互补地结合，换言之，其能够与在第一扩增反应中形成的第一引物延伸产物的3’末端区域特异性地结合；以及
g.第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。
在允许第二扩增的条件下，将样品与上述组分一起孵育，其中形成了包括第三寡核苷酸引物的引物延伸产物(P3.1-Ext)和第四寡核苷酸引物的引物延伸产物(P4.1-Ext)的扩增产物，其包含靶序列M或至少其部分和相应的互补序列。
然而，本发明不必局限于图50-56所示的形貌。
本发明另一方面涉及一种试剂盒，其包含以下组分：
a.第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5'-3’方向上包含两个连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中：
i.P1.1.1是一任意序列区段，其与待扩增序列[M1.1]互补[杂交]；
ii.序列区段P1.1.2不能与待扩增序列[或相对于待扩增序列紧随3’方向上的序列]结合；以及
iii.其中P1.1.2包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
b.第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其可序列特异性地与第一寡核苷酸引物所结合的序列的反链上的序列结合；
c.对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中：
i.C1.2.3与待扩增序列[M1]的区段M1.2相同，且区段M1.2位于[M1.1的]P1.1.1结合位点的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3可以与寡核苷酸引物P1.1-Ext的聚合产物结合]；
ii.C1.2.2与P1.1.1互补(并且与M1.1相同)；以及
iii.C1.2.1与P1.1.2互补；
其中C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
d.第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(例如Mg盐)；
e.第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其与第一寡核苷酸引物P1.1不同，尤其是没有其区段P1.1.2，并且其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，该序列区段3.1.1与靶序列[M1][的区段M1.1](反向)互补；
f.第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，并且其可序列特异性地与第三寡核苷酸引物所结合的序列的反链上的序列结合；以及
g.第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。
本发明另一方面涉及一种用于扩增核酸的方法，其中在第一扩增步骤中，使含有核酸(该核酸包含第一靶序列M1，其在5'-3’方向包含连续的序列区段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1)的样品与以下组分接触：
-第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物；
-第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5'-3’方向包含连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补的[杂交]序列，且序列区段P1.1.2不能与M1结合；
-其中P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
-第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同；以及
-对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与位于M1.1的5’方向上的M1的区段M1.2相同，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；
其中C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
其中所述样品还与第一探针寡核苷酸接触，该第一探针寡核苷酸：
a.包含一序列区段，该序列区段：
i.与位于序列区段M1.2、M1.3和M1.4上的M1的序列相同；或者
ii.与位于序列区段M1.3和M1.4上的M1的序列互补，
b.与一荧光染料结合，该荧光染料：
i.与第一探针寡核苷酸所连接的第二探针寡核苷酸形成供体-淬灭剂对或FRET对；或者
ii.形成供体-淬灭剂对或FRET对，其中荧光染料与第二探针寡核苷酸连接，该第二探针寡核苷酸能够足够接近第一探针寡核苷酸的结合位点进行结合。
此外，本发明一方面可表述为一种包括下列步骤的方法：
A)提供(包含第一靶序列的)核酸片段，在下文中也称为起始核酸链。
B)提供第一扩增***，其包含第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物、对照寡核苷酸、第一DNA聚合酶、用于第一聚合酶(dNTP)的底物以及适当的缓冲液。
C)提供第二扩增***，其包含第三寡核苷酸引物、第四寡核苷酸引物、第二耐热聚合酶、用于第二聚合酶(dNTP)的底物以及适当的缓冲液。
可选地，进一步提供一检测***，只要本发明的目的还包括检测(尤其是使用探针检测)由第一和/或第二扩增***扩增的核酸片段。
D)将起始核酸链用作初始模板链和第一扩增***来进行第一扩增，以获得第一扩增片段1.1；该第一扩增区段1.1包含第一靶序列，且包含可形成互补双链的第一引物延伸产物和第二引物延伸产物；其中，所述第一引物延伸产物是以起始核酸链和/或第二引物延伸产物为模板，通过聚合酶进行第一引物的模板依赖性延伸而获得的，所述第二引物延伸产物是以第一引物延伸产物为模板，通过聚合酶进行第二引物的模板依赖性延伸而获得的；其中，所述第一和第二引物延伸产物可相互用作各自引物延伸的模板；其中，所述第一扩增产物1.1的两条互补链可以在对照寡核苷酸的配合下至少部分地转变成单链形式，从而使新的引物有可能与合成的引物延伸产物的各互补区段结合。
用于第一扩增的反应条件包括至少一个温度步骤，其中允许第一扩增***的两个引物进行杂交和模板依赖性引物延伸；以及包括至少一个温度步骤，其中在对照寡核苷酸的参与下将第一引物延伸产物与第二引物延伸产物分离。在不存在对照寡核苷酸的情况下，所使用的反应条件不允许第一引物延伸产物与第二引物延伸产物自发分离。进行第一扩增，直到合成出所需数量的第一扩增产物1.1。
E)使用第一扩增片段1.1的两条链中的至少一条作为初始模板链并通过第二扩增***进行第二扩增，以获得第二扩增片段2.1，其包含可形成互补双链的第三引物延伸产物和第四引物延伸产物；扩增片段2.1的两条链在引物延伸过程中可以互相充当模板；其中，用于第二扩增的反应条件允许在至少一个温度步骤中使第二扩增***的两个引物杂交以及与互补区域结合的第二扩增***的引物进行模板依赖性引物延伸，并允许在至少一个另外的温度步骤中进行双链(包括第三引物延伸产物和第四引物延伸产物)分离；其中，所述第三和第四引物延伸产物被转变成单链形式，以便可再次进行引物结合和延伸。进行第二扩增，直到合成出所需数量的第二扩增产物2.1。
具体地，各扩增***的组分性质、包含第一靶序列的核酸片段以及所用的反应条件决定了两个扩增反应的过程。
通常，第一扩增是在对照寡核苷酸的参与下进行的。两种合成的引物延伸产物的分离至少部分地取决于第一引物延伸产物的序列及其与对照寡核苷酸序列的互补性。
在第二扩增期间，第二扩增片段的扩增基本上是在不涉及对照寡核苷酸的情况下进行的。
在这两个扩增反应的过程中，都可形成所需的扩增产物(扩增片段1.1和扩增片段2.1)及其中间体(中间产物)。
中间体的组成基本上取决于所提供的第一和第二扩增***的组分。
附图说明
图1以多相形式示意性地示出了本发明所述扩增方法的某些实施方式的组分；A)第一扩增***；B)第二扩增***。
图2示意性地示出了第一扩增***的某些实施方式的组分。
图3以多相形式示出了本发明所述方法的某些实施方式的温度曲线。
图4以多相形式示出了本发明所述方法的某些实施方式的温度曲线。
图5以均相形式示出了本发明所述扩增方法的某些实施方式的组分；A)第一扩增***；B)第二扩增***。
图6-11示出了本发明所述方法的实施方式的温度曲线。
图12示意性地示出了(A)第一寡核苷酸引物的结构；(B)第一引物与待扩增核酸链的互补式结合；(C)第一引物与待扩增核酸链的互补式结合以及引物的延伸。
图13示意性地示出了(A)在第一引物延伸产物的合成中各组分之间的关系；(B)第一引物延伸产物的合成；1＝在第一扩增中的待扩增核酸；2＝对照寡核苷酸；3＝第一寡核苷酸引物；4＝第一寡核苷酸引物的延伸产物。
图14示意性地示出了第二引物延伸产物的合成；附图标记1-4如图13所示；5＝第二寡核苷酸引物；6＝第二寡核苷酸引物的延伸产物。
图15示意性地示出了第三和第四引物延伸产物的合成：P3.1-Ext part 1＝以P2.1-Ext为模板合成的P3.1的延伸产物(中间产物)；P4.1-Ext part 1＝以P1.1-Ext为模板合成的P4.1的延伸产物(中间产物)；P3.1-Ext＝以P4.1-Ext-Part 1或以P4.1-Ext为模板合成的P3.1的延伸产物；P4.1-Ext＝以P3.1-Ext-Part 1或以P3.1-Ext为模板合成的P4.1的延伸产物。
图16示意性地示出了部分第三引物延伸产物(P3.1-Ext-Part 1)的合成；7＝与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)互补的区段P3.1；8＝不与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)互补的区段P3.1；P3.1-Ext-Part 1＝以P2.1-Ext为模板合成的第三引物(P3.1)的延伸产物。
图17示意性地示出了完整第四引物延伸产物的合成；P2.1-Ext＝区段5和6；P3.1-Ext part 1＝以P2.1-Ext为模板合成的P3.1的延伸产物；P4.1＝第四引物；9＝区段P4.1，其可以与P3.1-Ext-part 1互补地结合；10＝区段P4.1，其不可以与P3.1-Ext-part 1互补地结合；P4.1-Ext＝以P3.1-Ext-part 1为模板合成的P4.1的延伸产物。
图18示意性地示出了(A)使用第二引物延伸产物(P2.1-Ext)来合成第三引物延伸产物的中间产物(P3.1-Ext part 1)；(B)以P4.1-Ext为模板来合成完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)：P4.1-Ext＝以P3.1-Ext-part 1为模板合成的P4.1的延伸产物；P3.1-Ext＝以P4.1-Ext为模板合成的P3.1的延伸产物。
图19-26示意性地示出了在第一引物延伸产物和第三PCR引物的合成期间各组分之间的关系：1＝第一扩增中的P2.1延伸；2＝对照寡核苷酸；3＝第一寡核苷酸引物；4＝引物3.1。
图27-31示意性地示出了第一扩增***的不同实施方式的组分：(A)第一扩增***的组分；(B)第二扩增***的组分。图27-29：第四引物与第二引物相同，第三引物与第一引物不同；其结合可相对于第一寡核苷酸引物移位。图30：第四引物与第二寡核苷酸引物不同；第四引物的3’端可相对于第二寡核苷酸引物的3’端移位；第四引物包含不与靶序列互补或不与P1.1-Ext结合的可复制序列区段。图31：第三寡核苷酸引物包含不与靶序列互补或不与P2.1-Ext结合的可复制序列区段。
图32示意性示出了(A)第一寡核苷酸引物和(B)待扩增核酸(P1.1-Ext和P2.1-Ext)。
图33示意性地示出了通过对照寡核苷酸进行的链置换。
图34示意性地示出了在本发明所述方法的反应中组分之间的相互作用；该图示出从复合体中分离出第二引物延伸产物的中间步骤，该复合体具有由第一引物延伸产物和对照寡核苷酸构成的双链。
图35示意性地示出了通过同时合成两条链并分离合成的扩增片段而进行的扩增。
图36-49示出了样品实验的结果。
图50和51示意性地示出了某些类型的由基因组DNA得到起始核酸链的制备方式。
图52-54示意性地示出了基于本发明的扩增的某些实施方式。
图55-57示意性地示出了第一扩增***和第二扩增***的组分的形貌的某些实施方式。
图58-59示意性地示出了探针寡核苷酸的可能定位区域的某些实施方式。
图60示意性地示出了探针区段定位的某些实施方式，这些探针区段可以与第三(并且可能是第一)引物延伸产物(P3.1-Ext和P1.1-Ext)主要互补地结合。
图61示意性地示出了探针区段定位的某些实施方式，这些探针区段可以与第四(并且可能是第二)引物延伸产物(P4.1-Ext和P2.1-Ext)主要互补地结合。
图62-67示意性地示出了探针的某些实施方式。
图68-71示意性地示出了靶序列1-3在起始核酸1.1、扩增片段1.1(P1.1-Ext和P2.1-Ext)和第二扩增片段2.1(P3.1-Ext和P4.1-Ext)中的定位的某些实施方式。
具体实施方式
首先提到的本发明的目的尤其是通过两个连续扩增的组合来实现的，其中PCR扩增是最后一步。
在某些方面和实施方式中，通过使用以下所述的探针***实现了本发明的其他目的。
在下文中，以示例性和示意性的方式解释了一些分子过程及其生成的产物以及它们潜在的中间阶段。根据本发明的第一方面，提供了一种扩增方法。该方法包括下列步骤：
1)第一扩增，包括下列步骤：
1.A)将第一寡核苷酸引物与作为待扩增的第一核酸的模板的核酸片段(模板链，起始核酸链)的3’区段杂交，所述待扩增的第一核酸包含靶序列，其中所述第一寡核苷酸引物包含下列区域：
-第一区域，其可以与待扩增的第一核酸的模板链的3’区段特异性地结合，并且与靶序列的至少一部分互补；以及
-第二区域，其与第一区域的5’端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与对照寡核苷酸结合，并且在第一扩增中在所选择的反应条件下基本上未被所用的聚合酶复制；
1.B)当第一寡核苷酸引物通过第一模板依赖性聚合酶与待扩增的第一核酸的互补区段杂交时，使所述第一寡核苷酸引物延伸，以获得第一引物延伸产物；其中，所述第一引物延伸产物除了第一寡核苷酸引物之外，还包含由所述聚合酶合成的区域，且与靶序列的模板链基本互补；其中，所述第一引物延伸产物和所述待扩增的第一核酸的模板链在第一扩增所用的反应条件下基本以双链形式存在；
1.C)使对照寡核苷酸与第一引物延伸产物结合，其中所述对照寡核苷酸包含下列区域：
·第一区域，其可以与第一寡核苷酸引物和/或第一引物延伸产物的第二区域结合；
·第二区域，其与第一寡核苷酸引物和/或第一引物延伸产物的第一区域基本互补或完全互补；以及
·第三区域，其与通过所述聚合酶合成的引物延伸产物的区域至少部分互补或基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸不用作所述第一寡核苷酸引物的引物延伸的模板；
所述对照寡核苷酸包含与模板链的一条链(靶序列)相同或基本相同的序列区段；
对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的第一区域结合；以及
对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的第二区域结合，并且至少部分地与第一引物延伸产物的合成区域结合，从而置换待扩增的第一核酸的模板链的互补部分；其中，所述第一引物延伸产物的聚合酶合成区域(包含与第二寡核苷酸引物互补的第一引物延伸产物的区段)在反应条件下变为单链；
1.D)使第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物的单链互补区段杂交，其中所述第二寡核苷酸引物包含可序列特异性地与所述第一引物延伸产物的合成区域杂交的区域，并包含靶序列的至少一部分；
1.E)使用第一引物延伸产物作为模板，通过第一聚合酶来延伸第二寡核苷酸引物，以获得第二引物延伸产物；该第二引物延伸产物除了第二寡核苷酸引物之外，还包括内含至少一部分第一靶序列的聚合酶合成区域；其中，所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物在第一扩增的反应条件下形成第一双链扩增产物；以及
1.F)如有必要，重复(包括多次重复)第一扩增的步骤。
2)第二扩增，包括下列步骤(图15)：
2.A)将第三寡核苷酸引物与第一扩增产物的第二引物延伸产物杂交，其中所述第三寡核苷酸引物包含可以与所述第二引物延伸产物的区段基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.B)使用第二引物延伸产物作为模板，通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物，以获得第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)；其中，所述第三引物延伸产物(P3.1-Extpart 1)除了第三寡核苷酸引物之外，还包含与第二寡核苷酸引物或待扩增核酸或一部分靶序列基本互补的序列区段；其中，所述第二寡核苷酸引物和所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)以双链形式存在；
2.C)将第四寡核苷酸引物与第一扩增产物的第一引物延伸产物杂交，其中所述第四寡核苷酸引物包含可以与所述第一引物延伸产物的聚合酶合成区域基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.D)使用第一引物延伸产物作为模板，通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物，以获得第四引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)；其中，所述第四引物延伸产物(P4.1-Extpart 1)除了第四寡核苷酸引物之外，还包含由聚合酶合成的区域，该区域与第一寡核苷酸引物基本互补并包含部分靶序列；其中所述第一引物延伸产物和第四引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)以双链形式存在；
2.E)将第一引物延伸产物与第四引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)构成的双链分开，并且将第二引物延伸产物与第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)构成的双链分开；
2.F)将第三寡核苷酸引物与第四引物延伸产物(在步骤2.D中获得，P4.1-Extpart 1)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物包含可以与所述第四引物延伸产物(P4.1-Extpart 1)的区段基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.G)使用第四引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)作为模板，通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物，以获得完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)，其中所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和第四引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)以双链形式存在；
2.H)将第四寡核苷酸引物与第三引物延伸产物(在步骤2B中获得，P3.1-Ext part1)杂交，其中所述第四寡核苷酸引物包含可以与所述第三引物延伸产物的聚合酶合成区域基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.I)使用第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)作为模板，通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物，以获得完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)，其中所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)和第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
2.J)将第三引物延伸产物(P3.1-Ext Part 1)与完整第四引物延伸产物(P4.1-Ext)构成的双链分开，以及将第四引物延伸产物(P4.1-Ext Part 1)与完整第三引物延伸产物(P3.1-Ext)构成的双链分开；
2.K)将第三寡核苷酸引物与第四引物延伸产物(在步骤2I中获得，P4.1-Ext)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物包含可以与所述第四引物延伸产物(P4.1-Ext)的区段基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.L)使用完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)作为模板，通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物，以获得完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)，其中所述完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
2.M)将第四寡核苷酸引物与完整的第三引物延伸产物(在步骤2G中获得，P3.1-Ext)杂交，其中所述第四寡核苷酸引物包含可以与所述完整第三引物延伸产物的聚合酶合成区域基本上序列特异性地结合的第一区域；
2.N)使用完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)作为模板，通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物，以获得完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)，其中所述完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
2.O)分离在步骤2.L和2.N中形成的由完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)构成的双链；以及
2.P)可选地，重复第二扩增步骤，如有必要，使完整的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和完整的第四引物延伸产物(P4.1-Ext)增殖，且可选地重复几次。
在与所获得的扩增产物的检测(尤其是利用探针所进行的检测)有关的方面和实施方式中，可意图向反应混合物中加入检测***。
或者，本发明的所述方面也可表述为一种用于扩增核酸的方法(图1、5)：
1)进行第一扩增以增殖包含靶序列的第一扩增片段1.1，其中所述第一扩增包括下列步骤：
a)使第一寡核苷酸引物与待扩增核酸链的链的3’区段杂交，其中所述待扩增核酸链包含靶序列；
其中，所述第一寡核苷酸引物包含下列区域：
·第一引物区域，其在第一寡核苷酸引物的3’区段中，且可序列特异性地与待扩增核酸链的链结合；以及
·第二区域，其直接或通过接头与第一寡核苷酸引物的第一引物区域的5’端偶联，且包含多核苷酸尾巴，该多核苷酸尾巴适于与对照寡核苷酸结合并通过对照寡核苷酸来支持链置换(步骤c)；其中，在选定的反应条件下，聚合酶的多核苷酸尾巴基本未被复制；
b)通过聚合酶来延伸第一寡核苷酸引物，以形成第一引物延伸产物，该产物包含与待扩增核酸链的靶序列(a)互补的序列；
c)使对照寡核苷酸与第一延伸寡核苷酸引物的第二区域的多核苷酸尾巴结合，其中所述对照寡核苷酸包含下列区域：
·第一单链区域，其可与第一寡核苷酸引物的第二区域的多核苷酸尾巴结合；
·第二单链区域，其与第一寡核苷酸引物的第一区域基本互补且可与其结合；以及
·第三单链区域，其与第一引物延伸产物的聚合酶合成延伸产物的至少一个区段基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸不用作所述第一寡核苷酸引物的引物延伸的模板；
d)使所述对照寡核苷酸与所述第一延伸寡核苷酸引物的第一引物区域结合，从而将所述互补链置换至所述扩增核酸链的所述第一引物区域；
e)使所述对照寡核苷酸与所述第一延伸寡核苷酸引物的延伸产物的互补区段结合，从而置换与所述延伸产物互补的扩增核酸链的链，其中第一引物延伸产物的3’区段变成单链；
f)使第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物杂交，其中所述第二寡核苷酸引物的3’区段包含可与所述第一引物延伸产物杂交的序列；
g)使用聚合酶来延伸第二寡核苷酸引物以形成第二引物延伸产物，其中所述延伸包括所述第一寡核苷酸引物的第一引物区域，并且所述第一引物区域被聚合酶复制，其中所述第二区域的多核苷酸尾巴未被复制；以及
h)重复步骤(a)-(g)，直到达到所需的扩增水平。
2)进行第二扩增，该第二扩增使用在第一扩增反应中获得的第一扩增片段1.1作为模板，并使用第三引物和第四引物以及第二聚合酶和合适的辅因子，从而使第二扩增片段2.1增加，该第二扩增区段2.1包含靶序列或靶序列(或其互补序列)的至少一个区段，其中：
·所述第三寡核苷酸引物可以与所述第二引物延伸产物和/或第四引物延伸产物基本上序列特异性地结合，并且可被所述第二聚合酶延伸；以及
·所述第四寡核苷酸引物可以与所述第一引物延伸产物和/或第三引物延伸产物基本上序列特异性地结合，并且可被所述第二聚合酶延伸；
由第三和第四引物得到的引物延伸产物可用作第二扩增片段2.1的指数扩增模板。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，所述第二扩增是PCR(聚合酶链式反应，也称为PCR扩增)，并且在允许包含靶序列的第二扩增片段2.1进行扩增的条件下进行。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，至少第二扩增是一种在包含探针寡核苷酸的检测***存在的条件下进行的PCR扩增。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增是PCR扩增，并且在以下条件下进行：包括至少一个步骤，其中引物通过聚合酶杂交和/或延伸；以及包括至少一个步骤，其中所得的引物延伸产物被转变(变性)为单链形式。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增是PCR扩增，并且进行到合成出所需数量的扩增片段2.1为止。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增的第三寡核苷酸引物可结合在第二引物延伸产物的3’区段和/或第四引物延伸产物的3’区段中，并且可通过聚合酶延伸。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增的第四寡核苷酸引物可结合在第一引物延伸产物的3’区段和/或第三引物延伸产物的3’区段中，并且可通过聚合酶延伸。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增的第三寡核苷酸引物能够以其3’区段与第二引物延伸产物和/或第四引物延伸产物结合，并且可通过聚合酶延伸。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增的第四寡核苷酸引物能够以其3’区段与第一引物延伸产物和/或第三引物延伸产物结合，并且可通过聚合酶延伸。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，第二扩增的第三寡核苷酸引物的延伸产物和/或第四寡核苷酸引物的延伸产物包含靶序列或其互补序列的至少一个区段。
如上述任一方面所述的方法，其特征在于，对照寡核苷酸的第三单链区域与通过聚合酶合成的第一引物延伸产物的延伸产物的区段基本互补，且所述区段紧邻第一引物区域。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，与第一引物延伸产物互补的待扩增核酸链发生置换，直到所述待扩增核酸的互补链与第一引物延伸产物分离。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，对该方法的步骤(f)进行修改，使其包括使第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物杂交，其中同时通过链置换使对照寡核苷酸从与第一延伸产物的结合中至少部分地置换出来。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，对该方法的步骤(g)进行修改，使其包括在聚合酶的控制下从与第一引物延伸产物的结合中置换出对照寡核苷酸。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，对该方法的步骤(h)进行修改，使其包括使对照寡核苷酸与第一延伸寡核苷酸引物的未复制的多核苷酸尾巴结合以及使第二引物延伸产物从与第一引物延伸产物的结合中置换出来，而对照寡核苷酸同时与第一寡核苷酸引物的第一特异性延伸产物的区段形成互补的双链。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，在允许重复步骤(a)至(g)的条件下重复这些步骤。
此外，如上述任一方面所述的方法，其特征可在于，它包括使用所述第一和第二寡核苷酸引物和所述对照寡核苷酸在指数反应中同时扩增所述第一和第二引物延伸产物，其中所述引物延伸产物作为相互合成的模板。
各产物和中间体的收率取决于几个因素。例如，各寡核苷酸引物的浓度越高通常越有利于产物/中间体的收率。此外，产物/中间体的形成会受到反应温度的选择以及各反应物彼此之间的结合亲和力(各引物与其模板链内互补引物结合位点之间的亲和力)的影响：例如，较长的寡核苷酸在较高的温度下通常比较短的寡核苷酸结合得更好；并且CG水平也可在互补序列区段中发挥作用：在较高的温度下，富含CG的序列也比富含AT的序列结合得更强。此外，诸如MGB或2-氨基-dA或LNA之类的修饰可增加引物与其各自互补区段之间的结合强度，这还使寡核苷酸引物在较高温度下优先结合。
因此，可推断出，通过设计各引物序列的序列区段，可影响某些产物/中间产物的收率，从而影响它们在扩增过程中的富集。
此外，本发明所述的核酸扩增方法(图1、5、55-57)可表述为包括下列步骤：
a)第一扩增，包括下列步骤：
-提供包含靶序列的起始核酸1.1；
-使第一寡核苷酸引物(P1.1)与带有靶序列的待扩增核酸(起始核酸1.1或P2.1-Ext)杂交，其中所述第一寡核苷酸引物(P1.1)包含下列区域：
·第一区域(P1.1.1)，其可序列特异性地与待扩增核酸的区域(P2.1E1)结合；以及
·第二区域(P1.1.2)，其与第一区域的5’端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被所用的聚合酶复制；
-通过第一聚合酶延伸所述第一寡核苷酸引物(P1.1)，以获得第一引物延伸产物(P1.1-Ext)，所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)除了第一寡核苷酸引物(P1.1)之外，还包含与待扩增核酸或靶序列基本互补的合成区域(P1.1E1至P1.1E4)，其中所述第一引物延伸产物和所述待扩增核酸以双链形式存在；
-对照寡核苷酸(C1.2)与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)结合，其中所述对照寡核苷酸(C1.2)包含下列区域：
·第一区域(C1.2.1)，其可以与所述第一引物延伸产物(P1.1E6)的第二区域(突出端)结合；
·第二区域(C1.2.2)，其与所述第一寡核苷酸引物(P1.1.1)的第一区域互补；以及
·第三区域(C1.2.3)，其与所述第一引物延伸产物(P1.1E4)的合成区域的至少一部分基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸(C1.1)不用作所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的引物延伸的模板，并且对照寡核苷酸(C1.1)与第一引物延伸产物(P1.1E6，P1.1E5，P1.1E4)结合，从而置换待扩增核酸的互补区域(P2.1E1，P2.1E2)；
-使第二寡核苷酸引物(P1.1)与所述第一引物延伸产物杂交，其中所述第二寡核苷酸引物(P21)包含区域(P2.1.1)，该区域(P2.1.1)可序列特异性地与第一引物延伸产物(P1.1E1)的合成区域结合；
-通过第一聚合酶延伸所述第二寡核苷酸引物(P21)，以获得第二引物延伸产物(P2.1-Ext)，所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)除了第二寡核苷酸引物(P2.1)之外，还包含与待扩增核酸或靶序列基本相同的合成区域(P2.1E4至P2.1E1)，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第二引物延伸产物(P21)形成第一双链扩增产物；以及
-重复第一扩增的步骤，直到合成出所需数量的第一扩增产物。
b)第二扩增，包括下列步骤：
-使第三寡核苷酸引物(P32)与所述第二引物延伸产物(P1.1-Ext)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物(P3.2)包含第一区域(P3.1.1)，该区域(P3.1.1)可序列特异性地与第二引物延伸产物(P2.1E1)的区域结合；
-通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物(P32)，以获得第三引物延伸产物(P32-Ext)，该第三引物延伸产物(P3.1/2-Ext)除了第三寡核苷酸引物(P3.1；P3.2)之外，还包含与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)或靶序列基本互补的合成区域(P3.1E5至P3.1E2，或P3.1E5至P3.1E1)，其中所述第二引物延伸产物(P2.1)和第三引物延伸产物(P3.1)以双链形式存在；
-使第四寡核苷酸引物(P4.2)与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和/或与第三引物延伸产物(P3.1-Ext)杂交，其中所述第四寡核苷酸引物(P4.2)包含第一区域(P4.1.1)，该第一区域(P4.1.1)可序列特异性地与第一引物延伸产物(P1.1E1)和第三引物延伸产物(P3.1E2)的合成区域结合；
-通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物(P4.2)，以获得第四引物延伸产物(P4.2-Ext)，该第四引物延伸产物(P4.2-Ext)除了第四寡核苷酸引物之外，还包括与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)基本互补或与靶序列基本相同的合成区域(P4.1E5至P4.1E2，或P4.1E5至P4.1E1)，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
-将第一引物延伸产物(P1.1-Ext)与第四引物延伸产物(P4.2-Ext)构成的双链分开，以及将第二引物延伸产物(P2.1-Ext)与第三引物延伸产物(P3.1-Ext)构成的双链分开，以及将第四引物延伸产物(P4.1-Ext)与第三引物延伸产物(P3.1-Ext)构成的双链分开；
-使所述第三寡核苷酸引物(P32)与第四引物延伸产物(P4.2-Ext)杂交，并通过第二聚合酶来延伸第三寡核苷酸引物(P3.2)；以及
-使所述第四寡核苷酸引物与第三引物延伸产物(P3.2-Ext)杂交，并通过第二聚合酶来延伸第四寡核苷酸引物(P4.2)。
此外，本发明还包括以下方面：
如第一方面所述的方法，其中所述核酸片段包含单链形式的靶序列。
如第一方面所述的方法，其中所述包含靶序列的核酸片段以双链形式存在(包括内含第一靶序列的核酸片段、起始核酸链以及与其互补的核酸片段)，并且所述双链核酸片段在第一扩增之前被转变为单链形式。
如第一方面所述的方法，其中使用所述第三和第四引物通过聚合酶链式反应(PCR)进行第二扩增。
如第一方面所述的方法，其中在第一扩增期间所述合成链的分离主要是以序列特异性的方式进行的，并且涉及对照寡核苷酸。
如第一方面所述的方法，其中在第二扩增期间所述合成链的分离是在可引起所述合成链分离的温度下进行的。例如，该温度的范围为80℃至105℃。
如第一方面所述的方法，其中在第二扩增期间的杂交和引物延伸是在一定温度下进行的，该温度允许引物与所述合成链的互补序列区段主要互补地结合，且允许通过所述第二聚合酶来延伸引物。例如，该温度的范围为20℃至约80℃。
如第一方面所述的方法，其中在第二扩增之前，使在第一扩增期间合成的第一和第二引物延伸产物分离，以使两种引物延伸产物均为单链。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物在其第一区域包含一序列区段，该序列区段可在其3’区段中与所述第一靶序列互补地结合。
如第一方面所述的方法，其中所述第二寡核苷酸引物在其3’区域包含与所述第一靶序列的一部分基本相同的序列区段，且所述部分位于所述靶序列的5’区段中。
如第一方面所述的方法，其中所述对照寡核苷酸在其第二和第三区域包含与所述靶序列的一部分基本相同的序列区段。
如第一方面所述的方法，其中所述第一靶序列和与所述第一靶序列互补的链位于由第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物构成的引物对的两侧。
如第一方面所述的方法，其中所述第三寡核苷酸引物在其3’区域包含一序列区段，该序列区段可以与第一扩增片段1.1的第二引物延伸产物基本互补地结合。
如第一方面所述的方法，其中所述第三寡核苷酸引物在其3’区域包含一序列区段，该序列区段可以与第一扩增片段1.1的第二引物延伸产物基本互补地结合，并且所述3’区域包含与所述第一靶序列互补的区段。
如第一方面所述的方法，其中所述第四寡核苷酸引物在其3’区域包含一序列区段，该序列区段可以与第一扩增片段1.1的第一引物延伸产物基本互补地结合。
如第一方面所述的方法，其中所述第四寡核苷酸引物在其3’区域包含一序列区段，该序列区段可以与第一扩增片段1.1的第一引物延伸产物基本互补地结合，并且所述3’区域包含与所述第一靶序列的一部分基本相同的区段，且所述部分位于所述靶序列的5’区域中。
如第一方面所述的方法，其中所述第一靶序列和与所述靶序列互补的链至少部分地位于由第三寡核苷酸引物和第四寡核苷酸引物形成的引物对的两侧。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物相同。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物相同，其中在第二扩增期间得到的引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)和(P4.1-Ext)相同。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物相同，但是所述第二和第四引物不同。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物相同，其中在第二扩增期间得到的引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)和(P4.1-Ext)相同，但是所述第二和第四引物的引物延伸产物不同。
如第一方面所述的方法，其中所述第二寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物相同。
如第一方面所述的方法，其中所述第二寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物相同，其中在第二扩增期间得到的引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)和(P3.1-Ext)相同。
如第一方面所述的方法，其中所述第二寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物相同，但是所述第一和第三寡核苷酸引物不同。
如第一方面所述的方法，其中所述第二寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物相同，其中在第二扩增期间得到的引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)和(P3.1-Ext)相同，但是所述第一和第三寡核苷酸引物的引物延伸产物不同。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物以及所述第二和第四寡核苷酸引物是相同的。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物以及所述第二和第四寡核苷酸引物是相同的，其中在第二扩增过程中，所得的引物延伸产物(P4.1-Ext part 1)和(P4.1-Ext)相同，并且所得的引物延伸产物(P3.1-Ext part 1)和(P3.1-Ext)相同。
如第一方面所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物的第二区域包含不与所述第一靶序列结合的多核苷酸尾巴。
与第一方面有关的前述实施方式可以彼此组合。
在第一扩增中的待扩增核酸包含第一靶序列。在开始第一扩增之前，将至少一个起始核酸链1.1添加到反应中，该起始核酸链1.1包含靶序列且可用作合成第一扩增片段的模板。
第一扩增的合成引物延伸产物(第一扩增片段1.1)包含靶序列。所述第一扩增片段1.1可用作起始核酸链2.1，该起始核酸链2.1具有第二扩增的模板功能。
在第二扩增(第二扩增片段2.1)中合成的引物延伸产物(P3.1-Ext和P4.1-Ext)包含至少部分的第一靶序列。
在本说明书的上下文中，用语“基本互补”是指两个核酸(尤其是它们的相互互补的区域)彼此之间的错配不超过5、4、3、2或1个。
在本发明所述方法的某些实施方式中，重复第一扩增的步骤，直到第一扩增片段(1.1)的拷贝数量为10至1E12，尤其为100至10E9，尤其为1,000至10E9(10E9＝1,000,000,000)。
在本发明所述方法的某些实施方式中，重复第一扩增的步骤至少两次。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二扩增从第一扩增区段(1.1)的多个拷贝开始，该第一扩增片段(11)的拷贝数量为10-1E12个拷贝，尤其为100-1E10个拷贝，尤其为10E3-10E9个拷贝。
在本发明所述方法的某些实施方式中，重复第二扩增的步骤，直到扩增片段(2.1)的拷贝数量为10E5至1E16个拷贝，尤其为10E5至1E14个拷贝，尤其为10E6至1E14个拷贝。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二扩增的步骤重复至少两次。
在另一实施方式中，所述检测***包括至少一种用荧光报告剂标记的探针寡核苷酸。
在另一实施方式中，所述检测***包括至少一种用荧光报告剂和荧光淬灭剂标记的探针寡核苷酸。
在另一实施方式中，所述检测***包括至少一种用供体荧光团标记的探针寡核苷酸，该供体荧光团可以与荧光报告剂形成FRET对。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸包含与所形成的至少一种引物延伸产物(P1.1-Ext，P2.1-Ext，P3.1-Ext，P4.1-Ext)基本互补的序列区段，所述引物延伸产物可在合适的条件(杂交条件)下与所形成的至少一种引物延伸产物杂交。
在另一实施方式中，所述序列区段与第一和/或第三引物延伸产物互补。
在另一实施方式中，所述序列区段与第一和/或第三引物延伸产物互补，其中所述探针寡核苷酸可以在不与对照寡核苷酸互补地结合的各引物延伸产物的3’区段处互补地结合。
在另一实施方式中，所述序列区段与第二和/或第四引物延伸产物互补。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段的长度为10-50个核苷酸，尤其为15-40个核苷酸，尤其为15-30个核苷酸。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段不包含与对照寡核苷酸基本互补的序列区段。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段包含与对照寡核苷酸基本互补的序列区段，所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段不包含与寡核苷酸引物之一基本互补的序列区段。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段包含与寡核苷酸引物之一基本互补的序列区域，其中所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段不包含与对照寡核苷酸的第三区域的序列基本相同的序列区域。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸的所述序列区段包含与对照寡核苷酸的第三区域的序列基本相同的序列区域，所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸。
在一实施方式中，所述对照寡核苷酸包含以下组分之一(荧光报告剂和/或荧光淬灭剂和/或供体荧光团)，且所述组分中的至少一个位于对照寡核苷酸的第三区域。
在一实施方式中，探针寡核苷酸可被5’-3’核酸酶至少部分地切割。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸包含与靶序列或其扩增产物之一所包含的部分基本互补的序列区段，所述区段的长度为5-50个核苷酸，尤其为10-40个核苷酸，尤其为15-30个核苷酸。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸不包含与靶序列或其互补链基本互补的序列区段。
在另一实施方式中，探针寡核苷酸包含基本不与靶序列或其互补链互补的序列区段。
在合适的杂交条件下，探针寡核苷酸与所形成的引物延伸产物的各互补区段的结合导致双链的形成。在该方法期间存在杂交条件。
在该方法期间的适当时间点，用适当波长的光照射所述反应以产生荧光信号，并通过荧光报告剂检测该荧光信号，其中测量所述荧光信号的强度。
荧光信号的检测是通过适当的光学/物理手段来进行的，其中测量所述荧光信号的增加或减少。使用合适的传感器，可以将荧光信号的强度转变成测量值，且在适当校准之后，可确定反应混合物中是否存在所需的靶序列。
荧光检测***的一重要方面是报告剂-淬灭剂对。如果淬灭剂紧邻报告剂，则当暴露于激发光时不会发出任何信号。如果报告剂和淬灭剂分子由于互补的茎序列而保持紧密靠近，则即使在光照下也不会发出荧光信号。然而，如果改变了荧光***从而使位于报告剂与淬灭剂之间的核苷酸序列可以与靶序列杂交，则报告剂和淬灭剂在空间中的位置相距甚远，以至于当用激发光源照射反应混合物时，报告剂分子能够产生荧光辐射。报告剂与淬灭剂之间的距离取决于所用的分子。通常，当淬灭剂和报告剂之间的距离小于25个核苷酸时，荧光报告剂照射后的光发射减少或几乎完全消失。所述距离可以由核苷酸序列或由造成该距离的特异性分子(例如接头或间臂)所致。
在另一实施方式中，荧光报告剂可以与供体荧光团形成特异性报告剂-供体对(FRET对)，该报告剂-供体对(FRET对)可通过荧光共振能量转移(FRET)将吸收的能量转移至荧光报告剂。
包含荧光报告剂和匹配的供体荧光团并形成荧光共振能量转移对的报告剂-供体对可使得这样的FRET对中只有一个伙伴与探针寡核苷酸偶联，而另一伙伴与对照寡核苷酸偶联。荧光报告剂和供体荧光团都与各自的寡核苷酸偶联到一定的程度，使得在探针寡核苷酸的非杂交状态下，供体荧光团不能将吸收的能量转移给荧光报告剂。
在一实施方式中，对照寡核苷酸是检测***的组分，且包含荧光报告剂和/或荧光淬灭剂和/或供体荧光团。通过同时使对照寡核苷酸与合成的第一或第三引物延伸产物杂交，以及使探针寡核苷酸与相同的第一和/或第三引物延伸产物的3’区段杂交，使得在第一和/或第三引物延伸产物的相邻序列位置发生结合，导致供体荧光团和荧光报告剂在空间上接近。这使荧光报告剂与供体荧光团之间的距离减小到一定的程度，使得可以从供体荧光团到荧光报告剂执行FRET。这使得荧光报告剂产生荧光信号，并导致荧光报告剂的荧光信号具有可被检出的增加量。
杂交后，供体荧光团与荧光报告剂之间的距离应小于25个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。激发时的光波长被供体荧光团吸收并传输给报告剂，从而发出可被检出的光。就扩增产物中检测***的布置而言，优选以下实施形式(其中，荧光报告剂或荧光淬灭剂或供体荧光团与对照寡核苷酸偶联，尤其是在对照寡核苷酸的第三区域)：
-在对照寡核苷酸处的偶联优选在对照寡核苷酸的第三区域中进行；
-在对照寡核苷酸处的偶联优选在5’端或第三区域或其附近(例如从第三个区域的5’端开始的2至约10个核苷酸处)进行；
-与探针寡核苷酸的偶联优选在探针寡核苷酸的中间区域中进行；以及
-与探针寡核苷酸的偶联优选在探针寡核苷酸的3’区段中进行。
在本发明的应用中，已证明以下实施方式是尤其有利的：
-在与第一引物延伸产物杂交的寡核苷酸的杂交状态下，FRET对的两个成员之间的距离小于约30个核苷酸；
- 对包含与引物延伸产物之一互补的3’区段的探针寡核苷酸进行修饰，使得聚合酶不能延伸所述3’端；
-探针寡核苷酸包含与引物延伸产物之一互补的3’区段，使得聚合酶可延伸所述3’端，其中所述探针寡核苷酸用作PCR引物；
-用于检测扩增的方法，其中扩增两个或更多个核酸链，其中对每个待扩增核酸链使用特异性检测***；
-用于检测扩增的方法，其中扩增两个或更多个待扩增核酸链，其中通过统一的检测***对至少两条待扩增核酸链的扩增进行检测；
-所述扩增包括引物延伸产物之一的不对称扩增；
-在扩增期间激发荧光报告剂并测量荧光报告剂的荧光信号；
-在扩增期间激发供体荧光团并测量荧光报告剂的荧光信号；
-在扩增之后激发荧光报告剂并测量荧光报告剂的荧光信号；
-在扩增之后激发供体荧光团并测量荧光报告剂的荧光信号；
-探针寡核苷酸是一种DNA寡核苷酸；
-探针寡核苷酸是一种DNA寡核苷酸，其3’端被阻断，因此聚合酶无法延伸它；
-探针寡核苷酸包含与第一和/或第三引物延伸产物互补的序列区段，其中所述序列区段的长度为8至约60个核苷酸；以及
-探针寡核苷酸包含与第一和/或第三引物延伸产物的3’区段互补的序列区段，其中所述互补的序列区段不与对照寡核苷酸结合，其中所述区段的长度为8至约40个核苷酸。
探针寡核苷酸包含以下至少一种附加修饰：接头(例如HEG、C3、C6)，糖磷酸主链修饰(例如PTO、2’-O-Me、RNA、PNA、LNA修饰)。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第三寡核苷酸引物和/或第四寡核苷酸引物具有与第一区域的5’端相邻或通过接头连接的第二区域，其中所述第二区域不能与所述第一引物延伸产物或第二引物延伸产物互补地结合。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第三和/或第四寡核苷酸引物的第二区域位于第三和/或第四寡核苷酸引物的第一区域的5’方向上。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第三寡核苷酸引物和/或第四寡核苷酸引物包含条形码序列。
在本发明所述方法的某些实施方式中，将第一引物延伸产物与第四引物延伸产物构成的双链分开以及将第二引物延伸产物与第三引物延伸产物构成的双链分开是通过热变性进行的，尤其是在范围为85℃至105℃的温度下进行的。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一聚合酶能够在合成过程中进行链置换。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二聚合酶是一种耐热聚合酶。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一聚合酶和第二聚合酶相同。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一寡核苷酸引物和第三寡核苷酸引物基本相同。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二寡核苷酸引物(P2.1)和第三寡核苷酸引物(P4.2)基本相同。
在本说明书的上下文中，用语“基本相同”尤其是指两个核酸序列彼此之间的错配不超过5、4、3、2或1个。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一扩增的反应条件的选择应使第一扩增产物不发生自发解离。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二扩增在两个或更多个温度下进行，其中在第一温度下，所述第三和/或第四寡核苷酸引物与所述第一和/或第二和/或第三和/或第四引物延伸产物杂交并延伸，并且在第二温度下所得双链分离。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二扩增在三个或更多个温度下进行，其中在第一温度下，所述第三和/或第四寡核苷酸引物与所述第一和/或第二和/或第三和/或第四引物延伸产物杂交，在第二温度下所述第三和/或第四引物延伸，并且在第三温度下所得双链分离。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一扩增和第二扩增在同一反应批次中进行。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二聚合酶、第三寡核苷酸引物和/或第四寡核苷酸引物可被激活，以及/或者对照寡核苷酸可被灭活。
例如，可激活的聚合酶可以是可逆失活的聚合酶，例如耐热聚合酶(热启动聚合酶)，或者是被抗体或化学修饰可逆失活的聚合酶。
可激活的引物可以是可逆失活的引物，例如具有保护的3’-OH基团的寡核苷酸，其中可除去所述保护性基团，尤其是通过具有5’核酸外切酶活性的聚合酶除去所述保护性基团。在此，在第一扩增中使用没有5’核酸外切酶活性的聚合酶将是有利的。
例如，对照寡核苷酸可被具有5’核酸外切酶活性的聚合酶灭活或切割。或者，在第二扩增之前，还可通过其他酶促或化学方法来切割对照寡核苷酸，从而将其除去。
在本发明所述方法的某些实施方式中，在进行第二扩增之前使第一聚合酶失活。例如，如果第一聚合酶是一种不耐热的聚合酶，则所述失活可通过热变性来实现。
在本发明所述方法的某些实施方式中，预期第一扩增在第一反应批次中进行，第二扩增在第二反应批次中进行。
在本发明所述方法的某些实施方式中，预期将第一反应混合物的等分试样添加到第二反应混合物中。
在本发明所述方法的某些实施方式中，预期将全部的第一反应混合物添加到第二反应混合物中。
在本发明所述方法的某些实施方式中，对照寡核苷酸的第三区域与第一引物延伸产物的合成区域中紧邻第一寡核苷酸延伸产物的寡核苷酸引物部分的部分基本互补。这有利于改善待扩增核酸的序列特异性置换。
在本发明所述方法的某些实施方式中，预期对照寡核苷酸包含第四区域，该第四区域能够基本上序列特异性地与第三寡核苷酸引物的3’区域结合。所述第四区域可位于对照寡核苷酸的第二区域和/或第三区域内，或者可包括所述第二和/或第三区域的序列区段，并且所述第四区域的长度尤其为9-30个核苷酸，尤其为10-20个核苷酸或者12-16个核苷酸。
在本说明书的上下文中，用语“基本上序列特异性地”是指寡核苷酸引物和待扩增核酸中彼此基本互补的区域所包含的错配不超过5、4、3、2或1个。
在本发明的某些实施方式中，对照寡核苷酸包含一种或多种核苷酸修饰，所述修饰适于防止与对照寡核苷酸结合的引物的延伸。例如，多个2'-O-烷基修饰可阻止或防止这种延伸。特别地，多个核苷酸修饰位于对照寡核苷酸的第二和/或第三区域中。特别地，所述对照寡核苷酸包含至少5个这样的修饰，更好地至少10个修饰。
在某一实施方式中，对照寡核苷酸完全由核苷酸修饰组成。
在本发明所述方法的某些实施方式中，由聚合酶合成的第一引物延伸产物的区域中与对照物核苷酸的第三区域基本互补的部分的长度为5-70个核苷酸。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸的第三单链区域与第一引物延伸产物的5’区段完全互补，其中所述互补序列区段可具有以下长度：从至少3个核苷酸至70个核苷酸，或从至少5个核苷酸至50个核苷酸，尤其从5个核苷酸至40个核苷酸，从5个核苷酸至30个核苷酸，尤其从5个核苷酸至20个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，预期第一扩增基本上等温地进行。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二扩增在三个温度下进行，其中在第一温度下进行第三或第四寡核苷酸引物的杂交以及(可选地)引物的初始延伸，在第二温度下进行引物的完全延伸，以及在第三温度下使所形成的引物延伸产物从其各自的模板链中分离出来。特别地，第一温度为25℃至65℃，第二温度为65℃至80℃，并且第三温度为85℃至105℃。
在本发明所述方法的某些实施方式中，待扩增核酸的长度为20-300个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，寡核苷酸引物的第一区段的长度为15-100个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第二寡核苷酸引物的长度为15-100个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，对照寡核苷酸的长度为20-100个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的长度为15-60个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第四寡核苷酸引物的长度为15-60个核苷酸。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第三寡核苷酸引物具有至少一个耐核酸酶的核苷酸修饰，例如PTO(硫代磷酸酯)或2’-O-烷基修饰。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第四寡核苷酸引物具有至少一个耐核酸酶的核苷酸修饰，例如PTO或2'-O-烷基修饰。
在本发明所述方法的某些实施方式中，第一寡核苷酸引物在第二区域(尤其紧随第一寡核苷酸引物的第一区域)具有一个或多个修饰，其阻止所用的聚合酶复制第二区域。有利的是，仅第一寡核苷酸引物的第一区域被复制。
在某些实施方式中，这可通过使用可以与第一引物延伸产物互补地结合的核苷酸修饰来实现，但是所述核苷酸修饰不接受聚合酶作为模板。这类核苷酸修饰的实施例是具有改性糖磷酸主链部分(例如2'-O-烷基RNA修饰(例如2'-OMe)、LNA修饰或吗啉代修饰)的核苷酸化合物。通常，链中这种修饰的存在会阻止DNA依赖性聚合酶来转录这种链。此类修饰的数量可能会有所不同，通常几个修饰(1-20个)就足以阻止聚合酶读取这样的链。例如，这种核苷酸修饰可用于第一寡核苷酸引物与对照寡核苷酸的结合位点处或其附近，以及/或者用作第一寡核苷酸引物的第二区域的成分。
由于使用了这种修饰，聚合酶的功能被局部地阻碍，使得所使用的结构的某些区段不能被聚合酶复制并且主要保持为单链。它们以所述单链形式可以与更多的反应组分结合，从而实现其功能。
上文已讨论了本发明所述方法在某些实施方式中的各个特征。本领域技术人员知道，所述特征可组合在更具体的实施方式中。这一点适用于在本说明书的上下文中讨论的所有特征，除非它们的组合显然没有意义，例如在互斥参数重叠的情况下。
根据本发明的另一方面，根据上述方面或其具体实施方式或替代方式，提供了用于实施本发明所述方法的试剂盒。本发明所述试剂盒包括：
-第一寡核苷酸引物，其包含下列区域：
·第一区域，其可序列特异性地与待扩增核酸的区域结合；
·第二区域，其与第一区域的5’端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与第一对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被扩增所用的聚合酶复制；以及
·其中，所述第一寡核苷酸引物可通过聚合酶延伸至包含合成区域和第一寡核苷酸引物的第一引物延伸产物；
-第二寡核苷酸引物，其中所述第二寡核苷酸引物包含一区域，该区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物的合成区域结合，并且可通过聚合酶延伸至第二引物延伸产物，该第二引物延伸产物除了所述第二寡核苷酸引物之外还包含合成区域；
-对照寡核苷酸，其包含下列区域：
·第一区域，其可以与第一引物延伸产物的第二区域结合；
·第二区域，其与第一寡核苷酸引物的第一区域基本或完全互补；以及
·第三区域，其与所述引物延伸产物的所述合成区域的至少一部分基本或完全互补；
其中，所述对照寡核苷酸不用作所述第一寡核苷酸引物的引物延伸的模板，并且所述对照寡核苷酸可以在置换所述第二引物延伸产物的互补区域的同时与所述引物延伸产物结合；
-第三寡核苷酸引物，其包含第一区域，该第一区域可序列特异性地与所述第二引物延伸产物的区段结合，并且可通过聚合酶延伸至包含合成区域和第三寡核苷酸引物的第三引物延伸产物(P3.1-Ext)；以及
-第四寡核苷酸引物，其包含第一区域，该第一区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物的合成区域结合，并且可通过聚合酶延伸至包含合成区域和第四寡核苷酸引物的第四引物延伸产物。
在本发明所述试剂盒的某些实施方式中，所述试剂盒还包含至少一种聚合酶。
在本发明所述试剂盒的某些实施方式中，所述试剂盒包含用于延伸第一和第二寡核苷酸引物的第一聚合酶以及用于延伸第三和第四引物的第二聚合酶。
在本发明所述试剂盒的某些实施方式中，第一聚合酶不具有5’核酸外切酶活性，第二聚合酶不具有5’核酸外切酶活性。特别地，第二聚合酶可以是耐热聚合酶。
在本发明所述试剂盒的某些实施方式中，第二聚合酶、第三寡核苷酸引物和/或第四寡核苷酸引物可被激活，以及/或者对照寡核苷酸可被灭活。
根据本发明的另一方面，根据上述方面或其具体实施方式或替代方式，提供了如上述方面所述的试剂盒在实施本发明所述方法中的用途。
将通过附图和对所选实施方式的详细描述来非限制性地描述本发明的其他细节和优点。
本发明所述的组合包括两个要相继实施的扩增方法。在第一分扩增(第一扩增方法)期间，包含靶序列的核酸链被扩增。由此生成了扩增核酸链，该扩增核酸链随后在第二分扩增(第二扩增方法)中用作模板。所述第二分扩增在许多情况下将是常规PCR。在第二分扩增期间，从靶核酸或包含有在第一分扩增中扩增的靶核酸的核酸继续扩增。PCR片段被扩增。所述PCR片段尤其包含靶序列或部分靶序列。此外，可以在第二扩增程序期间对可扩增核酸链进行特定的改变。例如，可通过使用条形码引物或检测特异性寡核苷酸引物来侧接靶序列。也可以使用PCR探针(例如所谓的Taqman探针)进行检测。此外，在PCR阶段期间，可使用固定的寡核苷酸引物将靶序列固定在固相上，从而使PCR以固相PCR的方式进行。
通过使用本发明所述的第一扩增方法，应该能够合成或扩增具有确定序列组成的核酸链，其中所生成的产物可作为具有模板功能的起始核酸链用于随后的PCR，并且所述PCR扩增使用至少一种独特的PCR引物进行。
通过提供第一扩增方法(第一分扩增)和用于实施该方法的相应装置，进一步实现了本发明的目的。所述第一扩增程序的实施已在PCT申请PCT/EP2017/071011和欧洲申请16185624.0中描述。对于实施扩增的细节，请参阅所述申请。
第二扩增方法(第二分扩增)尤其可通过PCR来进行，其中所使用的引物中的至少一种具有与在第一扩增方法中使用的寡核苷酸引物不同的组成和/或结构。这导致至少一条包含特异性靶序列或其部分的核酸链的扩增。
PCR扩增本身通常能够由拷贝数量超过约1,000个拷贝(更好地，拷贝数量超过约100,000个拷贝)的初始模板生成特征明确的扩增产物，或者能够实时生成特定信号。如果拷贝数量减少到少于1000个拷贝(例如减少到100或10个拷贝)，则PCR必须包含更多的合成循环，由此会越来越多地导致错误的扩增产物或信号。如果PCR必须扩增批料中少量存在的序列变体(例如序列的突变或等位基因变体)，并且PCR扩增是在存在大量其他序列变体(例如野生型序列或等位基因变体)的情况下进行的，则情况尤其如此。尽管已开发出许多方法来改善PCR的特异性，但扩增依赖性检测方法可受益于扩增方法的更高特异性，例如在液体活检领域。尤其在临床诊断中，需要改善测量方法的特异性。
由于PCR技术的广泛应用，人们对所述技术进行了大量的修改或对基本PCR方法进行了扩展，这些修改或扩展被应用于分子生物学的许多领域。例如，通过另一种第一扩增方法的上游连接，可以在所述应用中改善信号的特异性或PCR产物的特异性。
本发明描述了在先的高特异性扩增方法与下游PCR的组合。该组合使得能够在第一扩增方法的高度选择性扩增条件下将待扩增核酸链的初始拷贝数量增加到所需数量，然后如果需要，将其在PCR扩增的较低特异性条件下进一步扩增。因此，第一扩增方法(第一分扩增)具有高特异性的第一扩增器的功能。在第一区段中合成拷贝的数量范围例如为约10至约1E11个拷贝，更好地约100至约1.0E10个拷贝，优选地约1000至约10E8个拷贝。靶序列的数量通过第一扩增而增加。所述扩增(基于所述批次中靶序列的初始数量)例如在以下范围内：从约2倍至约1E10倍，更好地从约10倍至约10E9倍，甚至更好地从约10倍至约10E8倍，优选地从约10倍至约10E7倍，尤其优选地从约100倍至10E6倍。可达到以下相对于反应体积的浓度范围：从约10amol/l至约10nmol/l，更好地从约1fmol/l至约1nmol/l，甚至更好地从约10fmol/l至约0.1nmol/l，尤其从约10fmol/l至约10pmol/l。
第二扩增方法(第二分扩增，用作PCR方法或其修饰)起到第二扩增器的作用，并允许使用现有的基于PCR的方法，例如在NGS文库构建或固相PCR中结合第一扩增的特定产物所进行的探针***或条形码编码或序列编码。
所述组合的优点一方面是使进行扩增所需的PCR循环量减少到最终产物的所需量，由此降低了通过PCR来合成缺陷产物的可能性或程度。因此，合成结果可以比单独的PCR扩增具有更高的特异性。
在一具体实施方式中，在第一扩增反应期间，在同一反应批次中，在不存在第二扩增***的至少一种必要组分的情况下，首先进行具有第一扩增***的所需组分的第一扩增。例如，仅在PCR扩增之前加入PCR引物或耐热聚合酶。
在第一扩增反应完成之后，使反应混合物与第二扩增***的组分接触并且进行PCR扩增。
在某些实施方式中，在扩增开始之前，特定扩增***的反应组分存在于单独的反应批料中和/或单独的反应容器中。
例如，在一个反应容器中进行第一扩增反应，然后将所述反应的合成结果(完全地或部分地)转移至第二反应容器中，然后进行第二扩增。
在其他实施方式中，按顺序加入反应组分，使得首先加入第一扩增***的组分并进行第一扩增反应。然后加入第二扩增***的组分，以便可进行第二扩增。在其他实施方式中，将第二扩增***的组分添加到第一扩增***中，使得反应基本上在同一反应容器中进行。因此，这两种扩增方法的顺序取决于各组分加入时的时间顺序。
为了降低污染的可能性，这两个反应尤其均可在密闭的***中进行。例如，这样的***可包括至少两个独立的反应容器。在某些实施方式中，还使用封闭***将批料从一反应容器转移到另一反应容器中。例如，在封闭的反应容器***中，这两个反应的这种分离被称为分离的反应容器，这些分离的反应容器被组合起来形成药筒***、阵列***或微流体***。
在某些实施方式中，将第一扩增的包括扩增核酸的第一扩增方法用于第二扩增，而不拆分第一方法。因此，第一批料基本上完全转移到第二扩增反应中。来自第一扩增程序的大量合成拷贝随其转移至第二扩增***，并且其数量范围例如为约10至约1E11个拷贝，更好地约100至约1E10个拷贝，优选地约1000至约10E9个拷贝。由此，靶序列的数量通过第一扩增而增加。所述增加(相对于所述批次中靶序列的初始数量)例如在以下范围内：从约2倍至约1E11倍，更好地从约10倍至约1,000,000,000倍，甚至更好地从约10倍至约100,000,000倍，优选地从约10倍至约10,000,000倍，尤其优选地从约100倍至1,000,000倍。可达到以下相对于反应体积的浓度范围：从约10amol/l至约10nmol/l，更好地从约1fmol/l至约1nmol/l，甚至更好地从约10fmol/l至约0.1nmol/l，优选地从约10fmol/l至约10pmol/l。
在另一具体实施方式中，在第二扩增反应中优选仅使用第一扩增批料的一部分(等分试样或部分量)。由于通过第一扩增***进行扩增，使得包含至少一个靶序列的核酸链的数量增加。在第二扩增反应中，所述数量的一部分可用作起始材料。例如，所述这部分可被转移或添加到第二反应批料中。例如，该部分可相对较少，并且基本上取决于所需应用的要求。由于PCR的扩增作用，第二扩增尤其可以从在第一扩增程序中被序列特异性地扩增的多于约1000个拷贝的核酸链开始。
因此，当在第一扩增程序中已合成了足够数量的扩增核酸链时，就可以开始PCR扩增。合成核酸链的所述数量范围可以如下：例如从约10,000至约1E11个拷贝，更好地从约10,000至约1E10个拷贝，尤其从约10,000至约1E9个拷贝。根据需要通过所述第一扩增来增加靶序列的数量。所述扩增(相对于所述批次中靶序列的初始数量)可被测得为初始数量的N倍，而且例如在以下范围内：从约2倍至约1E11倍，更好地从约10倍至约1E10倍，甚至更好地从约10倍至约1E9倍，尤其从约10倍至约1E8倍，尤其从约100倍至1E6倍。可达到相对于反应体积的以下浓度范围：从约10amol/l至约10nmol/l，更好地从约1fmol/l至约1nmol/l，甚至更好地从约10fmol/l至约0.1nmol/l，尤其从约10fmol/l至约10pmol/l。
由于可在第一扩增反应中生成超过1000个拷贝的包含靶序列的特异性核酸链，所以可将所述数量的一部分(或等分试样或部分)用于第二扩增反应。
例如，PCR可以从以下数量范围开始：例如从约100至约1E11个拷贝，更好地从约1,000至约1E10个拷贝，尤其从约1,000至约1E9个拷贝。所述数量可理解为包含所述靶序列的合成核酸链的子量，所述核酸链通过所述第一扩增而扩增。
所提供的第一扩增的扩增合成产物相对于反应体积的浓度范围如下：从约10amol/l至约100nmol/l，更好地从约1fmol/l至约10nmol/l，甚至更好地从约10fmol/l至约1nmol/l，尤其从约10fmol/l至约10pmol/l。可以从第一扩增的合成产物的所述浓度开始PCR扩增。在PCR扩增的过程中，产物进一步增殖，其中PCR片段的最终浓度为0.01nmol/l至5μmol/l，更好地为1nmol/l至1μmol/l。
此外，在第二扩增方法中只能使用在第一扩增方法中特异性地合成的核酸链的一部分。因此，在某些实施方式中，第一扩增提供了一定数量的拷贝，其相对于作为PCR起始材料所需或所期望的必要拷贝数量而言是相对过剩的。
一部分从所述第一扩增反应转移到第二扩增反应，其中包含的合成核酸链用作模板以开始PCR反应。
例如，可通过稀释第一反应批料并将包含合成核酸链的一定体积份数转移到第二反应中来得到第一反应批料的一部分。由此转移的这部分特异性地合成的核酸链可用作用于生成PCR片段的模板，因此这部分的范围(根据第一扩增中合成产物的总量计算)可如下：从约1E-7％至约90％，更好地从约1E-6％至约90％，甚至更好地从约0.0001％至约50％，尤其从约0.001％至约50％，或从约0.01％至约50％，尤其从0.1％至约20％。
这不仅会稀释包含靶序列的合成核酸链，而且还会稀释第一扩增***的组分(例如引物和对照寡核苷酸)。任何可能生成的副产物也会被稀释。由此导致的第一扩增***组分浓度的降低是可接受的，甚至可能对PCR的性能产生积极的影响。例如，稀释引物和对照寡核苷酸可导致在PCR反应期间使用的寡核苷酸引物或寡核苷酸探针的浓度高于第一扩增***的转移寡核苷酸引物的浓度。这可促进PCR反应，并使对扩增程序的干扰降到最低。
此外，稀释对照寡核苷酸还可以对PCR反应产生积极的影响，这是因为尽管所述对照寡核苷酸在第二扩增反应期间存在于所述批料中，但是其浓度在第二扩增期间降低，使得其与合成产物或反应组分的结合充分减慢，或者与互补序列区段的相互作用减少或发生得不充分，因此通过所述稀释效应降低了其对总反应序列的作用。
因此，当提供用于第二扩增的核酸链时，通常还可以在稀释所提供的特异性核酸链的同时稀释第一扩增***的反应组分。转移到第二扩增反应中的第一扩增***组分的相对量可以表示为份数。所述份数是指在第一扩增反应中使用的组分量(100％)。例如，在第二扩增反应中，所述第一扩增***组分的转移份数的范围如下：从约1E-7％至约50％，更好地从约1E-6％至约30％，甚至更好地从约0.0001％至约20％，尤其从约0.001％至约10％，尤其优选地从0.1％至约10％。因此，所述第一扩增***组分的浓度显著降低，以至于其在第二扩增步骤中的作用降低或可忽略不计。
例如，第一反应批料的转移份数可以是指所使用的浓度或体积份数。例如，将一微升(1μl)的包含第一扩增***的批料转移(在完成一扩增后)到49μl的包含第二扩增***的批料中，使得稀释的比例为2％(v/v)或1∶50。通过使用稀释系列可达到更高的稀释水平。
例如，第一扩增***中的对照寡核苷酸的浓度可以按1∶1000的稀释度从约10μmol/l降低至约10nmol/l。因此，转移份数仅为0.01％。在这样的稀释度下，可同时转移相同比例的包含靶序列的合成核酸链。例如，在第一扩增反应中，扩增出约10,000,000个拷贝，其中以1∶1000的稀释度转移到PCR反应中的产物的数量导致约10,000个拷贝的部分量。所述复制的初始数量通常足以使PCR进行稳定且足够特异性的扩增反应。
稀释潜在干扰的核酸链(例如野生型分子或等位基因变体)也是有利的。在序列特异性第一扩增期间，主要是对靶分子进行特异性扩增。其他核酸链未扩增或未显著扩增。
稀释时，稀释效应也适用于可能干扰PCR反应的所述序列。例如，野生型序列的数量从100,000个减少到约100个。这可以对PCR反应的特异性产生积极影响。
在某些实施方式中，尤其是这两种方法都以一种方式进行(作为“均相测定”)。为此，两个扩增***的组分必须在第一扩增开始时以一个批次供应。因此，在第一扩增开始之前，将两个扩增***所需的组分添加到反应批料中。
在一具体实施方式中，在第一扩增反应期间，在同一反应批次中，在存在第二扩增***的至少一种必要组分的情况下，首先进行具有第一扩增***的所需组分的第一扩增。
将两个扩增***合并为一个反应批次可能需要调整各组分或浓度和反应条件。
第二扩增***的组分的存在不应阻止第一扩增反应。
在某些实施方式中，选择可以与对照寡核苷酸互补地结合的第三寡核苷酸引物的3’区段的长度，以使所述区段不阻止对照寡核苷酸的链置换。这基本上是基于以下事实来实现的：在对照寡核苷酸置换链的反应条件下(例如第一扩增期间的65℃步骤)，对照寡核苷酸的双链复合体和第三引物的3’区段的稳定性足够低，以至于第三引物与对照寡核苷酸的结合只是暂时的，不能阻止链置换。例如，这可能受到能够与对照寡核苷酸形成这种复合体的第三引物的3’区段的长度的影响。例如，所述复合体的长度为8-20个核苷酸。此外，第三引物的3’区段可能与相应区段中的对照寡核苷酸的序列组成具有一个或多个错配，导致所述复合体不稳定。特别地，相对于第三引物的3’末端核苷酸，1-3个错配位于-10至-20的位置。这不会在降低与对照寡核苷酸构成的复合体的稳定性的同时显著影响第三引物的引物功能。
此外，第二扩增***的引物与聚合酶的对照寡核苷酸均不应用作模板。这对于第三寡核苷酸引物尤其重要，因为它包含可以与对照寡核苷酸互补地结合的序列区段。因此，对照寡核苷酸在其可能与第三寡核苷酸引物互补地结合的区段中的结构可被设计成与第一组的第一引物类似。在某些实施方式中，对照寡核苷酸使用核苷酸修饰来阻止第三寡核苷酸引物的引物延伸，以防止聚合酶延伸与对照寡核苷酸结合的第三引物。例如，几个2’-O-烷基修饰可介导这种阻断效应。
为了避免两个扩增***之间的不必要干扰，在第一分扩增期间将第二扩增***的组分完全或部分地保持在“惰性”或“非活性”或“可逆失活”或“非反应性”状态也可能是有利的。只有在为了实施第二扩增时，这种组分才应被转变到活性(即功能性)状态。
在某些实施方式中，所述PCR组分中的至少一种以可逆失活的形式存在于第一扩增期间，使得所述组分不参与或不显著参与第一扩增反应。在第一扩增完成之后，所述可逆失活组分随后被首先激活，从而除去所述失活现象，并且所述组分现在以活性形式存在于第二扩增反应中，因而能够在所述扩增中发挥其作用。
例如，使用可逆失活的PCR引物或可逆失活的耐热聚合酶(所谓的热启动聚合酶)。例如，从第一扩增到第二扩增的转变步骤使用允许激活所述非活性形式的组分的反应条件。在其他实施方式中，组分的激活是在PCR条件下连续进行的。
技术人员已知可逆失活引物的一些实施例(例如termolabile引物，即所谓的CleanAmp Primers Trilink-Technologies)。这种引物可通过加热来激活，使得聚合酶可以从所述引物开始合成。可逆失活引物的其他实施例包括具有3’末端核苷酸的引物，该引物包含修饰的糖残基，例如阻断的3’-OH基(例如通过3’位置的C3接头或具有末端双脱氧核苷酸的引物，Sambrook等人，NAR 1998，p.3073)。
在某些实施方式中，此类引物表现出与模板的3’末端错配。当使用这种引物时，在第一扩增中尤其使用不显示出3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶(例如Bst聚合酶或其修饰)。因此，这些引物在第一阶段保持未激活状态。所以，当在PCR阶段使用此类引物时，有必要将其激活。激活通常是通过将3’末端核苷酸与修饰的糖残基一起酶切来实现的。由于上述原因，将这些引物与具有3’-5’核酸外切酶活性的耐热聚合酶(所谓的校对聚合酶)结合使用是有利的。在包括具有3’末端错配的引物的某些实施方式中，这种末端错配促进了聚合酶的3’-5’核酸外切酶的功能。PCR扩增开始后，此类“非活性”引物与其在模板上的互补位置结合。与模板结合后，可通过核酸外切酶活性(与聚合酶有关)去除包含阻断基团的末端核苷酸。由此生成了互补地结合的寡核苷酸引物和可通过聚合酶来延伸的游离3’-OH基团。现在可通过聚合酶来延伸这种“激活的”引物，从而可合成与各自模板互补的链。能够在PCR条件下激活此类引物的聚合酶包括Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Pfu聚合酶和Phusion聚合酶。通过设计3’末端与各自模板不匹配(或例如相对于3’末端核苷酸位于-1或-2位置)的PCR引物，通常可加速激活此类引物(例如对于Pfu聚合酶或Phusion聚合酶)。其他耐热聚合酶(例如Vent聚合酶或Deep Vent聚合酶)也可切割带有阻断3’-OH基团的修饰末端核苷酸，即使它们与模板互补。为了限制聚合酶对PCR引物的降解作用，这种引物例如可在“-2”或“-3”的位置或从“-2”至“-7”的位置包含3’-5’核酸酶不可切割键，例如一个或多个硫代磷酸酯(PTO)修饰。由此防止了对引物的过度降解。
例如，可逆激活的聚合酶包括那些通过抗体而可逆失活的聚合酶或通过化学修饰(AmpliTaq聚合酶)而可逆失活的聚合酶。几个商家已开发出了这种用于PCR的“热启动”聚合酶(Qiagen，Thermofisher，Roche)。特别地，Taq聚合酶及其修饰以不同的可逆失活状态供应，被称为热启动Taq聚合酶。尤其优选热启动聚合酶，其例如通过制剂被初始加热至95℃达1-10min而转变成活性形式。由于抗体可屏蔽聚合酶中的不同表位，所以聚合酶的不同活性可以在不同程度上可逆失活(Scalice等人，J.Immunol.Methods，1994，p.147-，Lyamichev et al PNAS，1999，p.6143)。
对于某些类型的均相形式的扩增，在第二扩增开始之前，通过加热使在第一扩增反应中对待扩增核酸链进行指数扩增的聚合酶失活。例如，所述失活可通过将制剂加热至高于80℃(优选加热至高于90℃，尤其是加热至95℃)达1-10min来实现。这样，可以使嗜中温聚合酶(例如Bst聚合酶或Bsm聚合酶或Gst聚合酶)失活。这种失活有利于从第一扩增反应的过程过渡到第二扩增反应。这样的温度步骤允许第一扩增反应的聚合酶失活和第二扩增反应的聚合酶激活同时发生。
由于第一聚合酶的这种热灭活，第一聚合酶不再能以相同的程度与引物或模板结合。因此，在第二扩增反应期间，引物-模板复合体尤其被将在第二扩增步骤中进行合成的聚合酶使用。
通过以这种方式从一种聚合酶转变为另一种聚合酶，还可以“关闭”与聚合酶相关的其他活性，例如Bst聚合酶的链置换，或“开启”Taq聚合酶的5'-3’核酸外切酶活性。
在某些实施方式中，与第一引物延伸产物杂交的对照寡核苷酸的5’区段可在第二扩增反应期间被聚合酶的5'-3’核酸酶(例如Taq聚合酶的5’-3’核酸酶)切割。所述过程是众所周知的，并且通常用于探针降解和PCR反应的实时监测(US Pat 5，210,015)。此处，聚合酶可通过使用第三引物延伸产物在适当的反应条件下并入核苷酸来互补地延伸第四PCR引物，同时该聚合酶可以在其与第三引物延伸产物杂交的第三区域的5’区段中酶切对照寡核苷酸。在合成过程中，被聚合酶延伸的链尤其与对照寡核苷酸形成至少一个3’末端核苷酸的重叠，从而在所使用的反应条件下形成Taq聚合酶的5'-3’核酸酶活性可识别的结构，并且该结构可被切割。5’-3’核酸外切酶活性导致对照寡核苷酸的第三区域的核苷酸之间的磷酸二酯键断开。尽管一些糖磷酸主链修饰(例如2'-OMe核糖核苷酸或PTO修饰或PNA)可减缓甚至阻止所述切割，但是5'-3’核酸外切酶诱导的断开尤其发生在DNA链上。由于上述原因，在所述实施方式中尤其使用具有5'-3’核酸外切酶活性的聚合酶(例如Taq聚合酶)与对照寡核苷酸的组合，其中所述对照寡核苷酸在其第三区域的5’区段中主要包含可被核酸酶(例如DNA)切割的核苷酸或其类似物。所述对照寡核苷酸的所述5’区段的长度例如为5-50个(尤其为10-30个)核苷酸。
通过降解与第一引物延伸产物结合的对照寡核苷酸，即使没有链置换性质，聚合酶也可以延伸第二引物，从而合成第二引物延伸产物。
在某些实施方式中，第二扩增***的组分在第一扩增期间的存在被认为如下：
一方面，第二扩增***的组分的作用可通过其在第一扩增之前的可逆失活来降低。另一方面，在第一扩增期间，各序列成员不应作为引物延伸的非特异性基质出现。因此，应检查第一和第二扩增***的引物是否存在自互补结构，以避免引物二聚体的形成。
第三PCR引物通常在其3’区段中包含一序列区段，该序列区段包含与对照寡核苷酸互补的区域。这允许第三PCR引物与对照寡核苷酸互补地结合。为了进行第一扩增，第三PCR引物不得在第一扩增期间阻止对照寡核苷酸的链置换。为此，调整第三PCR引物的3’区段的序列长度或序列组成，以使其在链置换步骤的反应条件下(例如65℃)基本上不与对照寡核苷酸结合。例如，这可通过确保由对照寡核苷酸和第三寡核苷酸引物的3’区段组成的复合体的解链温度基本上低于链置换步骤的反应温度(例如在45℃与60℃之间)来实现。这种第三PCR引物仍能以其3’区段与其模板结合，并引发引物延伸反应。例如，这可以实现，从而使可以与对照寡核苷酸互补地结合的第三PCR引物的3’区段包含长度为9-30个核苷酸(更好地为12-20个核苷酸，尤其为12-16个核苷酸)的区域。第三PCR引物的所述3’区段可包含与对照寡核苷酸的相应位置的一个或多个错配，从而使结合强度持续降低。
与第三PCR引物基本互补的对照寡核苷酸的序列区段被称为对照寡核苷酸的第四区域。对照寡核苷酸的所述第四区域可包含第二区域和/或第三区域的序列区段。
对照寡核苷酸的第四区域包含长度为9-30个核苷酸(更好地为12-20个核苷酸，尤其为12-16个核苷酸)的区域。对照寡核苷酸的第四区域可包含与第三PCR引物的3’区段的一个或多个错配。特别地，所述第四区域包含核苷酸修饰，所述核苷酸修饰可防止第一和/或第二扩增***的聚合酶通过使用对照寡核苷酸作为模板来延伸第三PCR引物。已经针对第一引物与对照寡核苷酸的组合描述了此类修饰。例如，它们包括具有2'-O-烷基修饰的序列区段，其中所述区段的长度可以为6-30个修饰，并且所述对照寡核苷酸的与所述第三PCR引物的3’末端核苷酸互补的核苷酸本身尤其包含这种修饰，且还在两侧侧接有至少三个具有此类修饰的核苷酸。这确保了不会将第三引物和第四引物的对照寡核苷酸以及第二扩增***的聚合酶用作模板。
具有限定长度的第一和第二引物延伸产物的生成可以在使用对照寡核苷酸分离所述两种产物中起作用。因此，有利的是防止在第一扩增反应期间由第二扩增***的第三或第四引物作为模板所发生的(分别为第一和第二引物延伸产物的)3’端可能的过早延伸。
可通过以下不同的方式使用第四PCR引物作为模板来减少或预防第一引物延伸产物的3’端的可能不希望有的过度延伸：在某些实施方式中，这是通过第四PCR引物实现的，当该第四PCR引物与第一引物延伸产物的3’区段结合时，不能与所述合成的第一引物延伸产物的3’末端核苷酸形成完全匹配的互补式结合。这可防止或至少减少第一引物延伸产物的3’末端核苷酸的过度延伸。
在某些实施方式中，这是通过以下事实实现的，即所述第四PCR引物当与第一引物延伸产物的3’区段结合时，不能与所述合成的第一引物延伸产物的至少一个末端核苷酸形成完全匹配的互补式结合。所产生的至少一个错配位置尤其相对于第一引物延伸产物的末端核苷酸位于-1至-5的位置。
可通过以下不同的方式使用第三PCR引物作为模板来减少或预防第二引物延伸产物的3’端的可能不希望有的过度延伸：在某些实施方式中，这是通过以下事实实现的，即所述第三PCR引物当与第二寡核苷酸延伸产物的3’区段结合时，不能与所述合成的第一引物延伸产物的3’末端核苷酸形成完全匹配的互补式结合。这可防止或至少减少第二引物延伸产物的3’末端核苷酸的过度延伸。
在某些实施方式中，这是通过第三PCR引物实现的，当该第三PCR引物与第二引物延伸产物的3’区段结合时，不能与所述合成的第二引物延伸产物的至少一个末端核苷酸形成完全匹配的互补式结合。所产生的至少一个错配位置尤其相对于第二引物延伸产物的末端核苷酸位于-1至-5的位置。
第一扩增***的组分在第二扩增期间的存在被认为如下：
一方面，第一扩增***的组分的作用可通过其在第二扩增之前的稀释来降低。另一方面，在第二扩增期间，各成员不应作为引物延伸的非特异性模板出现。因此，应检查第一和第二扩增***的引物是否存在自互补结构，以避免形成引物二聚体。
在一具体实施方式中，第二扩增是在第一扩增***的对照寡核苷酸存在的条件下进行的。因此，必须调整对照寡核苷酸、第二组引物和反应条件的设计，以使对照寡核苷酸的存在不会明显干扰第二扩增反应。
首先，第二扩增***的引物与聚合酶的对照寡核苷酸均不应用作模板。这对于第三寡核苷酸引物尤其重要，因为它包含可以与第四区域中的对照寡核苷酸互补地结合的序列区段。第四区域中的对照寡核苷酸的结构尤其包含可防止潜在的引物延伸的修饰。例如，几个2’-O-烷基修饰可介导这种合成阻断效应。
对照寡核苷酸可以在第二扩增期间附着在第三引物延伸产物上，从而与第三引物延伸产物形成互补链。在某些情况下，这种双链片段可阻止聚合酶从第四PCR引物开始完全合成互补链，并且可阻止聚合酶复制第三引物延伸产物的5’区段。因此，聚合酶和反应条件的选择应使对照寡核苷酸的结合不会阻止第四引物延伸产物的合成。
例如，可以与对照寡核苷酸互补地结合的第三引物延伸产物的区段的长度是通过第三引物的定位来确定的。特别地，第三引物的定位方式使得预期的第三引物延伸产物与对照寡核苷酸的所得完全互补部分的长度尤其在以下范围内：从约15至约60个核苷酸，或从约20至约40个核苷酸，尤其从约20至约30个核苷酸。
在某些实施方式中，尤其在第二扩增反应中选择具有链置换活性的耐热聚合酶，例如可使用诸如Vent Exo minus聚合酶或Pyrophage聚合酶之类的耐热聚合酶。这允许在第二扩增期间将对照寡核苷酸与第三引物延伸产物分离，并且可全长合成第四引物延伸产物。
在某些实施方式中，尤其在第二扩增反应中选择可通过聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性来切割对照寡核苷酸的聚合酶，其中同时进行引物延伸(参见上文)。使用了一种对照寡核苷酸，该对照寡核苷酸至少可以在其5’区段被5’-3’核酸外切酶切割。降解逐步导致与第三引物延伸产物杂交的对照寡核苷酸的缩短，这在适当的反应条件下(例如温度约65℃至75℃)会导致该结合的不稳定，并最终分开与第三引物延伸产物的结合。因此，可全长合成第四引物延伸产物。
在某些实施方式中，选择对照寡核苷酸的浓度和第二引物组的第四引物的浓度，使得在选择的反应条件下，引物结合和引物延伸比对照寡核苷酸与第三引物延伸产物的结合发生得更快。例如，使用的对照寡核苷酸的浓度为0.01-0.3μmol/l。同时，使用的第四寡核苷酸引物的浓度为从约0.5μmol/l至2μmol/l。尤其在第二扩增反应中使用具有高度处理能力的聚合酶(例如Phusion聚合酶)。引物的结合及其延伸通常比对照寡核苷酸的结合更快，因此引物延伸反应具有动力学优势。
在某些实施方式中，引物延伸反应在第二扩增反应中在两个或两个以上的温度下进行。首先，通常在较低温度下，例如在45℃至65℃的温度范围内，第四引物与其在第三引物延伸产物的3’区段中的互补区段发生互补地结合以及通过聚合酶发生初始延伸。这生成了部分延伸的引物延伸产物，其与第三引物延伸产物足够稳定，从而在升高至第二个温度范围(例如约70℃至约80℃)后，可通过聚合酶来延伸所述部分延伸的第四引物延伸产物。在所述温度下，对照寡核苷酸可自发地从其与第三引物延伸产物的结合中解离出来，从而使聚合酶可继续合成第四引物延伸产物，直到(并包括)第三引物延伸产物的5’区段被所述聚合酶复制时为止。尤其在第二扩增反应中使用具有高度处理能力的聚合酶(例如phusion聚合酶)。
例如，当第一反应批次的划分不实际或技术上非常复杂时(例如在“微滴或纳米滴反应”(也称为数字PCR)中)，尤其适合采用以“均相形式”处理反应混合物的组成的方法。
还可以将其他成员添加到扩增中，例如包含适于形成产物的特异性结合和/或也可作为固定引物存在的寡核苷酸的固相，从而可进行固相PCR，其中引物延伸产物固定在所述固相上。可以在第一扩增之前、之中或之后与包含特异性寡核苷酸的固相接触。
在第一扩增反应开始之前，可以将反应批料分成大量的反应体积(分区)，从而将反应批料的扩增同时分成约100个或1000个或更多个等体积的分区。所述分区可以以液滴的形式(例如作为乳剂)发生。扩增可以在所述多个液滴中并行进行(例如以数字PCR的方式进行)。
扩增反应的顺序(首先是序列特异性扩增，然后才是PCR)起着重要作用。使用对照寡核苷酸的序列特异性扩增(第一扩增)尤其是在PCR扩增之前进行的。这是为了避免在第一扩增之前在靶序列和副反应中出现基于PCR的失真。因此，基于PCR的扩增仅作为第二步骤进行。
因此，在一具体实施方式中，未将通过PCR或任何其他扩增方法生成的DNA片段用作第一扩增反应的起始核酸链。
在下文中示意性地描述了第一扩增方法(第一分扩增)以及第一扩增***的所需组分，随后描述了第二扩增方法(第二分扩增)以及第二扩增***的组分，然后描述了第一和第二扩增方法的组合，并给出了有利的实施方式。在第一扩增之后实施第二扩增程序(也称为PCR)。
特别地，第一扩增以指数扩增的方式进行，其中两个引物的新合成产物(引物延伸产物)用作进一步合成步骤的模板。因此，所述引物序列被至少部分地复制，从而形成互补的引物结合位点，这些引物结合位点在合成之后随即作为双链的序列区段存在。在第一扩增方法中，两条链的合成步骤和新合成序列区段的双链打开步骤是交替进行的。合成后充分的双链分离是进一步合成的重要前提。总的来说，合成步骤和双链分离步骤的这种交替可导致指数扩增。
在本发明所述的第一扩增方法中，扩增(包含靶序列的核酸链的扩增)的主要产物的双链打开尤其是通过被称为对照寡核苷酸的寡核苷酸来进行的。对照寡核苷酸尤其包含对应于靶序列的序列区段。
详细地，本发明所述的链分离是通过使用具有各自预定序列的对照寡核苷酸来实现的，该对照寡核苷酸尤其是通过序列依赖性核酸介导的链分离来分离由两种特异性引物延伸产物组成的新合成的双链。引物延伸产物的所得单链区段包含靶序列以及相应的引物结合位点，这些引物结合位点可用作其他寡核苷酸引物的结合位点，从而实现待扩增核酸链的指数扩增。基本上，引物延伸反应和链置换反应优选同时进行。扩增尤其是发生在不允许两种特异性合成引物延伸产物自发分离的反应条件下。
包含靶序列的核酸链的特异性指数第一扩增包括重复合成步骤和双链打开步骤(引物结合位点的激活步骤)，这些步骤是扩增核酸链的强制性前提。
合成双链的打开被作为一反应步骤来实施，该步骤将受到对照寡核苷酸的序列特异性影响。所述打开可完全完成，直到两个互补引物延伸产物发生解离，或者也可部分完成。
根据本发明，对照寡核苷酸包含可与靶序列相互作用的序列区段以及可分别引起、允许或促进所述相互作用的其他序列区段。在与对照寡核苷酸相互作用的过程中，合成的引物延伸产物的双链部分通过序列特异性链置换被转变为单链形式。所述过程是序列依赖性的：只有当合成的双链的序列与对照寡核苷酸的相应序列具有一定量的互补性时，才能打开足够的双链，从而使对继续合成而言必不可少的序列区段(例如引物结合位点)被转变成对应于“活性状态”的单链形式。因此，对照寡核苷酸特异性地“激活”了包含靶序列的新合成的引物延伸产物，以用于进一步的合成步骤。
相反，不包含靶序列的序列区段不会被转变成单链状态，而是保持为对应于“非活性”状态的双链。这种双链中潜在的引物结合位点处于不利地位或完全无法与新引物相互作用，因此通常不会在这种“非激活”链上实施进一步的合成步骤。在合成步骤之后所述合成核酸链的缺乏或激活(即转变成单链状态)减少导致以下事实：在随后的合成步骤中，只有更少量的引物能够成功地参与引物延伸反应。
由于主要产物(包含靶序列的待扩增核酸链)的指数级第一扩增，因而几个合成步骤和激活步骤(双链打开步骤)组合在一扩增方法中，并分别进行或重复进行，直到获得所需数量的特异性核酸链。
在使用第一扩增方法期间，反应条件(例如温度)的设计使得在缺少对照寡核苷酸的情况下互补引物延伸产物的自发分离不太可能或明显减慢。
因此，扩增特异性的提高是由于包含靶序列的互补引物延伸产物的分离具有序列依赖性：对照寡核苷酸由于其序列区段与引物延伸产物的给定序列区段相匹配而能够实现或有利于所述双链分离。所述匹配在每个合成循环后由对照寡核苷酸验证。因此，指数扩增的实现是由于合成过程的成功重复以及通过对照寡核苷酸而进行的序列特异性链置换，即新合成的引物延伸产物的“激活”(双链打开/双链分离/链置换过程导致相应引物结合位点的单链形式)。
因此，使用预定的对照寡核苷酸能够在指数扩增期间对各合成步骤之间的引物延伸产物的含量进行序列依赖性验证，并获得后续合成步骤的序列选择。在此，可区分由于与对照寡核苷酸的成功的相互作用而新合成的特异性引物延伸产物的“活性”单链状态与由于与对照寡核苷酸的欠缺和/或不足以及/或者减少和/或减慢的相互作用而新合成的非特异性引物延伸产物的“非活性”双链状态之间的差别。
指数扩增产生以下效果：
在非变性条件下，特异性合成链的分离是在对照寡核苷酸的配合下进行的。
包含靶序列的核酸链的指数扩增是序列控制的(主反应)。所述序列控制在每个合成步骤之后进行，并且包括位于引物之间且包含靶序列的序列区段。在每个合成步骤之后成功验证合成结果会导致两种特异性引物延伸产物的分离，这是进一步特异性合成步骤的前提。
在第一扩增期间，基本上不能排除最初生成的非特异性引物延伸产物(副产物)。由于模板依赖性，这种非特异性引物延伸产物通常在合成后立即以双链形式存在。然而，与对照寡核苷酸的相互作用要么完全失败，要么受到限制，因此在主反应中链分离不存在或减慢。所以，没有错误的序列信息从一合成循环转移到下一合成循环。
因此，通过选择反应条件和设计对照寡核苷酸，有可能在扩增方法期间特异性地影响单个合成步骤之间正确核酸链模板的再生功效。通常，合成产物的分离和正确模板从一合成步骤到下一步骤的再生越成功，合成序列与对照寡核苷酸的给定序列之间的一致程度就越高。另一方面，副产物中的序列差异导致模板链的再生不足，从而导致在随后的每个循环中合成引发的减速和收率的降低。副产物的整个指数扩增要么进行得更慢，要么根本未发生以及/或者保持在无法检出的水平。
因此，该方法能够实时(即无需终止反应)验证合成的序列，因此代表了发展均相测定的潜力，其中所有分析组分在反应开始时就已存在于反应混合物甲。
作为第一分扩增的结果，提供了足够数量的高度特异性的扩增片段，其可用作第二分扩增(PCR)的模板。
在足够的反应时间或循环次数之后，终止第一扩增方法或改变反应条件，以便可开始实施第二扩增方法(PCR)。在第二扩增方法中，使用在第一扩增方法中生成的核酸链和至少一种其他PCR特异性组分(例如寡核苷酸引物和/或PCR聚合酶)来扩增靶序列。由于在第二扩增开始时特异性核酸链的数量已足够多，因此PCR过程需要较少的循环，直到获得所需的产物总量。这样生成的PCR产物总体上误差较少。
与常规PCR方法相比，通过在扩增开始时顺序地切换高特异性的第一扩增方法，然后才进行PCR，可提高生成的PCR产物的总体特异性，而常规PCR方法从一开始就在PCR条件下进行。
特别地，两种扩增方法的组分在扩增程序开始时就已经可用。
在某些实施方式中，第一扩增***的组分不同于第二扩增***(PCR)的组分。
在某些实施方式中，第一扩增***的组分不同于第二扩增***的组分，并且在第一扩增方法的反应条件下，(第二扩增***的)PCR组分至少部分地呈非活性形式(例如作为热启动聚合酶)。因此，从第一扩增变换到第二扩增需要附加的PCR组分(例如聚合酶)激活步骤。
在某些实施方式中，在完成第一扩增之后将第一扩增***的聚合酶灭活，从而在第二扩增(PCR)中使用不同的聚合酶。
在某些实施方式中，第二扩增***还部分地使用了第一扩增***的组分，其中使用了至少一种另外的PCR特异性组分(例如另外的寡核苷酸引物或聚合酶)，其非第一***的一部分。
本发明描述了这两种方法和寡核苷酸引物排列的一些实施方式，其中所述寡核苷酸引物排列对于实施这两种扩增方法都是有利的。通过将第一和第二扩增***的各成员适当地布置在包含靶序列的核酸链上，可进行具有更高总体特异性的均相测定。
术语和定义
除非另有说明，否则本文中使用的所有科技术语均具有与普通专业人员通常理解的相同含义。分子生物学或生化方法采用标准技术(see e.g.Sambrook et al，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2d ed(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.and Ausubel et al.，Short Protocols in MolecularBiology(1999)4th Ed，John Wiley&Sons，Inc.)。
如果说明书和序列表中所示的序列彼此不同，则在有疑问的情况下可使用说明书中所示的序列。
在本发明的上下文中所使用的术语具有以下含义：
如本文关于引物、对照寡核苷酸、探针、待扩增核酸链所用的那样，术语“寡核苷酸”被定义为包含两个或更多个(优选地三个以上)脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸和/或核苷酸修饰以及/或者非核苷酸修饰的分子。其长度例如为包括3-300个核苷酸单位或其类似物(尤其是5-200个核苷酸单位或其类似物)的区域。它的确切大小取决于许多因素，而这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。
如本文所用，术语“引物”涉及寡核苷酸，而不管其是自然生成的(例如在纯化的限制性切割中)，还是人工合成的。如果引物是在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)存在的条件下)使用的，则该引物能够在合适的温度和合适的pH值下用作合成的起始点。优选地，所述引物是单链的，以在扩增中具有最大功效。引物必须足够长，以便在诱导剂存在的条件下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括反应温度和引物来源以及方法的应用。例如，根据靶序列的复杂性，在诊断应用中寡核苷酸引物的长度为5-100个核苷酸，优选为6-40个核苷酸，尤其优选为7-30个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的反应温度来实现其引物功能，以便与模板形成足够稳定的复合体，或者需要更高浓度的其他反应组分(例如DNA聚合酶)，从而可充分延伸所形成的引物模板复合体。
选择此处使用的引物，使其与每个特异性待扩增序列的各种链“基本”互补。这意味着所述引物必须具有足够的互补性，以与其各个链杂交并引发引物延伸反应。因此，例如，引物序列不必反映靶序列的确切序列。例如，可以将非互补核苷酸片段连接到引物的5’端，其中剩余的引物序列与所述链互补。在另一实施方式中，可以将单个非互补碱基或更长的非互补序列***到引物中，条件是所述引物序列与待扩增链序列具有足够大的互补性，以便与其杂交，从而生成能够用于合成延伸产物的引物模板复合体。
在酶促合成与模板互补的链的过程中，生成与模板链完全互补的引物延伸产物。
Tm-解链温度
互补的或部分互补的双链的解链温度通常被理解为反应温度的测量值，在该温度下，约一半的链以双链形式存在，而另一半以单链形式存在。***(链的结合和解离)处于平衡状态。
由于许多因素会影响双链的Tm(例如序列长度、序列的CG水平、缓冲条件、二价金属阳离子的浓度等)，因此要在与预期扩增反应相同的条件下测定待扩增核酸的Tm。
由于可测量的解链温度取决于多个反应参数，例如反应物的各自缓冲条件和各自浓度，因此解链温度是指在与指数扩增相同的反应缓冲液中测得的温度值，其中双链的两互补组分的浓度为约0.1μmol/l至约10μmol/l，优选为约0.3μmol/l至约3μmol/l，优选为约1μmol/l。各解链温度值是与相应双链的稳定性相关的指导值。
脱氧核糖核苷三磷酸
将脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和TTP(或dUTP，或dUTP/TTP混合物)以适当的数量添加到合成混合物中。在某些实施方式中，除了dNTP之外，还可将至少一种其他类型的dNTP类似物添加到合成混合物中。在某些实施方式中，所述dNTP类似物例如包含可构建到核酸链中的特征标记(例如生物素或荧光染料)。在另一实施方式中，所述dNTP类似物包含核苷酸的糖磷酸比例的至少一种修饰，例如α-硫代磷酸-2’-脱氧核糖核苷三磷酸盐(或对核酸链赋予核酸酶抗性的其他修饰)、2’，3’-二脱氧核糖核苷三磷酸盐、无环核苷三磷酸酯(或导致合成终止的其他修饰)。在某些实施方式中，所述dNTP类似物包含核碱基的至少一种修饰，例如异胞嘧啶、异鸟苷(或扩展遗传字母的核碱基的其他修饰)、2-氨基腺苷、2-硫尿苷、肌苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶、5-丙基尿苷、5-丙基胞嘧啶(或核碱基的其他修饰，所述核碱基与天然核碱基相比可通过聚合酶来构建，并可改变链的稳定性)。在某些实施方式中，dNTP类似物既包含核碱基的修饰，又包含糖磷酸比例的修饰。在某些实施方式中，将至少一种其他类型的dNTP类似物而非至少一种天然的dNTP底物添加到合成混合物中。
核酸合成诱导剂可以是酶或***，其作用是导致引物延伸产物的合成。
用于所述目的的第一扩增的适宜酶包括但不限于例如DNA聚合酶，例如Bst聚合酶及其修饰、Vent聚合酶等，尤其是能够以正确的方式并入核苷酸的耐热DNA聚合酶，其中形成与每个合成的核酸链互补的引物延伸产物。通常，合成在每个引物的3’端开始，然后沿着模板链向5’方向进行，直到合成完成或中断。
在第一扩增中尤其使用能够进行链置换的模板依赖性DNA聚合酶。其中包括大片段的Bst聚合酶或其修饰(例如Bst 2.0 DNA聚合酶)、Klenow片段、Vent exo minus聚合酶、Deepvent exo minus DNA聚合酶、大片段的Bsu DNA聚合酶以及大片段的Bsm DNA聚合酶。
在某些实施方式中，尤其使用不显示出5’-3’核酸外切酶活性或5’-3’FEN活性的聚合酶。
对于第二扩增，尤其使用耐热的模板依赖性DNA聚合酶，例如Taq聚合酶或其修饰(例如Ampli-Taq)，或具有校对功能的聚合酶(Pfu及其修饰或Vent聚合酶及其修饰)。可使用已与另一蛋白质融合以提高其处理能力的聚合酶，例如Phusion聚合酶。市面上有大量的聚合酶。
也可使用聚合酶的组合，例如OneTaq聚合酶(NEB)是Taq聚合酶与vent聚合酶的组合。聚合酶的这种组合有助于提高第二扩增中的合成精度。
在某些实施方式中，使用至少两种不同的聚合酶，例如能够进行链置换的聚合酶和具有3’-5’校对活性的聚合酶。
在具体实施方式中，使用具有热启动功能的聚合酶，该聚合酶只有在达到一定温度时才能发挥其功能。
第一扩增***包括进行特异性的第一扩增所必需的组分：第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物、对照寡核苷酸以及第一聚合酶。
此外，还可包括核苷酸混合物和缓冲***，只要它们是进行特异性的第一扩增所必需的(例如用于第一聚合酶的特异性缓冲***)。
第一扩增***在第一扩增(也称为第一分扩增)期间支持第一扩增片段1.1(或第一扩增产物1.1，也称为待扩增的第一扩增的核酸链)的合成。
第二扩增***包括进行特异性的第二扩增所必需的组分：第三寡核苷酸引物、第四寡核苷酸引物以及第二聚合酶。
此外，还可包括核苷酸混合物和缓冲***，只要它们是进行特异性的第二扩增所必需的(例如用于第二聚合酶的特异性缓冲***)。
第二扩增***在第二扩增(也称为第二分扩增)期间支持第二扩增片段2.1(或第二扩增产物2.1)的合成。
第一寡核苷酸引物(第一扩增***的组分)：
第一寡核苷酸引物(图12-16)包含第一引物区域和第二区域。第一引物区域可以与待扩增核酸内的基本互补序列或其等同物结合，并引发引物延伸反应。
第二区域包含多核苷酸尾巴，该多核苷酸尾巴能够与对照寡核苷酸结合，从而使对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的其他部分之间足够接近，以通过对照寡核苷酸引发链置换。第一寡核苷酸引物的第二区域还包含至少一个修饰(核苷酸修饰或非核苷酸修饰)，其通过抑制聚合酶依赖性合成的持续进行来防止聚合酶复制多核苷酸尾巴。所述修饰例如位于第一寡核苷酸引物的第一与第二区域之间的过渡处。因此，寡核苷酸引物的第一引物区域可被聚合酶复制，从而聚合酶可在第二引物延伸产物的合成期间生成所述区域的互补序列(详见下文)。第一寡核苷酸引物的第二区域的多核苷酸尾巴不被复制，尤其是不被聚合酶复制。在某些实施方式中，这是通过第二区段中的修饰来实现的，该修饰在多核苷酸尾巴之前终止聚合酶。在某些实施方式中，这是通过第二区域中的核苷酸修饰实现的，其中整个多核苷酸尾巴基本上由这种核苷酸修饰组成，因此对于聚合酶是不可复制的。
在某些实施方式中，每个第一寡核苷酸引物对一个待扩增核酸而言是特异性的。
在某些实施方式中，每个第一寡核苷酸引物对至少两个待扩增核酸而言是特异性的，其中每个待扩增核酸包含基本不同的序列。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物用特征标记来标记，所述特征标记例如有荧光染料(例如TAMRA、荧光素、Cy3、Cy5)或亲和标记(例如生物素、地高辛配基)或附加序列片段，例如用于与特异性寡核苷酸探针结合以进行检测或固定或条形码标记。
第一寡核苷酸引物尤其在第一扩增中用作引物。
在某些实施方式中，它可在第一和第二扩增中用作引物。
第二寡核苷酸引物(第一扩增***的组分)：
一种寡核苷酸，其具有3’区段，能够与待扩增核酸或其等同物中的基本互补序列结合，并引发特异性的第二引物延伸反应。因此，所述第二寡核苷酸引物能够与第一寡核苷酸引物的第一特异性引物延伸产物的3’区段结合，并引发第二引物延伸产物的聚合酶依赖性合成。
第二寡核苷酸引物的长度可以为15-100个核苷酸，尤其为20-60个核苷酸，尤其为30-50个核苷酸。
在某些实施方式中，每个第二寡核苷酸引物分别对一个待扩增核酸是特异性的。
在某些实施方式中，每个第二寡核苷酸引物对至少两个待扩增核酸是特异性的，其中每个待扩增核酸包含不同的序列。
在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物用特征标记来标记，所述特征标记例如有荧光染料(例如TAMRA、荧光素、Cy3、Cy5)或亲和标记(例如生物素、地高辛配基)或附加序列片段，例如用于与特异性寡核苷酸探针结合以进行检测或固定或条形码标记。
第二寡核苷酸引物尤其在第一扩增中用作引物。在某些实施方式中，它可在第一和第二扩增中用作引物。
引物延伸产物
引物延伸产物是通过寡核苷酸引物的酶促(聚合酶依赖性)延伸而形成的，这是聚合酶催化的模板依赖性合成的结果。
引物延伸产物包括寡核苷酸引物在其5’区段中的序列和已经由聚合酶以模板依赖性形式合成的延伸产物的序列。通过聚合酶合成的延伸产物与其合成所在的模板链互补。
第一扩增的特异性引物延伸产物(例如P1.1-Ext和P2.1-Ext)(主产物)包含待扩增核酸链的序列。这是预期引物延伸反应的特异性合成或正确进行的结果，其中待特异性扩增核酸链用作模板。在一具体实施方式中，合成的引物延伸产物的序列与待扩增核酸的预期序列完全匹配。在另一实施方式中，可耐受所得序列与理论期望序列之间的偏差。在某些实施方式中，由扩增而获得的序列与理论上预期的待扩增核酸的序列之间的一致程度例如为90％至100％，尤其在95％以上，理想地在98％以上(以合成碱基的比例来衡量)。
特异性引物延伸产物的延伸产物的长度可以为10-300个核苷酸，尤其为10-180个核苷酸，尤其为20-120个核苷酸，尤其为30-80个核苷酸。
例如，在第二扩增中，第三引物和第四引物的特异性模板依赖性引物延伸反应的产物代表主要产物和各中间产物：部分的第三引物延伸产物(P3.1-Ext part 1，图15-18)，或完整的引物延伸产物(P3.1-Ext，图15-18)，部分的第四引物延伸产物(P4.1-Ext part1，图15-18)，或完整的引物延伸产物(P4.1-Ext，图15-18)。在某些实施方式中，所述产物包含靶序列或其等同物。在另一实施方式中，第二引物延伸产物包含靶序列，并且第一引物延伸产物包含所述靶序列的等同物，即互补链。在某些实施方式中，第四引物延伸产物包含靶序列，并且第三引物延伸产物包含所述靶序列的等同物，即互补链。在某些实施方式中，第四引物延伸产物包含靶序列的一部分，并且第三引物延伸产物包含所述靶序列的所述部分的等同物，即互补链。
第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和第二引物延伸产物(P2.1-Ext)一起代表第一扩增的第一扩增片段1.1(也称为扩增产物1.1)(图1)。
第三引物延伸产物(P3.1-Ext)和第四引物延伸产物(P4.1-Ext)一起代表第二扩增的第二扩增片段2.1(也称为扩增产物21)(图1)。
第三引物延伸产物(P3.1-Ext)也可称为完整的第三引物延伸产物。所述产物是以第四引物延伸产物(P4.1-Ext)为模板获得的。第四引物延伸产物(P4.1-Ext)也可称为完整的第四引物延伸产物。所述产物是以第三引物延伸产物(P3.1-Ext)为模板获得的(图15-18)。
相反，部分第三引物延伸产物(P3.1-Ext-Part 1)是以第二引物延伸产物(P2.1-Ext)为模板生成的中间产物。部分第四引物延伸产物(P4.1-Ext-Part 1)是以第一引物延伸产物(P1.1-Ext)为模板生成的中间产物(图15-18)。
例如，非特异性引物延伸产物(副产物)包含由非特异性或不正确或不期望的引物延伸反应所生成的序列。例如，这些产物包括由错误的引发事件(误引发)或其他副反应导致的引物延伸产物，所述副反应包括聚合酶依赖性序列变化，例如碱基取代、缺失等。非特异性引物延伸产物的序列偏离程度通常超过对照寡核苷酸成功地从其模板中置换出这种双链副产物的能力，使得此类副产物的扩增较慢或完全不存在。对偏差的可接受程度或耐受度例如取决于反应温度以及序列偏差的类型和方式。非特异性引物延伸产物的实施例是与待扩增核酸不对应的引物二聚体或序列变体，例如不包含靶序列的序列。
对扩增特异性充分程度的评估通常与手头的任务有关。在许多扩增方法中，只要能获得预期的结果，就可耐受一定程度的扩增反应的非特异性。在一具体实施方式中，以新合成链的总量计，待扩增核酸链在反应总结果中的比例高于1％，尤其高于10％，尤其高于30％。
待扩增核酸(第一扩增的预期结果)
待扩增核酸代表即将在第一扩增中由引物和对照寡核苷酸通过聚合酶来序列特异性地或至少主要序列特异性地扩增的核酸链。待扩增核酸包含第一扩增片段1.1(也称为第一扩增产物1.1)的两条链(图1)。它可用作起始核酸链2.1，其中至少一条链可用于引发第二扩增。
待扩增核酸的长度可以为20-300个核苷酸，尤其为30-200个核苷酸，尤其为40-150个核苷酸，尤其为50-100个核苷酸。
待扩增核酸链可包含一个或多个靶序列或其等同物。此外，待扩增核酸可包含与靶序列基本互补的序列，该序列在扩增反应中以与靶序列相似的效率进行扩增且包含靶序列或其区段。除靶序列外，待扩增核酸可包含其他序列区段，例如引物序列、具有引物结合位点的序列、以及/或者用于与检测探针结合的序列区段、以及/或者用于通过条形码序列对链进行序列编码的序列区段、以及/或者用于与固相结合的序列区段。寡核苷酸引物序列或其序列部分以及引物结合位点或其序列部分例如可属于靶序列的序列区段。
在某些实施方式中，待扩增核酸对应于靶序列。
在另一实施方式中，靶序列形成第一扩增的待扩增核酸链的序列的一部分。这种靶序列可侧接有其他序列的3’侧和/或5’侧。所述其他序列例如可包含寡核苷酸引物或其部分的结合位点、引物序列或其部分、用于检测探针的结合位点、用于与固相互补地结合的衔接子序列(例如在微阵列或基于微珠的分析中)以及/或者用于序列的数字签名的条形码序列。
为了开始扩增，必须在反应开始时将核酸链添加到反应混合物中，其在待扩增核酸链的合成中用作初始模板。所述核酸链称为起始核酸链。所述起始核酸链限定了各序列成员的排列，这对于待扩增核酸链的形成/合成/指数扩增是非常重要的。
在一具体实施方式中，在开始时提供给扩增反应或添加到反应混合物中的初始模板(起始核酸链)对应于待扩增核酸链的序列组成。
在扩增反应的初始阶段及其后续过程中，各引物与起始核酸链中的相应结合位点结合，并引发特异性引物延伸产物的合成。这种特异性引物延伸产物在扩增过程中呈指数级积累，并在指数扩增中越来越多地起到合成互补引物延伸产物时的模板作用。
因此，通过指数扩增中重复的模板依赖性合成过程形成待扩增核酸链。
在扩增反应即将结束时，反应的主要产物(待扩增核酸)可以主要是单链的，也可以主要形成互补的双链。这例如可通过寡核苷酸引物的相对浓度和相应的反应条件来确定。
待扩增核酸的等同物包括具有基本相同信息内容的核酸。例如，待扩增核酸的互补链具有相同的信息内容，因而可称为等同物。
靶序列
在某些实施方式中，靶序列是待扩增核酸链的区段，该区段可用作所述待扩增核酸的特征序列。所述靶序列可作为另一核酸存在与否的标记。因此，所述其他核酸用作靶序列的来源，并且例如可以是基因组DNA或RNA或者基因组DNA或RNA的部分(例如mRNA)，或者生物体基因组DNA或RNA的等同物(例如cDNA，修饰的RNA(如rRNA、tRNA、microRNA)，等等)，或包含生物体基因组DNA或RNA的明确变化，例如突变(例如缺失、***、取代、添加、序列增生(例如在微卫星不稳定性的情况下的重复增生))、剪接变体、重排变体(例如T细胞受体变体)等。各靶序列可代表表型性状(例如抗生素耐药性)，或具有预后信息，因此对于诊断分析/测试很有意义。作为靶序列的来源/起点，这种核酸可包含例如作为其链的序列成员的靶序列。因此，靶序列可用作另一核酸的特定序列内容的特征标记。
靶序列可以是单链的或双链的。它可以与第一扩增的待扩增核酸基本相同，也可以仅代表待扩增核酸的一部分。
靶序列的等同物包括具有基本相同信息内容的核酸。例如，靶序列的互补链具有相同的信息内容，可被称为等同物；序列的RNA和DNA变体也是等同信息内容的例子。
在扩增反应之前的材料制备过程中，这种靶序列可以从其原始序列环境中分离出来，并为扩增反应备用。
在一具体实施方式中，待扩增核酸包含靶序列。在某些实施方式中，靶序列对应于待扩增核酸。在另一具体实施方式中，起始核酸链1.1包含靶序列。在某些实施方式中，靶序列对应于起始核酸链1.1。
在第一扩增期间，靶序列可以全部或部分地成为第一扩增片段1.1的一部分。例如，第二引物延伸产物包含靶序列或其部分，因此第二引物延伸产物包含与所述靶序列互补的链。该链具有等同的信息内容。
在第二扩增期间，靶序列可以全部或部分地成为第二扩增片段2.1的一部分。例如，第四引物延伸产物包含靶序列或其部分，因此第三引物延伸产物包含与所述靶序列互补的链。该链具有等同的信息内容。
起始核酸链
为了开始第一扩增，必须在反应开始时将核酸链添加到反应混合物中，其在待扩增核酸链的合成中用作初始模板(图1)。所述核酸链被称为第一扩增的起始核酸链(起始核酸链1.1)。所述起始核酸链明确了各序列成员的排列，这对于待扩增核酸链的形成/合成/指数扩增是非常重要的。
这种起始核酸链在反应开始时可以是单链的或双链的。如果起始核酸链的互补链彼此分开，则这些链可用作合成特异性互补引物延伸产物的模板，而不管该核酸最初是双链的还是单链的。
在某些实施方式中，起始核酸链1.1包含靶序列。
起始核酸链还包含至少一个主要为单链的序列区段，且扩增***的至少一个引物能够以其3’区段与所述序列区段主要互补地结合。因此，当与起始核酸链杂交时，所用的聚合酶可通过引入dNTP来模板特异性地延伸这种引物。
起始核酸链还可包含不是靶序列但可以与寡核苷酸引物结合的区段。
为了开始第二扩增，必须在第二扩增反应开始时使核酸链存在于反应混合物中或添加到第二扩增反应中，作为合成第二扩增片段的初始模板(图1)。
所述起始核酸链2.1明确了各序列成员的排列，这对于待扩增核酸链的形成/合成/指数扩增是非常重要的。
在此，在第一扩增期间生成的第一扩增片段1.1(也称为待扩增核酸链)用作第二扩增的起始核酸链2.1。因此，所述起始核酸链2.1含有在第一扩增中生成的第一引物延伸产物或由其组成。在某些实施方式中，起始核酸链2.1包含靶序列。
PCR扩增(也称为第二扩增)
PCR是一种聚合酶链式反应，通常用于扩增DNA片段。PCR反应的许多变体是本领域已知的。其中，等位基因特异性PCR、基因分型PCR、不对称PCR、固相PCR、数字PCR(分区/微滴PCR)、多重PCR、使用探针或插层染料(例如分子信标或5'-3’核酸外切酶或带有FRET对的两个寡核苷酸探针)进行的实时PCR、使用阻断探针进行的PCR钳制、定量PCR、嵌套PCR等。技术人员可参考描述各PCR方法的大量评述。
通常，在PCR过程中扩增由寡核苷酸引物位置确定的核酸片段。通常至少使用两个温度范围：一低温范围，在该温度范围内，使引物与其主要特异性的序列区段结合，并延伸形成互补链；以及至少一温度范围，在该温度范围内，主要通过序列非选择性分离来分离链，从而使新合成的引物延伸产物与其模板分离。
已发展出许多技术来影响PCR的进程，例如热启动聚合酶、热启动寡核苷酸、可激活引物(例如通过聚合酶的3’-5’校对活性)。
PCR可通过使用PCR试管/微量滴定板在液相中进行，也可在固相中或在微流体***中或原位进行。
PCR引物对(第三和第四寡核苷酸引物)
(第二扩增的组分)
通常，PCR引物对包含两个寡核苷酸，其能够支持通过PCR方法来扩增核酸片段。
通常，PCR引物对包括第三和第四寡核苷酸引物。这种寡核苷酸引物在科学界众所周知。
为了清楚起见，PCR引物在此通常称为P3和P4(与对照物依赖性扩增P1和P2相反)。
PCR引物的许多变体为技术人员所知。通常，它们是长度为约15至约60个核苷酸的寡核苷酸，其至少在其3’区段中包含一序列，该序列能够与靶序列的互补区段结合并通过聚合酶使用所述靶序列作为模板来引发模板依赖性合成。
许多其他功能，例如染料标记(例如使用FAM、TAMRA、Cy5)或淬灭(例如BHQ1)、亲和标记(例如生物素，地高辛配基)，或者附加序列(例如用于序列条形码(使用特异性标记序列)或用于文库构建的序列)的许多其他功能是技术人员已知的。PCR引物可用于溶液中或与固相(例如微珠、微量滴定板)偶联。所述变体也为技术人员所熟知。
对照寡核苷酸：
对照寡核苷酸(图1，C1.1)是单链核酸链，其包含第一引物延伸产物的区段的预定基本互补序列，该序列是在待扩增核酸的扩增(第一扩增)期间特异性地生成的。这使得对照寡核苷酸能够基本互补地与第一寡核苷酸引物结合以及至少与第一寡核苷酸引物的特异性延伸产物的5’区段结合。在某些实施方式中，对照寡核苷酸在其内部序列区段中包含核苷酸修饰；当第一和/或第三寡核苷酸引物与对照寡核苷酸互补地结合时，所述核苷酸修饰阻止聚合酶使用对照寡核苷酸作为模板来合成互补链。在某些实施方式中，如果对照寡核苷酸完全由阻断其模板功能的修饰核苷酸组成，则是有利的。在某些实施方式中，如果对照寡核苷酸只是部分地由阻断其模板功能的修饰核苷酸组成，则是有利的。对照寡核苷酸还能够在所选择的反应条件下通过链置换将第二特异性引物延伸产物从与第一特异性引物延伸产物的结合中完全或部分地置换出来。因此，对照寡核苷酸连同其互补区域将其自身连接到第一特异性引物延伸产物上。如果对照寡核苷酸与第一特异性引物延伸产物之间的结合成功，这将导致第二特异性引物延伸产物的含3’区段的单链状态的恢复，该状态适于结合第一寡核苷酸引物，从而可发生新的引物延伸反应。在合成第二引物延伸产物期间，可通过链置换(例如通过聚合酶和/或通过第二寡核苷酸引物)使对照寡核苷酸从与第一引物延伸产物的结合中分离出来。
检测***：
检测***包括至少一个寡核苷酸探针和至少一个荧光报告剂(荧光团)。检测***应能检测第一和/或第二和/或第三和/或第四引物延伸产物(P1.1-Ext，P2.1-Ext，P3.1-Ext，P4.1-Ext)的合成。这是通过使用寡核苷酸探针完成的，这些探针能够与各引物延伸产物结合，从而产生特定信号或引起信号变化。所述变化可以是荧光强度的增大或减小。检测***还可包括附加组分。这种组分尤其包括荧光淬灭剂和/或供体荧光团。此外，检测***还可包含对照寡核苷酸。荧光报告剂、荧光淬灭剂、供体荧光团在寡核苷酸探针上或在寡核苷酸探针-对照寡核苷酸对上的布置使得能够检出与第一引物延伸产物的结合事件。
荧光报告剂
荧光团是一种当被电磁辐射激发时能够发出电磁辐射(光)(发射)的化合物或分子。荧光团发出的所述辐射(发射)可通过适当的技术手段检测为荧光信号。这种报告剂可以与寡核苷酸共价结合。已知许多可以与寡核苷酸偶联的荧光团(例如FAM、TAMRA、HEX、ROX、Cy染料、Alexa染料)。
荧光淬灭剂
淬灭剂是一种能够通过直接接触(接触淬灭)或通过能量转移(例如作为FRET)减少荧光团发射的化合物/分子。通常，必须将淬灭剂紧邻荧光团放置，以便显著减少所述信号。
对于通过淬灭剂显著减少荧光报告剂的信号而言有利的是，报告剂与淬灭剂之间的距离小于25个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
为了克服由淬灭剂引起的荧光报告剂的信号减少，必须相应地增加所述组分之间的距离。在此有利的是，报告剂与淬灭剂之间的距离增至15个核苷酸以上，尤其是增至20个核苷酸以上，尤其是增至40个核苷酸以上。在这种情况下，由核苷酸序列引起的距离一定是由于核苷酸序列的延伸所致。例如，如果形成发夹结构，则可能不再有空间距离。
特别是对于基于FRET的淬灭剂，在荧光团的发射光谱与淬灭剂的吸收光谱之间有足够的光谱重叠是有利的。因此，优选光谱重叠超过25％的荧光团-淬灭剂对(例如FAM/TAMRA)。
供体荧光团
供体荧光团是一种化合物/分子，该化合物/分子能够吸收电磁辐射并通过能量转移(例如作为FRET)将其转移到另一荧光团(受体)，其程度足以使所述荧光团被激发并因此自身产生光发射。在所述发射期间产生荧光信号。通常，供体和受体形成一荧光共振能量转移对(FRET对)。一般说来，必须将供体紧邻受体(荧光团)放置，以便在很大程度上产生所述信号。
对于由于来自供体荧光团的FRET而导致的荧光报告剂的信号产生有利的是，报告剂与供体之间的距离小于25个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
通常通过增加FRET对的两个伙伴之间的距离来消除从供体到受体的FRET效应。有利的是，报告剂与供体之间的距离增至15个核苷酸以上，尤其是增至20个核苷酸以上，尤其是增至40个核苷酸以上。
此外，在供体的发射光谱与受体的吸收光谱之间有足够的光谱重叠通常是有利的。因此，首选光谱重叠超过25％的FRET对(例如FAM/Cy3)。
根据本发明，各组分之间的空间距离尤其是由于两个组分通过可以与靶序列的特定部分杂交的核苷酸序列连接起来而引起的。
链置换：
一过程，在该过程中通过采用适当的工具，使第一双链(例如由A1和B1链组成)完全或部分地分离，并使新的第二双链同时/并行形成，其中至少一条链(A1或B1)参与所述新的第二链的形成。在此可区分两种形式的链置换。
在第一种形式的链置换中，可使用已存在的互补链形成新的第二双链，所述互补链在反应开始时通常为单链形式。在这种情况下，链置换的工具(例如具有与链A1互补的序列的预形成单链C1)作用在已形成的第一双链(A1和B1)上，并与链A1互补地结合，从而使链B1脱离与链A1的结合。如果B1的置换是完全的，则C1作用的结果是新双链(A1∶C1)和单链B1。如果B1的置换是不完全的，则结果取决于几个因素。例如，部分双链A1∶B1和A1∶C1的复合体可作为中间产物存在。
在第二种形式的链置换中，可以在同时酶促合成互补链的情况下形成新的第二双链，其中第一预形成双链的一条链用作聚合酶合成的模板。因此，链置换剂(例如具有链置换能力的聚合酶)作用于已预先形成的第一双链(A1和B1)上，并合成链A1的新互补链D1，其中链B1同时从与链A1的结合中被置换出来。
术语“核酸介导的链置换”用于描述中间步骤的总和/系列，这些中间步骤可相互平衡，并导致第一预形成双链体(由互补链B1和A1组成)的临时或永久打开以及新第二双链体(由互补链A1和C1组成)的形成，其中A1和C1彼此互补。
已知引发链置换的基本结构条件是在双链体(A1和B1的预形成第一双链体)端部与引发链置换的单链(C1)之间建立起空间接近性(其中A1和C1可形成互补链)。这种接近性尤其可通过单链突出端来实现(具有短突出端的实施例在文献中已知，被称为“toehold(粘性末端)”，参见上文文献)，所述单链突出端暂时或永久地与单链(C1)互补地结合，从而使C1和A1的互补区段足够接近，从而可引发链B1的成功置换。通常，链A1和C1的互补区段相距越近，引发核酸介导的链置换的效率就越高。
有效地继续在内部区段中进行核酸介导的链置换的另一基本结构前提是链之间(例如A1与C1之间)的高度互补性，这些链必须形成新的双链。例如，(C1中的)单核苷酸突变可导致链置换的中断(例如在分支迁移中所述)。
本发明利用互补核酸所具有的进行序列依赖性核酸介导链置换的能力。
在附图和实施例中进一步解释了本发明的具体实施方式。
具体实施方式
第一扩增的反应条件
反应条件包括缓冲条件、温度条件、反应持续时间和各反应组分的浓度。
在反应期间，特异性生成的待扩增核酸的数量以指数方式累积。可根据需要进行包括延伸产物合成的反应，以生成所需数量的特异性核酸序列。本发明所述方法尤其是连续实施的。在一优选实施方式中，扩增反应在相同的反应温度下进行，其中温度尤其为50℃至70℃。在另一实施方式中，反应温度也可以在控制下可变，使得扩增的单个步骤各自在不同的温度下进行。
指数扩增所需的试剂尤其在同一批次反应开始时就已经存在。在另一实施方式中，也可在该方法的后期添加试剂。
特别地，在反应混合物中不使用解旋酶或重组酶来分离待扩增核酸的新合成双链。
在一具体实施方式中，反应混合物不含生化赋能化合物，例如ATP。
反应开始时在一个批次中存在的待扩增核酸的数量可以为几个拷贝至几十亿个拷贝。在用于诊断的情况下，待扩增核酸链的数量可能是未知的。
在该反应中，还可能存在其他不被扩增的核酸。所述核酸可源自天然的DNA或RNA或其等同物。在某些实施方式中，必须与待扩增核酸并行扩增的对照序列存在于同一批料中。
特别地，将摩尔过量为约103∶1至约1015∶1(引物：模板比)的所用引物和对照寡核苷酸添加到反应混合物中，该反应混合物包含用于合成待扩增核酸链的模板链。
如果将本发明的方法用于诊断中，则靶核酸的数量可能是未知的，因而无法确定引物和对照寡核苷酸相对于互补链的相对量。如果待扩增序列包含在复杂的长链核酸链的混合物中，则所添加的引物的数量通常相对于互补链(模板)的数量存在摩尔过量。为了提高该方法的功效，优选大的摩尔过量。
所使用的引物1、引物2和对照寡核苷酸的浓度例如为0.01-100μmol/l，尤其为0.1-100μmol/l，尤其为0.1-50μmol/l，尤其为0.1-20μmol/l。高浓度的组分可提高扩增速率。可独立地改变各组分的各自浓度，以获得所期望的反应结果。
聚合酶的浓度为0.001-50μmol/l，优选为0.01-20μmol/l，尤其为0.1-10μmol/l。
各dNTP底物的浓度为10μmol/l至10mmol/l，尤其为50μmol/l至2mmol/l，更好地为100μmol/l至1mmol/l。dNTP的浓度会影响二价金属阳离子的浓度。可选地对此进行相应地调整。
对于二价金属阳离子，例如使用Mg2+。对于相应的阴离子Cl-，例如可使用乙酸盐、硫酸盐、谷氨酸盐等。
使二价金属阳离子的浓度范围例如与相应聚合酶的最佳范围相适应，并且为0.1-50mmol/l，更好地为0.5-20mmol/l，优选为1-15mmol/l。
通常，酶促合成在缓冲水溶液中进行。作为缓冲溶液，可使用溶解了的常规浓度的常规缓冲物质，例如Tris HCl、Tris乙酸盐、谷氨酸钾、HEPES缓冲液、谷氨酸钠。所述溶液的pH值通常为7-9.5，优选约为8-8.5。例如可根据所用聚合酶的制造商的建议来调整缓冲条件。
可以将诸如所谓的Tm抑制剂(例如DMSO、甜菜碱、TPAC)之类的其他物质添加到缓冲液中。这种物质降低了双链的解链温度(“Tm抑制剂”)，因此可以对双链的打开产生积极影响。聚合酶稳定组分(例如Tween 20或Triton 100)也可按常规量添加到缓冲液中。EDTA或EGTA可以按常规量添加到复合的重金属中。聚合酶稳定物质(例如海藻糖或PEG 6000)也可添加到反应混合物中。
特别地，反应混合物不包含链置换反应的任何抑制剂，也不包含聚合酶依赖性引物延伸的抑制剂。
在某些实施方式中，反应混合物中含有DNA结合染料，尤其是插层染料，例如EvaGreen或SybrGreen。这种染料可使得能够检出新核酸链的形成。
反应混合物也可包含例如源于原材料且不影响扩增的蛋白质或其他物质。
反应条件的具体实施方式
温度对双链的稳定性有显著影响。
在一具体实施方式中，在扩增反应期间不使用温度条件，这实质上导致了在不存在对照寡核苷酸的情况下待扩增核酸双链的分离。这是为了确保待扩增核酸链的双链分离取决于整个扩增程序期间对照寡核苷酸的存在。
在约等于待扩增核酸的测量解链温度(Tm)的温度下，待扩增核酸的两条链自发分离，从而使对照寡核苷酸对合成链的分离以及由此对扩增的序列特异性的影响是最小的或有限的。
在指数扩增(其必须具有较少的序列特异性(即较少依赖于对照寡核苷酸))的情况下，反应温度可约为待扩增核酸的解链温度(即Tm±(3-5)℃)。在这样的温度下，通常可以很好地耐受在链置换反应中对照寡核苷酸与合成的引物延伸产物之间的序列差异。
即使在约(Tm-3℃)至约(Tm-10℃)的温度范围内，合成的引物延伸产物仍会发生自发的链分离，尽管效率较低。对照寡核苷酸对待扩增核酸的序列特异性的影响高于在待扩增核酸链的解链温度(Tm)附近的温度条件下的影响。
链分离尽管是随着反应温度的降低而发生的，但主要是由于新合成的双链与对照寡核苷酸之间的相互作用。然而，在上述条件下，引物在延伸温度下生成的双链体也可自发解离，即无需由对照寡核苷酸引起的序列依赖性链置换。例如，用于减少序列特异性扩增的反应温度为约(Tm-3℃)至约(Tm-10℃)，尤其为约(Tm-5℃)至约(Tm-10℃)。在这样的温度下，在链置换反应中较难耐受对照寡核苷酸与合成的引物延伸产物之间的序列差异。
如果新合成的待扩增核酸链在反应条件下不能自发解离成单链，则主要实现了该方法的扩增的高序列特异性。在这种情况下，对照寡核苷酸的序列特异性链置换在序列特异性链分离中起决定性作用，并在很大程度上导致了扩增反应的序列特异性。如果反应温度显著低于待扩增核酸的两条链的解链温度且没有其他组分用于链分离，例如没有解旋酶或重组酶，则通常可实现这一点。例如，在序列特异性扩增中，反应温度为约(Tm-10℃)至约(Tm-50℃)，尤其为约(Tm-15℃)至约(Tm-40℃)，尤其为约(Tm-50℃)至约(Tm-30℃)。
在扩增的一具体实施方式中，最高反应温度在整个扩增反应期间不会高于待扩增核酸链的解链温度。
在扩增的某些实施方式中，反应温度可至少一次升高到高于待扩增核酸链的解链温度。例如，可以在扩增反应开始时升高温度，并导致基因组DNA的双链变性。应注意，在这样的步骤中，双链分离对对照寡核苷酸作用的依赖性被消除或至少显著降低。
扩增反应的各步骤的反应温度可以为约15℃至约85℃，更好地为约15℃至约75℃，尤其为约25℃至约70℃。
在下述实施例2、3中，使用65℃的反应温度进行扩增反应，其中待扩增核酸的Tm为约75℃至约80℃。因此，待扩增核酸的双链在反应条件下是稳定的，且扩增反应具有序列特异性。
通常，可针对每个单独的反应步骤来最佳地调整反应温度，从而在每个反应步骤中都可以达到这样的温度。因此，扩增反应包括循环性的温度的反复变化。在该方法的有利实施方式中，对几个反应步骤的反应条件进行了标准化，使得温度步骤的数量少于反应步骤的数量。在本发明的这种具体实施方式中，扩增的至少一个步骤发生在与扩增的其他步骤的反应温度不同的反应温度下。因此，反应不会等温地进行，而是反应温度循环变化。
例如，在扩增期间至少使用两个温度范围，这两个温度范围是交替实现的(各温度范围之间的温度循环变化)。在某些实施方式中，较低的温度范围例如为25℃至60℃，尤其为35℃至60℃，尤其为50℃至60℃，而较高的温度范围例如为60℃至75℃，尤其为60℃至70℃。
在某些实施方式中，较低的温度范围例如为15℃至50℃，尤其为25℃至50℃，尤其为30℃至50℃，而较高的温度范围例如为50℃至75℃，尤其为50℃至65℃。
在某些实施方式中，较低的温度范围例如为15℃至40℃，尤其为25℃至40℃，尤其为30℃至40℃，而较高的温度范围例如为40℃至75℃，尤其为40℃至65℃。
温度可以在各范围内保持恒定，也可以按照温度梯度而变化(下降或上升)。
在下面的实施方式部分中进一步详细说明了对温度的设置。
达到的每个温度均可保持一定的时间，从而得到一孵育步骤。因此，可以在扩增期间将反应混合物在选定的温度下孵育一定时间。所述时间对于每个孵育步骤可以是不同的，并且可取决于在给定温度下各反应(例如引物延伸或链置换等)的进程。孵育步骤的时间可包括以下范围：0.1-10,000s，尤其为0.1-1,000s，尤其为1-300s，尤其为1-100s。
通过以所述方式改变温度，可实施各反应步骤，尤其是在选定的温度下。以所述方式，可提高各反应步骤的收率。在一合成循环内，如有必要，可进行几次温度变化或在各范围之间的温度切换。因此，合成循环可包括至少一个温度变化。例如，这种温度变化可作为时间程序在PCR设备/热循环仪中常规地进行。
在某些实施方式中，优选一种扩增方法，其中包括链置换的至少一个步骤和包括引物延伸反应的至少一个步骤在相同的反应条件下同时或并行地进行。在这样的实施方式中，例如，至少一个寡核苷酸引物(例如第一寡核苷酸引物)的引物延伸反应尤其可在较低温度范围内进行。相反，在对照寡核苷酸的配合下进行链置换，并且发生进一步的引物延伸反应(例如第二寡核苷酸引物的延伸反应)，尤其是在较高温度范围的反应步骤中。
在某些实施方式中，优选一种扩增方法，其中包括对照寡核苷酸的链置换的至少一个步骤和包括引物延伸反应的至少一个步骤是在不同温度下进行的。在这样的实施方式中，例如，至少一个寡核苷酸引物(例如第一寡核苷酸引物和/或第二寡核苷酸引物)的引物延伸反应尤其可在较低温度范围内进行。另一方面，尤其是在较高温度范围的反应步骤中，在对照寡核苷酸的参与下发生链置换。
在另一具体实施方式中，扩增反应的所有步骤均在相同的反应条件下进行。
在这样的实施方式中，扩增程序可以在等温条件下进行，即无需温度变化即可进行该过程。在本发明的这种具体实施方式中，整个扩增反应在等温下进行，即该反应是等温的。例如，这种反应的时间包括以下范围：100-30,000s，尤其是100-10,000s，尤其是100-1,000s。
在“实施例”一节中，表明可以以等温反应的方式来匹配各反应组分的结构和相应的反应步骤。
导致待扩增核酸链数量加倍的所有方法步骤的总和可称为合成循环。这种循环可以是等温的，也可在其过程中存在温度变化。温度变化可以在每个循环之间重复，并且是相同的。
如果对照寡核苷酸的第三区域中超过5个(尤其是超过10个)核苷酸可以与第一引物延伸产物互补地结合，尤其是如果对照寡核苷酸中超过20个核苷酸与第一寡核苷酸延伸产物结合，则一些扩增方法特别有利，在这些扩增方法中最高可达温度仅允许在对照寡核苷酸的参与下进行链分离。通常，在反应条件下合成链解离之前，对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的互补链之间所需的结合时间越长，则扩增反应的特异性就越强。详细地，期望的特异性程度可通过延长或缩短对照寡核苷酸的第三部分来确定。
在整个过程中，可以在恒定温度下或在不同温度下重复过程步骤。
可通过添加各组分来依次实施各方法步骤。在一具体实施方式中，扩增程序所需的所有反应组分在扩增程序开始时存在于反应混合物中。
可通过添加一组分来开始扩增反应，例如通过添加包含靶序列的核酸链(例如起始核酸链)、聚合酶或二价金属离子，或通过诱导扩增所需的反应条件，例如为一个或多个过程步骤设置所需的反应温度。
可进行扩增，直到获得所需数量的待扩增核酸。在另一实施方式中，进行扩增反应的时间应使得足以获得足够数量的待扩增核酸。在另一实施方式中，进行扩增反应的合成循环次数(加倍次数)应使得足以获得足够数量的待扩增核酸。
可通过各种干预措施来阻止该反应。例如，通过改变温度(例如冷却或加热，其中聚合酶的功能被破坏)或通过添加阻止聚合酶反应的物质，例如EDTA或甲酰胺。
扩增后，扩增的核酸链可用于进一步分析。合成的核酸链可通过各种检测方法进行分析。例如，可使用荧光标记的寡核苷酸探针，或测序方法(Sanger测序或下一代测序)、固相测定(例如微阵列或微珠阵列分析)等。合成的核酸链可作为底物/模板用于进一步的寡核苷酸延伸反应中。
在一具体实施方式中，在反应期间监测合成反应的进程。这可通过使用插层染料(例如Sybrgreen或Evagreen)、标记引物(例如Lux-寡核苷酸引物或Scorpion-寡核苷酸引物)或荧光标记的寡核苷酸探针来完成。
对扩增期间荧光变化的检测是在该程序的检测步骤中进行的。所述步骤的温度和持续时间可以与寡核苷酸探针的各自要求相适应。例如，检测步骤的温度为20℃至75℃，尤其为40℃至70℃，尤其为55℃至70℃。
在检测步骤中，用具有能够激发检测***中使用的荧光团(供体或荧光报告剂)的波长的光来照射反应。信号采集通常与激发并行进行，其中检测特定的荧光信号并量化其强度。
作为诊断程序的一部分，扩增方法可用于验证生物材料或诊断材料中靶核酸链的存在。
第二扩增反应条件的具体实施方式
PCR的反应条件是技术人员众所周知的。
因此，这里将通过示例性方式来给出一些具体实施方式。
在某些实施方式中，图3-11中所示的温度包括以下范围：
T1＝55℃(±5℃)
T2＝65℃(±5℃)
T3＝95℃(±5℃)
T4＝45℃(±5℃)
T5＝70℃(±5℃)
在某些实施方式中，图3-11中所示的温度包括以下范围：
T1＝55℃(±10℃)
T2＝65℃(±10℃)
T3＝95℃(±10℃)
T4＝45℃(±10℃)
T5＝70℃(±10℃)
在某些实施方式中，图3-11中所示的温度包括以下范围：
T1＝55℃(±15℃)
T2＝65℃(±10℃)
T3＝95℃(±10℃)
T4＝45℃(±20℃)
T5＝70℃(±10℃)
在某些实施方式中，图3-11中所示的温度包括以下范围：
T1＝55℃(±5℃)
T2＝65℃(±3℃)
T3＝95℃(±10℃)
T4＝45℃(±5℃)
T5＝70℃(±3℃)
在某些情况下，单个温度步骤中的孵育时间可以为0.1s至60min，尤其为1s至10min，尤其为1s至5min。
循环温度变化通常称为PCR循环。例如，PCR循环包括温度从T1、T2至T3的完全变化。
所使用的温度范围主要用于支持第二扩增的以下步骤：
T1、T2、T4和T5温度：第三和第四引物与其各自模板链中互补区段的杂交，以及第三和第四引物延伸产物的延伸。
T3温度用于分离包含至少一种引物延伸产物的双链。所有以双链形式存在的核酸链(例如，双链靶序列、第一扩增片段1.1、第二扩增片段2.1以及包含P1.1-Ext和P4.1-Ext-part 1或P2.1-Ext和P3.1-Ext-part 1的中间产物)均在温度的作用下转变为单链形式。
此外，T3温度可用于激活第二聚合酶(例如被抗体灭活的第二聚合酶)的热启动形式，或将第一聚合酶灭活。此外，可在所述温度(T3)下切割不耐热的对照寡核苷酸。此外，可以将可被热激活的第三和第四寡核苷酸引物激活。
因此，可以在反应控制中使用不同的温度。
此外，结合各PCR引物(第二扩增的第三和第四引物)的反应温度选择会影响第二扩增期间产物的生成/中间体的形成。
各产物和中间体的收率范围取决于几个因素。例如，各引物的较高浓度通常有利于产物/中间体的收率。此外，产物/中间体的形成会受到反应温度以及各反应物彼此之间的结合/亲和力(各引物与其模板链内互补引物结合位点之间的亲和力)的影响：通常，例如，较长的寡核苷酸在较高的温度下比较短的寡核苷酸结合得更好；并且CG水平也可在互补序列区段中发挥作用：在较高的温度下，富含CG的序列也比富含AT的序列结合得更强。此外，诸如MGB或2-氨基-dA或LNA之类的修饰可增加引物与其各自互补区段之间的结合强度，这还导致了寡核苷酸引物在较高温度下优先结合。
例如，较长的寡核苷酸引物(例如25-60个核苷酸，CG水平超过40％)用于PCR，其因其互补区段而具有相对较高的Tm(例如60℃至70℃)。这允许第二扩增的杂交步骤和引物延伸步骤在较高温度(例如T2或T5)下进行。通过结合较短的第一和第二引物(来自第一扩增)，可控制反应，使得优先形成引物延伸产物P4.1-Ext和P3.1-Ext，并且可极大地抑制PCR扩增期间从P1.1和P2.1开始的引物延伸产物的共扩增。
当使用例如仅包含可与所述靶序列或其等同物结合的短3’区段(例如所述区段的长度为6-15个核苷酸)的第三和第四引物时，可能有利的是首先在低温下进行几个循环(图10A、10B，A2.1阶段)。类似的情况也适用于PCR引物，其例如仅包含基本互补的第一扩增片段1.1的错配。
在所述相对较低温度(T1和T4)的阶段，第三引物和/或第四引物与其第一扩增片段的互补区段发生引物结合。因此，尽管互补区段的长度短和/或存在错配，聚合酶仍可从与第一扩增片段的各链杂交的所述引物开始，进行模板依赖性引物延伸，并且可合成包含第三和第四寡核苷酸引物的引物延伸产物。
所述PCR循环至少重复两次，从而也可合成互补链。当重复循环时，第三和第四引物本身也因此被复制为模板，导致形成第三和/或第四寡核苷酸引物的完整引物结合位点。
然后可升高温度(A2.2阶段)，使得第三和第四引物可以在较高温度下与完全形成的引物结合位点结合。
使用较高的温度(T2和T5)是有利的，例如在均相测定中(当两个扩增***在同一反应批次中时)。例如，这可用于减少对照寡核苷酸与第三引物延伸产物(P3.1-Ext或P3.1-Ext part)的靶序列互补区域结合的影响。
在第二扩增中，酶促合成通常也在缓冲水溶液中进行。作为缓冲溶液，可使用溶解了的常规浓度的常规缓冲物质，例如Tris-HCl、Tris-乙酸盐、谷氨酸钾、HEPES缓冲液、谷氨酸钠。所述溶液的pH值通常为7-9.5，尤其约为8-8.5。例如，可根据所用聚合酶的制造商的建议来调整缓冲条件。
可将诸如所谓的Tm抑制剂(例如DMSO、甜菜碱、TPAC)之类的其他物质添加到缓冲液中。这种物质降低了双链的解链温度(“Tm抑制剂”)，因此可以对双链的打开产生积极影响。此外，可按常规量将聚合酶稳定组分(例如Tween 20或Triton 100)添加到缓冲液中。可按常规量添加EDTA或EGTA，以络合重金属。此外，可在反应混合物中添加聚合酶稳定物质(例如海藻糖或PEG 6000)。
起始核酸链的具体实施方式：对于第一扩增
在扩增反应开始时使用或待使用的核酸链可称为起始核酸链(图1)。
可看出它的功能在于它代表了初始模板，该初始模板允许引物的正确定位、两个引物之间的合成区段以及结合和延伸过程的启动。在一具体实施方式中，起始核酸链包含靶序列。
通过将引物与其各自的引物结合位点(PBS 1和PBS 2)结合并引发适当的引物延伸反应，生成了第一引物延伸产物。这些被合成为反应开始时存在的核酸链的特定拷贝。
在某些实施方式中，在扩增反应开始之前在反应混合物中使用的核酸链(起始核酸链)可以与待扩增核酸链相同。通过扩增反应，仅增加了这种核酸链的数量。
在某些实施方式中，待扩增核酸和起始核酸链的不同之处在于，起始核酸链指示了待扩增核酸链的各序列成员的排列方式，而起始核酸链的序列组成可不同于待扩增核酸链的序列。例如，在扩增期间引物结合和延伸的情况下，新的序列内容(关于起始核酸链)可以整合到待扩增核酸链中。此外，待扩增核酸链的序列成员在其序列组成(例如引物结合位点或引物序列)上可以与起始核酸链的此类序列成员不同。起始核酸仅用作待扩增核酸链的特异性合成的初始模板。所述初始模板可保留在反应混合物中直至扩增结束。然而，由于扩增的指数特性，在扩增反应结束时待扩增核酸链的数量超过添加到反应中的起始核酸链的数量。
在某些实施方式中，起始核酸链可包含至少一个未被扩增的序列部分。因此，这种起始核酸链与待扩增序列不同。例如，分别由于序列制备步骤或由于先前的序列操作步骤，这样的不被扩增的区段可代表起始核酸链的序列区段。
在一具体实施方式中，要在反应开始之前添加到反应混合物中的起始核酸链包含至少一个靶序列。
在某些实施方式中，这种起始核酸链包含至少一个靶序列和其他非靶序列的序列。在扩增过程中，包含靶序列的序列区段呈指数倍增，从而使其他序列区段要么根本未指数倍增要么仅部分倍增。
起始核酸链的结构(对于第一扩增)
这种起始核酸链的一实施例是包含靶序列、序列片段A以及序列片段B的核酸链。
起始核酸链的序列片段A包含一序列，该序列与用于扩增的两种引物之一的序列具有显著的同源性，或者与一个引物的3’区段的可复制部分基本相同。在该区段的互补链的合成中，生成了代表各自引物结合位点的互补序列。
起始核酸链的序列片段B包含适于与相应的另外引物或其3’区段互补地结合以形成可延伸的引物模板复合体的序列，其中序列片段A和B相互之间主要/尤其是非互补的。
在一具体实施方式中，将起始核酸链添加到具有以下特性的扩增方法的反应混合物中：
特别地，序列片段A在起始核酸链的5’区段中。特别地，所述序列片段A在5’方向上形成对核酸链链段的限制。
特别地，序列片段B相对于第一引物的结合位点和相对于第一引物的极性(“下游”)位于序列片段A的3’方向。
在一具体实施方式中，所述序列片段B在3’方向上形成对核酸链链段的限制。在某些实施方式中，所述序列片段B不代表对3’方向上的核酸链链的限制，而是其两侧侧接有3’侧的其他序列。特别地，所述序列不是靶序列，并且不参与指数扩增。
在某些实施方式中，靶序列包含序列片段A和B中的至少一个。在某些实施方式中，靶序列位于序列片段A与序列片段B之间。
在某些实施方式中(图50)，这种起始核酸链可用作合成第一引物延伸产物的模板。在此，例如在使用第二寡核苷酸引物进行引物延伸反应期间，起始核酸链可以在指数扩增之前的制备步骤中作为较长起始核酸链的序列区段，并且可转变为单链形式。例如，起始核酸链可以是基因组DNA或RNA，并且可作为靶序列的来源。核酸链的5’区段中的起始核酸链包含含有第二寡核苷酸引物的序列区段且代表在5’方向上限制的区段1、含有靶序列或其部分的区段2、含有第一寡核苷酸引物的引物结合位点的区段3、以及含有位于起始核酸链的3’区段中并由此位于3’侧的区段3侧面的非靶序列的区段4。
在扩增开始期间，至少具有其第一区域的3’区段的第一引物可以与区段3中的这种起始核酸链结合，并在聚合酶和核苷酸存在的情况下适当地延伸。由此，生成与起始核酸链的模板链互补且长度受限的第一引物延伸产物。在扩增反应期间，可通过对照寡核苷酸将这种引物延伸产物从其模板链上序列特异性地分离出来，因而在此合成的第一引物延伸产物的3’区段中的相应序列区段可用作第二寡核苷酸引物的结合位点。
在一具体实施方式中，起始核酸链由此包含以下序列片段(图50)：
·序列区段1(称为区段1)，其包含与第二引物的序列具有显著同源性或与第二引物的3’区段的可复制部分基本相同的序列。所述序列区段1在起始核酸链的5’区段中，尤其所述序列区段1在5’方向上形成对核酸链链的限制。
·序列区段3(称为区段3)，其包含适于与第一引物的第一区域或其3’区段互补地结合以形成可延伸的引物模板复合体的序列。特别地，所述序列区段3在序列区段1的3方向上(“上游”)。
·部分或全部地位于区段1与区段3之间的靶序列(靶序列的这部分称为区段2)。在一具体实施方式中，所述靶序列包含区段2以及区段1和/或区段3。
·可选地，3’区段中的起始核酸链包含未扩增的侧翼序列区段(称为区段4)。
在某些实施方式中(图51)，起始核酸链可用作合成第二引物延伸产物的模板。
在此，例如在使用第一寡核苷酸引物进行引物延伸反应期间，起始核酸链可以在指数扩增之前的制备步骤中作为较长起始核酸链的序列区段，并且可转变为单链形式。例如，起始核酸链可以是基因组DNA或RNA，并且可作为靶序列的来源(示意性地显示为双链)。核酸链的5’区段中的起始核酸链包含含有第一寡核苷酸引物的序列区段且代表在5’方向上限制的区段5、含有靶序列或其部分的区段6、含有第二寡核苷酸引物的引物结合位点的区段7、以及含有位于起始核酸链的3’区段中并由此位于3’侧的区段7侧面的非靶序列的区段8。
在扩增开始期间，至少具有其第一区域的3’区段的第一引物可以与区段7中的这种起始核酸链结合，并在聚合酶和核苷酸存在的情况下适当地一直延伸到第一寡核苷酸引物的终止部分。由此，生成与起始核酸链的模板链互补且长度受限的第二引物延伸产物。在扩增反应期间，可通过对照寡核苷酸将这种引物延伸产物从其模板链上序列特异性地分离出来，因而在此合成的第二引物延伸产物的3’区段中的相应序列区段可用作第一寡核苷酸引物的结合位点。
在所述具体实施方式中，起始核酸链包含以下序列片段：
·序列区段5(称为区段5)，其包含与第一引物的区域的序列具有显著同源性或与第一引物的第一区域的可复制部分基本相同的序列。所述序列区段5在起始核酸链的5’区段中，并且两侧侧接有不可复制的寡核苷酸尾巴(类似于第一寡核苷酸引物)，尤其是所述序列区段5在5’方向上形成对不可复制的核酸链链段的限制。
·序列区段7(称为区段7)，其包含适于与第二引物或其3’区段互补地结合以形成可延伸的引物模板复合体的序列。特别地，区段7在序列区段5的3’方向上(“上游”)。
·部分或全部地位于区段5与区段7之间的靶序列(在图23中，靶序列的这部分称为区段6)。在一具体实施方式中，所述靶序列包含区段6以及区段5和/或区段7。
·可选地，3’区段中的起始核酸链包含未扩增的侧翼序列区段(称为区段8)。
第一扩增反应中起始核酸链的作用模式
在扩增反应开始时，起始核酸链起模板作用，用于各引物延伸产物的最初生成。因此，它代表了待扩增核酸链的起始模板。起始核酸链不一定要与待扩增核酸链相同。通过在扩增反应期间结合和延伸两个引物，基本上两个引物都指示了在扩增期间在待扩增核酸链的两个末端区段上生成的序列。
在该方法的一具体实施方式中，在指数扩增程序期间保持了不使双链变性的反应条件。因此，有利的是，如果起始核酸链在其5’序列区段中具有可被聚合酶延伸的限制，这将导致各引物的酶促延伸终止。因此，在反应条件下生成的引物延伸片段的长度受到限制。这可以对对照寡核苷酸的链置换产生有益的影响，并导致各链的解离，从而使引物结合位点转变至单链阶段，因此可用于引物的新结合。
第一寡核苷酸引物(引物1)的具体实施方式
第一寡核苷酸引物(引物1)是至少包含下列区域的核酸链(图12-14)：
·第一引物区域，其在第一寡核苷酸引物的3’区段中，且能够基本上序列特异性地与待扩增核酸链的链结合；以及
·第二区域，其直接或通过接头与第一寡核苷酸引物的第一引物区域的5’端连接，且包含多核苷酸尾巴，该多核苷酸尾巴适于与对照寡核苷酸结合并通过对照寡核苷酸来支持链置换(步骤c)；其中，多核苷酸尾巴在反应条件下基本上保持单链(即不形成稳定的发夹结构或ds结构)，并且基本上不被聚合酶复制。
第一寡核苷酸引物的全长为10-80个核苷酸，尤其为15-50个核苷酸，更好地为20-30个核苷酸或其等同物(例如核苷酸修饰)。调整第一寡核苷酸引物的结构，使得其能够在所选反应条件下与对照寡核苷酸可逆地结合。此外，第一寡核苷酸引物的结构与其引物功能相适应。此外，调整所述结构，使得可通过对照寡核苷酸进行链置换。总的来说，对第一区域和第二区域的结构进行调整，使得可实施指数扩增。
在本发明的一有利实施方式中，引物的第一和第二区域以常规的5’-3’排列偶联。在本发明的某些实施方式中，两部分的偶联通过5’-5’键完成，使得第二区域具有与第一区域相反的方向。
彼此之间的偶联区域尤其是以共价方式获得的。在某些实施方式中，第一和第二区域之间的偶联是对于DNA常规的5’-3’磷酸二酯偶联。在某些实施方式中，它是5’-5’磷酸二酯偶联。在某些实施方式中，它是5'-3’磷酸二酯偶联，其中在两个区域的相邻末端核苷酸或核苷酸修饰之间定位有至少一个接头(例如C3、C6、C12或HEG接头或一无碱基修饰)。
各区域可包含不同的核苷酸修饰。在这里，可被修饰核苷酸的各成员：核碱基和主链(糖含量和/或磷酸盐含量)。此外，可使用缺少标准核苷酸结构单元的至少一种组分的修饰或被修饰的修饰，例如PNA。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的第二区域包含不与对照寡核苷酸结合的其他序列。这些序列可用于其他目的，例如用于与固相结合。这些序列尤其位于多核苷酸尾巴的5’端。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物可包含特征标记。这种标记的实施例是染料(例如FAM、TAMRA、Cy3、Alexa 488等)或生物素或其他可特异性结合的基团，例如地高辛配基。
第一寡核苷酸引物的第一引物区域
序列长度为约3-30个核苷酸，尤其为5-20个核苷酸，其中该序列主要与待扩增核酸链的链段的3’区段互补。详细地，所述引物区域必须能够特异性地与第二引物延伸产物的互补3’区段结合。所述第一区域在反向合成中是可复制的，并且还用作第二链的模板。特别地，核苷酸结构单元通过共同的5'-3’磷酸二酯结合或磷酸硫酯结合来相互连接。
第一引物区域尤其包含不影响或仅轻微影响聚合酶功能的核苷酸单体，例如：
·天然核苷酸(dA、dT、dC、dG等)或其修饰，且未改变碱基配对；以及
·修饰的核苷酸、2-氨基-dA、2-硫代-dT或其他具有不同碱基配对的核苷酸修饰。
在一具体实施方式中，所述区域的3’-OH端尤其没有修饰，且具有可被聚合酶识别的3’-OH官能团。第一引物区域用作扩增中第一引物延伸产物合成的引发剂。在另一具体实施方式中，第一区域包含至少一种硫代磷酸酯化合物，从而不会发生由于聚合酶的3’核酸外切酶活性引起的引物的3’端的降解。
第一寡核苷酸引物的第一区域的序列尤其与对照寡核苷酸的第二区域的序列彼此互补。
在某些实施方式中，第一引物区域或其3’区段可以与靶序列的序列区段结合。
第一寡核苷酸引物的第二区域
第一寡核苷酸引物的第二区域尤其是包含至少一个多核苷酸尾巴的核酸序列，所述多核苷酸尾巴在合成反应期间尤其未被聚合酶复制且能够与对照寡核苷酸的第一区域结合。第二区域的主要与对照寡核苷酸结合的区段可称为多核苷酸尾巴。
此外，第一寡核苷酸引物的第二区域不仅必须在反应条件下与对照寡核苷酸特异性地结合，而且还必须通过对照寡核苷酸参与链置换过程。因此，第二区域的结构必须适于使对照寡核苷酸与相应的双链端(具体地，第二引物延伸产物的3’端)相互靠近。
在几个实施方式中详细说明了第一寡核苷酸引物的第二区域的结构构型。在此，考虑了导致聚合酶催化合成中止的寡核苷酸区段的排列和所使用的修饰。
第二区域的长度为3-60个核苷酸，尤其为5-40个核苷酸，尤其为6-15个核苷酸或其等同物。
可任意选择第二区域的序列。特别地，该序列不与待扩增核酸和/或第二寡核苷酸引物和/或第一寡核苷酸引物的第一区域互补。此外，它尤其不包含任何自互补的区段，例如发夹或茎环。
第二区域的序列尤其适合对照寡核苷酸的第一区域的序列，从而两个序列可在反应条件下结合。在一具体实施方式中，所述结合在反应条件下是可逆的，因此在相互结合的组分与未结合的组分之间存在平衡。
尤其选择第一寡核苷酸引物的第二区域的序列，使得能够与对照寡核苷酸的第一区域结合的互补碱基的数量为1-40个，更好地为3-20个，尤其为6-15个。
第二区域的功能尤其是与对照寡核苷酸结合。在某些实施方式中，特别地，所述结合是特异性的，使得第一寡核苷酸引物的第二区域能够与特异性的对照寡核苷酸结合。在另一实施方式中，第二区域在反应条件下能够与不止一个对照寡核苷酸结合。
通常，第一寡核苷酸引物的第二区域与对照寡核苷酸的第一区域之间无需在序列上完全匹配。第一寡核苷酸引物的第二区域与对照寡核苷酸的第一区域之间的互补程度可以为20％至100％，更好地为50％至100％，尤其为80％至100％。各互补区域可直接彼此相邻，或者也可包含它们之间的非互补序列区段。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的第二区域可包含至少一个可改变Tm的修饰。通过引入这样的修饰，可改变第一寡核苷酸引物的第二区域与对照寡核苷酸的第一区域之间的键的稳定性。例如，可使用使Tm上升的修饰(核苷酸修饰或非核苷酸修饰)，例如LNA核苷酸、2-氨基腺苷或MGB修饰。另一方面，也可使用使Tm下降的修饰，例如肌苷核苷酸。在第二区域的结构中，还可以整合有接头(例如C3、C6、HEG接头)。
为了进行链置换，对照寡核苷酸必须在空间上靠近待扩增核酸的双链端。所述双链端由第一引物延伸产物的第一引物区域的区段和第二引物延伸产物的相应互补的3’区段组成。
多核苷酸尾巴在反应条件下主要与对照寡核苷酸互补地结合，因此引起对照寡核苷酸的第二区域和延伸的引物延伸产物的第一区域的瞬时接近，从而可以在链置换期间引发所述成员之间的互补式结合。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸与第一寡核苷酸引物的多核苷酸尾巴的结合直接导致这种接触。这意味着第一寡核苷酸引物的多核苷酸尾巴和第一引物区域必须彼此直接偶联。由于这种布置，在对照寡核苷酸已经结合在其第一区域中之后，对照寡核苷酸的第二区域的互补碱基与第一引物区域的相应碱基之间可能存在直接接触，因而可引发链置换。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的第二区域在多核苷酸尾巴与第一引物区域的结构之间还有其他结构。因此，在对照寡核苷酸已经与多核苷酸尾巴结合之后，它不直接定位于第一引物区域，而是定位于距其一定距离处。不可复制的多核苷酸尾巴与寡核苷酸引物的可复制的第一引物区域之间的结构可产生这样的距离。所述距离为0.1-20nm，尤其为0.1-5nm，尤其为0.1-1nm。
这样的结构例如代表不与对照寡核苷酸互补(例如以非互补的、不可复制的核苷酸修饰的形式)的接头(例如C3、C6、HEG接头)或区段。这些结构的长度通常可以用链原子来测量。所述长度为1-200个链原子，尤其为1-50个链原子，尤其为1-10个链原子。
为了使聚合酶的多核苷酸尾巴在扩增条件下不可复制，第一寡核苷酸引物的第二区域通常分别包含序列比对或结构，这会导致聚合酶在已成功复制了第一个引物区域后在第二引物延伸产物合成中终止。所述结构是为了防止第二区域的多核苷酸尾巴被复制。因此，多核苷酸尾巴尤其未被聚合酶复制。
在某些实施方式中，这样的结构位于第一引物区域与多核苷酸尾巴之间。
在某些实施方式中，多核苷酸尾巴的序列可包含导致聚合酶终止的核苷酸修饰。这样，第一寡核苷酸引物的第二区域的序列区段可包括两个功能：它既是多核苷酸的尾巴，也是导致聚合酶终止的核苷酸修饰序列。
术语“第一阻断单元或终止区域”涵盖了在第一寡核苷酸引物的第二区域中的修饰，这些修饰导致合成终止并因此使多核苷酸尾巴在本应用中未被复制。在下文中，给出了可导致第二链的合成终止的结构的其他实施方式。
已知寡核苷酸合成中的几个结构单元可阻碍聚合酶读取模板并导致聚合酶合成的终止。例如，已知不可复制的核苷酸修饰或非核苷酸修饰。寡核苷酸中还存在导致聚合酶终止的核苷酸单体的合成类型/比对(例如5’-5比对或3’-3’比对)。具有不可复制的多核苷酸尾巴的寡核苷酸引物在现有技术中也是已知的(例如Scorpion引物结构或用于与固相结合的引物)。两种引物变体均表明了能够引发链的合成从而导致引物延伸反应的寡核苷酸引物结构。结果是第一链也将引物结构与引物延伸产物中的尾巴整合。在第一引物延伸产物的互补链的合成中，例如在PCR反应期间第二链延伸至引物结构的“阻断单元/终止结构”。设计所述的两种引物结构，以使寡核苷酸引物的5’部分保持单链且不被聚合酶复制。
在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第二区域包含多核苷酸尾巴，该尾巴在其全长上具有从5’至3’的常规比对，且包含不可复制的核苷酸修饰。这种不可复制的核苷酸修饰例如有2'-O-烷基RNA修饰、PNA、吗啉代。所述修饰可以在第二引物区域中以不同的方式分布。
多核苷酸尾巴中不可复制的核苷酸修饰部分可以占核苷酸结构单元的20％至100％，尤其超过50％。特别地，这些核苷酸修饰位于第二区域的3’区段中，并因此位于第一寡核苷酸引物的第一区域的侧面。
在某些实施方式中，不可复制的核苷酸修饰的序列至少部分地与模板链中的序列互补，从而通过包含至少一部分所述核苷酸修饰来完成引物与模板的结合。在某些实施方式中，不可复制的核苷酸修饰的序列不与模板链中的序列互补。
不可复制的核苷酸修饰尤其彼此共价偶联，因此代表第二区域中的序列区段。该区段的长度为1-40个核苷酸修饰，尤其为1-20个核苷酸修饰，尤其为3-10个核苷酸修饰。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的第二区域包含多核苷酸尾巴，该多核苷酸尾巴在其全长上具有5’-3’常规比对，并且包含不可复制的核苷酸修饰(例如2'-O-烷基修饰)和至少一个非核苷酸接头(例如C3、C6、HEG接头)。非核苷酸接头的功能是共价连接相邻的核苷酸或核苷酸修饰，同时位点特异性地中断聚合酶的合成功能。
这样的非核苷酸接头不会使多核苷酸尾巴和第一引物区域的结构彼此相距太远。相反，多核苷酸尾巴应在空间上邻近第一引物区域。非核苷酸接头包含长度不超过200个链原子的修饰，甚至更有利地不超过50个链原子，尤其优选地不超过10个链原子。这种接头的最小长度可以是一个原子。这种非核苷酸接头的实施例是直链或支链烷基接头，这些接头的烷基链包含至少一个碳原子，尤其至少2-30个碳原子，更尤其4-18个碳原子。这种接头在寡核苷酸化学中是众所周知的(例如C3、C6或C12接头)，并且可以在寡核苷酸的固相合成期间并入在多核苷酸尾巴的序列与第一寡核苷酸引物的第一区域的序列之间。这种非核苷酸接头的其他实施例是线性或支链聚乙二醇衍生物。寡核苷酸化学中的已知实施例是六甘醇(HEG)。此类非核苷酸接头的其他实施例是无碱基修饰(例如作为dRibose的类似物的THF修饰)。
如果将一个或多个这样的修饰整合到第二区域中，它们可以在聚合酶合成第二引物延伸产物期间有效地干扰聚合酶的复制功能，从而使3’方向的区段在修饰后仍未被复制。在第二区域中的这种修饰的数量可以为1-100个，尤其为1-10个，尤其为1-3个。
这种非核苷酸接头的位置可以在第二区域的3’端，因此代表了向寡核苷酸引物的第一区域和第二区域的过渡。
此外，可使用非核苷酸接头在第二区域的中间区段中的位置。因此，多核苷酸尾巴被分成至少两个区段。在本实施方式中，多核苷酸尾巴的3’区段包含至少一个(尤其是更多个，例如2-20个，尤其2-10个)不可复制的核苷酸修饰。这些不可复制的核苷酸修饰尤其位于寡核苷酸引物的第一区域与第二区域之间的过渡处。
在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第二区域包含在全长上从5’至3’比对的多核苷酸尾巴，且包含从3’至5’“反向”比对的至少一个核苷酸单体，其位于第一寡核苷酸引物的第一区域与第二区域之间的过渡处。
在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第二区域包含多核苷酸尾巴，其中所述多核苷酸尾巴完全由以反向比对直接位于第一寡核苷酸引物的第一区域侧面的核苷酸组成，从而通过5’-5’位置实现第一区域和第二区域的偶联。这种比对的优点是，复制了第一区域后的聚合酶遇到核苷酸的“反向”比对，这通常导致在该位点的合成终止。
在多核苷酸尾巴的全长核苷酸的“反向”比对中，尤其是多核苷酸尾巴的3’末端核苷酸将在其3’-OH端被阻断，以防止副反应。或者，也可使用根本没有3’-OH基团的末端核苷酸，例如双脱氧核苷酸。
当然，在这样的实施方式中，对照寡核苷酸中的相应核苷酸比对也将被调整。在这种情况下，对照寡核苷酸的第一区域和第二区域必须以3’-3’比对的方式连接。
在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第二区域包含多核苷酸尾巴，该尾巴在其全长上具有从5’至3’的常规比对；寡核苷酸引物的第二区域还包含至少一个核苷酸修饰，该核苷酸修饰不代表与该聚合酶互补的核碱基(如果仅使用天然的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP)进行合成)。
例如，可以将Iso-dG或Iso-dC核苷酸修饰作为单个(但尤其是几个(至少2-20个))核苷酸修饰整合在第一寡核苷酸引物的第二区域中。核碱基修饰的其他实施例是扩展遗传字母的各种修饰。这种核苷酸修饰尤其不支持与天然核苷酸的互补碱基配对，使得聚合酶(至少在理论上)不会***该系列的核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP)。然而实际上，可能会有初步的***，尤其是在较高浓度的dNTP底物和延长的孵育时间(例如60min或更长时间)的情况下。因此，尤其是将要使用位于相邻位点的一些这样的核苷酸修饰。聚合酶合成的终止是通过缺少用于这些修饰的适当互补底物来实现的。具有Iso-dC或Iso-dG的寡核苷酸可通过标准方法合成，并且可以从多个商家(例如Trilink-Technologies、Eurogentec、Biomers GmbH)获得。或者，对照寡核苷酸的第一区域的序列也可以与这种第二引物区域的序列相适应。在此，扩展遗传字母的互补核碱基可相应地在化学合成期间整合在对照寡核苷酸的第一区域中。例如，可以将Iso-dG整合在第一引物核苷酸的第二区域中，而且可以将其互补核苷酸(Iso-dC-5-Me)置于对照寡核苷酸的第一区域中的适当位点。
总之，可以以不同方式来终止第二区域中聚合酶的合成。然而，优选仅在聚合酶复制了第一寡核苷酸引物的第一区域时才发生这种阻断。这样，可确保第二引物延伸产物在其3’区段具有适当的引物结合位点。该引物结合位点在链置换期间暴露，因此可用于另一第一寡核苷酸引物的新结合。
在合成第一引物延伸产物的互补链时，引物延伸反应在多核苷酸尾巴之前终止。由于由此该多核苷酸尾巴保持单链以与对照寡核苷酸相互作用并因而可用于结合，所以它通过使对照寡核苷酸的相应互补区段紧邻合适的双链体端部来支持对照寡核苷酸引发链置换反应。这样，对照寡核苷酸的互补部分(第二区域)与延伸寡核苷酸引物的互补部分(第一区域)之间的距离减小到最小。这种空间接近性有助于引发链置换。
现在，在核酸介导的链置换反应的示意性描绘中，对照寡核苷酸的互补序列紧邻适当的双链体端部。这导致在对照寡核苷酸的链和与引物互补的模板链之间竞争与第一寡核苷酸引物的第一区域的结合。通过分别在引物区域与对照寡核苷酸的互补区段(对照物核苷酸的第二区域)或模板链的互补区段之间重复闭合并形成碱基配对，引发核酸介导的链置换过程。
通常，对照寡核苷酸的相应互补序列部分越靠近引物区域的互补区段，链置换引发的收率就越高。然而，当该距离增加时，链置换引发的收率降低。
在本发明的上下文中，并非强制要求以最高的收率来进行链置换。因此，在与模板的互补链结合并形成互补双链体的第一寡核苷酸引物的第一引物区域的5’区段与对照寡核苷酸中的相应互补序列部分之间的距离(当与第一寡核苷酸引物的第二区域的多核苷酸尾巴结合时)可以在以下范围内：0.1-20nm，尤其为0.1-5nm，尤其为0.1-1nm。在特定情况下，所述距离小于1nm。以其他单位表示的所述距离对应于小于200个原子(尤其小于50个原子，尤其小于10个原子)的轨迹。在特定情况下，所述距离为一个原子。距离信息仅用于定向，并说明优选这些结构之间的较短距离。在许多情况下，只能通过分析寡核苷酸的确切结构并评估序列距离或接头长度的测量来测量所述距离。
第一引物还可包含在与对照寡核苷酸或模板链的相互作用中不需要的其他序列区段。这样的序列区段例如可以与其他寡核苷酸结合，这些寡核苷酸在与固相的结合中用作检测探针或固定化伙伴。
第一寡核苷酸引物的引物功能
第一寡核苷酸引物可用于几个单独的步骤。首先，它在扩增中发挥引物功能。由此，以第二引物延伸产物为模板进行引物延伸反应。在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物可以在扩增反应开始时使用起始核酸链作为模板。在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物可用于设计/提供起始核酸链。在扩增期间，第一引物使用第二引物延伸产物作为模板，充当合成第一引物延伸产物时的引发剂。第一引物的3’区段包含可主要与第二引物延伸产物互补地结合的序列。使用第二引物延伸产物作为模板对第一寡核苷酸引物进行酶促延伸，从而形成第一引物延伸产物。这种第一引物延伸产物包含靶序列或其序列部分。在合成第二引物延伸产物的过程中，第一寡核苷酸引物的可复制部分的序列被聚合酶识别为模板，并合成相应的互补序列，从而生成第一寡核苷酸引物的各引物结合位点。第一引物延伸产物的合成一直进行到第二寡核苷酸引物的5’区段并包括该区段。在合成第一引物延伸产物之后，该产物立即与第二引物延伸产物结合并形成双链复合体。第二引物延伸产物被对照寡核苷酸从所述复合体中序列特异性地置换出来。由此，对照寡核苷酸与第一引物延伸产物结合。在对照寡核苷酸成功置换链之后，第二引物延伸产物又可作为模板本身用于合成第一引物延伸产物。第一引物延伸产物的当前游离的3’区段可以与另一第二寡核苷酸引物结合，从而可引发第二引物延伸产物的新合成。
此外，第一寡核苷酸引物可以在扩增开始时在始于起始核酸链的第一引物延伸产物的合成中起引发剂的作用。在某些实施方式中，第一引物的序列与起始核酸链的相应序列区段完全互补。在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的序列仅与起始核酸链的相应序列区段部分互补。然而，所述差异互补性并非要阻止第一寡核苷酸引物启动主要是序列特异性的引物延伸反应。第一寡核苷酸引物与起始核酸链中各位置在互补性上的各差异尤其是在第一寡核苷酸引物的第一区域的5’区段中，从而在3’区段中主要互补的碱基配对和开始合成是可能的。例如，对于合成的开始，尤其是3’区段中的前4-10个位置将与模板(起始核酸链)完全互补。其余核苷酸位置可能偏离完美的互补性。因此，在第一寡核苷酸引物的第一区域的剩余5’区段中的完美互补程度可以为碱基组合物的50％至100％，尤其为80％至100％。根据第一寡核苷酸引物的第一区域的长度，序列差异为1至至多15个位置，尤其为1至至多5个位置。因此，第一寡核苷酸引物可引发起始核酸链的合成。在随后的第二引物延伸产物的合成中，第一寡核苷酸引物的可复制序列区段被聚合酶复制，使得又在随后的合成循环中在第二引物延伸产物内形成了完全互补的引物结合位点，用于第一寡核苷酸引物的结合，并且可用于随后的合成循环中。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物可用于制备起始核酸链。因此，这种第一寡核苷酸引物能够主要/尤其序列特异性地与核酸(例如包含靶序列的单链基因组DNA或RNA或其等同物)结合，并在存在聚合酶的情况下引发模板依赖性引物延伸反应。选择结合位置，使得引物延伸产物包含期望的靶序列。第一寡核苷酸引物的延伸导致具有与模板互补的序列的核酸链的生成。这种链可以从模板上分离(例如通过加热或碱)，从而可转变成单链形式。这种单链核酸链可以在扩增开始时用作起始核酸链。这种起始核酸链在其5’区段中包含第一寡核苷酸引物的序列部分，还包含靶序列或其等同物以及第二寡核苷酸引物的引物结合位点。其他步骤在“起始核酸链”一节中说明。
第一引物延伸产物的合成是引物延伸反应，并且构成扩增中的一单独步骤。在该步骤中的反应条件也相应地得到调整。选择反应温度和反应时间，使得反应可连续进行。该步骤中的优选温度取决于所用的聚合酶以及各自的第一寡核苷酸引物与其引物结合位点的结合强度，并且例如为15℃至75℃，尤其为20℃至65℃，尤其为25℃至65℃。第一寡核苷酸引物的浓度为0.01-50μmol/l，尤其为0.1-20μmol/l，尤其为0.1-10μmol/l。
在某些实施方式中，扩增的所有步骤均在严格的条件下进行，以防止或延迟非特异性产物/副产物的形成。这样的条件例如是较高的温度，尤其高于50℃。
如果要在一个批次中扩增超过一条的特异性核酸链，在某些实施方式中，尤其使用序列特异性寡核苷酸引物来扩增相应的靶序列。
特别地，第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和对照寡核苷酸的序列彼此适应，以尽可能减少副反应(例如引物二聚体的形成)。为此，例如，第一和第二寡核苷酸引物的序列彼此适应，使得在缺乏合适的模板和/或靶序列和/或起始核酸链的情况下，两个寡核苷酸引物均不能分别启动或支持扩增反应。这可以实现，原因例如在于，第二寡核苷酸引物不包含第一寡核苷酸引物的引物结合位点，且第一寡核苷酸引物不包含第二寡核苷酸引物的引物结合位点。此外，应避免引物序列包含延伸的自互补结构(自补体)。
在某些实施方式中，第一和第二引物延伸产物的合成在相同温度下进行。在某些实施方式中，第一和第二引物延伸产物的合成在不同温度下进行。在某些实施方式中，第一引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在相同温度下进行。在某些实施方式中，第一引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在不同温度下进行。
对照寡核苷酸的具体实施方式
对照寡核苷酸(图19-26)包括：
·第一单链区域，其可与第一寡核苷酸引物的第二区域的多核苷酸尾巴结合；
·第二单链区域，其可以与第一寡核苷酸引物的第一区域基本互补地结合；以及
·第三单链区域，其与第一引物延伸产物的延伸产物的至少一个区段基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸不用作所述第一或第二寡核苷酸引物的引物延伸的模板。
通常，对照寡核苷酸的第三区域的序列与待扩增核酸的序列相适应，因为这与第一引物的延伸产物中核苷酸顺序的模板有关。对照寡核苷酸的第二区域的序列与第一引物区域的序列相适应。对照寡核苷酸的第一区域的结构与第一寡核苷酸引物的第二区域的序列相适应，尤其与多核苷酸尾巴的性质相适应。
对照寡核苷酸还可包含不属于第一、第二或第三区域的其他序列区段。这些序列可作为侧翼序列附加到3’和5’端上。特别地，这些序列区段不干扰对照寡核苷酸的功能。
对照寡核苷酸的结构尤其具有以下性质：
各区域彼此共价结合。例如，可通过常规的5'-3’结合进行结合。例如，可使用磷酸二酯结合或耐核酸酶的磷酸硫酯结合。
对照寡核苷酸可通过其第一区域与第一寡核苷酸引物的多核苷酸尾巴结合，其中结合主要是通过杂交互补碱基来介导的。所述第一区域的长度为3-80个核苷酸，尤其为4-40个核苷酸，尤其优选为6-20个核苷酸。对照寡核苷酸的第一区域的序列与第一寡核苷酸引物的第二区域的序列之间的序列匹配度可以为20％至100％，尤其为50％至100％，尤其为80％至100％。在反应条件下，对照寡核苷酸的第一区域的结合尤其对第一寡核苷酸引物的第二区域具有特异性。
尤其选择对照寡核苷酸的第一区域的序列，使得能够与第一寡核苷酸引物的第二区域互补地结合的互补碱基的数量为1-40个，尤其为3-20个，尤其为6-15个。
由于对照寡核苷酸不代表聚合酶的模板，它可包括不支持聚合酶功能的核苷酸修饰，该修饰可以是碱基修饰和/或糖磷酸主链修饰。在其第一区域中的对照寡核苷酸例如可包括以下核苷酸和/或核苷酸修饰：DNA，RNA，LNA(在糖残基中具有2’-4’桥式结合的“锁核酸”类似物)，UNA(“解锁核酸”，在糖残基的2’-3’原子之间没有结合)，PNA(“肽核酸”类似物)，PTO(硫代磷酸酯)，吗啉代类似物，2'-O-烷基RNA修饰(例如2'-OMe、2’-O炔丙基、2'-O-(2-甲氧基乙基)、2’-O-丙基胺)，2’-卤代RNA，2’-氨基RNA，等等。这些核苷酸或核苷酸修饰例如通过常规的5’-3’结合或5'-2’结合彼此连接。例如，可使用磷酸二酯结合或耐核酸酶的磷酸硫酯结合。
在其第一区域中的控制寡子核苷酸可包括核苷酸和/或核苷酸修饰，其中核碱基选自以下物质：腺嘌呤及其类似物，鸟嘌呤及其类似物，胞嘧啶及其类似物，尿嘧啶及其类似物，胸腺嘧啶及其类似物，肌苷或其他通用碱基(例如硝基吲哚)，2-氨基腺嘌呤及其类似物，异胞嘧啶及其类似物，异鸟嘌呤及其类似物。
在其第一区域中的对照寡核苷酸可包括选自以下物质的非核苷酸化合物：能够影响对照寡核苷酸和第一寡核苷酸引物之间结合强度的***物，例如MGB、萘等。相同的成员也可用于第一引物的第二区域。
在其第一区域中的对照寡核苷酸可包含非核苷酸化合物，例如诸如C3、C6、HEG接头之类的可以将第一区域的各区段彼此连接的接头。
对照寡核苷酸可通过其第二区域与第一寡核苷酸引物的第一引物区域结合，其中结合基本上是通过互补碱基的杂交来介导的。
对照寡核苷酸的第二区域的长度适应于且尤其对应于第一寡核苷酸引物的第一区域的长度。该长度为3-30个核苷酸，尤其为5-20个核苷酸。对照寡核苷酸的第二区域的序列尤其与第一寡核苷酸引物的第一区域互补。互补性的匹配度为80％至100％，尤其为95％至100％，尤其为100％。对照寡核苷酸的第二区域尤其包含核苷酸修饰，该核苷酸修饰在第一寡核苷酸引物的延伸中阻碍聚合酶，但不会阻断或基本不会阻止互补双链(例如，诸如2'-O-Me、2'-O-(2-甲氧基乙基)、2’-O-丙基、2'-O-炔丙基核苷酸修饰之类的2'-O-烷基RNA类似物，LNA，PNA或吗啉代核苷酸修饰)的形成。各核苷酸单体尤其是通过5’-3’结合连接的，但也可使用核苷酸单体之间的5’-2’结合。
特别地选择对照寡核苷酸的第一和第二区域的序列长度及其性质，以使所述区域在反应条件下在所述方法的至少一个反应步骤中与第一寡核苷酸引物的结合是可逆的。也就是说，对照寡核苷酸和第一寡核苷酸引物当然可以彼此特异性地结合，但是这种结合并不会导致两种成员形成在反应条件下永久稳定的复合体。
而是，在反应条件下至少在一个反应步骤中，预期或能够使对照寡核苷酸和第一寡核苷酸引物的结合复合体形式与游离形式的各组分之间达到平衡。这样可确保在反应条件下至少一部分第一寡核苷酸引物以游离形式存在，并且能够与模板相互作用以引发引物延伸反应。另一方面，这样可确保对照寡核苷酸的各序列区域可用于与延伸寡核苷酸引物的结合。
通过选择反应过程中的温度，可影响部分的游离、单链组分，并可由此影响反应组分：通过降低温度，第一寡核苷酸引物可以与对照寡核苷酸结合，从而使两个参与物都与互补的双链复合体结合。这样，可降低单链形式的各组分的浓度。温度升高可导致两种组分解离成单链形式。在复合体(对照寡核苷酸/第一寡核苷酸引物)的解链温度范围内，约50％的组分以单链形式存在，约50％为双链复合体。因此，通过使用适当的温度，可影响反应混合物中单链形式的浓度。
在包括各反应步骤之间的温度变化的扩增方法的实施方式中，可以在各反应步骤期间实现期望的反应条件。例如，通过使用对照寡核苷酸/第一寡核苷酸的复合体的解链温度左右的温度范围，可影响各组分的一部分游离形式。在此，所使用的温度导致包含对照寡核苷酸/第一寡核苷酸引物的复合体失稳，使得在该反应步骤期间，各复合体组分至少瞬时变为单链，因此能够与其他反应物相互作用。例如，对照寡核苷酸的第一序列区域可通过未延伸的第一引物从双链复合体中释放出来，从而与延伸的第一寡核苷酸引物的第二序列区域相互作用，并因此引发链置换。另一方面，从包含对照寡核苷酸/第一寡核苷酸引物的复合体中释放出第一未延伸寡核苷酸引物会导致第一引物区域变为单链并因此可以与模板相互作用，从而可通过聚合酶来引发引物延伸。
使用的温度不得完全对应于对照寡核苷酸/第一寡核苷酸引物的复合体的解链温度。在一个反应步骤中使用的温度大约在解链温度的范围内就足够了。例如，一个反应步骤中的温度范围在对照寡核苷酸/第一寡核苷酸引物的复合体的Tm附近，即Tm±10℃，尤其为Tm±5℃，尤其为Tm±3℃。
例如，可以在反应步骤期间调整这样的温度，所述反应步骤包括通过对照寡核苷酸来进行序列特异性链置换。
在不包括各反应步骤之间的温度变化并且在等温条件下进行扩增的扩增方法实施方式中，在扩增反应的整个持续时间内保持反应条件，在该反应条件下，在复合体形式的对照寡核苷酸和第一寡核苷酸引物与游离形式的各组分之间的平衡是可能的。
复合体形式的对照寡核苷酸与第一寡核苷酸引物与游离形式的各组分之间的比例会受反应条件(例如温度和Mg2+浓度)以及各组分的结构和浓度的影响。
在某些实施方式中，选择对照寡核苷酸的第一和第二区域的序列长度及其性质，使得在给定的反应条件下(例如，在对照寡核苷酸的链置换的反应步骤中)在具有第一寡核苷酸引物的复合体中游离对照寡核苷酸部分与对照寡核苷酸部分之间的比率在以下范围内：1∶100至100∶1，尤其为1∶30至30∶1，尤其为1∶10至10∶1。在含有对照寡核苷酸的复合体中，游离的第一寡核苷酸引物部分与第一寡核苷酸引物部分之间的比率为1∶100至100∶1，尤其为1∶30至30∶1，尤其为1∶10至10∶1。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的浓度高于对照寡核苷酸的浓度。这样，反应中存在过量的第一引物，并且对照寡核苷酸就其效果而言必须通过适当反应温度的选择从与第一引物的结合中释放出来。通常，这是通过升高温度直到存在足够浓度的游离形式的对照寡核苷酸来完成的。
在某些实施方式中，第一寡核苷酸引物的浓度低于对照寡核苷酸的浓度。这样，存在过量的对照寡核苷酸，并且第一寡核苷酸引物就其效果而言必须通过适当反应温度的选择而脱离与对照寡核苷酸的结合。通常，这是通过升高温度直到存在足够浓度的游离形式的第一寡核苷酸引物来完成的。
在等温条件下，存在一平衡：第一寡核苷酸引物和对照寡核苷酸的某些部分彼此结合，而其他部分以单链形式存在于反应中。
对照寡核苷酸可通过其第三区域与第一寡核苷酸引物的特异性合成的延伸产物的至少一个区段结合(图13-35)。结合尤其是通过对照寡核苷酸与聚合酶合成的延伸产物之间的互补碱基杂交来实现的。
为了支持链置换反应，第三区域的序列尤其要与延伸产物具有高互补性。在某些实施方式中，第三区域的序列100％与延伸产物互补。
特别地，第三区域与紧跟在第一寡核苷酸引物的第一区域之后的延伸产物区段结合。因此，延伸产物的区段尤其位于第一寡核苷酸引物的总延伸产物的5’区段中。
特别地，对照寡核苷酸的第三区域不在第一寡核苷酸引物的延伸产物的全长上结合。特别地，位于延伸产物的3’端的一个区段仍未结合。所述3’末端区段是第二寡核苷酸引物结合所必需的。
相应地调整第三区域的长度，以使第三区域与延伸产物的5’固定区段结合，但不与延伸产物的3’固定区段结合。
对照寡核苷酸的第三区域的全长为2-100(尤其为6-60，尤其优选为10-40)个核苷酸或其等同物。对照寡核苷酸可以在该长度上与延伸产物区段互补地结合，并由此使延伸产物的所述5’固定区段从与其互补模板链的结合中置换出来。
未与对照寡核苷酸结合的延伸产物的3’固定区段的长度范围例如为5-60个核苷酸，尤其为10-40个核苷酸，尤其为15-30个核苷酸。
延伸产物的所述3’固定区段不会被对照寡核苷酸从与模板链的结合中置换出来。同样，由于对照寡核苷酸的第三区域与延伸产物的互补区段完全结合，第一引物延伸产物可通过其3’固定区段保持与模板链的结合。尤其选择所述复合体的结合强度，使得其例如可以在反应条件下自发解离(步骤e)。这可以实现，原因例如在于，在各自的反应步骤(反应步骤e)中，第一寡核苷酸引物的延伸产物的3’固定区段与其模板链的所述复合体的解链温度约在反应温度范围内或低于反应温度。如果所述复合体在延伸产物的3’区段中的稳定性低，则对照寡核苷酸的第三区域与延伸产物的5’固定区段的完全结合会导致第一引物延伸产物与其模板链的快速解离。
对照寡核苷酸具有适当的结构来发挥其功能：在各自的反应条件下，它能够从与模板链的结合中序列特异性地置换出延伸的第一寡核苷酸引物，因此模板链转变为单链形式，并由此可用于与新的第一寡核苷酸引物的进一步结合及其通过聚合酶的靶序列特异性延伸。
在反应条件下，对照寡核苷酸的区域1、2和3主要以单链形式存在，以实现链置换功能。因此，如果可能，应避免这些区域中的双链自互补结构(例如发夹)，因为它们会降低对照寡核苷酸的功能性。
在本发明所述方法中，对照寡核苷酸不作为模板存在，因此当在反应条件下与对照寡核苷酸连接时，第一寡核苷酸引物不被聚合酶延伸。
这尤其是通过使用核苷酸修饰来阻止聚合酶复制链实现的。特别地，如果第一寡核苷酸引物在反应条件下与对照寡核苷酸结合，则第一寡核苷酸引物的3’端保持未延伸状态。
反应的阻断/阻碍/减速/复杂程度可介于该性质的完全表达(例如在给定的反应条件下100％阻断)与该性质的部分表达(例如在给定的反应条件下30％至90％阻断)之间。优选的是单独或串联地偶联的核苷酸修饰(例如作为由修饰的核苷酸组成的序列片段)可防止第一引物延伸超过70％，尤其是超过90％，更尤其是超过95％，并且尤其是100％。
核苷酸修饰可包括碱基修饰和/或糖磷酸残基修饰。糖磷酸修饰是优选的，因为通过与常规核碱基结合，可布置对照寡核苷酸的任意互补序列。可分别阻碍或阻断聚合酶合成的那些在糖磷酸残基中具有修饰的核苷酸例如包括：2'-O-烷基修饰(例如2’-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基乙基)、2’-O-丙基、2'-O-炔丙基核苷酸修饰)，2’-氨基-2'-脱氧核苷酸修饰，2’-氨基烷基-2'-脱氧核苷酸修饰，PNA，吗啉代修饰等。可通过单个核苷酸修饰或仅通过串联地偶联几个核苷酸修饰(例如作为由修饰核苷酸组成的序列片段)来实现阻断。例如，在对照寡核苷酸中，至少2个(尤其是至少5个，尤其是至少10个)这样的核苷酸修饰可彼此相邻地偶联。
对照寡核苷酸可具有统一类型的核苷酸修饰或包含至少两种不同类型的核苷酸修饰。
这种核苷酸修饰在对照寡核苷酸中的位置尤其是要防止聚合酶延伸与对照寡核苷酸结合的第一寡核苷酸引物的3’端。
在某些实施方式中，这种核苷酸修饰位于对照寡核苷酸的第二区域。在某些实施方式中，这种核苷酸修饰位于对照寡核苷酸的第三区域。在某些实施方式中，这种核苷酸修饰位于对照寡核苷酸的第二和第三区域。
例如，对照寡核苷酸的第二区域的至少20％(尤其是至少50％)的位置是由这种核苷酸修饰组成的。
例如，对照寡核苷酸的第三区域是由这种核苷酸修饰的至少20％(尤其是至少50％，尤其是至少90％)的位置组成的。在某些实施方式中，整个第三区域包含核苷酸修饰，该核苷酸修饰以对照寡核苷酸为模板来阻止聚合酶延伸与该区域结合的引物。在某些实施方式中，整个第三和第二区域包含这种核苷酸修饰。在某些实施方式中，整个第一、第二和第三区域包含这种核苷酸修饰。因此，对照寡核苷酸可完全由这种核苷酸修饰组成。这种修饰的对照寡核苷酸例如可用于多重分析中，在该多重分析中使用附加寡核苷酸引物。这是为了防止在一个或多个对照寡核苷酸上发生意外的引物延伸反应。
这些核苷酸修饰的核碱基的序列与对各区域中序列的需求相适应。
其余部分例如是天然的核苷酸或核苷酸修饰，其根本不阻碍或仅略微阻碍聚合酶的功能，例如DNA核苷酸、PTO核苷酸、LNA核苷酸、RNA核苷酸。在此可使用另外的修饰，例如碱基修饰(例如2-氨基腺苷、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、肌苷、5-硝基吲哚、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、5-丙基胞嘧啶、5-丙基尿苷)或非核苷酸修饰(例如染料或MGB修饰)等，以调整对照寡核苷酸的各区域的结合强度。各核苷酸单体可通过常规的5’-3’结合或通过5’-2’结合彼此偶联。
具有核苷酸修饰的对照寡核苷酸区段被称为“第二阻断单元”，该区段阻止通过聚合酶与对照寡核苷酸结合的第一寡核苷酸引物的3’端的延伸。所述区段的长度可以为1-50个核苷酸修饰，尤其为4-30个核苷酸。所述区段例如可位于对照寡核苷酸中，使得结合的第一寡核苷酸引物的3’端位于该区段中。因此，该区段可跨越区域2和区域3。
在某些实施方式中，尤其不使用诸如C3、C6、HEG接头之类的接头结构或间臂结构来阻止与对照寡核苷酸结合的第一寡核苷酸引物的3’端的延伸。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸在其第三区域包含检测***的至少一种组分(例如荧光报告剂或荧光淬灭剂或供体荧光团)。在某些实施方式中，该组分的位置在对照寡核苷酸的5’端。在另一实施方式中，该组分位于第三区域的内部序列区段中。在此，到对照寡核苷酸的5’端的距离可以为2-50个核苷酸，尤其为2-20个核苷酸，尤其为2-10个核苷酸。如果寡核苷酸探针和对照寡核苷酸同时与相同的第一引物延伸产物结合，则检测***的两个组分将非常接近(例如在寡核苷酸探针上的荧光报告剂与对照寡核苷酸上的供体荧光团之间)
除了区域1、2和3之外，对照寡核苷酸还可包含位于上述区域两侧的其他序列区段，例如在对照寡核苷酸的5’区段或3’区段中。这种序列成员例如可用于其他功能，例如与探针的相互作用，与固相的结合等。这样的区域尤其不干扰区域1-3的功能。这些侧翼序列的长度例如可以为1-50个核苷酸。此外，对照寡核苷酸可包含至少一种用于固定到固相上的成员，例如生物素残基。此外，对照寡核苷酸可包含至少一种用于检测的成员，例如荧光染料。
在存在对照寡核苷酸的情况下，通过与对照寡核苷酸的相互作用，根据其序列内容检查新合成的序列。
·在与给定序列内容正确匹配的情况下，发生对照寡核苷酸链置换，其中模板链被新合成的链置换。因此，引物结合位点转变为单链状态，可用于与引物的新相互作用，从而进行进一步的合成。因此，两个引物延伸产物的***都处于活性状态。因此，对照寡核苷酸对***具有激活作用。
·如果缺少与对照寡核苷酸的给定序列内容的匹配，则会影响新合成链的模板链的链置换。链置换和/或分离在数量上已减速或已完全取消。因此，引物结合位点根本不会或几乎不会转变为单链状态。所以，有少量或根本没有引物结合位点可用于与引物的新相互作用。由此，两种引物延伸产物的***都很少处于活性状态或根本没有达到活性状态。
在每个单独的合成步骤后，新合成的引物延伸产物的双链打开功效对后续循环中可能获得的收率有影响：在合成步骤开始时，提供给待扩增核酸链的游离/单链引物结合位点越少，在该步骤中待扩增核酸链的新合成链的数量越少。换言之，合成循环的收率与可用于与相应互补引物相互作用的引物结合位点的数量成比例。总体上，这样可实现控制回路。
所述控制回路对应于合成片段的实时控制(实时/在线)：在发生扩增的同时，在反应混合物中进行序列控制。所述序列控制按照给定的模式进行，并且寡核苷酸***(通过对照寡核苷酸的链打开效应)能够在没有外部干预的情况下区分“正确”和“错误”状态。在正确的状态下，序列的合成继续进行；在错误的状态下，合成要么被减速，要么被完全阻止。每个步骤后“正确”和“错误”序列的收率差异将对包括多个此类步骤的整个扩增产生影响。
在指数扩增中，所述依赖性是指数的，因此在一个单一合成循环中，即使由于序列差异而导致的功效上的微小差异也可能意味着整个扩增时间的明显延迟，或导致在给定时间范围内完全没有可检出的扩增。
对新合成核酸链的这种实时控制效果与对照寡核苷酸的使用相关，并且对照寡核苷酸在扩增情况下的作用因此远远超出涵盖寡核苷酸引物长度的区域。
链置换反应的反应条件
通过对照寡核苷酸的序列依赖性链置换，使第二引物延伸产物从与第一引物延伸产物的结合中置换出来，由此形成扩增中的单个步骤。在所述步骤中的反应条件也相应地进行了调整。选择反应温度和反应时间，使得反应可成功进行。
在一具体实施方式中，对照寡核苷酸进行的链置换一直进行到第二引物延伸产物从与第一引物延伸产物的结合中脱离/解离出来。在两种引物延伸产物的温度依赖性/温度相关性分离期间，第二引物延伸产物的互补部分的第一引物延伸产物的3’区段的这种解离可以是自发的。这种解离对扩增反应的动力学具有有利的影响，并且可通过选择诸如温度条件之类的反应条件受到影响。因此，选择温度条件，使得通过对照寡核苷酸的互补式结合而成功进行的链置换有利于第二引物延伸产物与第一引物延伸产物的3’区段解离。
所述实施方式不代表“经典”PCR，但是3’区段的热诱导解离在远低于经典PCR的典型链分离诱导反应温度范围(＞90℃)的温度下进行。
在另一具体实施方式中，对照寡核苷酸进行链置换，直到第二引物延伸产物(P2.1-Ext)的3’区段从与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的互补式结合中脱离/解离出来；其中第二引物延伸产物(P2.1-Ext)的该3’区段包含至少一个与第一引物互补的区段以及一个与第一引物延伸产物(P1.1-Ext)互补的区段，该区段仅在酶促合成期间形成。这导致形成复合体(C1.1/P1.1-Ext/P2.1-Ext)(图2B)，该复合体包含第一引物延伸产物(P1.1-Ext)、第二引物延伸产物(P2.1-Ext)和对照寡核苷酸(C1.1)。在这种复合体中，第二引物延伸产物的3’区段至少暂时以单链形式存在，因为它可被对照寡核苷酸从其与第一引物延伸产物的结合中置换出来。第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的3’区段存在于与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)杂交的复合体中(图2B)。
由于第一寡核苷酸引物的部分开放引物结合位点(第二引物延伸产物的3’区段)，新的寡核苷酸引物可以在反应条件下与其仍然复合的单链序列区段(P2.1-Ext)的引物结合位点结合，从而通过聚合酶启动新的第一引物延伸产物(P1.2-Ext)的合成。通常，此反应以降低的速度进行，因为P2.1-Ext的3’区段不是永久性单链，而是与对照寡核苷酸竞争，并因此通过与P1.1-Ext结合来交替呈现出单链和双链状态。
使用第二引物延伸产物作为模板(P2.1-Ext)继续进行这种新开始的P1.2-Ext合成，由此也会由于聚合酶相关的链置换而导致复合体(C1.1/P1.1-Ext/P2.1.-Ext)的解离。在此，对照寡核苷酸、温度依赖性双链失稳和聚合酶引起的链置换协同和互补地起作用。这导致第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的3’区段与第二引物延伸产物(P2.1-Ext)的互补部分解离。
这种解离对扩增反应的动力学具有有利的影响，并且可通过选择诸如温度条件之类的反应条件受到影响。聚合酶介导的合成依赖性链置换参与P1.1-Ext和P2.1-Ext的解离有利于链分离。
所述步骤中的温度范围例如为15℃至75℃，尤其为30℃至70℃，尤其为50℃至70℃。
在对照寡核苷酸的第一区域和第一寡核苷酸引物的第二区域的给定长度(例如为3-25个核苷酸单体，尤其为5-15个核苷酸单体)下，通常可成功地引发链置换反应。如果对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的各自部分完全互补，则对照寡核苷酸可以与第一引物延伸产物结合(除了第一引物延伸产物的3’区段之外)，并置换第二引物延伸产物。因此，第二引物延伸产物保持与第一引物延伸产物的3’区段连接。所述连接的强度可能会受到温度的影响。当达到临界温度时，此连接可能会断开，并且两个引物延伸产物都可能解离。3’区段的序列越短，则连接越不稳定，导致自发解离的温度越低。
例如，可以在解链温度附近的温度范围内实现自发解离。在某些实施方式中，对照寡核苷酸进行链置换的步骤的温度在复合体的解链温度左右(Tm±3℃)，该复合体包含未分别与对照寡核苷酸和第二寡核苷酸引物或第二引物延伸产物结合的第一引物延伸产物的3’区段。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸进行链置换的步骤的温度在复合体的解链温度左右(Tm±5℃)，该复合体包含未分别与对照寡核苷酸和第二寡核苷酸引物或第二引物延伸产物结合的第一引物延伸产物的3’区段。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸进行链置换的步骤的温度高于复合体的解链温度，该复合体包含未分别与对照寡核苷酸和第二寡核苷酸引物或第二引物延伸产物结合的第一引物延伸产物的3’区段。这样的温度为约Tm+5℃至Tm+20℃，更好地为Tm+5℃至Tm+10℃。通过使用较高的温度，所述反应步骤中的平衡可以朝着解离方向移动。由此，可有利地影响反应的动力学。在通过对照寡核苷酸进行的链置换步骤中使用太低的温度会使扩增显著减速。
在某些实施方式中，第一引物延伸产物包含不与对照寡核苷酸结合的3’区段，该区段的序列长度为4-6个(优选为7-8个，尤其为1至约18个)核苷酸。在所述实施方式中，通常可能在40℃至65℃的温度范围内已经实现自发解离。较高的温度也导致解离。
在某些实施方式中，第一引物延伸产物包含不与对照寡核苷酸结合的3’区段，该区段的序列长度为15至约25个核苷酸。在该实施方式中，通常可能在50℃至70℃的温度范围内已经实现自发解离。较高的温度也导致解离。
在某些实施方式中，第一引物延伸产物包含不与对照寡核苷酸结合的3’区段，该区段的序列长度为20至约40个核苷酸。在该实施方式中，通常可能在50℃至75℃的温度范围内已经实现自发解离。较高的温度也导致解离。
第一引物延伸产物的3’区段的组成以及可选地添加影响解链温度的寡核苷酸修饰(例如MGB)或反应条件(例如TPAC、甜菜碱)会对温度的选择产生影响。因此，可进行相应的调整。
在某些实施方式中，扩增的所有步骤均在严格的条件下进行，以防止或减缓非特异性产物/副产物的形成。这样的条件例如是较高的温度，例如高于50℃。
在某些实施方式中，对照寡核苷酸的链置换的各步骤在与第一和第二引物延伸产物的合成相同的温度下进行。在另一实施方式中，对照寡核苷酸的链置换的各步骤在与第一和第二引物延伸产物的各自合成不同的温度下进行。在另一实施方式中，第一引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在相同温度下进行。在另一实施方式中，第一引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在相同温度下进行。
对照寡核苷酸的浓度为0.01-50μmol/l，更好地为0.1-20μmol/l，优选为0.1-10μmol/l。
第二寡核苷酸引物(引物2)的具体实施方式
一种寡核苷酸，其3’区段能够与待扩增核酸内的基本互补序列或其等同物序列结合，并引发特异性的第二引物延伸反应(图14、27-29、55、68-71)。因此，该第二寡核苷酸引物能够与第一寡核苷酸引物的第一特异性引物延伸产物的3’区段结合，并引发第二引物延伸产物的聚合酶依赖性合成。在某些实施方式中，每个第二寡核苷酸引物对一个待扩增核酸是特异性的。
第二寡核苷酸引物在反向合成时将是可复制的，并且在第一引物延伸产物的合成期间还自身充当模板。
第二寡核苷酸引物的长度可以为15-100个核苷酸，尤其为20-60个核苷酸，尤其优选为30-50个核苷酸。核苷酸结构单元尤其通过通常的5'-3’磷酸二酯结合或磷酸硫酯结合而相互连接。这种寡核苷酸引物可通过期望的方式来化学合成。
在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物可包含不影响或仅轻微影响聚合酶功能的核苷酸单体，例如：
·天然核苷酸(dA、dT、dC、dG等)或其修饰，且未改变碱基配对；以及
·修饰的核苷酸，2-氨基-dA，2-硫代-dT，或者其他具有不同碱基配对(例如诸如肌苷5-硝基吲哚之类的通用碱基对)的核苷酸修饰。
在一具体实施方式中，该区域的3’-OH端尤其没有修饰，并具有可被聚合酶识别且可根据模板进行延伸的3’-OH官能团。在另一具体实施方式中，第二引物的3’区段包含至少一种硫代磷酸酯化合物，从而不会发生由于聚合酶的3’核酸外切酶活性引起的引物的3’端的降解。
第二寡核苷酸引物可用于几个单独的步骤。首先，它在扩增中发挥引物功能。由此，以第一引物延伸产物为模板进行引物延伸反应。在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物可以在扩增反应开始时使用起始核酸链作为模板。在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物可用于设计/提供起始核酸链。
在扩增范围内，第二引物使用第一引物延伸产物作为模板，充当合成第二引物延伸产物时的引发剂。第二引物的3’区段包含可主要与第一引物延伸产物互补地结合的序列。使用第一引物延伸产物作为模板对第二寡核苷酸引物进行酶促延伸，从而形成第二引物延伸产物。这种合成通常与对照寡核苷酸从其与第一引物延伸产物的结合中置换出来是并行进行的。所述置换主要通过聚合酶实现，并且可部分地通过第二寡核苷酸引物完成。这种第二延伸产物包含靶序列或其区段。在合成第二引物延伸产物期间，第一寡核苷酸引物的可复制部分的序列被聚合酶识别为模板，并合成了各自的互补序列。所述序列位于第二引物延伸产物的3’区段中，并包含第一寡核苷酸引物的引物结合位点。第二引物延伸产物的合成一直进行到第一寡核苷酸引物中的终止位置。在合成第二引物延伸产物之后，该产物立即与第一引物延伸产物结合并形成双链复合体。第二引物延伸产物被对照寡核苷酸从所述复合体中序列特异性地置换出来。在对照寡核苷酸成功置换链之后，第二引物延伸产物又可作为模板本身用于合成第一引物延伸产物。
此外，第二寡核苷酸引物可以在扩增开始时在始于起始核酸链的第二引物延伸产物的合成中起引发剂的作用。在某些实施方式中，第二引物的序列与起始核酸链的相应序列区段完全互补。在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物的序列仅与起始核酸链的相应序列区段部分互补。然而，所述差异互补性并非要阻止第二寡核苷酸引物启动主要是序列特异性的引物延伸反应。第二寡核苷酸引物与起始核酸链中各自位置在互补性上的各自差异尤其是在第二寡核苷酸引物的5’区段中，从而在3’区段中主要互补的碱基配对和开始合成是可能的。例如，对于合成的起始，尤其是3’区段中的前4-10个位置将与模板(起始核酸链)完全互补。其余核苷酸位置可能偏离完美的互补性。因此，在5’区段中的完美互补程度可以为碱基组合物的10％至100％，尤其30％至100％。取决于第二寡核苷酸引物的长度，在5’区段中的这些与完全互补性之间的偏差为1-40个(尤其为1-20个)核苷酸位置。在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物仅以其3’区段与起始核酸链结合，而不通过其5’区段结合。与起始核酸链完全互补的第二寡核苷酸引物的这种3’区段的长度为6-40个核苷酸，尤其为6-30个核苷酸，尤其为6-20个核苷酸。不与起始核酸链互补的第二寡核苷酸引物的相应5’区段的长度为5-60个(尤其为10-40个)核苷酸。因此，第二寡核苷酸引物能够引发起始核酸链的合成。在随后的第一引物延伸产物的合成中，第二寡核苷酸引物的序列区段通过聚合酶复制，从而依次在随后的合成循环中在第一引物延伸产物内形成了完全互补的引物结合位点，以结合第二寡核苷酸引物，并可用于随后的合成循环中。
在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物可用于制备起始核酸链。在此，这种第二寡核苷酸引物能够主要/优选序列特异性地与核酸(例如包含靶序列的单链基因组DNA或RNA或其等同物)结合，并在存在聚合酶的情况下引发模板依赖性引物延伸反应。选择结合位置，使得引物延伸产物包含期望的靶序列。第二寡核苷酸引物的延伸生成具有与模板互补的序列的链。这种链可以通过模板分离(例如通过加热或碱)，从而可转变成单链形式。这种单链核酸链可以在扩增开始时用作起始核酸链。这种起始核酸链在其5’区段中包含第二寡核苷酸引物的序列部分，还包含靶序列或其等同物以及第一寡核苷酸引物的引物结合位点。其他步骤在“起始核酸链”一节中说明。
在一具体实施方式中，第二寡核苷酸引物至少在其3’区段中包含能够与靶序列的序列区段互补地且序列特异性地结合的序列部分，并通过聚合酶启动/支持成功的引物延伸反应。这种序列区段的长度为6-40个核苷酸，尤其为8-30个核苷酸，尤其为10-25个核苷酸。
在某些实施方式中，第二寡核苷酸引物在其3’和5’区段中包含可复制的序列区段，这些区段在第一引物延伸产物的合成中被聚合酶复制。因此，第二引物的所有序列区段都被聚合酶复制。这导致在第一引物延伸产物的3’区段中形成引物结合位点。
在某些实施方式中，具有在其长度上可复制部分的第二寡核苷酸引物对应于第一引物延伸产物的3’区段，该区段未与对照寡核苷酸结合。在包含第二寡核苷酸引物和第一引物延伸产物的复合体中，这种第二寡核苷酸引物的3’端位于与第一引物延伸产物结合的对照寡核苷酸的侧面。这种引物的延伸是通过使用第一引物延伸产物作为模板来完成的。在这种引物的延伸中，通过聚合酶依赖性链置换，使对照寡核苷酸从与第一引物延伸产物的结合中置换出来。
在某些实施方式中，具有可复制序列部分的第二寡核苷酸引物比未与对照寡核苷酸结合的第一引物延伸产物的3’区段短。在包含第二寡核苷酸引物和第一引物延伸产物的复合体中，在这种引物的3’端和与第一引物延伸产物结合的对照寡核苷酸之间存在第一引物延伸产物的单链部分。这种引物的延伸是通过使用第一引物延伸产物作为模板来完成的。在这种引物的延伸中，通过聚合酶依赖性链置换，使对照寡核苷酸从与第一引物延伸产物的结合中置换出来。
在某些实施方式中，具有可复制部分的第二寡核苷酸引物比未与对照寡核苷酸结合的第一引物延伸产物的3’区段长。在第二寡核苷酸引物和第一引物延伸产物的复合体中，第二引物的3’区段和对照寡核苷酸的5’区段竞争与第一引物延伸产物的结合。引发合成所需的第二个引物的3’区段与第一个引物延伸产物的结合伴随着对照寡核苷酸的5’区段的同时部分置换。
通过聚合酶开始合成后，使用第一引物延伸产物作为模板来置换这种引物。在这种引物的延伸中，通过聚合酶依赖性链置换，使对照寡核苷酸从与第一引物延伸产物的结合中置换出来。第二寡核苷酸引物的3’区段(置换对照寡核苷酸的5’区段)的序列长度可以在以下范围内：1-50个核苷酸，尤其为3-30个核苷酸，尤其为5-20个核苷酸。例如，在某些实施方式中，使用长度大于第一引物延伸产物的3’区段长度的第二寡核苷酸引物是有利的。此类实施方式例如包括第一引物延伸产物，该第一引物延伸产物的3’区段未与长度为5-40个核苷酸(尤其为10-30个核苷酸)的对照寡核苷酸结合。尤其对于较短的3’区段，较长的第二寡核苷酸引物可在合成起始时提供更高的序列特异性。
第二寡核苷酸引物与其引物结合位点的结合强度取决于引物的长度。通常，可以在更高的反应温度下使用更长的第二寡核苷酸引物。
特别地，第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和对照寡核苷酸的序列彼此适应，以尽可能减少副反应(例如引物二聚体的形成)。为此，例如，第一和第二寡核苷酸引物的序列彼此适应，使得在缺乏合适的模板和/或靶序列和/或起始核酸链的情况下，两个寡核苷酸引物均不能启动扩增反应。这可以实现，原因例如在于，第二寡核苷酸引物不包含第一寡核苷酸引物的引物结合位点，且第一寡核苷酸引物不包含第二寡核苷酸引物的引物结合位点。此外，应避免引物序列包含延伸的自互补结构(自补体)。
第二引物延伸产物的合成是引物延伸反应，并且形成第一扩增中的各步骤。在该步骤中的反应条件也相应地进行了调整。选择反应温度和反应时间，使得反应可成功进行。该步骤中分别优选的温度取决于所用的聚合酶以及各自的第二寡核苷酸引物与其引物结合位点的结合强度，并且例如为15℃至75℃，尤其为20℃至65℃，尤其为25℃至65℃。第二寡核苷酸引物的浓度为0.01-50μmol/l，尤其为0.1-20μmol/l，尤其为0.1-10μmol/l。
在某些实施方式中，扩增的所有步骤均在严格的条件下进行，以防止或减缓非特异性产物/副产物的形成。这样的条件例如是较高的温度，例如高于50℃。
如果必须在一批中扩增一个以上的特异性核酸链，则在某些实施方式中，优选地使用各自的序列特异性寡核苷酸引物来扩增各自相应的靶序列。
在某些实施方式中，第一和第二引物延伸产物的合成在相同温度下进行。在某些实施方式中，第一和第二引物延伸产物的合成在不同温度下进行。在某些实施方式中，第一引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在相同温度下进行。在另一实施方式中，第二引物延伸产物的合成和对照寡核苷酸的链置换在不同温度下进行。
聚合酶：
优选地，使用能够进行链置换的模板依赖性聚合酶。
在一实施方式中，可使用大片段的Bst聚合酶或其修饰(例如Bst 2.0 DNA聚合酶)。此外，还可使用Klenow片段、vent exo minus聚合酶、deepvent exo minus DNA聚合酶、大片段的Bsu DNA聚合酶、大片段的Bsm DNA聚合酶。Vent exo minus聚合酶、Deepventexo minus DNA(来自NEB)和PyroPhage聚合酶(来自Lucigen)是具有链置换活性的耐热酶。
在一实施方式中，使用在室温下未显示出活性的聚合酶，即所谓的热启动聚合酶。Bst 2.0热启动聚合酶(来自NEB)就是一个例子。
第三寡核苷酸引物的具体实施方式
(第二扩增***的组分)
在一实施方式中，第三寡核苷酸引物与第一扩增***的第一寡核苷酸引物相同。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物与第一扩增***的第一寡核苷酸引物不同。
第三寡核苷酸引物的长度可以为15-100个核苷酸，尤其为20-60个核苷酸，尤其为30-50个核苷酸。CG水平的范围例如为20％至80％，尤其为30％至79％。核苷酸结构单元尤其通过通常的5’-3’磷酸二酯结合或磷酸硫酯结合而相互连接。这种寡核苷酸引物可通过期望的形式来化学合成。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物可包含对聚合酶功能没有影响或几乎没有影响的核苷酸单体，例如：
·天然核苷酸(dA、dT、dC、dG等)或其修饰，且未改变碱基配对；以及
·修饰的核苷酸，耐核酸酶的硫代磷酸酯化合物(PTO)修饰，LNA修饰，2-氨基-dA，2-硫代-dT，或者其他具有不同碱基配对(例如诸如肌苷5-硝基吲哚之类的通用碱基对)的核苷酸修饰。
在一具体实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’-OH端尤其没有修饰，并具有可被聚合酶识别且根据模板进行延伸的3’-OH官能团。在另一具体实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’区段包含至少一种硫代磷酸酯化合物，从而不会发生由于聚合酶的3’核酸外切酶活性引起的引物的3’端的降解。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’端例如被3’磷酸基或C3接头阻断。在所述实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’区段直到第二扩增才被激活(例如利用第二聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性)。
特别地，第三寡核苷酸引物不包含可以与对照寡核苷酸的第一区段互补地结合的任何序列区段。
第三寡核苷酸引物(图15-31)可相对于第一扩增片段1.1(包含靶序列的第一扩增产物1.1)以不同的排列定位。
为了能够使用第一扩增片段1.1作为模板(起始核酸链2.1)来开始第二扩增反应，第三引物和第四引物必须在第一扩增片段预定的序列内结合并通过聚合酶延伸。
在一具体实施方式中，第三寡核苷酸引物可以与第一扩增片段1.1的一条链结合。特别地，第三寡核苷酸引物与第二引物延伸产物结合，并且可使用适当的聚合酶和反应条件来引发引物延伸。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的这种结合优选发生在第二引物延伸产物的3’区段中。
第三寡核苷酸引物优选在其3’区段中包含序列区段，该序列区段可以在所使用的反应条件下与第二引物延伸产物互补地或主要互补地结合，使得聚合酶能够引发第三引物延伸产物的合成。
该区段的长度尤其为6-30个核苷酸，尤其为8-25个核苷酸，尤其为10-20个核苷酸，尤其为10-15个核苷酸。在某些实施方式中，该区段与第二引物延伸产物的相应区段完全互补。在某些实施方式中，所述区段包含与引物延伸产物的至少一个错配。特别地，该错配的位置相对于第三引物的3’端不比位置-4更近，尤其是相对于第三寡核苷酸引物的3’端不比-5更近，尤其不比-6更近，尤其不比位置-8更近。由于第三寡核苷酸引物也可通过该3’区段与对照寡核苷酸结合，因此这种错配会削弱该区段与对照寡核苷酸的结合。因此，当选择错配的长度和数量时，应考虑到3’区段应与第二引物延伸产物结合并引发引物延伸反应，但同时考虑到在所使用的反应条件下，所述区段不会与对照寡核苷酸不可逆地结合，从而将其灭活。
因此，位置和长度的选择考虑了第三寡核苷酸引物与对照物以及与第二引物延伸产物之间的相互作用。
可通过不同的方式选择所述区段与第二引物延伸产物的结合位置(图27-31、57)。
例如，第三寡核苷酸引物和第一寡核苷酸引物可以与同一序列区段主要互补地结合。第三寡核苷酸引物的3’端的位置对应于第一寡核苷酸引物的3’端的位置。因此，第三寡核苷酸引物能够以互补的方式至少部分地(以其3’区段)与靶序列的一部分结合。因此，第三引物的3’端位于对照寡核苷酸的第二阻断单元内，并且不能通过聚合酶使用对照物作为模板进行延伸(图20)。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物与第二引物延伸产物主要互补地结合，其中其3’端相对于第一寡核苷酸引物的3’端移位。在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’端在第二引物延伸产物的3’方向上移位至少一个核苷酸的距离。因此，第二引物延伸产物的区段(第三寡核苷酸引物可以主要互补地与之结合)在3’方向上移位(图19)。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的3’端在第二引物延伸产物的5’方向上移位至少一个核苷酸的距离。因此，第二引物延伸产物的区段(第三寡核苷酸引物可以主要互补地与之结合)在5’方向上移位(图21)。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物的结合位置在第二引物延伸产物的5’方向上移位，使得第三寡核苷酸引物不与第一扩增***的第一寡核苷酸引物的结合位置重叠。因此，第二引物延伸产物的区段(第三寡核苷酸引物可以主要互补地与之结合)在5’方向上相对于第一寡核苷酸引物的结合位置移位(图22)。
因此，第三寡核苷酸引物包含可以与对照寡核苷酸互补地结合的序列区段。对照寡核苷酸的可以与第三寡核苷酸引物互补地结合的区段称为对照寡核苷酸的第四区段。为了防止第三寡核苷酸引物在对照物上进行不希望的引物延伸，可至少修饰位于第三寡核苷酸引物的3’端附近的对照寡核苷酸的位置。例如，这能够以与第二阻断单元的修饰类似的方式来完成。包含此类修饰(阻止第三寡核苷酸引物的延伸)的对照物区段被称为第四阻断单元(图19-22)。其位置由对照物中第三寡核苷酸引物的潜在结合位置决定。
第三寡核苷酸引物应该能够在反向合成期间被复制，并且还可以作为第四引物延伸产物合成的模板本身。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物在其3’区域包含至少一个序列区段，该区段可以与第一靶序列主要互补地结合。该区段能够与第二引物延伸产物(包含所述靶序列的相应区段)主要互补地结合，其中聚合酶能够进行引物延伸反应。
在一实施方式中，第三寡核苷酸引物在其5’区段中包含至少一个不与靶序列互补的区段。例如，所述区段可包含1-60个核苷酸，并且可用于其他目的，例如条形码编码、克隆、固定化、探针结合等。调整该5’区段的序列组成，以使其不干扰第二扩增。
第三寡核苷酸引物可包含其他修饰，例如荧光染料(例如FAM、Cy5等)、荧光淬灭剂(例如BHQ1、BHQ2等)、亲和力标记(例如生物素、地高辛配基等)。在一实施方式中，第三寡核苷酸引物可包含接头(例如C3或HEG接头)，使得其5’区段不被聚合酶复制。
在某些实施方式中，第三寡核苷酸引物在第二扩增反应之前固定在固相上。因此，该第三寡核苷酸引物的引物延伸导致整个第三引物延伸产物的固定。
第三寡核苷酸引物的使用浓度范围可以为0.01μmol/l至约10μmol/l，尤其为0.1μmol/l至约2μmol/l。
第四寡核苷酸引物(第二扩增***的组分)的具体实施方式
在一实施方式中，第四寡核苷酸引物与第一扩增***的第二寡核苷酸引物相同。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物与第一扩增***的第二寡核苷酸引物不同。
第四寡核苷酸引物的长度可以为15-100个核苷酸，尤其为20-60个核苷酸，尤其为30-50个核苷酸。CG水平范围例如为20％至80％，尤其为30％至79％。核苷酸结构单元尤其通过通常的5’-3’磷酸二酯结合或磷酸硫酯结合而相互连接。这种寡核苷酸引物可通过期望的形式来化学合成。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物可包含对聚合酶功能没有影响或几乎没有影响的核苷酸单体，例如：
·天然核苷酸(dA、dT、dC、dG等)或其修饰，且未改变碱基配对；以及
·修饰的核苷酸，耐核酸酶的硫代磷酸酯化合物(PTO)修饰，LNA修饰，2-氨基-dA，2-硫代-dT，或者其他具有不同碱基配对(例如诸如肌苷5-硝基吲哚之类的通用碱基对)的核苷酸修饰。
在一具体实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’-OH端尤其没有修饰，并具有可被聚合酶识别且根据模板进行延伸的3’-OH官能团。在另一具体实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’区段包含至少一种硫代磷酸酯化合物，从而不会发生由于聚合酶的3’核酸外切酶活性引起的引物的3’端的降解。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’端例如被3’磷酸基或C3接头阻断。在这些实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’区段直到第二扩增才被激活(例如利用第二聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性)。
特别地，第四寡核苷酸引物不包含可以与对照寡核苷酸的第一区段互补地结合的任何序列区段。
第四寡核苷酸引物(图15-31)可相对于第一扩增片段1.1(包含靶序列的第一扩增产物1.1)以不同的排列定位。
为了能够使用第一扩增片段1.1作为模板(起始核酸链21)来开始第二扩增反应，第三引物和第四引物必须在第一扩增片段预定的序列内结合并通过聚合酶延伸。
在一具体实施方式中，第四寡核苷酸引物可以与第一扩增片段1.1的一条链结合。优选地，第四寡核苷酸引物与第一引物延伸产物结合，并且可使用适当的聚合酶和反应条件来引发引物延伸。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物的这种结合优选发生在第一引物延伸产物的3’区段中。
第四寡核苷酸引物优选在其3’区段中包含序列区段，该序列区段可以在所使用的反应条件下与第一引物延伸产物互补地或主要互补地结合，使得聚合酶能够引发第四引物延伸产物的合成。
所述区段的长度尤其为6-40个核苷酸，尤其为8-30个核苷酸，尤其为10-25个核苷酸，尤其为10-20个核苷酸。在某些实施方式中，该区段与第一引物延伸产物的相应区段完全互补。在某些实施方式中，所述区段包含与第一引物延伸产物的至少一个错配。特别地，该错配的位置相对于第四引物的3’端不比位置-4更近，尤其是相对于第四寡核苷酸引物的3’端不比-5更近，尤其不比-6更近，尤其不比位置-8更近。
可通过不同的方式选择所述区段与第一引物延伸产物的结合位置(图23-31、57)。
例如，第四寡核苷酸引物可结合与第二寡核苷酸引物主要互补的相同序列区段。第四寡核苷酸引物的3’端的位置对应于第二寡核苷酸引物的3’端的位置。因此，第四寡核苷酸引物至少部分地(以其3’区段)包含靶序列的一部分。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物与第一引物延伸产物主要互补地结合，其中其3’端相对于第二寡核苷酸引物的3’端移位。在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’端在第一引物延伸产物的3’方向上移位至少一个核苷酸的距离。因此，第一引物延伸产物的区段(第四寡核苷酸引物可以主要互补地与之结合)在3’方向上移位(图1)。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物的3’端在第一引物延伸产物的5’方向上移位至少一个核苷酸的距离。因此，第一引物延伸产物的区段(第四寡核苷酸引物可以主要互补地与之结合)在5’方向上移位。
第四寡核苷酸引物尤其不包含任何可以与对照寡核苷酸互补地结合的序列区段。
第四寡核苷酸引物在反向合成期间应该是可复制的，并且在合成期间还可用作第三引物延伸产物的模板。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物在其3’区段中包含至少一个序列区段，该序列区段包含第一靶序列的部分，并因此可结合到与靶序列互补的链上。所述区段能够与第一引物延伸产物(包含所述靶序列的相应互补区段)主要互补地结合，其中聚合酶能够进行引物延伸反应。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物在其5’区段中包含至少一个序列区段，该序列区段不包含第一靶序列的序列区段。例如，所述区段可包含1-60个核苷酸，并且可用于其他目的，例如“条形码编码”、克隆、固定化、探针结合等。调整该5’区段的序列组成，以使其不干扰第二扩增。
第四寡核苷酸引物可包含其他修饰，例如荧光染料(例如FAM、Cy5等)、荧光淬灭剂(例如BHQ1、BHQ2等)、亲和力标记(例如生物素、地高辛配基等)。在一实施方式中，第四寡核苷酸引物可包含接头(例如C3或HEG接头)，使得其5’区段保持不被聚合酶复制。
在某些实施方式中，第四寡核苷酸引物在第二扩增反应之前固定在固相上。因此，这种第四寡核苷酸引物的引物延伸导致整个第四引物延伸产物的固定化。
第四寡核苷酸引物的使用浓度范围可以为0.01μmol/l至约10μmol/l，尤其为0.1μmol/l至约2μmol/l。
第二扩增***的聚合酶：
已知许多聚合酶可进行PCR。
在某些实施方式中，使用具有5’-3’核酸外切酶活性的耐热模板依赖性DNA聚合酶。
在某些实施方式中，Taq聚合酶和/或其制剂和/或修饰(例如Ampli-Taq)用于进行第二扩增。
在某些实施方式中，使用具有链置换活性的耐热模板依赖性DNA聚合酶。例如VentExo minus(来自NEB)、PyroPhage聚合酶(来自Lucigene)、SD聚合酶(来自Bioron)。
在某些实施方式中，使用具有3’-5’校对活性的耐热模板依赖性DNA聚合酶。例如Vent exo plus，Deep Vent exo plus(来自NEB)、Pfu聚合酶(Jena Biosciences)、Phusion聚合酶(NEB)。
在某些实施方式中，使用耐热模板依赖性DNA聚合酶，该酶与另一种蛋白质缀合，例如增加聚合酶的加工活性。例如Phusion聚合酶(NEB)。
包含附加序列区段的寡核苷酸引物：
第一引物和第二引物的上述结构可分别视为所谓的“引物的基本结构”和“引物的最小结构”。
具有引物功能的寡核苷酸的这种基本结构(例如第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物、(可选地)第三寡核苷酸引物、(可选地)第四寡核苷酸引物等)包含有利于进行扩增程序的序列区段，例如第一引物的第一和第二区段。
寡核苷酸引物的这种基本结构可通过其他附加序列区段来延伸。这种附加序列区段包括对于实施扩增程序并非必需但对于其他任务可能有用的结构。
可以可选地将此类附加序列区段引入到寡核苷酸引物中，并用于进一步的功能或反应。这样，可以将由聚合酶合成的引物延伸产物(例如从第一和/或第二引物开始)连接到这样的序列区段上。这使得这种附加序列区段和引物延伸产物能够整合到分子结构中。在某些实施方式中，这种整合可能是有利的。技术人员已知具有附加序列区段的寡核苷酸引物序列的多种应用。
技术人员已知几种功能，这些功能由寡核苷酸引物的附加序列区段支持。
例如，附加结构的引入可用作介导分子间或分子内结合的手段。技术人员已知这种结构的几个实施例。例如，可根据这种分子内结合(例如在Scorpion引物中)的原理设计探针。例如，序列区段仍可用于与其他寡核苷酸结合。序列特异性分子间结合可通过使用严格的条件来实现。这种相互作用例如可用于通过与固定化寡核苷酸互补地结合将扩增产物结合到固相上。
另一实施例是引入所谓的衔接子序列和/或使用其他区段来对引物和所得引物延伸产物进行独特编码或序列特异性标记(所谓的引物条形码编码)。例如，这用于NGS文库构建(
Figure BDA0002741821590000371
等人，Nucleic Acids Res.2016Jun 20；44(11)：e105)。在引物延伸产物的序列分析中，这种标记可用于以后的序列分配。
另一实施例提供了使用附加序列区段来引入结合有某些蛋白质(例如限制性核酸内切酶等)的特异性序列。
另一实施例使用其他区段来引入间臂序列，间臂序列不是为了结合特异性的相互作用伙伴，而是为了增加相邻序列之间的距离。
这种附加序列可位于引物的可复制部分上，或者可添加到寡核苷酸引物的不可复制部分上。有几个因素在确定是否复制序列区段中起作用。例如，序列区段在各自的寡核苷酸中的定位、所使用的核苷酸修饰(例如C3、HEG、2'-OMe等)可确定是否在过程步骤中将序列区段用作模板。
在一实施方式中，将附加序列区段引入到引物的可复制区域中，例如在第二引物的可复制部分的5’区段处，使得例如当在靶序列的合成期间读取引物序列时，聚合酶也读取附加序列区段。这种附加序列区段的长度为3-50个核苷酸。这些序列区段的组成允许在这种类型的实施方式中通过聚合酶进行合成，因此所述区段用作聚合酶依赖性合成的模板。在这样的区段中，例如使用诸如dA、dG、dC、dT之类的天然核苷酸。
在另一实施方式中，附加序列区段可位于例如寡核苷酸引物的5’末端，该寡核苷酸引物在合成包含靶序列的特异性扩增片段期间不被复制。例如，这可通过定位一个或多个可阻止聚合酶合成互补链的修饰或化学基团(例如HEG、C3、包含具有2'-OMe修饰的4-10个核苷酸的区段等)来实现。这种修饰例如可位于第二引物的可复制部分的5’末端，并阻碍合成的继续。例如，可以在第二引物的可复制区段的5’端引入HEG基团，然后可在此之后引入附加序列区段。
此外，可以将附加序列区段定位在第一引物的第二区域的5’端。附加序列区段的这种定位阻止了在包含靶序列的特异性扩增产物的常规合成期间合成互补链。
这种附加序列区段的长度为3-50个核苷酸。碱基组合物例如可包含天然核碱基(A、G、C、T、U、肌苷)或在核苷酸的不同位置处的修饰(例如在碱基处，如2-氨基腺嘌呤、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、5-炔丙基尿苷、5-炔丙基胞嘧啶，或者在糖磷酸主链上，如LNA、2'-OMe、2’-卤素等)。在一实施方式中，将第一引物和附加序列区段组合，以形成寡核苷酸引物。在某一实施方式中，将第二引物和附加序列区段组合，以形成寡核苷酸。
在寡核苷酸中以不阻止靶序列扩增的方式设计这种附加序列区段。例如，这是通过避免或减少与该过程所必需的引物或对照物的结构的抑制性相互作用来实现的。在某些实施方式中，在选定的反应条件下，附加结构可以与其他引物区域形成互补的双链区段。但是，尤其是这样的双链区段不会阻止靶序列的特异性扩增。在某些实施方式中，这种附加序列区段不与第一引物的第一或第二引物区域相互作用或结合。在某些实施方式中，这些附加区段不与对照寡核苷酸相互作用。在某些实施方式中，这些附加序列区段在反应中不与其他引物相互作用。在某些实施方式中，这种附加序列区段不与P1.1-Ext或P2.1-Ext或包含靶序列的其他扩增片段相互作用。在某些实施方式中，这种附加序列区段不会与第一引物的第一或第二区域在反应条件下形成稳定的双链区段，这完全阻止了第一或第二区域起作用。
在某些实施方式中，这种附加区段不与第二引物相互作用或结合。在某些实施方式中，这种附加序列区段尤其不与第二引物的3’区段相互作用。
在某些实施方式中，第一引物在其第二区域的5’末端包含第一引物的附加序列区段(附加序列变体P1)。所述区段可选地包含10-50个核苷酸的序列，其不干扰靶序列的扩增程序(例如不与引物形成二级结构)。此外，所述区段可选地包含第一引物的可复制的第一区段的约5-15个核苷酸的序列。附加序列变体P1包含作为单体(A、C、G、T)的天然核苷酸，并且可以潜在地用作聚合酶的模板。
在某些实施方式中，第二引物在其5’末端包含第二引物的附加区段(附加序列变体P2)。可选地，所述区段包含10-50个核苷酸的序列，其不干扰靶序列的扩增程序(例如不与引物形成二级结构)。此外，所述区段可选地包含第二引物的可复制区域的约5-15个核苷酸的序列。附加序列变体P2包含作为单体(A、C、G、T)的天然核苷酸，并且可以潜在地用作聚合酶的模板。
已观察到，与仅包含第一引物或仅包含第二引物的寡核苷酸相比，这种包含第一引物和附加序列变体P1的寡核苷酸或包含第二引物和附加序列变体P2的寡核苷酸不易发生副反应。在某些实施方式中，例如，可延迟非特异性引物二聚体结构的生成和/或扩增。在这种副反应中，因此可以可选地减少或延迟不包含靶序列的副产物的形成。例如，这样可减少或延迟引物的过早消耗。例如，如果通过副反应生成包含第一引物的引物二聚体(PD P1)或包含第二引物的引物二聚体(PD P2)并且导致反应中引物的过早消耗，则使用此类寡核苷酸是有利的。当在扩增反应中观察到非特异性反应时，在某些实施方式中，使用具有这种附加结构的引物(具有附加序列变体P1的第一引物和/或具有附加序列变体P2的第二引物)是有利的。有几个因素有助于此类副作用，这些因素包括：
·更长的反应时间(例如1-100h)；
·使用更高浓度的引物(例如1μmol/l至1mmol/l)；
·使用更高浓度的聚合酶(例如浓度高于10单位/10μl)；
·多重反应(例如在一种反应方法中扩增10个以上不同的靶序列)；以及
·反应混合物中高浓度的复杂核酸链(例如浓度超过每50μl中1μg hgDNA)。
单独的或与其他因素结合的各因素均可促进副反应。
一般而言，可通过优化反应组分和/或反应条件来防止副反应(例如非特异性引物-二聚体的形成)，例如通过降低单个组分的浓度、缩短反应时间、设计引物序列、选择更严格的反应条件。在有利的实施方式中列出的附加序列区段(包含第一引物和附加序列变体P1的寡核苷酸或包含第二引物和附加序列变体P2的寡核苷酸)代表延迟某些副反应的另一种可能性。
在实施例中，显示了具有附加序列区段的寡核苷酸引物。在所述实施方式中，使用不参与靶序列的特异性扩增并且有助于延迟副反应的附加序列区段。因此，使用包含第一引物和附加序列变体P1的寡核苷酸以及包含第二引物和附加序列变体P2的寡核苷酸。
本领域技术人员将认识到，除了有利于靶序列特异性扩增的引物结构(该结构也可称为“基本结构”或“最小结构”)之外，寡核苷酸还可包含另外的附加序列区段(例如附加序列变体P1或附加序列变体P2)。这种附加序列区段可提供多种其他有利或有用的性质或功能。
检测***的某些实施方式
所述检测***包括至少一种荧光报告剂(报告剂)和至少一种寡核苷酸探针，其能够与扩增期间形成的至少一种引物延伸产物杂交。此外，检测***可包括与荧光报告剂匹配的荧光淬灭剂(称为淬灭剂)，使得该淬灭剂能够在某些情况下降低荧光报告剂的荧光信号或降低信号强度。此外，检测***可包括与荧光报告剂匹配的供体荧光团，使得该供体荧光团能够在某些情况下通过能量转移而使荧光报告剂的荧光信号成为可能。此外，检测***可包括对照寡核苷酸，其中所述对照寡核苷酸包含荧光报告剂或供体荧光团或荧光淬灭剂。
寡核苷酸探针和/或对照寡核苷酸上的单个成员(荧光报告剂、荧光淬灭剂、供体荧光团)的排列应导致在存在引物延伸产物的情况下荧光报告剂的荧光信号发生改变，从而形成各自互补的复合体。
熟练的技术人员知道在过去的20年里在实时PCR领域中已开发出的大量报告剂***。这些包括具有自互补区段的探针，例如分子信标、基于核酸外切酶降解的探针(所谓的Taqman探针，其使用Taq聚合酶的5'-3’核酸酶活性进行特异性切割)、具有两个寡核苷酸的探针***(这两个寡核苷酸用FRET对标记，且能够与一条链结合以产生信号)、基于引物的探针(例如基于LUX引物的探针，当自互补结构在反向合成中展开时LUX引物会改变信号强度)、“Scorpion引物”(其区段与由引物合成的链互补)等。一些探针可以在信号采集期间用作端点测量(例如分子信标)。一些探针用于检测PCR的动力学，例如5'-3’核酸酶探针。在文献中已知探针和荧光报告剂、荧光淬灭剂和供体荧光团的许多不同布置。还已知许多荧光报告剂淬灭剂和荧光报告剂-供体荧光团(也称为供体-受体对或FRET对)(“FluorescentEnergy Transfer Nucleic Acid Probes”Ed.Didenko，2006，for example Chapter 1 and2：Product Description“Flurescent Molecular Probes”，published by Gene LinkInc.)。大多数探针是为基于PCR的方法而开发的，其中使用了引物、探针以及所使用的聚合酶(例如具有3’-核酸外切酶(FEN))的特异性排列。
通常，这种探针可或多或少地与扩增期间生成的DNA片段特异性地结合，其中信号仅由于这种结合或还结合有其他事件(例如核酸酶降解或另一寡核苷酸与相邻区段结合)而改变。这种变化可被检测和量化。
由于在第二扩增中使用了PCR，因此也可使用这种已知的技术和探针。寡核苷酸探针的序列与反应期间生成的扩增产物相适应。
探针的选择还取决于例如是否必须通过靶序列特异性探针来检测靶序列的某个变体，或者是否仅记录引物的消耗(作为扩增的标志)。因此，可根据任务选择不同的探针格式。
因此，在下文中，将讨论针对一些实施方式的这种修改的细节。
多相形式
两个扩增***的组分在第一扩增开始时都被分离了，因此寡核苷酸探针或PCR引物不会对第一扩增反应产生影响。相反，在完成第一扩增后，将等分试样从第一扩增转移至第二扩增。第一扩增***的反应组分的所得稀释物有利于使用PCR反应已知的探针结构。例如，在浓度小于100nmol/l(尤其小于10nmol/l，尤其小于1nmol/l，尤其小于0.01nmol/l)的对照寡核苷酸存在的情况下，探针与形成的引物延伸片段的互补区段的结合在PCR条件下几乎不受影响，因此可使用技术人员已知的基于探针的检测方法。
寡核苷酸探针可以与形成的引物延伸产物之一(例如第三和第四引物延伸产物)结合，并且该结合事件可通过各种技术(例如通过使用Taqman探针和Taq聚合酶或通过将“分子信标”结合到相应引物延伸产物的互补区段上)来检测。
均相形式
在均相形式中，两个扩增***的组分在第一扩增开始时处于同一批料，因此可以与其他组分相互作用并介入某些过程。尤其是有效浓度的对照寡核苷酸(例如有效浓度为0.01-10μmol/l)和寡核苷酸探针(例如有效浓度为0.01-10μmol/l)的存在会导致这些组分之间的相互作用，从而影响这些步骤的子步骤或结果。因此，必须考虑以下方面：
·对照寡核苷酸的存在会影响寡核苷酸探针与形成的引物延伸产物的结合。例如，如果探针和对照物在与引物延伸产物互补的区段中包含明显的重叠(例如，对照物和寡核苷酸探针的第三区段可以与第一和/或第三引物延伸产物的相同区段部分地杂交)，则属于这种情况。因此，限制这种重叠的范围是有利的。例如，可调整对照物和探针中的区段的长度，以尽量减少重叠。优选地，如果序列区段与形成的引物延伸产物互补地结合，则这些序列区段不重叠。
·寡核苷酸探针可以在必要时与对照寡核苷酸结合，并在发生链置换时对其产生影响。例如，如果对照寡核苷酸和寡核苷酸探针均包含一区段，则会发生这种情况，由此导致在对照物与探针之间形成双链复合体。因此，限制这种互补区段的范围是有利的。例如，可调整对照物和探针中的区段的长度，以使它们显示出尽可能少的互补性。优选地，对照物和探针不包含互补序列区段。
由于这些原因，例如，以均相形式设计寡核苷酸探针是有利的，使得它优先与第一或第三引物延伸产物的3’区段杂交。这些区段不与对照寡核苷酸杂交。本发明的另一重要方面是从第一扩增切换到第二扩增时可能发生聚合酶变化：第一聚合酶可被灭活，第二聚合酶可被激活。例如，这允许在第二扩增期间使用5’-3’核酸酶敏感探针(“Taqman探针”)。例如，在第一扩增中，优选Bst聚合酶大片段。该片段不能切割Taqman探针。在第二扩增开始时，Bst聚合酶大片段被灭活，Taq聚合酶(例如用作热启动聚合酶)被激活。这允许使用5’-3’核酸酶敏感探针。
根据荧光报告剂和/或供体荧光团和/或荧光淬灭剂之间所选择的构象，这种变化可导致荧光报告剂的信号强度升高或降低。在过期反应期间或之后，可通过已知的适当方法(例如在诸如StepOne-PCR或Lightcycler或Rotorgene之类的实时PCR装置中，请参见制造商提供的说明书)检测这种变化。对信号变化的检测可得出关于反应过程的结论：例如信号幅度、动力学、信号出现的时间或浓度依赖性。如果使用多个靶序列，则可通过不同的光谱特性对多重分析进行相应编码，从而可并行观察到多个反应。
本发明描述了寡核苷酸探针的各种实施方式，其对于检测反应进程尤其有利。
寡核苷酸探针是优选由DNA核苷酸组成的寡核苷酸。在除DNA之外的一实施方式中，该寡核苷酸可以由其他核苷酸单体(例如RNA或核苷酸修饰(例如带有诸如PTO或LNA或2'-O-Me之类的糖磷酸主链修饰))组成。在另一实施方式中，该寡核苷酸样品是包含DNA和非DNA成员(例如RNA、PTO LNA)的混合聚合物。所述寡核苷酸探针可包含其他寡核苷酸修饰，例如接头或间臂(例如C3、HEG、无碱基单体，例如THF修饰)。
寡核苷酸探针的碱基组合物优选包含可在杂交条件下与天然核碱基(A、C、T、G)互补地结合的碱基。在另一实施方式中，该探针还包含修饰，该修饰例如包含通用碱基(例如肌苷、5-硝基吲哚)。探针可包含影响寡核苷酸结合行为的其他修饰，例如MGB修饰。
寡核苷酸探针的长度优选为8-80个核苷酸，尤其为12-80个核苷酸，尤其为12-50个核苷酸，尤其为12-35个核苷酸。寡核苷酸探针通常包含可以与所形成的至少一种产物互补地结合的区段。在一实施方式中，寡核苷酸探针包含至少一个不能与所形成的引物延伸产物之一互补地结合的其他区段。
探针可相对于扩增***的其他组分不同地布置。因此，某些实施方式是优选的：
在一实施方式中，寡核苷酸探针包含与所形成的引物延伸产物(P1.1-Ext、P2.1-Ext、P3.1-Ext、P4.1-Ext)中的至少一种基本互补的序列区段，该序列区段可以在适当条件下与所形成的引物延伸产物中的至少一种杂交(杂交条件)。在另一实施方式中，该序列区段与第一和/或第三引物延伸产物互补。在另一实施方式中，该序列区段与第一和/或第三引物延伸产物互补，其中所述寡核苷酸探针可以与未与所述对照寡核苷酸互补地结合的各引物延伸产物的3’区段互补地结合。在另一实施方式中，所述序列区段与第二和，或第四引物延伸产物互补。在另一实施方式中，寡核苷酸探针的所述序列区段的长度为10-50个核苷酸，尤其为15-40个核苷酸，尤其为15-30个核苷酸。在另一实施方式中，寡核苷酸探针的所述序列区段不包含与对照寡核苷酸基本互补的序列区域。在另一实施方式中，寡核苷酸探针序列的所述区段包含与对照寡核苷酸基本互补的序列区域，其中所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
在另一实施方式中，寡核苷酸探针的所述序列区段不包含与寡核苷酸引物之一基本互补的序列区域。在另一实施方式中，寡核苷酸探针的所述区段包含与寡核苷酸引物之一基本互补的序列区域，其中所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
在另一实施方式中，寡核苷酸探针的所述序列区段不包含与对照寡核苷酸的第三区域的序列基本相同的序列区域。在另一实施方式中，寡核苷酸探针序列的所述区域包含与对照寡核苷酸的第三区域的序列基本相同的序列区域，其中所述区段的长度小于20个核苷酸，尤其小于15个核苷酸，尤其小于10个核苷酸，尤其小于5个核苷酸。
在一实施方式中，所述对照寡核苷酸包含以下组分之一(荧光报告剂和/或荧光淬灭剂和/或供体荧光团)，其中这些组分中的至少一个位于对照寡核苷酸的第三区域。
在一实施方式中，寡核苷酸探针可被5’-3’核酸酶至少部分地切割。在一实施方式中，对照寡核苷酸至少可在其5’区段(对照物的第三区域)被5’-3’核酸酶切割。
在另一实施方式中，寡核苷酸探针包含与靶序列或其扩增产物之一所包含的区段基本互补的序列区段，其中所述区段的长度为5至50个核苷酸，尤其为10至40个核苷酸，尤其为15至30个核苷酸。
在另一实施方式中，寡核苷酸探针不包含与靶序列或其互补链基本互补的序列区段。例如，它可以是
在一实施方式中，寡核苷酸探针的3’端被修饰(例如荧光团或淬灭剂或供体)阻断，或被可阻止聚合酶将寡核苷酸用作引物的另一修饰(例如磷酸酯残基或C3接头或双脱氧核苷酸修饰)阻断。
在另一实施方式中，寡核苷酸探针的3’端是游离的，且可以与第一引物延伸产物互补地结合，并通过聚合酶开始合成。这使得寡核苷酸探针像引物一样被延伸，从而形成探针延伸产物。
在一实施方式中，探针的序列组成与引物的序列组成相对应。
取决于寡核苷酸探针的实施方式，荧光报告剂、荧光淬灭剂或供体荧光团的位置可以不同。所述成员可共价结合在寡核苷酸探针的各末端之一或中间区域上。许多这样的修饰是技术人员已知的，例如将FAM报告剂偶联至核苷酸的3’端或5’端，或使用dT-BHQ1或dT-FAM或dT-TMR修饰来偶联探针的中部或内部序列区段。此类修饰的寡核苷酸探针可以从商家(例如Sigma-Aldrich、Eurofins、IDT、Eurogentec、Thermofisher Scientific)获得。
例如，寡核苷酸探针包含至少一个序列区段，该序列区段可以在检测步骤的适当反应条件下与在扩增期间形成的第三或第四引物延伸产物基本互补地结合。在该过程中，寡核苷酸探针例如与合成的第三引物延伸产物的单链3’区段或第四引物延伸产物的合成5’区段互补地结合。这种探针不包含与对照物相同或与对照物互补的任何序列区段。因此，生成了一种包含引物延伸产物和寡核苷酸探针的复合体。寡核苷酸探针和对照寡核苷酸与合成的第三引物延伸产物的结合优选是序列特异性的。与第一引物延伸产物的3’区段互补的该序列区段的长度范围例如为8-80个核苷酸，尤其为12-80个核苷酸，尤其为12-50个核苷酸，尤其为12-35个核苷酸，尤其为15-25个核苷酸。
包含与寡核苷酸探针或对照寡核苷酸结合的至少一个荧光报告剂的检测***可根据寡核苷酸探针与互补序列的结合来改变荧光报告剂的信号产生或信号强度。取决于检测***的实施方式，该改变可导致信号的产生或增减。
在扩增期间，将第三和第四引物延伸产物分开，以使第三引物延伸产物的3’区段和第四引物延伸产物的相应片段以单链形式存在。寡核苷酸探针可在反应期间或仅在反应完成后才与第三引物延伸产物的3’区段或第四引物延伸产物的5’区段结合。
这种结合本质上是序列特异性的，但是也可容许偏离完全互补性。
寡核苷酸探针的结合优选不阻止扩增。调整探针的浓度及其长度，以使足够数量的引物可引发引物延伸产物的合成。
随着反应的进行，形成足够数量的引物延伸产物，使得寡核苷酸探针也可以充分结合以引起可检出的信号变化。
在一实施方式中，包含至少一个荧光报告剂的合适的检测***还包含至少一个与荧光报告剂匹配的荧光淬灭剂。荧光淬灭剂(也称为淬灭剂)可因此发挥其作为接触淬灭剂或FRET淬灭剂的功能。合适的实施例在文献(“Fluorescent Energy Transfer NucleicAcid Probes'’Ed.Didenko，2006，for example Chapter 1 and 2：Product Description“Flurescent Molecular Probes”，published by Gene Link Inc)中已知。例如，荧光报告剂可以是荧光素(FAM)，并且合适的荧光淬灭剂可以是BHQ-1或BHQ-2或TAMRA。在一实施方式中，鸟苷核碱基可作为淬灭剂(例如与作为报告剂的FAM结合)。当用合适的光波长激发荧光报告剂时，在没有淬灭剂的情况下发出荧光信号。然而，如果荧光报告剂和合适的淬灭剂非常靠近，则荧光报告剂的强度会降低。随着荧光报告剂和淬灭剂的距离/间隔的增加，信号强度升高。
在一实施方式中，包含至少一个荧光报告剂的另一合适的检测***还包含至少一个与荧光报告剂匹配的供体荧光团(也称为供体)，从而形成FRET对。合适的实施例在文献(“Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes'’Ed.Didenko，2006，forexample Chapter 1 and 2：Product Description“Fluorescent Molecular Probes”，published by Gene Link Inc)中已知。FRET对通常包括供体和受体(通常由报告剂充当受体)。例如，荧光报告剂可能是四甲基罗丹明(TAMRA)，FRET对的合适伙伴可能是FAM(供体)，另一实施例是FAM(供体)和Cy3(作为受体或报告剂)。在空间接近的情况下，施主(例如FAM)的激发使能量转移到报告剂(TAMRA或Cy3)，因此报告剂本身能够以电磁辐射(可检出的光信号或荧光信号)的形式发射能量。报告剂的这种荧光信号可通过适当的方式检出。随着报告剂和供体荧光团的空间距离增加，信号逐渐减弱，并且通常在超过50个核苷酸(以双链的50个核苷酸测量)的距离处不再可检出。
通过将检测***的各成员适当地定位在寡核苷酸探针和/或对照寡核苷酸上，可通过信号增减来检测这些组分与第一引物延伸产物的结合事件。
这种检测可以在扩增期间进行(例如在线检测)，也可以按适当的时间间隔进行，也可以仅在反应结束时进行。
荧光信号是在一个检测步骤中获得的。在该方法的检测步骤中，应检查寡核苷酸探针是否与第一引物延伸产物(P1-Ext)的3’区段互补地结合。因此，在检测步骤中，调整反应温度，以使探针能够与第一引物延伸产物的3’区段基本互补地结合。所述温度可对应于扩增期间的温度之一，或可代表与扩增温度步骤分开的一步骤。
在所述步骤期间，可通过光源使用合适波长的光来激发反应。根据检测***的设计，使波长与荧光报告剂或供体荧光团的吸收光谱相适应。如果寡核苷酸探针可以与合成的第一引物延伸产物的3’端结合，则可预期来自荧光报告剂的信号。所述信号具有波长的特征光谱，并且可通过适当的检测***来检测和量化。当前的实时PCR设备通常包括用于激发的光源和用于检测报告剂荧光的检测***，以及用于反应批料的温控容器。实时PCR设备(例如StepOne或LightCycler或RotorGene)就是一很好的实施例。
该检测可用于量化反应中存在的一个或多个起始核酸链。此外，所述检测可用于检测反应开始时起始核酸链的可用性。此外，检测***可以与内部扩增控制结合使用。
在另一实施方式中，两条或更多条核酸链可以在一扩增批次中被特异性地扩增。例如，可使用特异性的第一引物和/或特异性的对照寡核苷酸和/或特异性的第二引物的组合。例如，靶序列和内部扩增控制在一批中被扩增。因此，有利的是在各核酸链的扩增期间单独且独立地进行所述核酸链的检测。
在一实施方式中，在每种情况下都使用特定的检测***，因而在每种情况下都通过特定的检测***来监测核酸链的扩增。来自荧光报告剂的特定信号可同时被检出。优选地，荧光报告剂的光谱特性不同到它可通过在特征波长下检测相应的荧光信号来完成的程度。例如，可使用两个或三个或四个荧光报告剂。在荧光光谱的最大强度(荧光峰)下测得的荧光信号的各自特定波长优选大于约10nm，尤其大于约20nm，尤其大于约30nm。这样的组合是已知的。例如，包括FAM和/或Cy3和/或Cy5或FAM和/或HEX和/或ROX的组合是合适的。优选地针对每个荧光报告剂分别选择各自的淬灭剂，使得通过淬灭剂能够高效地减弱信号。例如，使用FAM/BHQ-1与HEX/BHQ-2或FAM/BHQ-1与Cy5/BHQ-2的组合。
在另一实施方式中，可使用检测***来监测一组不同核酸链的扩增情况。所述基团可包含两个或更多个待扩增核酸链。检测***的组分相应地被调整。在一实施方式中，这样的一组不同的待扩增核酸链例如包含至少一个对寡核苷酸探针具有特异性的均匀序列区段，该序列区段用于在检测步骤的反应条件下与寡核苷酸探针互补地结合。在另一实施方式中，这样的一组不同的待扩增核酸链例如包含至少一个与寡核苷酸探针主要互补地结合的序列区段，其中该序列区段的序列组成在该组内是不同的。这些不同可包括1-10个核苷酸，优选1-3个核苷酸。
在以下各项中可找到其他方面和实施方式，其对本发明做了说明，但本发明不限于此：
1.一种用于扩增核酸的方法，其中：
a)样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M[以及与M(反向)互补的序列M’]，其中M包含紧邻序列中5’-3’方向上的序列区段MPL、MS和MPR，并且在第一扩增步骤中与以下组分接触：
b)第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子；
c)第一左寡核苷酸引物PL1，其与MPL(基本)相同；
d)第一右寡核苷酸引物PR1，其在5'-3’方向包含连续的序列区段PCR和PMR，其中PMR具有与MPR互补[可基本上序列特异性地结合]的[杂交]序列，而序列区段PCR不能与M[或相对于序列M紧随3’方向上MPR的序列]结合；
其中，PR1(尤其是在区段PCR中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得PCR不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；以及
e)对照寡核苷酸CR，其在5'-3’方向包含连续的序列区段CSR、CPR和CCR，其中CSR与MPR的5’方向上的MS区段相同[并且在PR的聚合酶启动时首先被读取，即CSR可以与引物PR1的聚合产物结合]，CPR与PMR互补(并且与MPR相同)，并且CCR与PCR互补；
其中，CR含有在CSR中修饰的核苷酸结构单元，因此CSR不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板。
2.如第1项所述的用于扩增核酸的方法，其中获得第一引物延伸产物PR1’，其在5'-3’方向上除了序列区域PCR和PMR之外，还包含与靶序列M基本互补的合成区域PSR，且该靶序列M所在的区域与5’方向上的MPR相邻；其中，获得了第二引物延伸产物PL1’，其除了序列区域MPL之外，还包含与靶序列M基本相同的合成区域PSL，且该靶序列M所在的区域与3’方向上的MPL相邻；
其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择PCR和MS的长度和解链温度(如果适用)，
以使PR1’可以与M形成双链[PL1’可以与M’形成双链][PR1’可以与PL1’形成双链]，且PR1’可以与C形成双链，并且与形成具有M的PR1’双链相比，优选形成PR1’和C的双链[至少在MPR区域中]。
3.如第2项所述的用于扩增核酸的方法，其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择PCR和(适当时)MS的长度和解链温度以及/或者MPL和MPR的位置，
以使在没有所述对照寡核苷酸CR的情况下，所述第一引物延伸产物PR1’不会与所述第二引物延伸产物PL1’分离。
4.如前述项目中的任一项所述的方法，其中在第二扩增步骤中使所述样品与以下组分接触：
a)与第一次级引物结合区域MPL2相同的第二左寡核苷酸引物PL2；以及
b)与区域MPR2互补的第二右寡核苷酸引物PR2；
其中，MPL2和MPR2包含在M中，并且MPL2的3’端(至少20个位置)位于MPR2的5’端的5’方向上(尤其是MPL2与MPL相同以及/或者MPR2与MPR相同)。
5.如第4项所述的方法，其中PL2和/或PR2分别[直接]包含在与MPL2相同或与MPR2互补的序列部分(序列部分PCL2或PCR2)的5’方向上。
6.如前述第1-5项之一所述的方法，其中第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸和合适的辅因子)在所述第二扩增步骤中与所述样品接触。
7.如上述第1-6项中的任一项所述的方法，其特征在于：修饰的核苷酸结构单元包括2'-O-烷基核糖核苷结构单元，尤其是2'-O-甲基核糖核苷结构单元。
8.如前述第1-7项之一所述的方法，其特征在于：第一扩增步骤基本上是等温进行的。
9.如前述第1-8项中的任一项所述的方法，其特征在于：MS的长度为20-200个核苷酸。
10.如前述第1-9项中的任一项所述的方法，其特征在于：PR1的长度为15-100个核苷酸。
11.如前述第1-10项之一所述的方法，其特征在于：PCR的长度为5-85个核苷酸，尤其是PCR的长度为所述序列区段PMR的长度的50％至300％。
12.如前述第1-11项中的任一项所述的方法，其特征在于：CR(对照寡核苷酸)的长度为20-100个核苷酸。
13.如前述第1-12项中的任一项所述的方法，其特征在于：所述第一扩增和所述第二扩增在同一反应批次中进行。
14.如前述第1-13项之一所述的方法，其特征在于：所述第二模板依赖性核酸聚合酶是一种耐热聚合酶，尤其是一种耐热DNA聚合酶。
15.如前述第1-14项之一所述的方法，其特征在于：所述第一模板依赖性核酸聚合酶是热灭活的，尤其是所述第一模板依赖性核酸聚合酶是嗜中温聚合酶。
16.如前述第1-15项之一所述的方法，其特征在于：所述第二模板依赖性核酸聚合酶、所述第二右寡核苷酸引物PR2和/或所述第二左寡核苷酸引物PL2可被激活和/或所述对照寡核苷酸CR可被灭活。
17.如前述第1-16项之一所述的方法，其特征在于：在完成所述第一扩增步骤之后，使所述第二扩增步骤的组分与所述样品接触。
18.如前述第1-17项中的任一项所述的方法，其特征在于：CSR和CPR中的CR包含可序列特异性地与所述第二右寡核苷酸引物PR2结合的序列区域。
19.如前述第1-18项中的任一项所述的方法，其特征在于：所选择的反应条件(尤其是所述第一扩增步骤的反应条件)包括在25℃至80℃(尤其是50℃至70℃)范围内的反应温度。
20.一种试剂盒，用于实施如第1-19项之一所述的方法，该试剂盒包含：
-第一右寡核苷酸引物PR1，其在5'-3’方向包含连续的序列区段PCR和PMR；其中PMR能够与(尤其是哺乳动物的)真核生物或致病细菌的基因组序列M的引物结合位点MPR结合，尤其是与人类靶序列结合；其中M在5'-3’方向包含连续的序列区段MPL、MS和MPR，并且所述序列区段PCR不能与直接位于MPR的3’方向上的序列结合；其中：
PR1(尤其是在所述区段PCR中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得PCR不能用作所述第一模板依赖性核酸聚合酶的活性的模板；
-第一左寡核苷酸引物PL1，其与MPL(基本)相同；
-对照寡核苷酸CR，其在5’-3’方向包含连续的所述序列区段CSR、CPR和CCR，其中CSR与MPR的5’方向上的MS区段相同[并且在PR的聚合酶启动时首先被读取，由此CSR可以与引物PR1的聚合产物结合]，CPR与PMR互补(并且与MPR相同)，并且CCR与PCR互补；
其中，在CSR中的CR包含核苷酸结构单元，这些核苷酸结构单元的修饰方式使得CSR不能用作所述模板依赖性核酸聚合酶的活性的模板；
-与第一次级引物结合区域MPL2相同的第二左寡核苷酸引物PL2；以及
-与区域MPR2互补的第二右寡核苷酸引物PR2；
其中，MPL2和MPR2包含在M中，并且MPL2的3’端(至少20个位置)位于MPR2的5’端的5’方向上(尤其是MPL2与MPL相同以及/或者MPR2与MPR相同)。
21.如第20和21项之一所述的试剂盒，还包含第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)所述DNA聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子，尤其是嗜中温模板依赖性聚合酶，尤其是无5'-3’核酸外切酶活性的嗜中温模板依赖性聚合酶。
22.如第20和21项之一所述的试剂盒，还包含第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)所述模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子，尤其是嗜热模板依赖性聚合酶，尤其是有5'-3’核酸外切酶活性的嗜热模板依赖性聚合酶。
23.一种用于扩增核酸的方法，包括下列步骤：
a)第一扩增，包括下列步骤：
-使第一寡核苷酸引物(P1.1)与包含靶序列的待扩增核酸杂交，其中所述第一寡核苷酸引物(P1.1)包含下列区域：
·第一区域，其可序列特异性地与所述待扩增核酸的区域结合，其中所述待扩增核酸的区域至少包含所述靶序列的5’末端或位于所述靶序列的5’方向；以及
·第二区域，其与所述第一区域的5’端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被所用的聚合酶复制；
-通过第一聚合酶延伸所述第一寡核苷酸引物(P1.1)，以获得第一引物延伸产物(P1.1-Ext)，所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)除了第一寡核苷酸引物(P1.1)之外，还包含与所述待扩增核酸或所述靶序列基本互补的合成区域，其中所述第一引物延伸产物和所述待扩增核酸以双链形式存在；
-对照寡核苷酸(C1.1)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)结合，其中所述对照寡核苷酸(C1.1)包含下列区域：
·第一区域，其可以与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的第二区域(突出端)结合；
·第二区域，其与所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的所述第一区域基本互补；以及
·第三区域，其与所述引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述第一区段的所述合成区域的至少一部分基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸(C1.1)不用作所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的引物延伸的模板，并且所述第一对照寡核苷酸(C1.1)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述第一和第二区域结合，同时置换与所述第一和第二区域互补的所述待扩增核酸的所述区域；
-使第二寡核苷酸引物(P1.1)与所述第一引物延伸产物杂交，其中所述第二引物(P2.1)包含一区域，该区域能够序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述合成区域结合，该合成区域至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向；
-通过所述第一聚合酶延伸所述第二寡核苷酸引物(P2.1)，以获得第二引物延伸产物(P2.1-Ext)，所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)除了所述第二寡核苷酸引物(P2.1)之外，还包含与所述待扩增核酸或所述靶序列基本相同的合成区域，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第二引物延伸产物(P2.1)形成第一双链扩增产物；
(b)第二扩增，包括下列步骤：
-使第三寡核苷酸引物(P3.2)与所述第一扩增产物的所述第二引物延伸产物(P1.1-Ext)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物(P3.2)包含第一区域，该第一区域可序列特异性地与所述第二引物延伸产物(P1.1-Ext)的区段结合，且至少包含所述靶序列的5’末端或位于其5’方向；
-通过第二聚合酶来延伸所述第三寡核苷酸引物(P3.2)，以获得第三引物延伸产物(P3.2-Ext)，该第三引物延伸产物(P3.2-Ext)除了所述第三寡核苷酸引物(P3.2)之外，还包含与所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)或所述靶序列基本互补的合成区段，其中所述第二引物延伸产物(P2.1)和所述第三引物延伸产物(P3.1)以双链形式存在；
-使第四寡核苷酸引物(P4.2)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)杂交，其中所述第四引物(P4.2)包含第一区域，该第一区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述合成区域结合，该合成区域至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向；
-通过所述第二聚合酶来延伸所述第四寡核苷酸引物(P4.2)，以获得第四引物延伸产物(P4.2-Ext)，该第四引物延伸产物(P4.2-Ext)除所述第四寡核苷酸引物外，还包括与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)基本互补或与所述靶序列基本相同的合成区域，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
-将第一引物延伸产物(P1.1-Ext)与第四引物延伸产物(P4.2-Ext)构成的双链分开，以及将第二引物延伸产物(P2.1)与第三引物延伸产物(P3.1)构成的双链分开；
-使所述第三寡核苷酸引物(P3.2)与所述第四引物延伸产物(P4.2-Ext)杂交，并通过所述第二聚合酶来延伸所述第三寡核苷酸引物(P3.2)；以及
-使所述第四寡核苷酸引物与所述第三引物延伸产物(P3.2-Ext)杂交，并通过所述第二聚合酶来延伸所述第四寡核苷酸引物(P4.2)。
24.如第23项所述的方法，其特征在于：重复所述第一扩增的步骤，直到所述第一扩增产物的拷贝数量为10至100,000,000,0000，尤其为100至1,000,000,000，尤其为1,000至100,000,000。
25.如第23或24项所述的方法，其特征在于：所述第三寡核苷酸引物和/或所述第四寡核苷酸引物具有与所述第一区域的5’端邻接或通过接头连接的第二区域，其中所述第二区域不能与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)或所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)互补地结合。
26.如前述第23-25项之一所述的方法，其特征在于：所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第四引物延伸产物(P4.2-Ext)的双链分离，以及所述第二引物延伸产物(P2.1)和所述第三引物延伸产物(P3.1)的双链分离是通过热变性进行的，尤其是在范围为85℃至105℃的温度下进行的。
27.如前述第23-26项之一所述的方法，其特征在于：所述第一聚合酶和所述第二聚合酶是相同的。
28.如前述第23-27项之一所述的方法，其特征在于：
-所述第一寡核苷酸引物(P1.1)和所述第三寡核苷酸引物(P3.2)基本相同；以及/或者
-所述第二寡核苷酸引物(P2.1)和所述第三寡核苷酸引物(P4.2)基本相同。
29.如前述第23-28项之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增和所述第二扩增在同一反应批次中进行。
30.如第29项所述的方法，其特征在于：所述第二聚合酶、所述第三寡核苷酸引物(P3.1)和/或所述第四寡核苷酸引物(P4.1)可被激活，以及/或者所述对照寡核苷酸可被灭活。
31.如前述第23-28项之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增在第一反应批次中进行，所述第二扩增在第二反应批次中进行。
32.如第31项所述的方法，其特征在于：将所述第一反应批料或全部的第一反应批次的等分试样添加到所述第二反应批次中。
33.如前述第23-32项之一所述的方法，其特征在于：所述对照寡核苷酸(C1.1)包含可序列特异性地与所述第三寡核苷酸引物(P3.2)结合的第四区域。
34.如前述第23-33项之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增基本上是等温进行的。
35.如前述第23-24项之一所述的方法，其特征在于：所述第一寡核苷酸引物(P1.1)在所述第二区域(尤其紧随所述第一寡核苷酸引物的所述第一区域)具有一个或多个修饰，其将所述第一聚合酶终止在所述第二区域。
36.一种试剂盒，用于实施如第23-35项之一所述的方法，该试剂盒包含：
-第一寡核苷酸引物(P1.1)，其包含下列区域：
·第一区域，其可序列特异性地与所述待扩增核酸的区域结合，其中所述待扩增核酸的所述区域至少包含所述靶序列的5’末端或位于所述靶序列的5’方向；以及
·第二区域，其与所述第一区域的5’末端相邻或通过接头连接，其中所述第二区域可以与第一对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被扩增所用的聚合酶复制；
其中，所述第一寡核苷酸引物(P1.1)可通过聚合酶延伸至包含合成区域和所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的第一引物延伸产物(P1.1-Ext)；
-第二寡核苷酸引物(P2.1)，其中所述第二寡核苷酸引物(P2.1)包含一区域，该区域可序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述合成区段结合，所述合成区段至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向，并且可通过聚合酶延伸至第二引物延伸产物(P2.1-Ext)，该第二引物延伸产物(P2.1-Ext)除了第二寡核苷酸引物(P2.1)之外还包含一合成区段；
-对照寡核苷酸(C1.1)，其包含下列区域：
·第一区域，其可以与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述第二区域结合；
·第二区域，其与所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的所述第一区域基本互补；以及
·第三区域，其与所述引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述第一区域的所述合成区域的至少一部分基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸(C1.1)不用作所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的引物延伸的模板，并且所述对照寡核苷酸(C1.1)可以与所述第一寡核苷酸延伸产物(P1.1-Ext)的所述第一和第二区域结合，同时置换与所述第一和第二区域互补的所述待扩增核酸的所述区域；
-第三寡核苷酸引物(P3.2)，其中所述第三寡核苷酸引物(P3.2)包含第一区域，该第一区域可序列特异地与所述第二引物延伸产物(P1.1-Ext)的一区域结合，该区域至少包含所述靶序列的5’末端或位于其5’方向，并且可通过聚合酶延伸至第三引物延伸产物(P3.2-Ext)，该第三引物延伸产物(P3.2-Ext)除了所述第三寡核苷酸引物(P3.2)之外还包含一合成区域；以及
-第四寡核苷酸引物(P4.2)，其中所述第四寡核苷酸引物(P4.2)包含第一区域，该第一区域可序列特异地与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)的所述合成区域结合，该合成区域至少与所述靶序列的5’末端互补或位于其3’方向，并且可通过聚合酶延伸至第四引物延伸产物(P4.2-Ext)，该第四引物延伸产物(P4.2-Ext)除了所述第四寡核苷酸引物(P4.2)之外还包含一合成区域。
37.如第36项所述的试剂盒在实施如第23-35项中的任一项所述的方法中的用途。
38.一种用于扩增核酸的方法，包括下列步骤：
a)第一扩增，包括下列步骤：
-提供包含靶序列的起始核酸1.1；
-使第一寡核苷酸引物(P1.1)与带有靶序列的待扩增核酸(起始核酸1.1或P2.1-Ext)杂交，其中所述第一寡核苷酸引物(P1.1)包含下列区域：
·第一区域(P1.1.1)，其可序列特异性地与待扩增核酸的区域(P2.1E1)结合；以及
·第二区域(P1.1.2)，其与所述第一区域的5’端邻接或通过接头连接，其中所述第二区域可以与对照寡核苷酸结合，并且在所选择的反应条件下基本上未被所用的聚合酶复制；
-通过第一聚合酶延伸所述第一寡核苷酸引物(P1.1)，以获得第一引物延伸产物(P1.1-Ext)，所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)除了所述第一寡核苷酸引物(P1.1)之外，还包含与所述待扩增核酸或所述靶序列基本互补的合成区段(P1.1E1至P1.1E4)，其中所述第一引物延伸产物和所述待扩增核酸以双链形式存在；
-对照寡核苷酸(C1.2)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)结合，其中所述对照寡核苷酸(C1.2)包含下列区域：
·第一区域(C1.2.1)，其可以与所述第一引物延伸产物(P1.1E6)的所述第二区域(突出端)结合；
·第二区域(C1.2.2)，其与所述第一寡核苷酸引物(P1.1.1)的所述第一区域互补；以及
·第三区域(C1.2.3)，其与所述第一引物延伸产物(P1.1E4)的所述合成区域的至少一部分基本互补；
其中，所述对照寡核苷酸(C1.1)不用作所述第一寡核苷酸引物(P1.1)的引物延伸的模板，并且所述第一对照寡核苷酸(C1.1)与所述第一引物延伸产物(P1.1E6，P1.1E5，P1.1E4)结合，同时将所述待扩增核酸的所述互补区域(P2.1E1，P2.1E2)置换到所述区域；
-使第二寡核苷酸引物(P1.1)与所述第一引物延伸产物杂交，其中所述第二寡核苷酸引物(P2.1)包含区域(P2.1.1)，该区域(P2.1.1)可序列特异性地与所述第一引物延伸产物的所述合成区域(P1.1E1)结合；
-通过所述第一聚合酶延伸所述第二寡核苷酸引物(P2.1)，以生成第二引物延伸产物(P2.1-Ext)，所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)除了所述第二寡核苷酸引物(P2.1)之外，还包含与所述待扩增核酸或所述靶序列基本相同的合成区域(P2.1E4至P2.1E1)，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第二引物延伸产物(P2.1)形成第一双链扩增产物；以及
-应重复所述第一扩增的步骤，直到合成出所需数量的第一扩增产物；
b)第二扩增，包括下列步骤：
-使第三寡核苷酸引物(P3.2)与所述第二和/或第四引物延伸产物(P1.1-Ext或 P4.1-Ext)杂交，其中所述第三寡核苷酸引物(P3.2)包含第一区域(P3.1.1)，该区域(P3.1.1)可序列特异性地与所述第二引物延伸产物(P2.1E1)和所述第四引物延伸产物(P4.1E2)的区域结合；
-通过第二聚合酶来延伸所述第三寡核苷酸引物(P3.2)，以获得第三引物延伸产物(P3.2-Ext)，该第三引物延伸产物(P3.2-Ext)除了所述第三寡核苷酸引物(P3.2)之外，还包含与所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)或所述靶序列基本互补的合成区域(P3.1E5至P3.1E2，或P3.1E5至P3.1E1)，其中所述第二引物延伸产物(P2.1)和所述第三引物延伸产物(P3.1)以双链形式存在；
-使第四寡核苷酸引物(P4.2)与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和/或与所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)杂交，其中所述第四寡核苷酸引物(P4.2)包含第一区段(P4.1.1)，该第一区段(P4.1.1)可序列特异性地与所述第一引物延伸产物(P1.1E1)和所述第三引物延伸产物(P3.1E2)的所述合成区域结合；
-通过所述第二聚合酶来延伸所述第四寡核苷酸引物(P4.2)，以得到第四引物延伸产物(P4.2-Ext)，该第四引物延伸产物(P4.2-Ext)除所述第四寡核苷酸引物外，还包括与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)基本互补或与所述靶序列基本相同的合成区域(P4.1E5至P4.1E2，或P4.1E5至P4.1E1)，其中所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第四引物延伸产物(P4.1-Ext)以双链形式存在；
-分离所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第四引物延伸产物(P4.2-Ext)的双链、所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)和所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)的双链、以及所述第四引物延伸产物(P4.1-Ext)和所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)的双链；
-使所述第三寡核苷酸引物(P3.2)与所述第四引物延伸产物(P4.2-Ext)杂交，并通过所述第二聚合酶来延伸所述第三寡核苷酸引物(P3.2)；以及
-使所述第四寡核苷酸引物与所述第三引物延伸产物(P3.2-Ext)杂交，并通过所述第二聚合酶来延伸所述第四寡核苷酸引物(P4.2)。
39.如第38项所述的方法，其特征在于：重复所述第一扩增的步骤，直到所述第一扩增产物的拷贝数量为10至100,000,000,000，尤其为100至1000,000,000，尤其为1000至100,000,000。
40.如第38或39项所述的方法，其特征在于：所述第三寡核苷酸引物和/或所述第四寡核苷酸引物具有与所述第一区域的5’端相邻的第二区域(分别为P3.1.2或P4.1.2)，其中所述第二区域不能与所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)或所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)互补地结合。
41.如前述第38-40项中的任一项所述的方法，其特征在于：所述第一引物延伸产物(P1.1-Ext)和所述第四引物延伸产物(P4.2-Ext)的双链分离，以及所述第二引物延伸产物(P2.1-Ext)和所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)的双链分离，以及所述第四引物延伸产物(P4.1-Ext)和所述第三引物延伸产物(P3.1-Ext)的双链分离是通过热变性进行的，尤其是在范围为85℃至105℃的温度下进行的。
42.如前述第38-40项之一所述的方法，其特征在于：所述第一聚合酶和所述第二聚合酶是相同的。
43.如前述项目之一所述的方法，其特征在于：
·所述第一寡核苷酸引物(P1.1)和所述第三寡核苷酸引物(P3.2)基本相同；以及/或者
·所述第二寡核苷酸引物(P2.1)和所述第四寡核苷酸引物(P4.2)基本相同。
44.如前述第38-40项之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增和所述第二扩增在同一反应批次中进行。
45.如第44项所述的方法，其特征在于：所述第二聚合酶、所述第三寡核苷酸引物(P3.1)和/或所述第四寡核苷酸引物(P4.1)可被激活，以及/或者所述对照寡核苷酸可被灭活。
46.如前述第38-45项之一所述的方法，其特征在于：用荧光染料标记的第一寡核苷酸探针可以与所述第三引物延伸产物互补地结合，并且检测所述荧光染料的信号。
47.如前述第38-46项之一所述的方法，其特征在于：用荧光染料标记的第一寡核苷酸探针可以与所述第四引物延伸产物互补地结合，并且检测所述荧光染料的信号。
实施例
材料和方法：
试剂购自以下供应商：
未修饰和修饰的寡核苷酸(Eurofins MWG，Eurogentec，Biomers，TrilinkTechnologies，IBA Solutions for Life Sciences)；聚合酶(NEB，New EnglandBiolabs)；dNTP(Jena Bioscience)；插层EvaGreen染料(Jena Bioscience)；缓冲物质及其他化学品(Sigma-Aldrich)；塑料制品(Sarstedt)。
溶液1(扩增反应溶液1)：
谷氨酸钾，50mmol/l，pH 8.0；醋酸镁，10mmol/l；dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP)，各200μmol/l；聚合酶(Bst 2.0热启动，120.000U/ml NEB)，12单位/10μl；Triton x-100，0.1％(v/v)；EDTA，0.1mmol/l；TPAC(四丙基氯化铵)，50mmol/l，pH 8.0；EvaGreen染料(根据制造商的说明，染料按1∶50的比例稀释后使用)。
溶液2(扩增反应溶液2)：
1×等温缓冲液(New England Biolabs)；单一浓度的缓冲液包含20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、2mM MgSO4、0.1％
Figure BDA0002741821590000441
20；25℃时的pH为8.8；dNTP(dATP，dCTP，dUTP，dGTP)，各200μmol/l；
EvaGreen染料(根据制造商的说明，染料按1∶50的比例稀释后使用)
溶液4(扩增反应溶液4)；1x等温缓冲液(New England Biolabs)见上文。
所有浓度均为反应中的最终浓度。相应地指出与标准反应之间的偏差。
在溶液1中各组分的浓度为1μmol/l时，测定所涉及组分的解链温度(Tm)。在每种情况下都给出偏差参数。
反应的一般信息(第一扩增)
通过将反应溶液加热至反应温度来开始反应，因为在较低温度下，Bst 2.0聚合酶的热启动功能在很大程度上受到温度敏感寡核苷酸的抑制(根据制造商的说明)。聚合酶在高于45℃的温度下具有越来越高的活性。在65℃的温度下，无法检出聚合酶Bst 2.0与热启动聚合酶Bst 2.0之间的差异。为了防止在反应的制备阶段大量形成副产物(例如引物二聚体)，使用了热启动聚合酶Bst 2.0。特别指出与其之间的差异。
通过将反应溶液加热到超过80℃(例如在95℃下加热10min)来终止反应。在该温度下，聚合酶Bst 2.0不可逆地变性，合成反应的结果在随后不能改变。
反应在带有荧光测量设备的等温器中进行。为此，使用了一种商业实时PCR设备StepOne Plus(Applied Biosystems，Thermofischer)。标准反应体积为10μl。指出与其之间的偏差。
进行终点测定和动力学观察。在终点测定中，来自例如与核酸结合的染料(例如来自TMR(四甲基罗丹明，也称为TAMRA)或FAM(荧光素))的信号被记录下来。FAM和TMR荧光信号的激发和测量波长作为默认设置存储在StepOne Plus实时PCR设备中。此外，插层染料(EvaGreen)也用于终点测量(例如解链曲线的测量)。EvaGreen是一种插层染料，是常用染料Sybrgreen的类似物，但对聚合酶的抑制作用略低。SybrGreen和EvaGreen荧光信号的激发和测量波长相同，且作为出厂设置存储在StepOne Plus实时PCR设备中。可通过内置检测器连续地(即“在线地”或“实时地”)检测荧光。由于聚合酶在合成期间合成一双链，因此该技术可用于反应的动力学测量(实时监控)。由于StepOne Plus设备中颜色通道之间存在一定的串扰，在使用浓度高于1μmol/l(例如10μmol/l)的TMR标记引物进行测量时，有时会观察到基础信号强度增加。观察到，Sybr-Green通道中的TMR信号导致基础信号强度增加。在计算中考虑了所述升高的基本值。
通常使用荧光素(FAM-TAMRA Fret对)或插层染料(EvaGreen)的荧光信号来记录反应过程的动力学观察结果。记录了信号的时间依赖性(使用StepOne plus PCR设备实时采集信号)。根据批料的结构解释了与对照反应相比反应期间信号的增加。例如，当使用Evagreen染料时，信号的增加被解释为表明反应期间双链核酸链的数量增加，并且因此是DNA聚合酶进行合成的结果。
对于某些反应，在反应后测定解链曲线。这样的测量可得出关于双链存在的结论，例如双链可吸收插层染料并因此显著放大染料的信号强度。随着温度的升高，双链比例减小，信号强度也降低。信号取决于核酸链的长度和序列组成。所述技术对于技术人员是众所周知的。
当对包含大量修饰核酸链(例如对照寡核苷酸或引物)的反应使用解链曲线分析时，发现例如来自EvaGreen染料的信号在B型DNA与A型修饰核酸链之间可表现出不同的行为。例如，在B型双链核酸链(通常用于经典DNA部分)中观察到的信号强度高于在具有相同核碱基序列的双链核酸链中观察到的信号强度，所述具有相同核碱基序列的双链核酸链可呈现出类似于A型的构象(例如通过核苷酸的几个2'-O-Me修饰)。当使用插层染料时，考虑了这一观察结果。
必要时，通过毛细管电泳分析反应，并将形成的片段长度与标准品进行比较。在准备毛细管电泳时，将反应混合物在缓冲液(Tris-HCl，20mmol/l，pH 8.0，and EDTA，20mmol/l，pH 8.0)中稀释至标记核酸的浓度约为20nmol/l。毛细管电泳是由GATC-Biotech(德国康斯坦斯)作为一项合同服务进行的。根据供应商所述，毛细管电泳是在ABI 3730CappilarySequencer上在用于使用POP7凝胶基质进行Sanger测序的标准条件下进行的，温度约为50℃且电压恒定(约10kV)。所用条件导致双链变性，因此在毛细管电泳中单链形式与核酸链分离。电泳是遗传分析中的标准技术。如今，自动毛细管电泳已被常规用于Sanger测序。在毛细管电泳期间(通常使用虚拟滤镜)连续记录荧光信号，生成电泳图，其中信号强度与电泳持续时间相关。对于较短的片段，例如未使用的引物，观察到较早的信号峰；对于较长的片段，信号的时移与延伸段的长度成正比。延伸片段的长度可通过使用已知长度的对照物来测量。该技术是技术人员已知的，并且还用作片段长度多态性的标准。
除非针对特定序列另有定义，否则大写字母AGCT和小写字母agct均表示DNA的脱氧核糖核苷酸结构单元，或相应的核糖核苷酸或碱基类似物。在一些实施例中，在修饰的序列区段中使用尿嘧啶核碱基，因此将2’-OMe修饰用作糖(具有2'-O-甲基修饰的核糖)。其他2’-O-烷基修饰也是可能的。在使用dUTP的批次(尤其是第一扩增反应)中，生成包含dump的扩增片段(以防止污染)。然而，一般而言，尿嘧啶碱可以与2’-脱氧核糖以及与核糖一起使用；该人员从整个启示中获得了与此处所用序列的各序列区段有关的教导，以确定可以在哪些点上有效地应用经典的DNA主链、RNA或碱基类似物。
实施例1(图36)
使用人类基因组DNA作为靶序列的来源
该实施例展示了使用人类基因组DNA(hgDNA)作为靶序列的来源。选择因子VLeiden基因的序列区段(智人凝血因子V(F5)，mRNA，在此称为FVL基因)作为靶序列。
仅进行第一扩增。该实施例表明，可实施依赖于对照物的第一扩增。在该实施例中，未进行第二扩增。
靶序列：
Figure BDA0002741821590000451
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。第二寡核苷酸引物以其3’区段与双下划线序列的反向补体结合。
针对该基因的FVL突变体设计并合成了第一引物、第二引物和对照寡核苷酸。
第一寡核苷酸引物：P1F5-200-AE2053
Figure BDA0002741821590000454
在反应中用作引物的区段标有下划线。
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
该寡核苷酸包含以下修饰：
1＝C3接头，用于终止第二引物延伸产物的合成。
方括号中的引物[CUCU GAUGCUUC]的区段包含2’-O-Me修饰，并用作第二引物区域以结合对照寡核苷酸的第一区域：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；U＝(2'-O-甲基尿苷)
该寡核苷酸引物包含第一区域(从3’端开始的位置1-12)、第二区域(C3接头和从3’端开始的位置13-24)以及带有附加序列变体P1的区段(从3’端开始的位置25-57)。第一区域和第二区域是进行特异性扩增所必需的，并且可概括为“第一引物的基本结构”或“第一引物的最小结构”。附加序列变体P1提供了可整合在第一寡核苷酸引物上的附加区段的实施例。位置1-12用作合成第二引物延伸产物的模板。在合成第二引物延伸产物期间，C3修饰和第二区域阻止在位置25-57处继续合成。
引物2：P2G3-5270-7063
Figure BDA0002741821590000452
在反应中用作引物的区段标有下划线。
该寡核苷酸包含以下修饰：
6＝HEG接头
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
该寡核苷酸引物包含可复制区域和不可复制区域。该可复制区域包括(从3’端开始的位置1-13和位置14-35，位置1-13可以与hgDNA内的FVL基因的序列互补地结合，位置14-35不与FVL基因的序列互补地结合但可以在扩增期间与第一引物延伸产物结合)。可复制区域可概括为“第二引物的基本结构”或“第二引物的最小结构”。
通过HEG修饰将不可复制区域(从3’端开始的位置36-70，其不与FVL基因的序列互补地结合)与可复制区域分开，这阻止了在第一引物延伸产物的合成期间在位置36-70继续合成。不可复制的区段是可整合在第二寡核苷酸引物上的附加序列变体P2的一实施例。
使用了以下对照寡核苷酸：AD-F5-1001-503
Figure BDA0002741821590000453
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
在方括号中的寡核苷酸[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGCAA GGAAUAC]的5’区段包含2’-O-Me核苷酸修饰：
修饰：A＝(2’-O-甲基腺苷)；G＝(2’-O-甲基鸟苷)；C＝(2'-O-甲基胞嘧啶)；U＝(2’-O-甲基尿苷)
x＝3’磷酸基，用于阻断聚合酶可能的延伸。
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键彼此连接。对照寡核苷酸的3’端被磷酸基阻断，以防止聚合酶可能的延伸。
第一引物在其第一区域中包含一序列，该序列可特异性地与基因组DNA内的Factor V Leiden基因的序列结合，从而可通过聚合酶启动合成。第一引物的第二区域包含不与FVL基因的序列特异性地杂交的序列。此外，第一引物包含与第二区域的5’端连接的另一序列区段(附加序列变体P1)。所述区段不参与Factor 5Leiden区段的特异性扩增。所述区段的作用主要体现在延缓副反应上。
第二引物在其3’区段中包含一区段，该区段可特异性地与基因组DNA结合，从而可通过聚合酶启动合成。第二引物的5’区段包含不与FVL基因的序列特异性地杂交的序列。在反向合成期间，可复制此序列区段。第二引物包含不能与对照寡核苷酸、第一引物或第二引物特异性地杂交的另一序列区段。所述区段位于第二引物的5’端，并通过HEG接头(附加序列变体P2)与引物的5’端分开。所述区段不参与特异性扩增。所述区段的作用主要体现在延缓副反应上。
对照寡核苷酸以与FVL基因的Factor V Leiden突变的序列完全匹配的方式构建。对照寡核苷酸包含第一、第二和第三区域。
FVL突变的WHO标准被用作基因组DNA。在用于反应之前，通过加热(在95℃下5min)使DNA变性，从而使DNA从双链状态转变为单链状态。使用该单链hgDNA，首先通过引物延伸生成起始核酸链。随后，从该起始核酸链开始进行指数扩增。通过解链曲线分析和用测序引物进行Sanger测序来确定扩增的特异性。
所有反应均在扩增溶液1中进行。
所使用的dNTP包括：dATP、dGTP、dCTP、dUTP(代替dTTP)。
用来自NEB的热启动聚合酶Bst 2.0作为聚合酶。
起始核酸链的创建如下：
在杂交条件下(扩增溶液1，温度约60℃)，使约50,000个单倍体基因组当量(HGE)的150ng hgDNA与第二引物(0.5μmol/l)和Bst 2.0热启动聚合酶(约1个单位)以及dNTPs(约250μmol/l)在50μl反应体积中接触，并孵育约10min。在该阶段期间，第二引物被延伸，其中基因组DNA用作模板。结果得到可用作起始核酸的引物延伸产物。该反应完成后，将反应混合物加热至95℃约10min，以分离该起始核酸链。将该反应混合物冷冻，并根据需要用作起始核酸链的来源。
使用5μl带有起始核酸链的反应混合物(相当于约5000HGE)对FVL基因的靶序列进行特异性扩增。
加入其他反应组分(第一引物、第二引物、对照寡核苷酸、EvaGreen染料、Bst.2.0热启动聚合酶、dNTP)后，得到的反应终体积约为10μl。组分的最终浓度为：第一引物：5μmol/l；第二引物：2μmol/l；对照寡核苷酸：1μmol/l；EvaGreen染料(1∶50)；Bst.2.0热启动聚合酶(约8个单位)；dNTP：约250μmol/l。
未将hgDNA添加到对照批次中。
该反应在Step-One Plus设备(Thermofisher Scientific)中进行。
首先通过在65℃(5min，包括检测步骤)与55℃(1min)之间进行循环变化(30个循环)来改变反应温度，然后在65℃下保持恒定达1h(每2min实施一次检测步骤)。反应过程之后是EvaGreen染料的信号检测。反应完成后，首先将反应混合物在95℃下加热10min，然后测量所形成的产物的解链曲线。
首先，建立起始核酸链(示意图50)。随后，通过延伸第一引物和第二引物以及对照寡核苷酸来进行指数扩增。
扩增的结果是扩增片段的积累。扩增的检测结果如图36所示。可看出，大约在反应2h后荧光明显增强(36A)。随后的解链曲线分析显示出Tm为84℃时的特定解链曲线(图36B)。
序列检查(图36C)：
使用测序引物进行序列验证：
Figure BDA0002741821590000461
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
为了验证序列，将反应混合物(在测量解链曲线后)用水稀释(从约1∶10至约1∶100)，并将所得等分试样与测序引物(添加浓度为2μmol/l)混合。该混合物由测序供应商(GATC-Biotec)装运，并使用Sanger测序作为合同测序来进行测序。检查获得的电泳图与FVL序列基因的一致性。作为反应的结果，鉴定了FVL基因的序列。
实施例2(图37)：
靶序列的序列变体的选择性扩增反应。
在该实施例中，研究了模板中的序列变化对扩增的影响。当第一寡核苷酸引物延伸时，形成互补链，其具有与模板互补的序列，因此包含这些序列变体。目的是评估在所得第一引物延伸产物与对照寡核苷酸之间的这种错配对扩增的影响。错配的位置在第一引物的3’方向上，因此并非通过引物而是通过对照寡核苷酸来评估。
因此，通过对照寡核苷酸使用统一的第一和第二引物来区分靶序列的各序列变体。
仅进行第一扩增。该实施例表明，可以在区分两个靶序列变体的情况下进行依赖于对照物的第一扩增。在该实施例中，未进行第二扩增。
使用了以下模板：
具有序列组成的模板(SEQ ID NO 6)，其生成与对照寡核苷酸完全匹配的第一引物延伸产物：
M2SF5-M001-200
Figure BDA0002741821590000462
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向互补体(在5’末端的35个位置)结合。
具有序列组成的模板(SEQ ID NO 7)，其生成第一引物延伸产物，该产物在单个碱基位置(粗体)与对照寡核苷酸形成错配：
Figure BDA0002741821590000471
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向补体结合。
使用了以下引物：
第一寡核苷酸引物：
P1F5-200-AE2053
Figure BDA0002741821590000472
在反应中用作引物的区段标有下划线。
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
该寡核苷酸包含以下修饰：
1＝C3接头，用于终止第二引物延伸产物的合成。
引物[CUCU GAUGCUUC]的区段包含2'-O-Me修饰，并用作第二引物区域以结合对照寡核苷酸的第一区域：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
引物2：P2G3-5270-7063
Figure BDA0002741821590000473
在反应中用作引物的区段标有下划线。
该寡核苷酸包含以下修饰：
6＝HEG接头
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
使用了以下对照寡核苷酸：
AD-F5-1001-503
Figure BDA0002741821590000474
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
在方括号中的寡核苷酸[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]的5’区段包含2’-O-Me核苷酸修饰：
修饰：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
X＝3’磷酸基，用于阻断聚合酶可能的延伸。
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键彼此连接。对照寡核苷酸的3’端被磷酸基阻断，以防止聚合酶可能的延伸。
制备了四批：
第一批包含浓度为300fmol/l(相当于约2×106个拷贝/批)的模板M2SF5-M001-200(完全匹配情况)作为起始核酸链。
第二批包含浓度为300amol/l(相当于约2×103个拷贝/批)的模板M2SF5-M001-200(完全匹配情况)作为起始核酸链。
第3批不包含模板，因此形成一对照物。
第4批包含浓度为300pmol/l(相当于约2×109个拷贝/批)的模板M2SF5-WT01-200(单个错配情况)作为起始核酸链。
引物1使用5μmol/l，对照寡核苷酸使用2μmol/l，引物2使用1μmol/l。
其他反应条件为：扩增溶液2。
为了模拟分析中基因组DNA的存在，每个反应中添加100ng新鲜变性的鱼DNA(鲑鱼DNA)。
热反应条件为循环交替的温度变化，其中在55℃下间隔2min，然后在65℃下间隔5min。扩增被监测超过100个循环。在65℃下检测EvaGreen荧光信号。
成功的扩增取决于EvaGreen荧光信号随时间的增加。
温度变化和实时监控是通过Thermofisher的StepPne Plus实时PCR设备进行的。
图37示出了EvaGreen信号的典型曲线。Y轴表示荧光信号的增加(ΔRn)，X轴表示反应时间(以循环次数表示)。箭头标记各反应的准备。标记位置属于以下批次：
箭头1：300fmol/l完美匹配模板(约2×106个拷贝/批)；
箭头2：300amol/l完美匹配模板(约2×103个拷贝/批)；
箭头3：无模板；以及
箭头4：300pmol/l错配模板(约2×109个拷贝/批)。
可看到在模板的完全匹配和错配变体中荧光信号增加，其中尽管有100倍的过量，但错配变体(4)的信号稍后出现。可看出，与完全匹配放大信号相比，错配放大信号明显延迟。对于单个错配，观察到约15个循环的延迟。延时(＝循环次数)是对扩增中分辨力的直接量度。通过与完全匹配扩增下的模板浓度系列进行比较，可进一步量化扩增中的分辨力。
当使用完全匹配模板时，可合成引物延伸产物的互补链。该延伸产物与完美匹配模板以及与所用对照寡核苷酸互补。
相反，当使用错配序列时，引物延伸产物的第一区段的合成导致延伸产物的互补链的生成，该互补链与错配模板完全互补，但由此偏离与寡核苷酸对照物的第三区域的互补性。该偏离发生在延伸产物的5’链区段中，其应与对照寡核苷酸反应，以允许链置换过程继续进行。如该实施例所示，错配干扰了对照寡核苷酸的链置换。
具有完美匹配模板的对照反应(箭头1和2)显示了扩增的浓度依赖性。随着浓度的降低，反应需要更长的时间来合成足够数量的待扩增核酸，以使信号上升至基线水平以上。
该结果说明了碱基组成在对照寡核苷酸中的重要性：与对照寡核苷酸和引物延伸产物之间互补性的偏离会减慢甚至中断扩增。
在该实施例中显示，尽管完全匹配模板和错配模板的序列端部完全相同，且因此两寡核苷酸引物结合的可能性相同，但两个反应却完全不同：如果对照寡核苷酸与第一寡核苷酸引物的延伸产物的5’区段之间完全互补，则按计划进行扩增。由于序列偏差(在这种情况下是由于错配)而引起的链置换的中断导致扩增受到抑制。
实施例3(图38-42)：
使用两个扩增：第一扩增之后是第二扩增
该实施例表明，第一扩增的扩增产物可用作随后的经典PCR(第二扩增)的起始核酸链。因此，总共进行了两个单独的扩增反应：首先是第一扩增，然后是第二扩增。
第一扩增
最初，在第一扩增***中使用包含靶序列的单链核酸链(在此为单链起始核酸链1.1)进行第一扩增。在没有对照寡核苷酸的情况下，所使用的反应条件(温度为55℃和65℃)不允许使在反应期间形成的包含第一引物延伸产物和第二引物延伸产物的双链自发分离。
第一扩增***包含以下组分：
·第一寡核苷酸引物；
·第一寡核苷酸引物；
·对照寡核苷酸；
·具有链置换特性的聚合酶(Bst 2.0热启动聚合酶)；以及
·聚合酶所需的底物(dNTP’：dATP，dCTP，dGTP，dTTP)和合适的缓冲***(反应在等温缓冲液1x(NEB)中进行)。
在65℃下使用EvaGreen检测反应进程。
在使用第一寡核苷酸引物(5μmol/l)和对照寡核苷酸(2μmol/l)的浓度比的情况下，第一引物与对照寡核苷酸相比相对过量。在同一反应溶液中测得，包含第一寡核苷酸引物和对照寡核苷酸的复合体的解链温度约为63℃(Tm)。
对于第一扩增反应，使用了两个温度范围：
55℃(2min)和65℃(2min)。在55℃的温度步骤中，对照寡核苷酸与第一寡核苷酸引物完全复合。这阻止了对照寡核苷酸与第一引物延伸产物的结合。在第二温度步骤(65℃)中，该复合体至少可部分地与复合体解离，因此可在批次中使用游离的单链对照寡核苷酸。这种游离的对照寡核苷酸可以与新的第一寡核苷酸引物形成复合体，也可以退火到第一引物延伸产物。与第一引物延伸产物的接触开始于对照寡核苷酸的第一区域的序列区段与引物的第二区域的对应序列区段的互补结合，且聚合酶未复制所述对应序列区段。
各合成方法和链分离方法基本包括以下过程：
第一寡核苷酸引物可主要特异性地与所提供的核酸链的3’区段结合(起始核酸链1.1)，并通过聚合酶延伸(该反应主要发生在55℃下)。合成进行到模板链的端部(起始核酸链的5’区域)。由此生成了第一引物延伸产物。对照寡核苷酸可通过互补碱基配对与所述第一引物延伸产物结合，且通过互补碱基配对置换模板链(这里首先是起始核酸链)(该反应主要发生在65℃下)。在65℃下，第一引物延伸产物的3’区段(未与对照物结合)主要是由于温度(所述3’区段的Tm低于65℃)从具有模板链的复合体中分离出来。由此，第一引物延伸产物的3’区段变成单链。因此，第一引物延伸产物与对照寡核苷酸形成复合体。
现在第二寡核苷酸引物能够与第一引物延伸产物的所述区段结合，并通过聚合酶启动第二引物延伸产物的合成(该步骤可在55℃和65℃下进行)。在进行合成的同时将对照寡核苷酸从与第一引物延伸产物的结合中置换出来。在第一引物延伸反应中使用的聚合酶(Bst 2.0热启动)具有链置换特性。进行第二引物延伸产物的合成，直至并包括第一引物的第一区域，该区域被聚合酶复制。第二引物延伸产物的合成被第一引物延伸产物中的C3接头终止，使得第一引物延伸产物的第二区域未被聚合酶复制。这生成了第二引物延伸产物，其与第一引物延伸产物形成双链(该双链的Tm＝第一扩增产物的Tm，约为79℃)。将反应混合物反复加热至65℃，导致对照寡核苷酸与第一引物延伸产物再次结合，从而使第二引物延伸产物从其与第一引物延伸产物的结合中释放出来。
由于第二引物延伸产物的释放，该产物现在可用作模板：第二引物延伸产物在其3’区段中包含与第一引物的第一区域互补的序列，因此能够结合新的寡核苷酸引物并通过聚合酶开始合成。
结果，进行了重复的合成和链分离过程，其中两个合成的引物延伸产物都可以在随后的循环中作为模板。
可使用所提供的引物并在所提供的对照寡核苷酸的帮助下，从起始核酸链(1.1)开始合成第一扩增产物，直到达到所需的拷贝数量为止(此处，第一扩增产物1.1的浓度在第一扩增结束时约为0.8-1μmol/l，相当于在10μ1反应批料中有约1,000,000,000个拷贝)。为了便于说明，根据浓度估计拷贝数量。
通过加热至95℃达10min来终止反应，其中使第一聚合酶变性。然后进行短融合分析，以确认特异性扩增。将反应批料冷冻，并在需要时用于第二扩增。
第二扩增(PCR)
第一扩增完成后，将一部分第一反应批料添加到第二扩增中。在第一扩增中合成的第一扩增片段(1.1)用作第二扩增的第二起始核酸链(2.1)。
在第二扩增反应中加入第一批完成的几个稀释步骤，得到一个稀释系列。
应注意的是，未对形成的第一扩增片段(1.1)进行纯化，只进行了稀释。因此，第二扩增步骤中也存在第一扩增***的所有未使用组分(尽管已被稀释)。
使用PCR反应条件(三个温度范围，即55℃(1min)、72℃(3min)、95℃(20s))来实施标准PCR(第二扩增)。
第二扩增***分别包含以下组分：
·第三寡核苷酸引物；
·第四寡核苷酸引物；
·聚合酶(Taq聚合酶)，其是一种耐热聚合酶；以及
·聚合酶所需的底物(dNTP：dATP，dCTP，dGTP，dTTP)和适当的缓冲***。
对于PCR，使用了各组分的典型浓度：PCR引物的终浓度分别为0.5μmol/l，Taq聚合酶的浓度(1,100稀释度，相当于约1个单位/反应)和dNTP(A，G，C，T)的浓度约为200μmol/l。反应在等温缓冲液1x(NEB)中进行。
使用该第一扩增片段作为起始核酸链(2.1)并使用第二扩增***进行第二扩增。在72℃下用EvaGreen检出了合成过程。以NTC和起始核酸链1.1作为对照反应，它们也可以在第二扩增***中用作模板。
测量直到特定信号增加为止第二扩增所需的循环次数，并将其与参考值进行比较。通过比较可检测的扩增所需的循环次数，得出在PCR中成功地使用了第一扩增片段(1.1)的结论。
具体实施了以下操作：
基于对照寡核苷酸的第一扩增反应的第一扩增产物被稀释，并在典型的PCR条件下扩增为模板(输入)。在该实施例中，随后的PCR中的检测是使用插层染料EvaGreen进行的。通过与许多不同的对照方法进行比较，本发明人表明，如果基于对照寡核苷酸的扩增反应成功，则仅在随后的PCR中生成信号。因此，随后的经典PCR也可称为检测PCR。
基本上如实施例2中所述，生成基于对照寡核苷酸的扩增反应的扩增产物。
使用了以下寡核苷酸引物：
第一寡核苷酸引物：P1F5-200-AE205
Figure BDA0002741821590000491
在反应中用作引物的区段标有下划线。
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
该寡核苷酸包含以下修饰：
1＝C3接头，用于终止第二引物延伸产物的合成。
2＝2’-脱氧肌苷
引物[CUCU GAUGCUUC]的区段包含2'-O-Me修饰，并用作第二引物区域以结合对照寡核苷酸的第一区域：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
第二寡核苷酸引物：P2G3-5270-7063
Figure BDA0002741821590000492
在反应中用作引物的区段标有下划线。
该寡核苷酸包含以下修饰：
6＝HEG接头
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
使用了以下对照寡核苷酸(SEQ ID NO：4)：
AD-F5-1001-503
Figure BDA0002741821590000493
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
寡核苷酸[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]的在方括号中的5’区段包含2'-O-Me核苷酸修饰：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
x＝3’磷酸基，用于阻断聚合酶可能的延伸
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键彼此连接。对照寡核苷酸的3’端被磷酸基阻断，以防止聚合酶可能的延伸。
启动与对照物完美匹配的核酸链(1.1)。
M2SF5-M001-200
Figure BDA0002741821590000501
起始核酸链的使用浓度约为1pM。
结果，可预期扩增片段生成具有以下序列的第二引物延伸产物：
Figure BDA0002741821590000502
(无法复制的第二引物的序列区段在此处未显示)
用3对不同的引物进行PCR。引物覆盖扩增产物的不同序列区域。为了更好地理解，还为每对引物标上模板链(＝扩增产物)上的引物结合位点。
对于PCR，使用：
PCR引物对1，其由第三寡核苷酸引物SeqP1F5 300-35x(SEQ ID NO 8)和第四寡核苷酸引物P2-4401-601 TMR(SEQ ID NO 9)组成：
第三寡核苷酸引物SeqP1F5 300-35x
Figure BDA0002741821590000503
第四寡核苷酸引物P2-4401-601
TMR 5’GCTCATACTACAATGTCACTTAC 3’(SEQ ID NO.9)
分别具有：A＝2’-脱氧腺苷；C＝2’-脱氧胞嘧啶；G＝2'-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
TMR＝与链(P2-4401-601 TMR)的5’端连接的四甲基罗丹明
所述两个引物以如下方式与模板链结合(此处显示为第一扩增的第二引物延伸产物)：
Figure BDA0002741821590000504
在对照方法中，该引物对的引物还可以与起始核酸链1.1结合，如下所示：
M2SF5-M001-200(SEQ ID NO：006)：
Figure BDA0002741821590000505
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。
第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向补体结合。
PCR引物对2，其由第三寡核苷酸引物P3F5D-600-203(SEQ ID NO XY)和第四寡核苷酸引物P2-4401-601 TMR组成：
第三寡核苷酸引物
P3F5D-600-203
Figure BDA0002741821590000506
第四寡核苷酸引物P2-4401-601 TMR
TMR-5’GCTCATACTACAATGTCACTTAC 3’(SEQ ID NO 9)
分别具有：A＝2’-脱氧腺苷；C＝2’-脱氧胞嘧啶；G＝2'-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
修饰：
TMR＝与链(P3F5D-600-203)和P2-4401-601 TMR的5’端连接的四甲基罗丹明
所述两个引物以如下方式与模板链结合(此处显示为第一扩增的第二引物延伸产物)：
Figure BDA0002741821590000507
在对照批次中，该引物对的引物还可以与起始核酸链1.1结合，如下所示：
M2SF5-M001-200
Figure BDA0002741821590000508
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。
第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向补体结合。
PCR引物对3，其由第三寡核苷酸引物SeqP1F5-35-X02和第四寡核苷酸引物P2-4401-601 TMR组成：
第三寡核苷酸引物SeqP1F5-35-X02
Figure BDA0002741821590000509
第四寡核苷酸引物P2-4401-601 TMR
TMR-5’GCTCATACTACAATGTCACTTAC 3’(SEQ ID NO：009)
分别具有：A＝2’-脱氧腺苷；C＝2’-脱氧胞嘧啶；G＝2'-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
TMR＝与链(P2-4401-601 TMR)的5’端连接的四甲基罗丹明
所述两个引物以如下方式与模板链结合(此处显示为第一扩增的第二引物延伸产物)：
Figure BDA00027418215900005010
在对照批次中，该引物对的引物还可以与起始核酸链1.1结合，如下所示：
M2SF5-M001-200：
Figure BDA0002741821590000511
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。
第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向补体结合。
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键彼此连接。
在PCR中使用Taq聚合酶(NEB，目录号M0273S)。每个反应使用的聚合酶稀释度为1∶100。
在PCR中使用基于对照寡核苷酸的扩增反应(第一扩增)的扩增产物，且该扩增产物的稀释度为1∶5,000至1∶500,000,000。
作为对照，还检查了不含扩增模板的反应混合物(NTC＝无模板对照＝阴性对照)。
另外，进一步的对照方法用于检查是否可将对照寡核苷酸用作PCR引物的模板。为此，提供了先前在基于对照寡核苷酸的扩增期间使用的对照寡核苷酸(SEQ ID NO4＝此处称为“对照物503”)，用于PCR中浓度为1μmol/l至1pmol/l时的扩增。
在另一对照中，提供了确定数量的模板M2SF5-M001-200，用于PCR扩增(阳性对照)。所述对照证明了PCR-引物对的功能(在理想条件下)。另外，通过将接收到的Ct值与阳性对照的标准稀释系列进行比较，可以在第一扩增后对样品进行定量。对浓度为1nmol/l至1fmol/l的模板M2SF5-M001-200进行了测试。
第三和第四寡核苷酸引物各自的使用浓度为0.5μmol/l。
其他反应条件为：
1x等温缓冲液(New England Biolabs)；单一浓度的缓冲液包含20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KC1、2mM MgSO4、0.1％
Figure BDA0002741821590000512
20；25℃时pH为88；dNTP(dATP，dCTP，dUTP，dGTP)，每个200μmol/l；
EvaGreen染料(根据制造商的说明，染料按1∶50的比例稀释后使用)
选择的热反应条件如下：
·20s 95℃激活***
·30个循环，每个循环具有以下温度-时间曲线
ο1min 55℃
ο3min 72℃
ο20s 95℃
·10min 72℃，用于扩增产物的标准化
·解链曲线分析
通常在30个循环中监测扩增，即30×(1min 55℃+3min 72℃+20s 95℃)＝＝约30×260s＝130min。扩增的成功取决于EvaGreen荧光信号随时间的增加。
对检测PCR的分析
以下技术用于分析检测PCR并评估所得的扩增产物：
·插层染料(EvaGreen)的荧光信号
·所得扩增产物的解链曲线分析
分析PCR时，我们仅讨论由按1∶100的比例稀释的Taq聚合酶获得的数据。
在使用模板(M2SF5-M001-200)的对照实验中，可验证所有三个选定的PCR引物对都可在使用的PCR条件下生成特异性的PCR产物。还可证实，所有三对引物均不能形成从对照寡核苷酸开始的产物。这是预期的结果，因为使用的所有“第三”引物都结合在对照寡核苷酸的修饰部分中。
图38A示出了在稀释对照寡核苷酸扩增方法的扩增期间通过引物对1获得的EvaGreen荧光信号的典型时程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数表示)。箭头标记了不同的扩增方法。箭头指示以下批料：
位置 检测PCR批料中对照寡核苷酸扩增批料的稀释度
箭头1 约1∶5,000
箭头2 约1∶50,000
箭头3 约1∶500,000
箭头4 约1∶5,000,000
箭头5 约1∶50,000,000
箭头6 0mol/l＝阴性对照
箭头6标记的阴性对照批料不含模板，因此在实验期间不会产生扩增信号。
根据所选择的对照寡核苷酸扩增批料的稀释度，观察到延时扩增信号。对于PCR引物对1，可以在所选条件下很好地分辨1∶5,000至1∶50,000,000的稀释度。1∶50,000,000的稀释度产生的扩增信号与阴性对照(参见箭头5)略有不同。
图38B示出了反应1至5的相关解链曲线分析，并阐明形成了特异性扩增产物(Tm＝827℃)。
图38B示出了图38A中引物对1的扩增产物的解链曲线。Y轴示出了荧光信号对温度的导数，而x轴示出了温度。找到一均匀的峰，用箭头1标记。解链温度约为82.7℃的位置1处的峰属于引物对1的扩增产物。解链曲线分析表明特异性扩增。
图39A示出了通过PCR引物对2从稀释对照寡核苷酸扩增方法的扩增获得的EvaGreen荧光信号的典型时间曲线。在Y轴上是EvaGreen染料的荧光信号，在x轴上是反应时间(以循环次数计)。箭头标记了不同的扩增方法。箭头指示以下批料：
位置 检测PCR批料中对照寡核苷酸扩增批料的稀释度
箭头1 约1∶5,000
箭头2 约1∶50,000
箭头3 约1∶500,000
箭头4 约1∶5,000,000
箭头5 0mol/l＝阴性对照
箭头5标记的阴性对照批料不含模板，因此在实验期间不会产生扩增信号。
根据所选择的对照寡核苷酸扩增批料的稀释度，观察到延时扩增信号。对于PCR引物对2，可以在所选条件下很好地分辨1∶5,000至1∶5,000,000的稀释度。1∶5,000,000的稀释度产生的扩增信号恰好与阴性对照(箭头4)形成相比。
图39B示出了反应1至4的相关解链曲线分析，并清楚地表明已形成了特异性扩增产物。
图39B示出了图39A中PCR引物对2的扩增产物的解链曲线。Y轴示出了荧光信号对温度的导数，而x轴示出了温度。找到一均匀的峰，用箭头1标记。解链温度约为81.9℃的位置1处的峰属于PCR引物对2的扩增产物。解链曲线分析表明特异性扩增。
图40A示出了通过PCR引物对3从稀释对照寡核苷酸扩增方法的扩增获得的EvaGreen荧光信号的典型时间曲线。在Y轴上是EvaGreen染料的荧光信号，在x轴上是反应时间(以循环次数计)。箭头标记了不同的扩增方法。箭头指示以下批料：
Figure BDA0002741821590000521
箭头7标记的阴性对照批料不含模板，因此在实验期间不会产生扩增信号。
根据所选择的对照寡核苷酸扩增方法的稀释度，观察到延时扩增信号。对于引物对3，可以在所选条件下很好地分辨1∶5,000至1∶500,000,000的稀释度。1∶500,000,000的稀释度产生的扩增信号恰好与阴性对照(参见箭头6、7)形成相比。
图40B示出了反应1至6的相关解链曲线分析，并清楚地表明已形成了特异性扩增产物。
图40B示出了图40A中PCR引物对3的扩增产物的解链曲线。Y轴示出了荧光信号对温度的导数，而x轴示出了温度。找到一均匀的峰，用箭头1标记。解链温度约为81.2℃的位置1处的峰属于PCR引物对3的扩增产物。解链曲线分析表明特异性扩增。
扩增过程中的荧光信号分析(扩增图)和扩增结束时的解链曲线分析表明，PCR引物对1至3均能够将第一扩增反应生成的稀释扩增产物用作模板。
根据所选的稀释液，会产生延时扩增信号，这是稀释液系列的典型信号。使用此处选择的PCR条件，可检出稀释5,000,000倍的扩增产物。引物对3的灵敏度最高，甚至可检出稀释500,000,000倍后的扩增产物。
图41示出了使用模板(M2SF5-M001-200)和NTC对照(箭头3)的对照实验，该模板用于1nmol/l(箭头1)和10pmol/l(箭头2)。
图41A示出了PCR引物对1的结果。
图41B示出了PCR引物对2的结果。
图41C示出了PCR引物对3的结果。
在对照实验(模板)与从第一扩增片段进行的第二扩增之间荧光信号上升时间的比较表明，第一扩增使得可用作第二扩增中的模板的扩增片段增加。
图42示出了第一扩增的过程(PCR之前)。
信号增加是可见的，这被解释为第一扩增中的拷贝数量增加。箭头1对应于具有起始核酸链1.1的批料。箭头2＝NTC对照。
实施例4(图43-47)：
同一批料中第一扩增与第二扩增的组合(均相测定)
在该实施例中，发明人证明了基于对照寡核苷酸的扩增反应如何与随后的经典PCR以均相测定的形式结合。在此，发明人在扩增的早期使用基于高度选择性的对照寡核苷酸的扩增反应，然后切换到经典PCR，以扩增和检测扩增产物。与实施例3(＝异相测定形式)相反，本实施例中的组合以均相测定形式实施。在反应开始时，所有分析组分均已可用。通过在反应过程中改变温度控制，可以在基于对照寡核苷酸的扩增与经典PCR之间进行切换。
首先，使用基于对照寡核苷酸的扩增反应从单链起始核酸链(1.1)开始扩增第一扩增产物1.1，进行15-30个循环，然后进行30个经典PCR循环，以进一步扩增和检测预扩增产物。在本实施例中，将插层染料EvaGreen用于检测。
第一扩增***包含以下组分：
·第一寡核苷酸引物；
·第二寡核苷酸引物；
·对照寡核苷酸；
·具有链置换特性的聚合酶(Bst 2.0热启动聚合酶)；以及
·聚合酶所需的底物(dNTP’：dATP，dCTP，dGTP，dTTP)和合适的缓冲***(反应在等温缓冲液1x(NEB)中进行)。
第二扩增***包含以下组分：
·第三寡核苷酸引物；
·第四寡核苷酸引物；
·聚合酶(Taq聚合酶)，其是一种耐热聚合酶；以及
·聚合酶所需的底物(dNTP：dATP，dCTP，dGTP，dTTP)和适当的缓冲***。
在第一扩增开始之前，两个扩增***可一起使用。
在本实施例中，第二寡核苷酸引物用于两种扩增。因此，第四寡核苷酸引物与第二寡核苷酸引物相同。
第三寡核苷酸引物是变化的。
在该实施例中，发明人提出了4种不同的引物，每种引物中的每批单独用作“第三寡核苷酸引物”。
各自的第三寡核苷酸引物不同于第一寡核苷酸引物。因此，每个反应批料都包含三个引物：第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物(作为第一扩增***的组分)，以及用作第二扩增***的特异性引物的第三寡核苷酸引物。第一扩增***的第二引物承担了第四引物的作用，该第二引物也适用于随后的PCR反应。为了更好地理解，还在模板链(＝扩增产物)上标上每个引物组合的引物结合位点。
以下起始核酸链(1.1)被用作单链模板：
具有序列组成的模板(SEQ ID NO 6)，其生成与对照寡核苷酸完全匹配的第一引物延伸产物：
M2SF5-M001-200
Figure BDA0002741821590000531
第一寡核苷酸引物的结合序列标有下划线。
第二寡核苷酸引物与双下划线序列的反向补体结合。第三寡核苷酸引物(P3F5D-600-203)的结合序列以粗斜体显示。
第一扩增***：
第一寡核苷酸引物：P1F5-200-AE205
Figure BDA0002741821590000532
在反应中用作引物的区段标有下划线。
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
该寡核苷酸包含以下修饰：
1＝C3接头，用于终止第二引物延伸产物的合成。
2＝2’-脱氧肌苷
引物[CUCU GAUGCUUC]的一个区段包含2’-O-Me修饰，并用作第二引物区域以结合对照寡核苷酸的第一区段：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
第二寡核苷酸引物：P2G3-5270-7063
Figure BDA0002741821590000533
在反应中用作引物的区段标有下划线。
该寡核苷酸包含以下修饰：
6＝HEG接头
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
使用了以下对照寡核苷酸：
AD-F5--1001--503
Figure BDA0002741821590000541
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
寡核苷酸的在方括号[UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUAC]中的5’区段包含2'-O-Me核苷酸修饰：
修饰：
A＝(2'-O-甲基腺苷)；G＝(2'-O-甲基鸟苷)；C＝(2’-O-甲基胞嘧啶)；
U＝(2'-O-甲基尿苷)
x＝3’磷酸基，用于阻断聚合酶可能的延伸
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键彼此连接。对照寡核苷酸的3’端被磷酸基阻断，以防止聚合酶可能的延伸。
第二扩增***特别包含以下列表中的第三寡核苷酸引物(P3引物)：
·第三寡核苷酸引物P3F5D-600-201
Figure BDA0002741821590000542
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
修饰：
TMR(＝四甲基罗丹明)在5’位置
·第三寡核苷酸引物P3F5D-600-202
Figure BDA0002741821590000543
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
修饰：
TMR(＝四甲基罗丹明)在5’位置
·第三寡核苷酸引物P3F5D-600-203
Figure BDA0002741821590000544
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
修饰：
TMR(＝四甲基罗丹明)在5’位置
·第三寡核苷酸引物P3F5D-600-204
Figure BDA0002741821590000545
A＝2’-脱氧腺苷
A＝2’-脱氧腺苷；C＝2'-脱氧胞嘧啶；G＝2’-脱氧鸟苷；T＝2'-脱氧胸苷(胸苷)
修饰：
TMR(＝四甲基罗丹明)在5’位置
核苷酸和核苷酸修饰通过磷酸二酯键连接在一起。3’端被磷酸基阻断，以防止聚合酶可能的延伸。
起始核酸链1.1(模板)的浓度为1pmol/l。使用时的浓度：引物1为5μmol/l，对照寡核苷酸为2μmol/l，引物2为1μmol/l，引物3为0.5μmol/l。为了扩增，在批料Taq聚合酶(NEB，目录号M0273S2)中以及在Bst 20热启动聚合酶(NEB，目录号M0538S2)中分别以稀释度1∶100和1∶200使用两种聚合酶。
在对照反应中，未使用P3引物。在进一步的对照反应中，仅使用BST聚合酶，而未使用Taq聚合酶。
其他反应条件为：
1x等温缓冲液(New England Biolabs)；单一浓度的缓冲液包含20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KC1、2mM MgSO4、0.1％
Figure BDA0002741821590000546
20；25℃时的pH为88；dNTP(dATP，dCTP，dUTP，dGTP)，各200μmol/l；
EvaGreen染料(根据制造商的说明，染料按1∶50的比例稀释后使用)
根据以下曲线选择热反应条件：
·2min65℃激活***
·具有以下温度-时间曲线的15或30个循环(基于对照寡核苷酸的扩增反应)
ο2min 55℃
ο2min 65℃
·20s 95℃激活***
·30个具有以下温度-时间曲线的循环(检测PCR)
ο1min 55℃
ο3min 72℃
ο20s 95℃
·10min 72℃，用于扩增产物的标准化
·解链曲线分析
总扩增通常在45-60个循环内进行，即：
第一扩增：(15或30)×(2min 55℃+2min 65℃)＝(15至30)×4min＝60至120min
第二扩增(PCR)30×(1min 55℃+3min 72℃+20s 95℃)＝30×260s＝130min监测。这相当于190-250min的总时间。
扩增的成功可取决于EvaGreen荧光信号随时间的增加。
分析基于对照寡核苷酸的扩增反应与检测PCR的组合。
使用以下技术来分析和评估所得的扩增产物：
·插层染料(EvaGreen)的荧光信号
·所得扩增产物的解链曲线分析
第一分扩增(15个循环或30个循环)导致核酸链(第一扩增片段1.1)富集，该核酸链可在随后的PCR中用作模板。这意味着PCR需要更少的循环来生成可检测量的PCR产物。通过选择两个扩增阶段中的循环次数，可以调节两个扩增反应的总扩增的扩增分数。
通过将其与多种不同的对照方法进行比较，发明人表明，通过使用第一扩增，可减少第二扩增(PCR)的循环次数，直到产生可检测的信号(Ct)为止。仅当第一扩增(基于对照寡核苷酸的扩增反应)成功时，PCR循环次数才会减少。然后从第一扩增产物开始进行第二扩增，直至检测。因此，随后的经典PCR也可称为检测PCR。
此外，发明人表明，可将第一扩增***和第二扩增***组合在一个批料中，从而可进行均相测定形式。
各反应批次的结果如下所示。
图43A示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-201的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数计)。在循环1至15中，使用基于对照寡核苷酸的扩增反应。从循环15到循环45，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环15的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增方法，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照操作。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4表示另一种对照方法，其中省略了引物P3F5D-600-201的添加。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
图43B示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-202的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数计)。在循环1至15中，使用基于对照寡核苷酸的扩增反应。从循环15到循环45，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环15的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增方法，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照操作。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4标记了另一种对照方法，其中未添加引物P3F5D-600-202。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
图44A示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-203的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数计)。在循环1至15中，使用基于对照寡核苷酸的扩增反应。从循环15到循环45，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环15的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增方法，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照操作。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4标记了另一种对照方法，其中未添加引物P3F5D-600-203。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
图44B示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-204的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数计)。在循环1至15中，使用基于对照寡核苷酸的扩增反应。从循环15到循环45，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环15的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增方法，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照操作。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4标记了另一种对照方法，其中未添加引物P3F5D-600-204。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
看来，基于对照寡核苷酸的扩增反应和(经典)检测PCR与引物3的4个变体(P3F5D-600-201至P3F5D-600-204)中的任何一个以均相测定形式进行的组合是成功的。BST与Taq聚合酶的组合使用很重要。同样重要的是第三引物，没有该引物就不能检出扩增信号。引物3的变体的行为相当独立，这可从扩增信号开始从基线突显出的不同时间点看出。在检测PCR中越早检出扩增信号，引物3的各变体在检测先前生成的基于对照寡核苷酸的扩增产物中就越有效。
我们现在表明，在早期扩增阶段将基于对照寡核苷酸的扩增反应的循环次数加倍会导致定性上非常相似的结果。
图45A示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-201的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，X轴显示反应时间(以循环次数计)。基于对照寡核苷酸的扩增反应用于循环1至30。从循环31到循环60，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环30的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增方法，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照操作。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4表示另一种对照方法，其中省略了引物P3F5D-600-201的添加。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
图45B示出了在模板M2SF5-M001-200与引物P3F5D-600-203的组合扩增期间EvaGreen荧光信号的典型过程。Y轴显示EvaGreen染料的荧光信号，x轴显示反应时间(以循环次数计)。基于对照寡核苷酸的扩增反应用于循环1至30。从循环31到循环60，使用经典PCR(检测PCR)。切换时间(循环30的结束)用箭头1标记。
箭头2表示一种扩增批料，其中BST和Taq聚合酶从起始浓度1pmol/l开始对模板M2SF5-M001-200进行扩增。
箭头3表示仅包含BST聚合酶的对照批料。由于热敏性BST聚合酶从循环16开始被检测PCR中的温度曲线变性，所以省略了扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中形成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
箭头4标记了另一种对照方法，其中未添加引物P3F5D-600-203。现在不再观察到扩增信号，因为在没有第三引物的情况下不可能在检测PCR中进行指数扩增。已在基于对照寡核苷酸的扩增反应中生成的扩增产物仍隐藏在EG的检测阈值以下。
图46示出了组合扩增(包括第一和第二扩增)与单独PCR(仅第二扩增)之间的时间间隔的比较。
如上所示进行第一扩增。在第二反应中，使用第三寡核苷酸引物(P3F5D-600-203)。用移液管移取批料，并如上所述进行反应。如上所示，首先在组合批料中进行对照物依赖性扩增(此处为15个循环)，然后切换至PCR(箭头1)。比较了时间间隔1和2。
箭头2显示了组合扩增的过程(Bst和Taq聚合酶均在批料中)。在第一扩增开始之前，该批料包含1pmol/l的起始核酸链(模板)。荧光信号的增加发生在时间间隔1之后。
箭头3表示一对照批料的过程，其中省略了Bst，因此第一扩增反应被“终止”(尽管第一扩增***的所有组分都在该批料中，但缺少正确的聚合酶(在这种情况下为Bst 20聚合酶))。在第一扩增开始之前，该批料包含1pmol/l的起始核酸链(模板)。荧光信号的增加发生在时间间隔2之后。尽管Taq聚合酶也可从同一模板合成产物，但PCR本身需要更多的循环。
箭头4显示了没有起始核酸链1.1(无模板＝NTC对照)的组合批料的过程。
总体上可看出，通过在第一扩增过程中增加扩增片段1.1的数量，然后可将扩增片段1.1在PCR中用作起始核酸链2.1(模板)，批料2中反应的PCR片段的生成总体速度上更快：PCR需要较少的循环，直到生成了可检测量的第二扩增产物(2.1)。时间间隔1比时间间隔2短。
图47示出了组合扩增(包括第一和第二扩增)与单独PCR(仅第二扩增)之间的时间间隔的比较。
如上所示进行第一扩增。在第二反应中，使用第三寡核苷酸引物(P3F5D-600-203)。用移液管移取批料，并如上所述进行反应。如上所示，首先在组合批料中进行对照物依赖性扩增(此处为30个循环)，然后切换至PCR(箭头1)。比较了时间间隔3和4。
箭头2显示了组合扩增的过程(Bst和Taq聚合酶均在批料中)。在第一扩增开始之前，该批料包含1pmol/l的起始核酸链(模板)。荧光信号的增加发生在时间间隔3之后。
箭头3表示一对照批料的过程，其中省略了Bst，因此第一扩增反应被“终止”(尽管第一扩增***的所有组分都在该批料中，但缺少正确的聚合酶(在这种情况下为Bst 2.0聚合酶))。在第一扩增开始之前，该批料包含1pmol/l的起始核酸链(模板)。荧光信号的增加发生在时间间隔4之后。尽管Taq聚合酶也可从同一模板合成产物，但PCR本身需要更多的循环。
箭头4显示了没有起始核酸链1.1(无模板＝NTC对照)的组合批料的过程。
总体上可看出，通过在第一扩增过程中增加扩增片段1.1的数量，然后可将扩增片段1.1在PCR中用作起始核酸链2.1(模板)，PCR片段的生成使批料2中的反应总体上更快些：PCR需要较少的循环，直到生成了可检测量的第二扩增产物(2.1)。时间间隔3比时间间隔4短。
实施例5(图48-49、71)：在具有野生型序列变体的人类基因组DNA存在的条件下，扩增具有突变的人类FVL靶序列
该实施例显示了包含多态性基因座的靶序列的选择性扩增，其中该多态性基因座包含两个序列变体(突变或野生型)(凝血因子V Leiden基因的SNP变体，FVL基因)。
选择第一扩增***的组分(第一引物、第二引物、对照物、聚合酶)和反应条件，以使待扩增核酸(包含两个引物延伸产物P1.1-Ext和P2.1-Ext的扩增片段1.1))优选包含在FVL基因中具有突变的序列变体。野生型序列变体(WT序列)在第一扩增操作期间不应显著扩增。第一扩增从起始核酸1.1开始，该起始核酸1.1是使用单链人类gDNA(包含靶序列的模板)作为引物延伸产物获得的。进行扩增，直到达到所需的扩增片段水平。在第一扩增中生成的产物(扩增片段1.1)可作为第二扩增(PCR)的模板(起始核酸21)。
选择第二扩增***的组分(第三引物、第四引物、聚合酶)和反应条件(PCR扩增)，以便可扩增靶序列的两个变体。在第一扩增后，在单独的步骤中进行第二扩增(PCR)。
第一扩增***和第二扩增***的示意性形貌如图71所示。第二扩增***的引物相对于第一扩增***的引物为“嵌套形式”。
通过不同方法检测和分析获得的第一扩增产物(扩增片段1.1)和第二扩增产物(扩增片段21)。一种检测方法包括通过插层染料(EvaGreen染料)进行实时检测，另一种检测方法包括通过序列特异性寡核苷酸探针(Taqman探针)进行实时检测(这些探针允许根据序列变体来区分突变与野生型变体)，另一种分析方法包括对扩增中获得的扩增片段进行Sanger测序。
用多种方式证明了序列特异性扩增。首先，靶序列的扩增包含突变变体(通过单独的第一扩增或通过组合第一和第二扩增)。其次，在约30,000个拷贝的具有野生型变体的人类gDNA存在的情况下，实现了包含一个突变变体的靶序列的扩增(100或10个拷贝)。此外，可表明在选定条件下，具有野生型变体的靶序列未发生可测量的扩增(5000个拷贝)。
材料和方法：
靶序列：
选择以下变体作为具有多态性基因座的靶序列：
具有突变的FVL序列变体：
Figure BDA0002741821590000571
野生型序列变体：
Figure BDA0002741821590000572
两种序列均基于可从NCBI获得的信息得出：
智人1号染色体，GRCh38.p12初级装配体，序列ID：NC_000001.11
带有SNP 1691G＞A(取代)的凝血因子V，密码子506。
批料中用于制备起始核酸1.1的组分
人类gDNA：关于FVL基因的人类gDNA的WHO标准04/224
·人类DNA的携带突变的变体(03/260因子V Leiden纯合子)(FVL突变)
·野生型携带变体人类gDNA(03/254野生型因子V)(WT序列)
·寡核苷酸引物
P1F5G2-2001-203(SEQ ID NO 19)
Figure BDA0002741821590000573
1＝C3
带下划线的序列由2’-OMe修饰核苷酸(2’-O-甲基核苷酸)组成，并且对应于第一引物的第二区域。
Bst 2.0热启动DNA聚合酶(NEB 120,000单位/ml)(以1∶1000稀释度用于反应中)，又称为“Bst聚合酶”
第一扩增***
·第一寡核苷酸引物P1F5G2-1001-103
Figure BDA0002741821590000574
1＝C3
带下划线的序列由2’-OMe修饰核苷酸组成，并且对应于第一引物的第二区域。
·阻断性寡核苷酸：B1-P1F5G2-3501-304
Figure BDA0002741821590000575
2＝HEG
X＝3’-磷酸基
括号中带下划线的序列由2'-OMe修饰核苷酸组成。
·对照物-寡核苷酸：CF5G2-1002-401(SEQ ID NO 22)
Figure BDA0002741821590000576
X＝3’-磷酸基
括号中的序列由2'-OMe修饰核苷酸组成。
·第二寡核苷酸引物
P2-HAF5-081-1051(SEQ ID NO 23)
Figure BDA0002741821590000577
6＝HEG
·Bst 2.0热启动DNA聚合酶(NEB 120,000单位/ml)，又称为“Bst聚合酶”
各组分的浓度如下：
Figure BDA0002741821590000578
将人类gDNA(来自Promega，“人类雄性”)以单链形式添加到第一扩增的批料中，浓度约为每批次(12μl)100ng。这模拟了具有复杂遗传背景的测试***。人类gDNA包含汇集的样本(每批次约30,000个拷贝)。
第二扩增***(EvaGreen检测)
·第三寡核苷酸引物：P3F5G2-1001-301
5’-CTCGACACTACTTCAAGGACAAAATacctgtattcc(SEQ ID NO 24)(以0.5μmol/l的浓度使用)
·第四寡核苷酸引物：P4F5G2-1001-401
5’-ctc tgggctaata ggactacttc taatatgtaa gagca gat(SEQ ID NO 25)(以0.5μmol/l的浓度使用)
·Taq聚合酶热启动(NEB 5,000单位/ml)(以1∶100的稀释度用于反应中)
·使用EvaGreen染料进行检测(Jena Biosciences Stock 1∶50)
第三和第四引物以分别与第一和第二引物有关的“嵌套形式”设计。
用于在第二扩增中检测FVL***的寡核苷酸探针：
第二扩增***(探针检测)
·第三寡核苷酸引物：P3F5G3-1001-3303-4
5’-ACTTCAAGGACAAAATacctgt att(SEQ ID NO 26)(以0.5μmol/l的浓度使用)
·第四寡核苷酸引物：P4F5G3-1001-3404-2
5’-ATATGTAA GAGCA GAT CCC(SEQ ID NO 27)(以0.5μmol/l的浓度使用)
·Taq聚合酶热启动(NEB 5,000单位/ml)(以1∶100的稀释度用于反应中)
·寡核苷酸探针检测
第三和第四引物以分别与第一和第二引物有关的“嵌套形式”设计。
·用于FVL突变特异性检测的探针寡核苷酸S1P4-FVL-1007
5’-FAM-TTGACAGGCAAGG AA 3’-MGB-NFQ(SEQ ID NO 28)(von Thermofisher)(以0.2pmol/l的浓度使用)
·用于WT特异性检测的探针寡核苷酸：S1P4-FVL-1003-1
5’-NED-TTCTGGACAGGCGAGG 3’-MGB-NFQ(SEQ ID NO 29)(von Thermofisher)(以0.6μmol/l的浓度使用)
下划线标出了区分碱基。
NFQ＝非荧光淬灭剂(BlackHole系列淬灭剂)
这些探针是带有荧光报告剂和荧光淬灭剂的“Taqman探针”的实施例。
缓冲液：
所有反应均在同一缓冲液中进行。1x缓冲液组分(NEB)
20mM Tris-HCl
10mM(NH4)2SO4
50mM KC1
2mM MgSO4
0.1％
Figure BDA0002741821590000581
20
25℃时的pH为8.8
·可选地，EvaGreen染料(Jena Biosciences)(以1∶50的稀释度用于反应中)
·Bst聚合酶的dNTP混合物：dATP、dCTP、dGTP，每个200μmol/L，dUTP 400μmol/l
·Taq聚合酶的dNTP混合物：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，每个200μmol/L
该方法的步骤：
用于第一扩增的起始核酸的制备
首先，使用引物(P1F5G2-2001-203，***浓度为0.2μmol/l)通过Bst聚合酶的引物延伸方法来合成起始核酸1.1(在50℃下10min)，该起始核酸1.1包含始自单链人类基因组DNA的靶序列(FVL和WT序列变体的WHO标准)；然后使所述起始核酸1.1在95℃(5mid)下通过热变性从模板链上脱离下来。具有FVL突变和野生型突变的靶序列的序列变体的起始核酸1.1是分批生成的。每批使用了约100,000个拷贝的人类gDNA。用于此的引物在结构上与第一寡核苷酸引物P1F5G2-1001-103相似。
引物延伸后获得起始核酸1.1，其包含引物延伸产物，该引物延伸产物具有与靶序列互补的序列区段和在5’端的突出端。在第一扩增中，此类起始核酸可用作模板：第二引物可序列特异性地与这种起始核酸1.1结合，并且可被聚合酶延伸。对照寡核苷酸可以以其第一区域与突出端结合。
实施第一扩增和检测：
将起始核酸1.1(具有FVL突变和/或WT序列)以不同的稀释度(100个拷贝，FVL突变有10个拷贝，WT序列有5000个拷贝)添加至扩增批料中。
反应在50℃至65℃的循环温度变化下进行。
在所述温度下，未发生特异性扩增问题的自发衰减。一个循环包括在50℃(2min)和65℃(4min)下的孵育。将这些批料孵育不同的时间(最长约15h)。在反应期间检出了插层染料EvaGreen的信号。反应完成后，测定了解链曲线。扩增导致能够存储插层染料的双链DNA(扩增片段1.1)的数量增加，从而导致EvaGreen的信号增加。
在该反应期间合成的扩增片段1.1可用作第二扩增或Sanger序列分析的模板。
实施第二扩增和检测(EvaGreen)：
在用于第二扩增之前，将第一扩增的产物以1∶6000的比例稀释。存在于所述稀释批料中的扩增片段用作PCR反应的起始核酸2.1。PCR反应进行了40个循环。一个循环包括：55℃ 1min，68℃ 3min，95℃ 20s。用EvaGreen染料进行检测。通过观察信号的增加(Ct值)，可估计出反应开始时添加的模板的相对数量。在第二扩增中合成的扩增片段2.1可用于Sanger测序。
实施第二扩增和检测(探针寡核苷酸)：
在用于第二扩增之前，将第一扩增的产物以1∶6000的比例稀释。存在于所述稀释批料中的扩增片段用作PCR反应的起始核酸2.1。PCR反应进行了40个循环。一个循环包括：57℃ 1min，95℃ 20s。用序列特异性寡核苷酸探针(具有荧光报告剂的Taqman探针和来自Thermofisher的MGB)进行检测。通过观察信号的增加(Ct值)，可估计出反应开始时添加模板的相对数量以及合成产物相关序列部分中的序列组成。
结果与评阶：
在第一扩增中，从起始核酸1.1(具有FVL突变序列变体的靶序列)开始，可分批检出(EvaGreen染料)信号的增加，初始浓度约为每批100和10个拷贝(图48，箭头1和2，其中A)扩增期间的信号曲线，B)解链曲线)。从起始核酸(具有WT变体的靶序列，初始浓度约为每批次5000个拷贝)开始的批次中，未检出信号的增加(图48，箭头3)。信号处于没有起始核酸的批次水平。第一扩增完成后，取等分试样，稀释后添加到第二扩增中。
第二扩增基于完成的第一扩增的批料的稀释度(最终稀释度为1∶6000)。第二扩增使用第三和第四引物，它们嵌套在第一和第二引物上。第二扩增在第一扩增的所有批料中均显示出特定信号的增加，其扩增片段源自起始核酸1.1，该起始核酸1.1具有FVL突变变体的靶序列(图49箭头2，其中A)扩增期间的信号进程，B)解链曲线)。信号增加发生在PCR过程的早期(Ct值约为5或8)，表明第一扩增产生了高浓度的扩增片段。从具有野生型变体靶序列的起始核酸1.1开始的批次中，观察到信号(图49，箭头3，Ct值约为25)，该信号处于无起始核酸的批次水平(图49，箭头4，Ct值约为25)。对这些批次中信号增加的时间点(Ct值)的比较表明，在第一扩增结束时具有FVL突变的扩增片段的数量明显大于具有野生型DNA的扩增片段的数量。考虑到第一扩增中使用的起始核酸(10个拷贝FVL序列变体与5000个拷贝野生型DNA)，可观察到FVL序列变体的扩增明显优于野生型变体。通过Sanger分析和基于探针的检测进一步证实了单个反应的扩增产物(FVL序列)的组成。
该结果表明在第一扩增期间所述靶序列有特异性扩增。在第一扩增中合成的扩增片段可用作第二扩增中的模板。
在第一扩增期间，靶序列的两个变体之间的区分是通过对照寡核苷酸的影响来进行的，该寡核苷酸被设计成与具有突变的靶序列互补。因此，该对照寡核苷酸在一个核苷酸位置包含与所述靶序列的野生型变体的错配。对照寡核苷酸的设计使得靶序列的多态性基因座位于对照寡核苷酸的第三区域。因此，多态性基因座位于靶序列的序列区段中，该序列区段是第一引物的3’和第二引物的3’。单独使用的引物将无法区分靶序列多态性基因座中的各序列变体。
在第一扩增期间，主要是选择性扩增那些具有与对照物(具有突变的FVL靶序列)的第三区域完全互补的序列的产物。在该实施例中，选择了反应条件的有利实施方式，其中一方面引物浓度低于对照寡核苷酸的浓度，另一方面使用循环温度变化(50℃至65℃)。
在所用的寡核苷酸中，寡核苷酸引物与相应的对照寡核苷酸形成相互作用对(例如第一寡核苷酸引物和第一对照寡核苷酸)。所述相互作用对在扩增反应条件下的解链温度约为63℃(在扩增缓冲条件下，在两种组分的浓度约为1μmol/l时测定)。在约50℃的解链温度下，寡核苷酸引物的第一区域与模板的互补序列部分形成复合体(例如，在扩增缓冲条件下，在两种组分的浓度约为1μmol/l时测得的第一引物的第一区段和第二引物延伸产物(P2.1-Ext))。
取决于实施方式，引物和对照寡核苷酸可以以不同的比例使用。
在一有利的实施方式中，使用引物-对照物组合，其中引物的浓度高于对照物的浓度(例如第一引物5μmol/l和对照物2μmol/l，参见实施例1-3)。在所述实施方式中，存在过量的引物，使得尽管寡核苷酸引物与对照寡核苷酸部分地结合，在50℃的温度下的引物延伸步骤仍给出良好的收率。
在另一有利的实施方式(实施例5)中，使用引物与相应的对照寡核苷酸的混合物，其中引物的浓度低于对照寡核苷酸的浓度(例如引物0.5μmol/l和对照物2μmol/l)。因此，对照寡核苷酸过量。在所述实施方式中，将反应温度降低至50℃导致寡核苷酸引物与对照寡核苷酸的快速结合。这降低了在50℃下引物延伸步骤的收率，并降低了扩增速度。为了即使在低温下也保持足够的引物浓度并因此提高引物延伸步骤的收率，使用了所谓的阻断性寡核苷酸。这种阻断性寡核苷酸与寡核苷酸引物竞争结合对照寡核苷酸，但其自身不能被聚合酶延伸。
通过使用阻断性寡核苷酸，可在一定浓度范围内使用寡核苷酸引物与对照寡核苷酸的组合，并将其与循环温度变化相结合。这导致了反应速度的提高。
阻断性寡核苷酸的结构与寡核苷酸引物的结构基本类似，但有以下差异：
-阻断性寡核苷酸不被聚合酶延伸。例如，这可通过阻断具有修饰(例如3’-磷酸基、3’-C3、双脱氧核苷酸)的3’端以及/或者将末端错配引入到阻断性寡核苷酸的3’端来实现。
-阻断性寡核苷酸的序列组成可能与其相应的引物不同。序列错配的数量可以为1-20个核苷酸。
当设计阻断性寡核苷酸时，将阻断性寡核苷酸至对照寡核苷酸的Tm保持在与寡核苷酸引物和对照寡核苷酸的Tm相近的范围内是有利的。结果，阻断性寡核苷酸和寡核苷酸引物在相似的水平上(例如引物-对照物复合体的Tm±3℃)竞争与对照寡核苷酸的结合。通过使用相比于寡核苷酸引物而言浓度更高的阻断性寡核苷酸，可有利地影响结合率。
本发明实施方式的其他实施例
图1示意性地示出了扩增的引出物和产物，所述扩增包括使用第一扩增***和第二放大***的组分的第一扩增(图1A)(第一分扩增)和第二扩增(图1B)(第二分扩增)。反应从起始核酸1.1开始，该起始核酸1.1包含靶序列，并用作模板以开始第一分扩增。
第一扩增***的组分尤其为：第一寡核苷酸引物(P1.1)、第二寡核苷酸引物(P2.1)、对照寡核苷酸(C1.1)和第一聚合酶(Pol 1.1)、dNTP。
在第一分扩增(A1.1)期间发生了包含第一引物延伸产物P1.1-Ext和第二引物延伸产物P2.1-Ext的第一扩增片段1.1的特异性扩增。引物延伸产物P1.1-Ext在第一分扩增的反应条件下通过聚合酶实现为P1.1的模板依赖性延伸。引物延伸产物2.1-Ext是由P2.1在第一分扩增的反应条件下的依赖模板性延伸所致。引物P1.1和P2.1都包含可以与靶序列或其互补序列区段互补地结合的序列区段，从而引物位于靶序列的两端。
在第一分扩增过程中形成的扩增产物1.1可用作第二分扩增(A2.1)的起始核酸2.1。在第二分扩增期间扩增第二扩增片段2.1，该第二扩增片段2.1包含第三引物延伸产物P3.1-Ext和第四引物延伸产物P4.1-Ext，其中由P3.1的模板依赖性延伸并通过聚合酶形成了引物延伸产物P3.1-Ext，并且引物延伸产物4.1-Ext是由P4.1在第二分扩增的反应条件下的模板依赖性延伸所致。引物P3.1和P4.1都包含可以与靶序列或其互补序列区段互补地结合的序列区段。尽管P1.1和P3.1可以以其3’区段与对照寡核苷酸互补地结合，但是由于对照寡核苷酸的修饰，它们不会被所用的聚合酶延伸。
图2示意性地示出了第一分扩增的引出物和产物。在第一分扩增期间，包含第一引物延伸产物P1.1-Ext和第二引物延伸产物P2.1-Ext的第一扩增片段1.1的特异性扩增。由P1.1的模板依赖性延伸获得引物延伸产物P1.1-Ext，并且由P2.1的模板依赖性延伸生成引物延伸产物2.1-Ext。
在反应过程中形成的合成产物(P1.1-Ext和P2.1-Ext)可以在其之间以及可以与对照寡核苷酸形成不同形式的复合体(取决于浓度比和反应条件)。详细地，这些形式可包括P1.1-Ext/C1.1和/或P1.1-Ext和/或P1.1-Ext/C1.1/P2.1-Ext的复合体。
P1-Ext包含3’区段，该3’区段包含可以在第二分扩增的反应条件下与P4.1引物基本互补地结合的序列部分。P2-Ext包含3’区段，该3’区段包含可以在第二分扩增的反应条件下与P3.1引物基本互补地结合的序列部分。
图3示出了在第一和第二分扩增期间两个分扩增的温度曲线(图3A)和产物积累示意图(以时间依赖性方式增加的拷贝数)(图3B)。
在一定的温度条件下进行第一分扩增部分A1.1，其中在该温度条件下在不存在特异性对照寡核苷酸的情况下不允许发生非特异性的自发链分离。基本上，反应发生在温度T1与T2之间。在较低温度(T1)下，尤其发生第一扩增***的至少一个引物的杂交及其通过聚合酶的延伸，以及在第二温度(T2)下，尤其发生有对照寡核苷酸参与的P1-Ext与P2-Ext的分离。随着反应温度的循环变化而进行反应，其中可选择所需的循环次数，并且可影响扩增的程度。在此，示出了从约10个拷贝增加到约108个拷贝的示意图(图3B)。此外，这里示意性地示出了在完成第一分扩增之后，所形成的一部分产物(扩增产物1.1)已作为等分试样转移到第二分扩增中，并且可用作第二分扩增的起始核酸链。因此，当在第一部分反应之后对该批料进行稀释时，只有在第一反应中形成的拷贝数的一部分被转移到第二反应中。第一扩增***的组分也被稀释，从而由于产生的低浓度而降低了它们对第二扩增***的影响。
图3A还示意性地示出了第二分扩增的序列(A2.1)，其中选择所使用的温度条件，使得在合成的互补引物延伸产物的两条链之间的键的热去稳作用下，在温度(T3)下所得扩增产物的分离主要是非特异性的，且无需对照寡核苷酸的基本参与。在T1下的引物结合和延伸类似于第一分扩增中的引物结合和延伸。反应基本上像PCR一样进行，其中进行必要数量的PCR循环，以生成所需的拷贝数。反应包括引物与模板的结合，其延伸直至形成相应的引物延伸产物以及通过温度使形成的链分离。PCR从包含约105个靶序列的第一扩增产物1.1的初始拷贝数开始，并且将包含靶序列的扩增产物2.1扩增至约1010个拷贝。
第一分扩增是在对照寡核苷酸的参与下在可导致合成链的序列依赖性分离的条件下进行的。第二分扩增以PCR进行，其中链分离主要是序列非特异性的。
图4示意性地示出了在第一和第二分扩增期间两个分扩增的温度曲线(图4A)和产物积累示意图(以时间依赖性方式增加的拷贝数)(图4B)。反应进行如图3所示，不同之处在于第二扩增***的组分添加到第一分扩增的批料中，以使形成的第一扩增片段1.1的拷贝数构成用于第二分扩增的起始核酸2.1的初始量，并且第一扩增***的组分不会发生明显的稀释。
图5示意性地示出了扩增的起始材料和产物，所述扩增包括使用第一扩增***和第二扩增***的组分的第一分扩增(图5A)和随后的第二分扩增(图5B)。该反应的进行基本上如图1所示，不同之处在于在第二分扩增期间使用了引物P3.2和P4.2，这些引物不包含分别与P1.1-Ext和P2.1-Ext的3’末端基本互补的序列片段。因此，具有3’末端的P1.1-Ext和P2.1-Ext产物不能分别与被聚合酶(例如Pol 1.1或Pol 2.1)延伸的引物P3.2和P4.2互补地结合。这防止了在第一分扩增的反应条件下使用引物P3.2和P4.2时P1.1-Ext和P2.1-Ext的过度延伸。在第二分扩增期间，在循环合成过程及其增生过程中形成完整的P3.1-Ext和P4.1-Ext产物。通过使用这种引物组合(包括P1.1和P2.1的第一组和包括P3.1和P4.1的第二组)，可设计均相反应，其中两组引物在扩增开始时都提供在同一反应批次中。
图6示意性地示出了在第一和第二分扩增期间两个分扩增的温度曲线(图6A)和产物积累示意图(以时间依赖性方式增加的拷贝数)(图6B)。
该图示意性地示出了温度曲线，其中两个分扩增彼此紧接进行(两组引物在反应开始时都存在于批料中)。示意性地示出了在第一扩增期间，扩增产物1.1的拷贝数从约10增加到约104。这些产物包含靶序列，并用作第二扩增的起始核酸2.1。在第二扩增期间，扩增靶序列的数目从扩增产物1.1的约104个进一步增加到所得扩增产物2.2的约1010个。
图7A示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。图7A中的温度变化顺序对应于图3中描述的顺序：在一定的温度条件下进行第一分扩增区段A1.1，其中在该温度条件下在不存在特异性对照寡核苷酸的情况下不允许发生非特异性的自发链分离。基本上，反应发生在温度T1与T2之间。在较低温度(T1)下，尤其进行第一扩增***的至少一个引物的杂交及其通过聚合酶的延伸，以及在第二温度(T2)下，尤其进行有对照寡核苷酸参与的P1-ext与P2-ext的分离。在反应过程中，第一扩增产物1.1发生扩增，其可用作第二分扩增中的起始核酸2.1。随着反应温度的循环变化而进行反应，其中可选择所需的循环次数，并且可影响扩增的程度。图7A还示意性地示出了第二分扩增(A2.1)的过程，其在第一分扩增之后立即进行，其中使用的温度条件使得由于在合成的互补引物延伸产物的两条链之间的键的热去稳作用，在温度(T3)下所得扩增产物的分离主要是非特异性的，且无需对照寡核苷酸的大量参与。在T1下的引物结合和延伸类似于第一分扩增中的引物结合和延伸。反应基本上像PCR一样进行，其中进行必要数量的PCR循环，以生成所需的拷贝数。反应包括引物与模板的结合，其延伸直至形成相应的引物延伸产物以及通过温度使形成的链分离。第一分扩增是在对照寡核苷酸的参与下在可导致合成链的序列依赖性分离的条件下进行的。第二分扩增以PCR发生，其中链分离主要是序列非特异性的。
图7B示出了如图7A所示的第一和第二扩增。这两个反应都通过另一温度步骤(在此称为“温度切换步骤”)分离，该步骤包括在一定时间内将温度升高至约T3。在所述步骤期间，例如，可能发生第一分扩增的聚合酶的失活和/或第二分扩增的聚合酶的失活和/或不耐热引物的激活。通过这样的步骤，扩增***的各组分的活性也随之发生变化。
图8示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。第一分扩增的序列对应于图7A中描述的序列。第二分扩增分为两个阶段。在第一阶段(A2.1阶段1)期间，温度在T1与T3之间变化。在T1期间，第二扩增***的至少一个引物可以与其在扩增产物1.1中的相应互补位置结合并被延伸。通过使用较低的温度，可使用具有相对短的3’区段的引物，它们可互补地结合(如图5所示)。阶段1可包括几个循环，其中形成初始扩增产物2.1，其包含较长的互补区段，因此能够在较高温度下结合引物。这允许在阶段2中使用较高的温度进行引物结合和引物延伸步骤(此处显示为T2与T3之间的循环延伸)。通过升高温度，例如，可抵消副反应的发展。
图8B示意性地示出了在A2.1的阶段1期间温度进一步降低至温度T4，从而例如使第二组的引物可以结合。在阶段1中使用温度T4可能是由于使用了第二组的至少一个引物，所述引物包含与第一扩增产物的互补序列区段的至少一个错配。低温(T4)用于支持从P3.1和/或P4.1开始的引物延伸产物的初始生成。在此初始生成之后，由于现已存在完全互补的引物结合位点，因而可提高具有引物结合和引物延伸的步骤的温度(阶段2)。
图9A示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。第一分扩增在均匀温度下(此处为T2)进行。在此温度下进行第一分扩增的所有必要步骤。例如，这之后可升高温度(温度切换步骤)(如图7B所示)。随后进行PCR反应作为第二分扩增。
第一分扩增在均匀温度下进行，这在对照寡核苷酸的帮助下促进了序列依赖性链分离。
图9B示意性地示出了第一分扩增的另一温度曲线，其包括等温相(开始时)和随后的循环相。在此，第一分扩增也在对照寡核苷酸的参与下在促进序列依赖性链分离的温度下进行。
图10A示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。阶段2中的第二分扩增包括使用高于T2的另一温度T5。所述温度在约68℃与82℃之间。使用温度T5可削弱对照寡核苷酸与P3.1 Ext的结合，并因此减少这种结合对P4.1延伸的影响，使得P4.1的延伸可以更有效。
图10B示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。在第二分扩增区段期间，第二扩增产物的初始生成在阶段1中进行。当使用可在较高温度下(T5)与互补位置结合并可通过聚合酶延伸的引物3.1和4.1时，第二阶段的温度可以在T5与T3之间变化。反应条件的选择会影响中间产物或最终产物的形成。例如，通过在第二分扩增中(例如在T2和/或T5下)在引物结合步骤和引物延伸步骤中使用较高的温度和较长的P3.1和P4.1(例如长度为30-40个核苷酸)，P3.1-Ext和P4.1-Ext优选地被累积。
图11示意性地示出了两个分扩增的温度曲线。两个分扩增之间的过渡阶段可以设计得不同。图11A示出了在第一分扩增即将结束时温度的连续升高。图11B示出了在第一分扩增结束时温度的循环性降低。因此，分扩增的两个区段在反应过程中可以有部分重叠。
图12-18示出了第一扩增***的各组分之间的关系(直到图14)以及第一扩增***和第二扩增***的组分之间的关系。图15A示意性地示出了从起始核酸1.1(在此示意性地将其作为待扩增核酸添加到反应中)开始的第一扩增片段(包含P1.1-Ext和P2.1-Ext)的生成。图15B示意性地示出了中间体的生成，所述中间体是使用第一分扩增的引物P3.1和P4.1以及P1.1-Ext和P2.1-Ext作为模板而生成的(P3.1-Ext Part 1和P4.1-Ext Part 1)。通过使用P3.1-Ext Part 1和P4.1-Ext Part 1作为模板再次进行引物结合和延伸，可在后续循环中将这些中间体转变为完整的P3.1-Ext和P4.1-Ext。条件的选择会影响中间产物或最终产物的形成。例如，通过在第二分扩增中(例如在T2和/或T5下)在引物结合步骤和引物延伸步骤中使用较高的温度和较长的P3.1和P4.1(例如长度为30-40个核苷酸)，P3.1-Ext和P4.1-Ext优选地被累积。
图19-26示意性地示出了对照寡核苷酸(C1.1)、第一引物(P1.1)和第三引物(P3.1)以及第二引物延伸产物(P2.1-Ext)的序列区段的排列实施例。P2.1-Ext包含与3’区段中的P1.1互补的序列，并且可用作模板以在第一分扩增中生成P1.1-Ext。此外，P2.1-Ext包含P3.1的3’区段的另一互补区段，该区段可以与P2.1-Ext结合并通过聚合酶延伸，因此P3.1-Ext可以在第二分扩增中生成。
图16-26总结了区段在对照寡核苷酸以及P1.1和P3.1中排列的实施例。P3.1可以以其3’区段与对照寡核苷酸互补地结合。该结合发生在对照寡核苷酸的序列区段中，在此称之为第四区域。取决于P3.1的详细定位方式，该第四区域相对于区域一、二或三可具有不同的定位。在某些实施方式中，第四区域位于第二区域内(图19、20)；在另一实施方式中，第四区域位于区域二与区域三之间的过渡处(图21)；在另一实施方式中，第四区域位于对照寡核苷酸的第三区域中(图22)。特别地，对照寡核苷酸的存在不应导致意外形成副产物。总之，与对照寡核苷酸结合的引物不应导致聚合酶使用对照寡核苷酸来催化P1.1延伸或P3.1延伸。这通常通过在对照寡核苷酸中使用核苷酸修饰(例如通过使用2’-O-烷基修饰)来实现。此类修饰特别用于对照寡核苷酸的序列区段中，这些序列区段包含与各自引物的至少3’区段互补的序列。此外，这种修饰可延伸到与引物互补的序列区段之外，例如这些序列区段可包含约-10至约+10个核苷酸的位置或各自引物的3’端的位置。具有这种核苷酸修饰的序列区段在此被称为“第二阻断单元”(其包含与第一引物(P1.1)互补的序列区段(图19-22))，或被称为“第四阻断单元”(其包含与第三引物(P3.1)互补的序列区段(图19-22))。当引物与对照寡核苷酸结合时，对照寡核苷酸的这种修饰阻止聚合酶启动模板依赖性引物延伸。核苷酸修饰的组成在第二和第四阻断单元中可以相同或不同。对于各阻断单元，组合起来形成第二或第四阻断单元的各序列区段的长度也可以相同或不同。各阻断单元的位置取决于引物在对照寡核苷酸上的各潜在结合位点的位置(图19-22)。详细示出了用于第一引物的第二阻断单元的可能组成。第四阻断单元的组成可类似于第二阻断单元的组成。在一具体实施方式中，对照寡核苷酸的第三区域完全由核苷酸的2'-O-烷基修饰组成。在另一具体实施方式中，对照寡核苷酸在其3’区段中的第三区域(例如与对照寡核苷酸的第二区域相邻的1-20的核苷酸位置)完全由核苷酸的2'-O-烷基修饰组成。在另一具体实施方式中，对照寡核苷酸的第二区域完全由核苷酸的2’-O-烷基修饰组成。在另一具体实施方式中，对照寡核苷酸的第二区域及在其3’区段中的第三区域(第二区域后的位置1-20)完全由核苷酸的2'-O-烷基修饰组成。因此，并非绝对需要单独提供具有修饰的单个片段，而是可通过互补核苷酸(例如具有2’-O-烷基修饰)来提供对照寡核苷酸的完整序列区段。
由于引物延伸产物的互补序列区段中缺乏修饰(这是由于聚合酶以模板依赖性方式产生的酶促活性而产生)，因而引物在通过聚合酶与此类序列区段互补地结合时可以被识别并延伸。
图27-31示意性地示出了包括第一引物组(P1.1和P2.1)和第二引物组(P3.1和P4.1)的布置和潜在组合的实施例。第一引物组的引物之一可以与第二引物组的引物之一相同(例如P4.1对应于图27-28中的P2.1)。尤其是当在第一分扩增后使用反应混合物的稀释液并在第一分扩增后添加第二扩增***的组分时，第二引物组的引物的长度可能与第一引物组的长度不同(图30)。优选地，使用引物3的结构，其仅在其3’区段中包含与对照寡核苷酸互补的序列。第三引物的5’区段的组成尤其不包含与对照寡核苷酸互补的序列区段(图31)。
图32-35示意性地示出了第一分扩增中的组分的相互作用。
图32示出了图33-35中所示结构的组分。
图33示意性地示出了链置换机制。
图34示意性地示出了链置换期间结构的相互作用。
图35示意性地示出了在第一核酸扩增期间结构的相互作用，其一方面是通过第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的扩增，另一方面是通过对照寡核苷酸的作用和由此产生的链置换。
图36示出了实施例1的结果。
图37示出了实施例2的结果。
图38-40示出了实施例3的结果。
图41-47示出了实施例4的结果。
图48-49示出了实施例5的结果。
图50-51示意性地示出了起始核酸链1.1的制备。
图52-54示意性地示出了扩增方法的某些实施方式。
为了引发第一扩增，提供了第一核酸聚合物，其包含第一靶序列M[和与M(反向)互补的序列M’]，其中5'-3’方向的M包含连续的序列区段MPL、MS和MPR。
在一实施方式中，第一核酸聚合物包含起始核酸链。在另一实施方式中，第一核酸聚合物包含待扩增的第一扩增核酸链。在另一实施方式中，第一核酸聚合物包含要从第二扩增中扩增的核酸链。
在所述实施方式中，5'-3’方向的靶序列M[和与M(反向)互补的序列M’]包含连续的序列区段MPL、MS和MPR。在一实施方式中，第一核酸聚合物包含这样的靶序列M。在另一实施方式中，起始核酸链包含这样的靶序列M。在另一实施方式中，第一扩增中的待扩增核酸链包含这样的靶序列M。在另一实施方式中，第一扩增的扩增片段1.1包含这样的靶序列M。在另一实施方式中，第二扩增的待扩增核酸链包含这样的靶序列M。在另一实施方式中，第二扩增的扩增片段21包含这样的靶序列M。
此处所示的第一左寡核苷酸引物PL1与靶序列M的MPL(基本)相同。这种PL1是第二寡核苷酸引物(P2.1)的一具体实施方式。
此处所示的第一右寡核苷酸引物PR1是第一寡核苷酸引物(P1.1)的一具体实施方式。PR1在5'-3’方向包含连续的序列区段PCR和PMR，其中PMR(在本实施方式中对应于所述靶序列M的第一区域，其包含在待扩增核酸中)具有基本上互补的[杂交]序列[可以基本上序列特异性地结合]，并且序列区段PCR(在所述实施方式中，所述区段对应于第一引物的第二区域)不与靶序列M[或相对于3’方向上的序列M而言与MPR紧邻的序列，例如第一起始核酸的序列]结合；其中，PR1(尤其是在所述区段PCR中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得PCR不能用作所述第一模板依赖性核酸聚合酶的活性的模板。在此示出的对照寡核苷酸CR在5’-3’方向包含连续的序列区段CSR、CPR和CCR。序列区段CSR对应于对照寡核苷酸的第三区域。序列区段CPR对应于对照寡核苷酸的第二区域。序列区段CCR对应于对照寡核苷酸的第一区段。
在一实施方式中，序列区段CSR与位于MPR的5’方向上的靶序列的MS区段相同[并且在PR1的聚合酶启动时首先被读取，即CSR可以与引物PR1的聚合产物(第一引物的延伸产物)结合]。
在一实施方式中，序列区段CPR与第一引物的PMR互补(并且与靶序列M的MPR相同)。
在一实施方式中，序列区段CCR(对照寡核苷酸的第一区段)与第一引物的PCR(第二区域)互补。
在一实施方式中，对照寡核苷酸(CR)在其第三区段(CSR)中包含修饰的核苷酸结构单元，因此CSR不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板。
第一引物延伸产物(PR1’)：该第一引物延伸产物在5'-3’方向上除了(第一寡核苷酸引物的)序列区域PCR和PMR之外，还包含与靶序列M基本互补的合成区域PSR，且该靶序列M所在的区域与5’方向上的MPR相邻。
第二引物延伸产物(PL1’)：除了序列区域MPL之外，该引物延伸产物还包含合成区域PSL，该合成区域PSL与靶序列M基本相同，且该靶序列M所在的区域与3’方向上的MPL相邻。
PR1’和PL1’一起形成扩增片段1.1，并用作第二扩增的模板(起始核酸2.1)。
第二左寡核苷酸引物PL2：这种PL2是第四寡核苷酸引物(P4.1)的一具体实施方式。在一实施方式中，所述PL2与第一次级引物结合区域MPL2相同。在这种类型的实施方式中，该MPL2包含在第二扩增片段2.1的P4.1 Ext中。在另一实施方式中，MPL2可包含在第二引物延伸产物中。在另一实施方式中，MPL2可包含在靶序列M中。
第二右寡核苷酸引物PR2：PR2是第三寡核苷酸引物(P3.1)的一具体实施方式，该第三寡核苷酸引物(P31)在一实施方式中与区域MPR2互补。所述MPR2可包含在第二引物延伸产物的一实施方式中。在除此之外的实施方式中，MPR2可包含在第四引物延伸产物中。在另一实施方式中，MPR2可包含在靶序列M中。
PL2和PR2的排列可以不同。在一实施方式中，MPL2和MPR2将由靶序列M组成。在一实施方式中，MPL2的3’端(至少20个位置)位于MPR2的5’端的5’方向上。在另一实施方式中，尤其是MPL2与MPL相同以及/或者MPR2与MPR相同。
在另一实施方式中，第三(PR2)和第四(PL2)寡核苷酸引物可包含其他序列区段(PCL2或PCR2)。
在第二扩增中，第三(PR2)和第四(PL2)寡核苷酸引物可以与第一扩增片段的相应互补位点结合，使得这些引物在第二扩增中被第二聚合酶延伸。一一第二扩增，第三和第四引物的引物延伸产物(P3.1-Ext和P4.1-Ext)增加。结果得到第二扩增片段2.1。
图55示意性地示出了第一扩增***的组分的形貌的某些实施方式。
起始核酸1.1包含(在5'-3’方向上)以下区段：M1.Y、M1.5、M1.4、M1.3、M1.2、M1.1、M1.x。
第一寡核苷酸引物包含(在5’-3’方向上)以下区段：第一区段(P1.1.1)和第二区段(P1.1.2)。
对照寡核苷酸(C1.1)包含(在5'-3’方向上)以下区段：第三区域(C1.1.3)、第二区域(C1.1.2)、第一区域(C1.1.1)。
对照寡核苷酸(C1.2)包含(在5'-3’方向上)以下区段：第三区段(C1.2.3)、第二区域(C1.2.2)、第一区域(C1.2.1)。
第二引物P2.1包含(在5’-3’方向上)以下区段：P2.1.1。
第二引物P2.2包含(在5’-3’方向上)以下区段：P2.2.1。
第二引物P2.3包含(在5’-3’方向上)以下区段：P2.3.1。
第一引物延伸产物(P1.1-Ext)包含(在5'-3’方向上)以下区段：P1.1E6、P1.1E5、P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2、P1.1E1。
第二引物延伸产物(P2.1-Ext)包含(在5'-3’方向上)以下区段：P2.1E5、P2.1E4、P2.1E3、P2.1E2、P2.1E1。
优选在第一扩增期间获得的引物延伸产物P1.1-Ext和P2.1-Ext可形成互补双链体，并一起代表第二扩增片段1.1，该第二扩增片段1.1可用作第二扩增的起始核酸2.1。
P1.1.1可以与M1.1主要互补地结合，并可通过聚合酶进行延伸。P2.1.1可以与P1.1E1互补地结合，并可通过聚合酶进行延伸。P1.1-Ext和P2.1-Ext代表待扩增核酸，其用作第二扩增的起始核酸2.1。P2.1、P2.2和P2.3代表第二引物的变体，并导致相同的扩增片段。
图56-57示意性地示出了第一和第二扩增***的形貌的某些实施方式：
第三寡核苷酸引物包含(在5’-3’方向上)以下区段：P3.1.2、P3.1.1，其中P3.1.2不与起始核酸1.1或P2.1-Ext互补。P3.1.1与P2.1-Ext的P2.1E1基本互补。
第四寡核苷酸引物包含(在5’-3’方向上)以下区段：P4.1.2、P4.1.1，其中P4.1.2不与起始核酸1.1的互补链或不与P1.1-Ext互补。P4.1.1与P1.1-Ext的P1.1E1基本互补。
优选在第二扩增期间获得的引物延伸产物P3.1-Ext和P4.1-Ext可形成互补双链体，并且一起代表第二扩增片段2.1。
P3.1-Ext包含(在5’-3’方向上)以下区段：P3.1E7、P3.1E6、P3.1E5、P3.1E4、P3.1E3、P3.1E2、P3.1E1。区段P3.1.E5至P3.1E3在序列上与P1.1E4至P1.1E2相同。
P4.1-Ext包含(在5’-3’方向上)以下区段：P4.1E7、P4.1E6、P43.1E5、P4.1E4、P4.1E3、P43.1E2、P4.1E1。区段P4.1.E5至P4.1E3在序列上与P2.1E4至P2.1E2相同。
图57示意性地示出了第三引物(P3.1，P3.2，P3.3)和第四引物(P4.1，P4.2，P4.3)的某些实施方式，其中各引物的3’区段可相对于彼此移位。
图58-59示意性地示出了寡核苷酸探针的定位区域的某些实施方式：
D1-位于P4.1 Ext的5’端。因此，可使用具有探针功能的引物，例如Scorpion引物、Lux引物，其中引物在其3’区段中的结构类似于P4.1。
D4-位于P3.1 Ext的5’端。因此，可使用具有探针功能的引物，例如Scorpion引物、Lux引物，其中引物在其3’区段中的结构类似于P3.1。
区域D2和D3分别位于P3.1-Ext和P4.1-Ext的中间区段。因此，杂交探针(例如分子信标、Taqman探针(5’-3’核酸酶可切割探针或具有FRET对的2-寡核苷酸探针)可位于此处。
因为所述区域不与对照寡核苷酸重叠，所以D2区域尤其适合潜在的探针定位(在P3.1-Ext或P4.1-Ext中)。因此，尤其对于均相测定，探针可用于所述区域中。所述区域包含第三引物延伸产物的3’区段。区域D3中的探针也可用于P3.1-Ext和P4.1-Ext。然而，在C1.2浓度较高的情况下(对照物，例如0.5mol/l至5μmol/l，例如在均相测定中)，必须考虑到此类探针可能与对照物相互作用或可能被对照物取代。当对照物的浓度相对较低时(例如在小于1nmol/l的区段中)，可忽略与对照物的这种相互作用(例如当在第二扩增之前稀释第一扩增时)。
图60示意性地示出了探针片段定位的某些实施方式，其可以与第三(并且可能是第一)引物延伸产物(P3.1-Ext和P1.1-Ext)主要互补地结合。不同的实施方式表明存在多种可能的潜在探针定位。
图61示意性地示出了探针片段定位的某些实施方式，其可以与第四(并且可能是第二)引物延伸产物(P4.1-Ext和P2.1-Ext)主要互补地结合。不同的实施方式表明存在多种可能的潜在探针定位。
图62-63示意性地示出了探针的某些实施方式。
定位于D1的探针：S3.1、S3.2、S3.3。该探针包含荧光报告剂(R)/荧光淬灭剂(Q)对，该荧光报告剂(R)/荧光淬灭剂(Q)对当与引物延伸产物的相应区段杂交时(报告剂/淬灭剂的空间分离)会使信号增加。探针S3.1和S3.3可作为引物进行延伸，从而得到基于具有探针功能的引物(S3.1-Ext)和S3.3.Ext的引物延伸产物(图63)。
图64-67示意性地示出了寡核苷酸探针的某些实施方式及其广泛程度：S3.4代表5'-3’核酸酶裂变探针(“Taqman探针”)。该探针与P3.1 Ext杂交后可被Taq聚合酶切割，其中同时发生P4.1的延伸。
探针S3.6代表一探针***，其中2个寡核苷酸可以/必须与P3.1 Ext结合。因此，一个寡核苷酸是具有荧光报告剂(R)的探针S3.6，另一探针是对照寡核苷酸C1.2，其在其5’区域包含供体荧光团。如果两个寡核苷酸同时与P3.1-Ext结合，则有足够的空间接近性(低于25NT)使FRET发生，从而产生信号。
探针S3.7示意性地表示具有自互补部分(“分子信标”)的探针。在未结合状态下，来自荧光报告剂(R)的信号在选定的反应条件下优先被荧光淬灭剂(Q)淬灭。互补结合导致结构解卷积，这导致R与Q在空间上分离，这通常导致信号增加。
图68-71示意性地示出了靶序列1-3在起始核酸1.1、扩增片段1.1(P1.1-Ext和P2.1-Ext)和第二扩增片段2.1(P3.1-Ext和P4.1-Ext)中的定位的某些实施方式。
序列表
<110> AGCT有限公司
<120> 一种具有更高特异性的核酸扩增方法
<130> agc105wo
<160> 29
<170> 专利版本 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gtaagagcag atccctggac aggcaaggaa tacaggta 38
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (34)..(45)
<223> 2?O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (45)..(46)
<223> C3 接头
<400> 2
aactcagaca agatgtgatt tttttacctg tatcucugau gcuuctacct gtattcc 57
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (35)..(36)
<223> HEG 接头
<400> 3
ctacagaact cagacaagat gtgaactaca atgttgctca tactacaatg tcacttactg 60
taagagcaga 70
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照寡核苷酸
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(49)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (56)..(56)
<223> 3’-磷酸基
<400> 4
uaaucuguaa gagcagaucc cuggacaggc aaggaauaca ggtagaagca tcagag 56
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aagctcgaca aaagaactca gagtgtgctc gacactacct gtattccttg cc 52
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
gctcatacta caatgtcact tactgtaaga gcagatccct ggacaggcaa ggaatacagg 60
taaaaaa 67
<210> 7
<211> 67
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gctcatacta caatgtcact tactgtaaga gcagatccct ggacaggcga ggaatacagg 60
taaaaaa 67
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
acgaagctcg caagaactca gagtgtgctc gacactacct gtattcc 47
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的四甲基罗丹明
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
gctcatacta caatgtcact tactgtaaga gcagatccct ggacaggcaa ggaatacagg 60
ta 62
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的四甲基罗丹明
<400> 11
gtaccgaagc tcgcaggaac tcagagtgtg gagaggacga aaatgtccag gga 53
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
aagctcgaca aaagaactca gagtgtgctc gacactacct gtattccttg 50
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (11)..(12)
<223> ***两次2? 脱氧肌苷
<220>
<221> 其他功能
<222> (31)..(43)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (43)..(44)
<223> C3 接头
<400> 13
cacttacgac acaagatttt tttacctgta tcucugaugc uuctacctgt attcc 55
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的四甲基罗丹明
<400> 14
gtaccgaagc tcgcaggaac tcagagtgtg gagaggacga aaactgtcca gggatc 56
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的四甲基罗丹明
<400> 15
gtaccgaagc tcgcaggaac tcagagtgtg gagaggacga aaaccaggga t 51
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的四甲基罗丹明
<400> 16
gtaccgaagc tcgcaggaac tcagagtgtg gagaggacga aaactgtcca g 51
<210> 17
<211> 70
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
tgggctaata ggactacttc taatctgtaa gagcagatcc ctggacaggc aaggaataca 60
ggtattttgt 70
<210> 18
<211> 70
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
tgggctaata ggactacttc taatctgtaa gagcagatcc ctggacaggc gaggaataca 60
ggtattttgt 70
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (31)..(42)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (42)..(43)
<223> C3 接头
<400> 19
cacaatcatc aatacttttt tgtcaaaata cucugaugcu cugtcaaaat acctgtatt 59
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (31)..(42)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (42)..(43)
<223> C3 接头
<400> 20
cacaatcatc aatacttttt tgtcaaaata cucugaugcu cugtcaaaat acct 54
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阻断寡核苷酸
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(17)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (17)..(18)
<223> HEG 接头
<220>
<221> 其他功能
<222> (28)..(28)
<223> 3?磷酸基
<400> 21
cucugaugcu cugucaaaat acctgaaa 28
<210> 22
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照寡核苷酸
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(57)
<223> 2’-O-甲基修饰
<220>
<221> 其他功能
<222> (76)..(76)
<223> 3?磷酸基
<400> 22
aggacuacuu cuaaucugua agagcagauc ccuggacagg caaggaauac agguauuttg 60
acagagcatc agagag 76
<210> 23
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 其他功能
<222> (24)..(25)
<223> HEG 接头
<400> 23
cacaatcatc aatactaata ggacctctgg gctaatagga ctacttctaa tctgtaagag 60
ca 62
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ctcgacacta cttcaaggac aaaatacctg tattcc 36
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ctctgggcta ataggactac ttctaatatg taagagcaga t 41
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
acttcaagga caaaatacct gtatt 25
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
atatgtaaga gcagatccc 19
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针寡核苷酸
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的 FAM 染料
<220>
<221> 其他功能
<222> (15)..(15)
<223> MGB-非荧光淬灭剂
<400> 28
ttgacaggca aggaa 15
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针寡核苷酸
<220>
<221> 其他功能
<222> (1)..(1)
<223> 5’ 端的 NED 染料
<220>
<221> 其他功能
<222> (16)..(16)
<223> MGB-非荧光淬灭剂
<400> 29
ttctggacag gcgagg 16

Claims (22)

1.一种用于扩增核酸的方法(图56)，其中：
·样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及与M1(反向)互补的序列M1’]，其中M在5’-3’方向包含连续的序列片段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，且在第一扩增步骤中与以下组分接触：
·第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(尤其是镁离子)；
·第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列片段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补[可基本上序列特异性地结合]的[杂交]序列，而序列区段P1.1.2不能与M1[或相对于序列M1紧随3’方向上M1.1的序列]结合；
其中，P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
·第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同[并且能够序列特异性地与M1的反链上的M1.5的反向互补序列或P1.1的延伸产物P1.1-Ext(该处称为P1.1E1)结合]；以及
·对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列片段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与M1的区段M1.2相同，且区段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3可以与引物P1.1-Ext的聚合产物结合]，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；
其中，C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
其中，所述样品在第二扩增步骤中与下列组分接触：
c)第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且与M1的M1.1(反向)互补[可以与P2.1-Ext互补地结合]；
d)第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且与M1的M1.5相同和/或基本相同[可以与P1.1-Ext互补地结合]；以及
e)第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。
2.如权利要求1所述的用于扩增核酸的方法，其中获得了第一引物延伸产物P1.1-Ext，其在5’-3’方向上除了序列区域P1.1.2和P1.1.1之外，还包括在5’-3’方向上包含序列片段P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2和P1.1E1的合成区域，其中P1.1E4与靶序列M1的序列区段M1.2基本互补，P1.1E3与M1.3基本互补，P1.1E2与M1.4基本互补，以及P1.1E1与M1.5基本互补，并且得到第二引物延伸产物P2.1-Ext，其除了序列区域P2.1.1之外还包含合成区域P2.1-Ext，其与所述靶序列M1基本相同，且所述靶序列M1所在的区域与3’方向上的M1.5相邻；
其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，
以使P1.1-Ext可以与M1或P2.1-Ext形成双链，而P1.1-Ext可以与C1.2形成双链，并且P1.1-Ext与C1.2形成的所述双链优选于其与P2.1-Ext形成的所述双链。
3.如权利要求2所述的用于扩增核酸的方法，其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，
以使在没有所述对照寡核苷酸C1.2的情况下，所述第一引物延伸产物P1.1-Ext根本或基本不与所述第二引物延伸产物P2.1-Ext分离。
4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述修饰的核苷酸结构单元包括2’-O-烷基核糖核苷结构单元，尤其是2’-O-甲基核糖核苷结构单元。
5.如前述权利要求之一所述的方法，其中所述第一扩增步骤基本上等温地进行，尤其是在20℃至50℃之间的温度下进行。
6.如前述权利要求之一所述的方法，其中进行所述第一扩增步骤，直至P1.1-Ext的拷贝数达到10至1e12，尤其是100至1e10，尤其是1000至1e8。
7.如前述权利要求之一所述的方法，其中P3.1和P4.1分别包含第二区域P3.1.2和P4.1.2；所述第二区域P3.1.2和P4.1.2分别与区域P3.1.1和P4.1.1的5’端相邻，且分别不与P1.1-Ext和P2.1-Ext互补。
8.如前述权利要求之一所述的方法，其中在所述第二扩增步骤期间，所述反应温度循环地升高和降低，尤其是在20℃与75℃之间的低温范围中以及85℃与105℃之间的温度范围中。
9.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述第一聚合酶和所述第二聚合酶是相同的。
10.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：
-P1.1和P3.1基本相同；以及/或者
-P2.1和P4.1基本相同。
11.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增和所述第二扩增在同一反应批次中进行。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述第二聚合酶、所述第三寡核苷酸引物(P3.1)和/或所述第四寡核苷酸引物(P4.1)可被激活，以及/或者所述对照寡核苷酸可被灭活。
13.如前述权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增在第一反应批次中进行，所述第二扩增在第二反应批次中进行。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于：将所述第一反应批次或全部的第一反应批次的等分试样添加到所述第二反应批次中。
15.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述对照寡核苷酸(C1.1)包含可序列特异性地与所述第三寡核苷酸引物(P3.2)结合的第四区域。
16.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述第一寡核苷酸引物(P1.1)在所述第二区域(尤其紧随所述第一引物寡核苷酸的所述第一区域)具有一个或多个修饰，其将所述第一聚合酶终止在所述第二区域。
17.如前述权利要求之一所述的方法，其中所述样品还与第一探针寡核苷酸接触，该第一探针寡核苷酸：
a.包含一序列区段，该序列区段：
i.与位于序列区段M1.2、M1.3和M1.4上的M1的序列相同；或者
ii.与位于序列区段M1.3和M1.4上的M1的序列互补；
b.与一荧光染料结合，该荧光染料：
iii.与第一探针寡核苷酸所连接的第二探针寡核苷酸形成供体-淬灭剂对或FRET对；或者
iv.形成供体-淬灭剂对或FRET对，其中荧光染料与第二探针寡核苷酸连接，该第二探针寡核苷酸能够足够接近第一探针寡核苷酸的结合位点进行结合。
18.一种用于扩增核酸的方法，其中：
a)在第一扩增步骤中，使包含第一靶序列M1的第一核酸聚合酶(其中M1在5’-3’方向包含连续的序列区段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1)与以下组分接触：
b)第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物：
c)第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补的[杂交]序列，且序列区段P1.1.2不能与M1结合：
其中，P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作所述第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
d)第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同；以及
e)对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与位于M1.1的5’方向上的M1的区段M1.2相同，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，以及C1.2.1与P1.1.2互补；
其中，C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作所述模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
其中，所述样品还与第一探针寡核苷酸接触，该第一探针寡核苷酸：
a.包含一序列区段，该序列区段：
i.与位于序列区段M1.2、M1.3和M1.4上的M1的序列相同；或者
ii.与位于序列区段M1.3和M1.4上的M1的序列互补；
b.与一荧光染料结合，该荧光染料：
i.与所述第一探针寡核苷酸所连接的第二探针寡核苷酸形成供体-淬灭剂对或FRET对；或者
ii.形成供体-淬灭剂对或FRET对，其中荧光染料与第二探针寡核苷酸连接，该第二探针寡核苷酸能够足够接近所述第一探针寡核苷酸的结合位点进行结合。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中在所述第二扩增步骤的反应条件下，所述第一探针寡核苷酸的所述序列区段不与P1.1、P2.1、P3.1和P4.1杂交，也不与C1.2杂交。
20.一种用于实施如前述权利要求之一所述的方法的试剂盒，包含：
a)第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列区段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1连接至真核生物或致病细菌(尤其是哺乳动物)的基因组序列M1的引物结合位点M1.1，尤其是人类靶序列；其中M1在5’-3’方向包含连续的所述序列区段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，并且所述序列区段P1.1.2不能与M1结合[或不能与相对于3’方向上的所述序列M1紧随在M1.1之后的序列结合；
其中，P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
b)第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同[并且可序列特异性地与M1的反链上的M1.5的反向互补序列或P1.1的延伸产物P1.1-Ext(该处称为P1.1E1)结合]；
c)对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的所述序列区段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与M1的区段M1.2相同，且所述区段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3能够与所述引物P1.1-Ext的聚合产物结合]，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；
其中，C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
f)第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且与M1的M1.1(反向)互补[可以与P2.1-Ext互补地结合]；
g)第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且与M1的M1.5相同和/或基本相同[可以与P1.1-Ext互补地结合]；
所述试剂盒可选地还包含第二模板依赖性核酸聚合酶，尤其是DNA聚合酶，以及(可选地)所述模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子，尤其是嗜热模板依赖性聚合酶，尤其是有5’-3’核酸外切酶活性的嗜热模板依赖性聚合酶；以及/或者
包含第一探针寡核苷酸，该第一探针寡核苷酸：
a.包含一序列区段，该序列区段：
i.与位于序列区段M1.2、M1.3和M1.4上的M1的序列相同；或者
ii.与位于序列区段M1.3和M1.4上的M1的序列互补；
b.与一荧光染料结合，该荧光染料：
i.与所述第一探针寡核苷酸所连接的第二探针寡核苷酸形成供体-淬灭剂对或FRET对；或者
ii.形成供体-淬灭剂对或FRET对，其中荧光染料与第二探针寡核苷酸连接，该第二探针寡核苷酸能够足够接近所述第一探针寡核苷酸的结合位点进行结合。
21.如权利要求20所述的试剂盒，还包含第一模板依赖性核酸聚合酶，尤其是DNA聚合酶，以及(可选地)所述DNA聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子，尤其是嗜中温模板依赖性聚合酶，尤其是无5’-3’核酸外切酶活性的嗜中温模板依赖性聚合酶。
22.如权利要求20和21之一所述的试剂盒，其中所述修饰的核苷酸结构单元包括2’-O-烷基核糖核苷结构单元，尤其是2’-O-甲基核糖核苷结构单元。
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