CN112074521B - 作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(par4)抑制剂的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学药物技术领域，特别提供了一系列作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物及其医药用途。

Description

作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂 的化合物
技术领域
本发明属于化学药物技术领域，特别提供了一系列作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物及其医药用途。
背景技术
血栓栓塞性疾病仍是目前死亡的主要原因之一，尽管有可利用的抗凝血剂如华法林，肝素，和抗血小板剂如阿司匹林和氯吡格雷，替格瑞洛，利伐沙班等等。
血小板的主要生理功能是参与血栓与止血，任何凝血过程都涉及血小板的活化，这是一个复杂的信号级连过程，凝血酶在其中占有核心地位。凝血酶活化血小板主要通过一族G蛋白偶连的蛋白酶活化受体PARs(protease-activated receptors)介导。人类血小板表面表达PAR1与PAR4两种受体，凝血酶能连接并切割PAR1或PAR4，暴露新的N-末端，后者作为一个固定配基与受体进行分子内结合，从而激发跨膜信号传导，引起血小板聚集、释放以及膜糖蛋白的一系列改变。
PAR1抑制剂已得到广泛研究，包括vorapaxar(沃拉帕沙)和atopaxar(阿托帕沙)的数种化合物已进入后期临床试验。近来，在ACS患者的示踪III期试验中，vorapaxar没有显著减少心血管事件，而是显著增加严重出血的风险(Tricoci，P.等人，N.Eng.J.Med.，366(1)：20-33(2012)。因此，仍然需要发现新的具有增加功效和减少出血副作用的抗血小板药。
另外，有一些PAR4抑制剂专利申请公开，如CN104640869A和CN104583218A分别公开了下式I和II的一系列作为蛋白酶活化受体4(PAR4)抑制剂，用于抑制或防止血小板聚集的药物中的用途。
Figure GPA0000295864850000021
所述化合物的研究还处于临床研究阶段，据专利申请公开资料显示，其五元母核中应当含有氧原子才有相应的PAR4活性。
发明内容
为了寻找具有增加功效和减少出血副作用的抗血小板药，并且本发明提供了一系列作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物，本发明的化合物结构母核不同于已公开的PAR4抑制剂。
本发明首先提供了一系列的作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的母核如下：
Figure GPA0000295864850000031
其中，R0选自氢，卤素，C1-4烷基，C1-4的氨基，C1-4的烷氧基，C1-4的烷硫基；
X、Z选自CH或者N；
Y选自O或者CH；
R1选自氢，卤素、羟基、巯基、C1-4的烷氧基；
R2选自氢，卤素、羟基、巯基、C1-4的烷氧基、C1-4的氨基取代的C1-4烷氧基、C3-6的环烷基取代的C1-4烷氧基、羟基取代的C1-4烷氧基、C1-4的烷氧基-W-C1-4烷氧基、C3-6杂环-W-C1-4烷氧基，其中W为键、(CH2)n-O、羰基、(CH2)n-S、(CH2)n-吡啶或(CH2)n-噻唑，其中C3-6杂环可进一步被卤素、羟基所取代，噻唑或吡啶可进一步被C1-4烷基或羟基取代，n＝0、1、2或3。
作为本发明的一种优选方案，所述卤素选自氟、氯、溴、碘。
作为本发明的一种优选方案，所述C1-4的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
作为本发明的一种优选方案，所述C1-4的氨基选自甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙胺基、正丁氨基、异丁氨基、仲丁氨基和叔丁氨基、二甲氨基。
作为本发明的一种优选方案，所述C1-4的烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
作为本发明的一种优选方案，所述C1-4的烷硫基选自甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基。
作为本发明的一种优选方案，C3-6的环烷基选自环丙烷、环戊烷、环己烷。
作为本发明的一种优选方案，C3-6杂环选自
Figure GPA0000295864850000032
作为本发明的一种优选方案，所述化合物通式结构如下式(II-1，II-2)所示：
Figure GPA0000295864850000033
其中，R0、R1、X如上定义；
m等于0，1，2，3或4；
当A选自氧原子，B选自H、C1-4烷基、或者烷氧基取代的C1-4的烷基；
当A选自羰基，B选自羟基、氨基或者C1-4烷氧基；
当A选自亚甲基，B选自羟基、C3-6的环烷基、含氮和/或氧C3-6的杂环、C1-4烷基取代或者非取代氨基。
当A选自C1-4烷基取代或非取代的噻唑环、取代或非取代的苯环、取代或非取代的吡啶环，B选自
Figure GPA0000295864850000034
其中R3、R4选自氢、甲基、羟基，所述
Figure GPA0000295864850000035
为连接键。
作为本发明的一种优选方案，其特征在于，
X、Y、Z如上定义；
R0选自氢、甲氧基；
R1选自氢、甲氧基；
R2选自羟基、甲氧基、
Figure GPA0000295864850000041
甲氧乙氧基、
Figure GPA0000295864850000042
羟乙氧基、
Figure GPA0000295864850000043
甲氧丙氧基、
Figure GPA0000295864850000044
二甲氧基、
Figure GPA0000295864850000045
作为本发明的一种优选方案，所述药学上可接受的盐是化合物与无机酸或有机酸成盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、氢碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟萘酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁酸、酒石酸和对甲苯磺酸。
本发明优选自以下化合物：
Figure GPA0000295864850000046
Figure GPA0000295864850000051
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体和前述的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的在于提供一种药物用途，包括前述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于制备治疗血栓相关疾病的药物用途。
优选的所述血栓相关疾病选自动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、脑血管血栓栓塞性病症、和心脏腔室或外周循环中的血栓栓塞性病症。
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.，″Pharmaceutical Salts″，Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、氢碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟萘酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、三氟乙酸、单宁酸、酒石酸和对甲苯磺酸。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体，以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂载体或介质，代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington：The Science and Practice ofPharmacy，21st Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
通式制备路线：
Figure GPA0000295864850000071
通式合成步骤A：合成5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000072
将2，4，6-三羟基苯甲酸溶于丙酮中。将反应液冷却到0摄氏度，然后，向上述溶液中依次缓慢滴加三氟乙酸和三氟乙酸酐。将反应液加热至65摄氏度，并搅拌16小时。
将反应液冷却到室温，并在减压下浓缩。所得残余物溶于乙酸乙酯与水的混合溶液中。向混合液中加入饱和碳酸氢钠调节PH值约为8。混合液用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，有机相先用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/5)。得到白色固体5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮。
通式合成步骤B：合成5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000073
在冰水浴和氮气保护下，将5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮溶于四氢呋喃中。随后，向上述溶液中依次加入甲醇和偶氮二甲酸二异丙酯。将反应液升至室温，并搅拌3小时。
向反应液中加入水淬灭反应。混合液用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，有机相先用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到白色固体5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮。
通式合成步骤C：合成5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000081
将5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮溶于N，N-二甲基甲酰胺中。随后，向上述溶液中依次加入无水碳酸钾和溴化苄，在室温下搅拌16小时。
向反应液中加入水淬灭反应。混合液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相先用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/5)。得到白色固体5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮。
通式合成步骤D：合成2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛
Figure GPA0000295864850000082
在氮气保护下，将5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮溶于二氯甲烷中。在-78摄氏度下，向上述溶液中缓慢滴加二异丁基氢化铝。在-78摄氏度下搅拌3小时。在-78摄氏度，向反应液中缓慢滴加甲醇淬灭反应，然后向反应液中滴加稀盐酸溶液。将反应液升至室温。混合液用二氯甲烷萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/7)，得到棕色固体2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛。
通式合成步骤E：合成2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯
Figure GPA0000295864850000083
将2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛，2-溴乙酸乙酯和无水碳酸钾溶于乙腈。将反应液加热至70摄氏度，并搅拌3小时。
将反应液冷却到室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。滤液在减压下浓缩。得到黄色油状物2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯。无需纯化，直接用于下步反应。
通式合成步骤F：合成2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸
Figure GPA0000295864850000084
将2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯溶于四氢呋喃与水的混合溶液中。随后，向上述溶液中加入氢氧化钠。在室温下搅拌30分钟。
将反应液在减压下浓缩。所得残余物溶于水中，向上述溶液中缓慢滴加稀盐酸调节PH值约为2，有白色固体析出。过滤，收集滤饼，滤饼烘干得到白色固体2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸。无需纯化，直接用于下步反应。
通式合成步骤G：合成4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃
Figure GPA0000295864850000085
将2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸溶于乙酸酐中。随后，向上述溶液中加入醋酸钠。将反应液加热至140摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯，滤液在减压下浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/20)。得到黄色固体4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃。
通式合成步骤H：合成2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷
Figure GPA0000295864850000091
在氮气保护下，将4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃和4，4，4’，4’，5，5，5’，5’-八甲基-2，2’-二(1，3，2-二氧杂硼烷)溶于正己烷中。随后，向上述溶液中加入[Ir(COD)(OMe)]2，dtbpy。将反应液加热至60摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温，向反应液中加入水淬灭反应。混合液用乙酸乙酯萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。将所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到黄色油状物2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷。
通式合成步骤I：合成2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000092
在氮气保护下，将2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑和2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷溶于1，4-二氧六环中。随后向上述溶液中加入无水碳酸钾，四三苯基膦钯和水。将反应液加热至80摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温。混合液用乙酸乙酯萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。将所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到白色固体2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑。
通式合成步骤J：合成6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000093
在氮气保护下，2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑和五甲基苯溶于二氯甲烷中。在-78摄氏度下向上述溶液中缓慢滴加三氯化硼。在-78摄氏度下搅拌1小时。向反应体系中加入甲醇淬灭反应。将反应液升至室温，并减压浓缩。粗产品用反相柱纯化[反相柱：C18；流动相A：水(含有0.05％甲酸)，流动相B：乙腈；梯度：30％乙腈到90％乙腈在8分钟内；检测波长：254nm]收集馏分，直接低温冻干。得到黄色固体6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇。
通式合成步骤K：
Figure GPA0000295864850000101
在室温和氮气保护下，将6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇，R6-醇溶于四氢呋喃(1毫升)中。随后，向上述溶液中依次加入三丁基膦和偶氮二甲酰二哌啶。在室温下搅拌1小时。
向反应液中加入水淬灭反应。混合液用乙酸乙酯萃取。合并有机相。有机相先用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的TFA)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从5％升到100％；检测波长：254nm。纯化后，低温冻干得到目标化合物。
通式合成步骤L：
Figure GPA0000295864850000102
将6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入
Figure GPA0000295864850000103
(R＝Cl，或Br)和无水碳酸钾。在室温下搅拌4小时。LCMS监测显示原料消失后，过滤除去不溶物。滤液用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X selectC18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的甲酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从50％升到60％；检测波长：254nm。减压冻干，得到mm目标化合物。
实施例1：合成2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000104
步骤A：合成2，5-二溴噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000105
将噻唑并[5，4-d]噻唑(500毫克，3.5毫摩尔)溶于四氯化碳(14.0毫升)中。随后，向上述溶液中加入吡啶(556毫克，7.0毫摩尔)和溴素(5.56克，34.7毫摩尔)。将反应液加热至80摄氏度，并搅拌5小时。
将反应液冷却到室温。将反应液倒入饱和的亚硫酸氢钠溶液(80毫升)中淬灭反应。混合液用二氯甲烷(100毫升×3次)萃取，合并有机相。有机相先用饱和食盐水(50毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)。得到320毫克浅灰色固体2，5-二溴噻唑并[5，4-d]噻唑(收率：30.5％)。MS(ESI)M/Z：301[M+H+]。
步骤B：合成2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000106
将2，5-二溴噻唑并[5，4-d]噻唑(150毫克，0.5毫摩尔)溶于二氯甲烷(4.0毫升)与甲醇(2.0毫升)的混合溶液中。随后，向上述溶液中加入叔丁醇钾(62毫克，0.6毫摩尔)。在室温下搅拌4小时。向反应液中加水淬灭，混合液用二氯甲烷(30毫升×3次)萃取。合并有机相。有机相先用饱和食盐水(30毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。得到110毫克浅棕色固体2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑。无需纯化，直接用于下一步反应。MS(ESI)M/Z：251，253[M+H]+。
步骤C：合成2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000111
在氮气保护下，将2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(110毫克，0.4毫摩尔)溶于1，4-二氧六环(10.0毫升)。随后，向上述溶液中加入无水碳酸钠(140毫克，1.3毫摩尔)，(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)硼酸酯(201毫克，0.66毫摩尔)和四(三苯基磷)钯(51毫克，0.044毫摩尔)，水(2.0毫升)。将反应液加热至90摄氏度，并搅拌2小时。
将反应液冷却到室温，并减压浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的三氟乙酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从5％升到100％；检测波长：254nm。纯化后，低温冻干得25.0毫克浅黄色固体2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑(收率：17.9％)。MS(ESI)M/Z：349[M+H+]；1HNMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.34(s，1H)，6.71(s，1H)，6.36(s，1H)，4.22(s，3H)，3.94(s，3H)，3.89(s，3H)。
实施例2：合成2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000112
步骤A：合成2-溴噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000113
将噻唑并[5，4-d]噻唑(200毫克，1.41毫摩尔)溶于四氯化碳(10毫升)中。向体系中依次加入吡啶(175毫克，2.22毫摩尔)和溴素(334毫克，2.09毫摩尔)。在80摄氏度下搅拌2小时后，再向体系中依次加入吡啶(55毫克，0.70毫摩尔)和溴素(333毫克，2.08毫摩尔)。在80摄氏度下继续搅拌2小时。TLC监测显示原料消失后，将体系冷却到室温。将混合液倒入饱和亚硫酸氢钠水溶液(100毫升)淬灭反应。混合液用二氯甲烷(100毫升X2)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(100毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚25％)浓缩得浅黄色固体2-溴噻唑并[5，4-d]噻唑(90毫克，28.8％)。MS(ESI)M/Z：221[M+H]+
步骤B：合成2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000114
在室温和氮气保护下，将2-溴噻唑并[5，4-d]噻唑(90毫克，0.407毫摩尔)溶于1，4-二氧六环(6毫升)中。向体系中依次加入无水碳酸钠(130毫克，1.23毫摩尔)，(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)硼酸酯(187毫克，0.615毫摩尔)，四(三苯基磷)钯(47毫克，0.041毫摩尔)和水(1毫升)。在90摄氏度下搅拌2小时。TLC监测显示原料消失后，将体系冷却到室温。向体系中加入水(10毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(20毫升X2)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(10毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。制备条件如下。色谱柱：Xselect C18 19mm*150mm；流动相：水(0.05％甲酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从10％升到80％；检测波长：254nm。纯化后，低温冻干得浅黄色固体2-(4，6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(53.3毫克，41.0％)。MS(ESI)M/Z：319[M+H]+；1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ8.87(s，1H)，7.48(s，1H)，6.73(s，1H)，6.37(s，1H)，3.96(s，3H)，3.90(s，3H)。
实施例3：合成6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000121
步骤A：合成5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000122
详见通用合成步骤A。2，4，6-三羟基苯甲酸(100.0克，588.2毫摩尔)，丙酮(1.0升)，三氟乙酸(400毫升)，三氟乙酸酐(250毫升)，乙酸乙酯(1.0升)与水(1.5升)，乙酸乙酯(1.0升×3次)，饱和食盐水(1.0升×3次)。得到59.50克白色固体5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(收率：48.1％)。MS(ESI)M/Z：211[M+H+]。
步骤B：合成5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000123
详见通用合成步骤B。5，7-二羟基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(59.50克，283毫摩尔)，四氢呋喃(952毫升)，甲醇(9.70克，303毫摩尔)和偶氮二甲酸二异丙酯(61.24克，303毫摩尔)，水(100毫升)，乙酸乙酯(1.0升×3次)，饱和食盐水(1.0升×3次)。得到60.05克白色固体5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(收率：94.7％)。MS(ESI)M/Z：225[M+H+]。
步骤C：合成5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮
Figure GPA0000295864850000124
详见通用合成步骤C。5-羟基-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(60.05克，268毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(780毫升)，无水碳酸钾(38.91，281毫摩尔)，溴化苄(48.05克，281毫摩尔)，水(200毫升)，乙酸乙酯(500毫升×3次)，饱和食盐水(100毫升×3次)。得到66.07克白色固体5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(收率：78.5％)。MS(ESI)M/Z：315[M+H+]。
步骤D：合成2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛
Figure GPA0000295864850000131
详见通用合成步骤D。5-(苄氧基)-7-甲氧基-2，2-二甲基-4H-苯并[d][1，3]二氧杂环己烯-4-酮(35.00克，111毫摩尔)，二氯甲烷(525毫升)，二异丁基氢化铝(222毫升，333毫摩尔，1.5摩尔/升)，甲醇(30毫升)，稀盐酸溶液(35毫升，6.0摩尔/升)，二氯甲烷(500毫升×3次)，饱和食盐水(500毫升×3次)。得到17.14克棕色固体2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛(收率：59.9％)。MS(ESI)M/Z：259[M+H+]。
步骤E：合成2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯
Figure GPA0000295864850000132
详见通用合成步骤E。2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛(17.14克，66.43毫摩尔)，2-溴乙酸乙酯(13.30克，79.63毫摩尔)，无水碳酸钾(27.47克，199毫摩尔)，乙腈(514毫升)，乙酸乙酯(50毫升×3次)。得到19.02毫克黄色油状物2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯。无需纯化，直接用于下步反应。MS(ESI)M/Z：345[M+H+]。
步骤F：合成2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸
Figure GPA0000295864850000133
将2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯(19.02克，55.2毫摩尔)溶于四氢呋喃(95毫升)与水(38毫升)的混合溶液中。随后，向上述溶液中加入氢氧化钠(8.84克，221毫摩尔)。在室温下搅拌30分钟。
将反应液在减压下浓缩。所得残余物溶于水(50毫升)中，向上述溶液中缓慢滴加稀盐酸(1.0摩尔/升)调节PH值约为2，有白色固体析出。过滤，收集滤饼，滤饼烘干得到14.52克白色固体2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸。无需纯化，直接用于下步反应。MS(ESI)M/Z：317[M+H+]。
步骤G：合成4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃
Figure GPA0000295864850000134
将2-(3-(苄氧基)-2-甲酰基-5-甲氧基苯氧基)乙酸(14.52克，45.95毫摩尔)溶于乙酸酐(145毫升)中。随后，向上述溶液中加入醋酸钠(38.8克，473毫摩尔)。将反应液加热至140摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯(50毫升×3次)，滤液在减压下浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/20)。得到9.50克黄色固体4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃(收率：81.4％)。MS(ESI)M/Z：255[M+H+]。
步骤H：合成2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷
Figure GPA0000295864850000141
在氮气保护下，将4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃(2.50克，9.84毫摩尔)和4，4，4’，4’，5，5，5’，5’-八甲基-2，2’-二(1，3，2-二氧杂硼烷)(2.75克，10.82毫摩尔)溶于正己烷(55.0毫升)中。随后，向上述溶液中加入[Ir(COD)(OMe)]2(100毫克，0.15毫摩尔)，dtbpy(79毫克，0.29毫摩尔)。将反应液加热至60摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温，向反应液中加入水(20毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(50毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(50毫升×3次)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。将所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到3.50克黄色油状物2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷(收率：93.6％)。MS(ESI)M/Z：381[M+H+]。
步骤I：合成2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000142
在氮气保护下，将2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(330毫克，1.31毫摩尔)和2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷(765毫克，2.01毫摩尔)溶于1，4-二氧六环(20毫升)中。随后向上述溶液中加入无水碳酸钾(361毫克，2.62毫摩尔)，四三苯基膦钯(132毫克，0.11毫摩尔)和水(2毫升)。将反应液加热至80摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温。混合液用乙酸乙酯(20毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(20毫升×3次)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。将所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到400毫克白色固体2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(收率：72.0％)。MS(ESI)M/Z：425[M+H+]。
步骤J：合成6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000143
在氮气保护下，2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(425毫克，1.0毫摩尔)和五甲基苯(1.04克，7.0毫摩尔)溶于二氯甲烷(80毫升)中。在-78摄氏度下向上述溶液中缓慢滴加三氯化硼(2.5毫升，2.5毫摩尔，1.0摩尔/升)。在-78摄氏度下搅拌1小时。向反应体系中加入甲醇(10毫升)淬灭反应。将反应液升至室温，并减压浓缩。粗产品用反相柱纯化[反相柱：C18；流动相A：水(含有0.05％甲酸)，流动相B：乙腈；梯度：30％乙腈到90％乙腈在8分钟内；检测波长：254nm]收集馏分，直接低温冻干。得到130毫克黄色固体6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(收率：38.9％)。MS(ESI)M/Z：335[M+H+]。1H NMR(300MHz，DMSO-d6，ppm)δ10.4(s，1H)，7.48(s，1H)，6.80(s，1H)，6.32(s，1H)，4.20(s，3H)，3.78(s，3H)。
实施例4：合成4-(6-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000151
步骤A：合成2-溴-6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶
Figure GPA0000295864850000152
将(6-溴吡啶-2-基)甲醇(1.88克，10.0毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(122毫克，1.00毫摩尔)和1H-咪唑(3.40克，50.0毫摩尔)溶于四氢呋喃(60.0毫升)中。随后，向上述溶液中缓慢滴加叔丁基二甲基氯硅烷(7.55克，50.0毫摩尔)的四氢呋喃溶液(10.0毫升)。在室温下搅拌6小时。
向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(50.0毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(50毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(50毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚)。得到2.98克无色油状物2-溴-6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶(2.98克，98.7％)。MS(ESI)M/Z：302，304[M+H+]。
步骤B：合成4-(6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000153
将2-溴-6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶(2.98克，9.87毫摩尔)和四氢吡喃-4-酮(1.18克，11.8毫摩尔)溶于四氢呋喃(50毫升)中。在-78摄氏度下，向上述溶液中缓慢滴加正丁基锂的四氢呋喃溶液(12.0毫升，12.0毫摩尔，1.0摩尔/升)。在-78摄氏度下搅拌1小时。
向反应液中加入氯化铵水溶液(20毫升)淬灭反应，混合液用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取，合并有机相。有机相先用饱和食盐水(50毫升×3次)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩至干。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚60％-90％)。得到1.20克黄色油状物4-(6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇(收率：37.7％)。MS(ESI)M/Z：324[M+H+]。
步骤C：合成4-(6-(羟基甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000154
将4-(6-((叔丁基二甲硅氧基)甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇(1.20克，3.72毫摩尔)溶于四氢呋喃(20.0毫升)中。随后，向上述溶液中滴加四丁基氟化铵(116克，4.44毫摩尔)的四氢呋喃溶液(5毫升)。在室温下搅拌1小时。
向反应液中加入饱和氯化铵水溶液(5毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(20毫升×3次)萃取，合并有机相。得到的有机相先用饱和食盐水(20毫升×3次)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。粗产品用反相柱纯化[反相柱：C18；流动相A：水(含有0.05％甲酸)，流动相B：乙腈；梯度：30％乙腈到90％乙腈在8分钟内；检测波长：254nm]，低温冻干得到600毫克无色油状物4-(6-(羟基甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇(收率：77.2％)。MS(ESI)M/Z：210[M+H+]。
步骤D：合成4-(6-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇
Figure GPA0000295864850000161
详见通用合成步骤K。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(22毫克，0-065毫摩尔)，4-(6-(羟基甲基)吡啶-2-基)-四氢-2H-吡喃-4-醇(26毫克，0.124毫摩尔)，四氢呋喃(1毫升)，三丁基膦(60毫克，0.297毫摩尔)，偶氮二甲酰二哌啶(75毫克，0.285毫摩尔)，水(1毫升)，偶氮二甲酰二哌啶(74毫克，0.293毫摩尔)，乙酸乙酯(5毫升×3次)，饱和食盐水(10毫升×3次)。得到2.3毫克4-(6-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(收率：6.7％)。MS(ESI)M/Z：526[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.89(t，J＝7.8Hz，1H)，7.61(t，J＝6.0Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.40(d，J＝8.1Hz，1H)，6.76(s，1H)，6.44(s，1H)，5.40(s，2H)，4.23(s，3H)，4.09-3.95(m，4H)，3.87(s，3H)，2.23-2.13(m，2H)，1.66(d，J＝13.2Hz，2H)。
实施例5：合成4，6-二甲氧基-2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]吡唑并[1，5-a]吡啶
Figure GPA0000295864850000162
步骤A：合成2-溴-3，5-二甲氧基吡啶
Figure GPA0000295864850000163
将3，5-二甲氧基吡啶(1.00克，7.2毫摩尔)溶于乙腈溶液(30.0毫升)中。随后，向上述溶液加入N-溴代琥珀酰亚胺(1.30克，7.2毫摩尔)。将反应液加热至80摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温，并减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到800毫克黄色固体2-溴-3，5-二甲氧基吡啶(收率：51.0％)。MS(ESI)M/Z：218，220[M+H+]。
步骤B：合成2-乙炔基-3，5-二甲氧基吡啶
Figure GPA0000295864850000164
在室温和氮气气氛下，将2-溴-3，5-二甲氧基吡啶(800毫克，3.7毫摩尔)溶于乙腈(14.0毫升)中。随后，向上述溶液依次加入三甲基硅基乙炔(362毫克，3.7毫摩尔)，二(三苯基膦)二氯化钯(53毫克，0.075毫摩尔)，碘化亚铜(14毫克，0.07毫摩尔)，三苯基膦(39毫克，0.15毫摩尔)和N，N-二异丙基乙胺((1.10克，8.59毫摩尔)。在室温下搅拌4小时。向反应液中加入无水碳酸钾(3.60克，26.0毫摩尔)和甲醇(20.0毫升)。在室温下继续搅拌1小时。
将反应液在减压下浓缩。所得残余物溶于二氯甲烷(50毫升)与水(50毫升)的混合溶液中。混合液用二氯甲烷(50毫升×3次)萃取，合并有机相。有机相先用饱和食盐水(50毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝2/8)。得到130毫克2-乙炔基-3，5-二甲氧基吡啶(收率：21.6％)。MS(ESI)M/Z：164[M+H+]。
步骤C：合成3，5-二甲氧基-2-(2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]乙炔基)吡啶
Figure GPA0000295864850000171
在室温和氮气保护下，将2-乙炔基-3，5-二甲氧基吡啶(130毫克，0.8毫摩尔)溶于乙腈(10.0毫升)中。随后，向上述溶液中加入2-溴-5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑(240毫克，0.96毫摩尔)，二(三苯基膦)二氯化钯(28毫克，0.04毫摩尔)，碘化亚铜(6毫克，0.03毫摩尔)，三苯基膦(21毫克，0.08毫摩尔)和N，N-二异丙基乙胺((237毫克，1.84毫摩尔)。在室温下搅拌4小时。
将反应液在减压下浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝2/8)。得到125毫克白色固体3，5-二甲氧基-2-(2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]乙炔基)吡啶(收率：47.0％)。MS(ESI)M/Z：334[M+H+]。
步骤D：合成4，6-二甲氧基-2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]吡唑并[1，5-a]吡啶
Figure GPA0000295864850000172
将3，5-二甲氧基-2-(2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]乙炔基)吡啶(100毫克，0.30毫摩尔)溶于二氯甲烷(10.0毫升)中。冰水浴下，向上述溶液中缓慢滴加2-[(氨基氧基)磺酰]-1，3，5-三甲基苯(71毫克，0.33毫摩尔)的二氯甲烷(80.0毫升)溶液。将反应液升至室温，并搅拌过夜。
将反应液在减压下浓缩。将所得残余物的N，N-二甲基甲酰胺溶液(20.0毫升)溶液缓慢滴加到无水碳酸钾(36毫克，0.26毫摩尔)的N，N-二甲基甲酰胺(1.4升)溶液中。在室温下搅拌过夜。
将反应液在减压下浓缩除去N，N-二甲基甲酰胺。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)。得到5.3毫克白色固体4，6-二甲氧基-2-[5-甲氧基-[1，3]噻唑并[5，4-d][1，3]噻唑-2-基]吡唑并[1，5-a]吡啶(收率：8.35％)。MS(ESI)M/Z：334[M+H+]。1H-NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.78(s，1H)，7.12(s，1H)，6.27(d，J＝1.8Hz，1H)，4.22(s，3H)，3.98(s，3H)，3.86(s，3H)。
实施例6：合成4-(4-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)-5-甲基噻唑-2-基)吗啉
Figure GPA0000295864850000173
步骤A：合成4-(4-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)-5-甲基噻唑-2-基)吗啉
Figure GPA0000295864850000181
详见通用合成步骤K。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(18毫克，0.054毫摩尔)，(5-甲基-2-吗啉代-4-基)甲醇(16毫克，0.07毫摩尔)，三丁基膦(200毫克，1.0毫摩尔)，偶氮二甲酰二哌啶(50毫克，0.19毫摩尔)，四氢呋喃(1.0毫升)。得到4.6毫克白色固体4-(4-(((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)-5-甲基噻唑-2-基)吗啉(收率：16.1％)。MS(ESI)M/Z：531[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.63(s，1H)，6.74(s，1H)，6.62(s，1H)，5.30(s，2H)，4.22(s，3H)，3.89-3.87(m，7H)，3.71(s，4H)，2.40(s，3H)。
实施例7：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-甲氧基乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000182
步骤A：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-甲氧基乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000183
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(55毫克，0.17毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(6.0毫升)，2-溴乙基甲醚(46毫克，0.33毫摩尔)，无水碳酸钾(46毫克，0.33毫摩尔)。得到32.0毫克黄色固体2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-甲氧基乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(收率：48.0％)。MS(ESI)M/Z：393[M+H+]。1HNMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.63(s，1H)，6.69(s，1H)，6.37(s，1H)，4.26(t，J＝4.8Hz，2H)，4.22(s，3H)，3.88(s，3H)，3.85(t，J＝4.8Hz，2H)，3.51(s，3H)。
实施例8：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-((5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000184
步骤A：合成5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-羧酸乙酯
Figure GPA0000295864850000185
将2-溴-5-甲基噻唑-4-羧酸乙酯(1.00克，4.00毫摩尔)，1-甲基哌嗪(2.01克，20.1毫摩尔)和三乙胺(2.03克，20.1毫摩尔)加入1，4-二氧六环(25.0毫升)中。将反应液加热至120摄氏度，并搅拌24小时。
将反应液冷却至室温。向反应液中加入水(25.0毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(25毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(25毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝3/2)。得到1.06克黄色固体5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-羧酸乙酯(收率：98.1％)。MS(ESI)M/Z：270[M+H+]。
步骤B：合成(5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲醇
Figure GPA0000295864850000191
冰水浴下，将5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-羧酸乙酯(1.06克，3.94毫摩尔)溶于四氢呋喃溶液(10.0毫升)中。随后，向上述溶液中分批次加入四氢锂铝(448毫克，11.8毫摩尔)。在常温下搅拌1小时。
向反应液中缓慢加入饱和氯化铵溶液(5.0毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(10毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(5毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。粗产品用反相柱纯化[反相柱：C18；流动相A：水(含有0.05％的甲酸)，流动相B：乙腈；梯度：30％乙腈到90％乙腈在8分钟内；检测波长：254nm]浓缩得650毫克黄色油状物(5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲醇(收率：72.7％)。MS(ESI)M/Z：228[M+H+]。
步骤C：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-((5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000192
详见通用合成步骤K。在室温和氮气保护下，向四氢呋喃溶液(8.0毫升)中依次加入偶氮二甲酰二哌啶(363毫克，1.44毫摩尔)和三丁基膦(454毫克，2.25毫摩尔)。在室温下搅拌20分钟。随后，向上述溶液中缓慢滴加6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(50毫克，0.15毫摩尔)和(5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲醇(68毫克，0.30毫摩尔)的四氢呋喃溶液(2.0毫升)。在室温下搅拌3小时。
将反应液在减压下浓缩。残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝3/97)。收集产品用N，N-二甲基甲酰胺(4.0毫升)溶至澄清。粗产品用高效液相制备，制备条件：色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的碳酸氢铵)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在25分钟内，乙腈从25％升到50％；检测波长：254nm。减压冻干，得到12.8毫克2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-((5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(收率：15.7％)MS(ESI)M/Z：544[M+H+]。1H NMR(300MHz，DMSO-d6，ppm)δ7.42(s，1H)，6.96(s，1H)，6.68(s，1H)，5.04(s，2H)，4.19(s，3H)，3.84(s，3H)，3.35-3.34(m，2H)，3.33-3.32(m，2H)，2.41(t，J＝5.1Hz，4H)，2.33(s，3H)，2.22(s，3H)。
实施例9：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙酸甲酯
Figure GPA0000295864850000201
步骤A：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙酸甲酯
Figure GPA0000295864850000202
详见通用合成步骤L。将6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(35毫克，0.105毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10.0毫升)中，加入溴代乙酸甲酯(32毫克，0.207毫摩尔)和无水碳酸钾(28毫克，0.203毫摩尔)。将反应液加热至40摄氏度，并搅拌3小时。LCMS监测显示原料消失后，过滤除去不溶物。滤液用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的甲酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从50％升到60％；检测波长：254nm。减压冻干，得到18.2毫克黄色固体2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙酸甲酯(收率：42.7％)。MS(ESI)M/Z：407[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.41(s，1H)，6.76(s，1H)，6.26(s，1H)，4.77(s，2H)，4.22(s，3H)，3.87(s，3H)，3.85(s，3H)。
实施例10：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙-1-醇
Figure GPA0000295864850000203
步骤A：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000204
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(30毫克，0.09毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(2.0毫升)2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(38毫克，0.18毫摩尔)和无水碳酸钾(25毫克，0.18毫摩尔)。得到25毫克黄色固体2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑。无需纯化，直接用于下步反应。MS(ESI)M/Z：463[M+H+]。
步骤B：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙-1-醇
Figure GPA0000295864850000211
将2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(25毫克，0.054毫摩尔)溶于四氢呋喃溶液(2.0毫升)中。随后，向上述溶液中加入稀盐酸溶液(0.5毫升，1.0摩尔/升)。在室温下搅拌1小时。
向混合液中加入饱和碳酸氢钠溶液调节PH值约为8。混合液用乙酸乙酯(10毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(10毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X selectC18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的TFA)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从5％升到100％；检测波长：254nm。纯化后，低温冻干得6.0毫克黄色固体2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)乙-1-醇(收率：29.4％)。MS(ESI)M/Z：379[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.48(s，1H)，6.75(s，1H)，6.39(s，1H)，4.47-4.32(m，5H)，4.08(s，2H)，3.89(s，3H)。
实施例11：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑甲酸盐
Figure GPA0000295864850000212
步骤A：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑甲酸盐
Figure GPA0000295864850000213
详见通用合成步骤L。将6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(20毫克，0.060毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(8.0毫升)中。向体系中加入碳酸钾(17毫克，0.120毫摩尔)和1-(2-氯乙基)吡咯烷(20毫克，0.120毫摩尔)。在60摄氏度下搅拌1小时。TLC监测显示原料消失后，将体系冷却到室温。向体系中加入水(10毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(20毫升X2)萃取，合并后的有机相先用饱和盐水(20毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：Xselect C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的甲酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从50％升到60％；检测波长：254nm。纯化后，低温冻干得到黄色固体2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(9毫克，31.3％)。MS(ESI)M/Z：432[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.30(s，1H)，6.75(s，1H)，6.38(s，1H)，4.53(t，J＝4.8Hz，2H)，4.23(s，3H)，3.88(s，3H)，3.45(t，J＝4.8Hz，2H)，3.35-3.25(m，4H)，2.14-2.07(m，4H)。
实施例12：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(3-甲氧基丙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000221
步骤A：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(3-甲氧基丙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000222
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(20毫克，0.060毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(8毫升)，碳酸钾(16毫克，0.120毫摩尔)和1-溴-3-甲氧基丙烷(18.4毫克，0.120毫摩尔)。得到黄色固体2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(3-甲氧基丙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(13.2毫克，54.2％)。MS(ESI)M/Z：407[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.37(s，1H)，6.71(s，1H)，6.38(s，1H)，4.28(s，3H)，4.17(t，J＝6.3Hz，2H)，3.88(s，3H)，3.60(t，J＝6.3Hz，2H)，3.37(s，3H)，2.16-2.09(m，2H)。
实施例13：合成4-(4-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-基氧基)甲基)-5-甲基噻吡啶-2-基)吗啉
Figure GPA0000295864850000223
步骤A：合成3-(苄氧基)-5-甲氧基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶
Figure GPA0000295864850000224
在室温和氮气保护下，将3-(苄氧基)-2-碘-5-甲氧基吡啶(1.20克，3.52毫摩尔)溶于三乙胺(25毫升)中。向体系中依次加入三甲基乙炔基硅(520毫克，5.30毫摩尔)、碘化亚铜(130毫克，0.684毫摩尔)，双三苯基膦二氯化钯(250毫克，0.350毫摩尔)。在室温下搅拌过夜。LCMS监测显示原料消失后，混合液在真空下浓缩。将所得残余物溶于乙酸乙酯/水(20毫升/20毫升)中。混合液用乙酸乙酯(50毫升X2)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(50毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚10％)浓缩得黄色固体3-(苄氧基)-5-甲氧基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶(970毫克，89％)。MS(ESI)M/Z：312[M+H+]。
步骤B：合成3-(苄氧基)-2-乙炔基-5-甲氧基吡啶
Figure GPA0000295864850000225
将3-(苄氧基)-5-甲氧基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶(970毫克，3.12毫摩尔)溶于甲醇(20毫升)中。向体系中加入碳酸钾(130克，9.42毫摩尔)。在室温下搅拌1小时。LCMS监测显示原料消失后。向体系中加入水(20毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(30毫升X3)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(30毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品经柱层析法分离纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚30％)浓缩得白色固体3-(苄氧基)-2-乙炔基-5-甲氧基吡啶(650毫克，86.8％)，无需纯化直接用于下一步。MS(ESI)M/Z：240[M+H]+.
步骤C：合成2-((3-(苄氧基)-5-甲氧基吡啶-2-基)乙炔基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000231
在室温和氮气保护下，将3-(苄氧基)-2-乙炔基-5-甲氧基吡啶(453毫克，1.89毫摩尔)溶于甲苯/二异丙基胺(25毫升/25毫升)中。向体系中依次加入3-(苄氧基)-2-乙炔基-5-甲氧基吡啶(683毫克，2.72毫摩尔)，碘化亚铜(2毫克，0.01毫摩尔)和四三苯基膦钯(46毫克，0.04毫摩尔)。在室温下搅拌过夜。LCMS监测显示原料消失后，向体系中加入水(20毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(50毫升X2)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(20毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚20％)浓缩得黄色固体2-((3-(苄氧基)-5-甲氧基吡啶-2-基)乙炔基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(510毫克，65.8％)。MS(ESI)M/Z：410[M+H+]。
步骤D：合成2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基[1，5-a]吡啶-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000232
将2-((3-(苄氧基)-5-甲氧基吡啶-2-基)乙炔基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(510毫克，1.24毫摩尔)溶于二氯甲烷(25毫升)中。在室温下向体系中缓慢滴加2，4，6-三甲基苯磺酰羟胺(752毫克，3.72毫摩尔)的二氯甲烷(5毫升)溶液。在室温下搅拌4小时。LCMS监测显示原料消失后，将体系在真空下浓缩得到黄色油状物。将所得到的油状物溶于N，N-二甲基甲酰胺(20毫升)缓慢滴加到碳酸钾(517毫克，3.72毫摩尔)的N，N-二甲基甲酰胺(500毫升)溶液中。在室温下搅拌1小时。LCMS监测显示原料消失后，真空浓缩。粗产品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚25％)浓缩得棕黄色固体2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基[1，5-a]吡啶-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(340毫克，65％)。MS(ESI)M/Z：425[M+H+]。
步骤E：合成6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-醇
Figure GPA0000295864850000233
在室温和氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基[1，5-a]吡啶-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(100毫克，0.24毫摩尔)和五甲基苯(244毫克，1.65毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中。在-78摄氏度下向体系中加入三氯化硼的二氯甲烷溶液(0.60毫升，0.61毫摩尔，1.0摩尔/升)，在-78摄氏度下搅拌1小时。LCMS监测显示原料消失后，向体系中加入甲醇(10毫升)淬灭反应。将体系缓慢升至室温并真空浓缩。粗产品用反相柱纯化[反相柱：C18；流动相A：水(含有0.05％甲酸)，流动相B：乙腈；梯度：30％乙腈到90％乙腈在8分钟内；检测波长：254nm]浓缩得棕黄色固体6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-醇(60毫克，74.6％)。MS(ESI)M/Z：335[M+H+]。
步骤F：合成4-(4-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-基氧基)甲基)-5-甲基噻吡啶-2-基)吗啉
Figure GPA0000295864850000241
在室温和氮气保护下，将三苯基膦(19毫克，0.072毫摩尔)溶于四氢呋喃(0.5毫升)中。在0摄氏度下向体系中逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(9毫克，0.043毫摩尔)。在0摄氏度下搅拌5分钟。向体系中加入6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-醇(12毫克，0.036毫摩尔)和(5-甲基-2-吗啉代-4-基)甲醇(8毫克，0.036毫摩尔)的四氢呋喃(2毫升)溶液。在室温下搅拌1小时。LCMS监测显示原料消失后。向体系中加入水(5毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(5毫升X2)萃取。合并后的有机相先用饱和盐水(10毫升)反洗，然后用无水硫酸钠干燥，最后真空浓缩。粗产品用制备型高效液相色谱纯化。分离条件如下，色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的甲酸)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在7分钟内，乙腈从5％升到100％；检测波长：254nm。减压冻干白色固体4-(4-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)吡唑并[1，5-a]吡啶-4-基氧基)甲基)-5-甲基噻吡啶-2-基)吗啉(3.1毫克，16.3％)。MS(ESI)M/Z：531[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.78(s，1H)，7.14(s，1H)，6.51(s，1H)，5.08(s，2H)，4.21(s，3H)，3.96-3.82(m，7H)，3.43-3.57(t，J＝9.6Hz，4H)，2.39(s，3H)。
实施例14：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000242
步骤A：合成2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000243
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(20毫克，0.060毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(8毫升)1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(22毫克，0.120毫摩尔)和碳酸钾(16毫克，0.120毫摩尔)。得到白色固体2-甲氧基-5-(6-甲氧基-4-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)苯并呋喃-2-基)噻唑并[5，4-d]噻唑(11.2毫克，42.9％)。MS(ESI)M/Z：437[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.38(s，1H)，6.72(s，1H)，6.36(s，1H)，4.28(t，J＝4.8Hz，2H)，4.22(s，3H)，3.96(t，J＝4.8Hz，2H)，3.88(s，3H)，3.81-3.78(m，2H)，3.64-3.60(m，2H)，3.43(s，3H)。
实施例15：合成2-(6，8-二甲氧基中氮茚-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000251
步骤A：合成1-(4-溴-1H-吡咯-2-基)乙酮
Figure GPA0000295864850000252
将1-(1H-吡咯-2-基)乙酮(200.0克，1.83摩尔)溶于二甲基亚砜(1.0升)中。随后，向上述溶液中缓慢滴加氢溴酸水溶液(1.0升，48％wt)。将反应液加热至50摄氏度，并搅拌3小时。
将反应液冷却到室温。向反应液中滴加氢氧化钠水溶液(4.0摩尔/升)调节PH值约为7-8。混合液用乙酸乙酯(500毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(500毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。得到300.0克棕色固体1-(4-溴-1H-吡咯-2-基)乙酮(收率：87.2％)。MS(ESI)M/Z：188，190[M+H+]。
步骤B：合成乙基2-(2-乙酰基-4-溴-1H-吡咯-1-基)乙酸乙酯
Figure GPA0000295864850000253
将1-(4-溴-1H-吡咯-2-基)乙酮(100.0克，532毫摩尔)溶于乙腈(2.0升)中。随后，向上述溶液中依次加入2-溴乙酸乙酯(178.7克，1.07摩尔)和无水碳酸钾(147.7克，1.07摩尔)。将反应液加热至40摄氏度，并搅拌24小时。
将反应液冷却到室温，然后，减压除去乙腈。残余物加入水稀释。混合液用乙酸乙酯(500毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(500毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)。得到105克类白色固体乙基2-(2-乙酰基-4-溴-1H-吡咯-1-基)乙酸乙酯(收率：72.1％)。MS(ESI)M/Z：274，276[M+H+]。
步骤C：合成2-溴吲哚嗪-6，8-二醇
Figure GPA0000295864850000254
在冰水浴下，于250毫升高压反应釜中，将乙基2-(2-乙酰基-4-溴-1H-吡咯-1-基)乙酸乙酯(20.0克，73.0毫摩尔)溶于干燥的四氢呋喃(200.0毫升)中。随后，向上述溶液中分批次加入氢化钠(17.48克，60％wt，437毫摩尔)。加料完成后，将反应釜置于90摄氏度油浴中搅拌过夜。
将反应液冷却到室温，向反应液中缓慢滴加水(500毫升)淬灭反应。混合液用乙酸乙酯(200毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水(100毫升×2次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。得到17.6克黄色固体2-溴吲哚嗪-6，8-二醇。无需纯化，直接用于下步反应。MS(ESI)M/Z：228，230[M+H+]。
步骤D：2-溴-6，8-二甲基中氮茚
Figure GPA0000295864850000261
将2-溴吲哚嗪-6，8-二醇(1.00克，4.39毫摩尔)溶于无水甲醇(50.0毫升)。随后，向上述溶液中加入浓硫酸(0.5毫升)。将反应液加热至60摄氏度，并搅拌1小时。
将反应液冷却到室温。向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液调节PH值约为7。混合液用乙酸乙酯(100毫升×3次)萃取。合并有机相，有机相先用饱和食盐水100毫升×3次)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩。残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/3)。得到350毫克黄色固体2-溴-6，8-二甲基中氮茚(收率：31.3％)。MS(ESI)M/Z：256，258[M+H+]。
步骤E：6，8-二甲氧基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)中氮茚
Figure GPA0000295864850000262
在氮气保护下，将6，8-二甲氧基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)中氮茚(300毫克，1.17毫摩尔)溶于1，4-二氧六环(30.0毫升)。随后，向上述溶液中加入氯(2-二环己基膦基-2′，4′，6′-三异丙基-1，1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1，1′-联苯)]钯(II)(69毫克，0.088毫摩尔)，2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯(84毫克，0.176毫摩尔)，双联频哪醇硼酸酯(1.34克，5.27毫摩尔)。将反应液加热至60摄氏度，并搅拌3小时。
将反应液冷却到室温，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/3)。得到70毫克黄色固体6，8-二甲氧基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)中氮茚(收率：19.7％)。MS(ESI)M/Z：304[M+H+]。
步骤F：2-(6，8-二甲氧基中氮茚-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000263
在室温和氮气保护下，将6，8-二甲氧基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)中氮茚(70毫克，0.231毫摩尔)和2-溴-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(63毫克，0.251毫摩尔)溶于1，4-二氧六环(5.0毫升)中。向上述溶液中依次加入无水碳酸钾(63毫克，0.457毫摩尔)，四三苯基膦钯(26.8毫克，0.023毫摩尔)和水(1.0毫升)。在80摄氏度下搅拌1.5小时。
将反应体系冷却到室温，在减压下浓缩。残留物用N，N-二甲基甲酰胺(3.0毫升)溶至澄清，经制备型高效液相色谱纯化。纯化条件如下，色谱柱：X select C18 19mm*150mm；流动相：水(含有0.05％的碳酸氢铵)和乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在8分钟内，乙腈从22％升到48％；检测波长：254nm。收集产品，减压冻干。得到最终产物14.7毫克棕色固体2-(6，8-二甲氧基中氮茚-2-基)-5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑(收率：18.3％)。MS(ESI)M/Z：348[M+H+]。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)：δ7.74(s，1H)，7.15(s，1H)，6.88(s，1H)，5.91(s，1H)，4.19(s，3H)，3.94(s，3H)，3.81(s，3H)。
实施例16：合成2-(4-异丙氧基-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000271
步骤A：合成2-(4-异丙氧基-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000272
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(55毫克，0.16毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(6.0毫升)，2-溴丙烷(41毫克，0.33毫摩尔)和无水碳酸钾(46毫克，0.33毫摩尔)。得到6.6毫克淡黄色固体2-(4-异丙氧基-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(收率：11.0％)。MS(ESI)M/Z：377[M+H]+；1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.35(s，1H)，6.70(s，1H)，6.37(s，1H)，4.72-4.63(m，1H)，4.26(s，3H)，3.99(s，3H)，1.44(t，J＝6.0Hz，6H)。
实施例17：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)-N，N-二甲基乙-1-胺
Figure GPA0000295864850000273
步骤A：合成2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)-N，N-二甲基乙-1-胺
Figure GPA0000295864850000274
详见通用合成步骤K。四氢呋喃(1.0毫升)，偶氮二甲酰二哌啶(181毫克，0.72毫摩尔)和三丁基膦(228毫克，113毫摩尔)，6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(25毫克，0.075毫摩尔)和(2-(二甲基氨基)乙醇(14毫克，0.15毫摩尔)的四氢呋喃溶液(2.0毫升)。得到5.2毫克淡黄色固体2-((6-甲氧基-2-(5-甲氧基噻唑并[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)-N，N-二甲基乙-1-胺(收率：17.2％)。MS(ESI)M/Z：406[M+H+]；1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.33(s，1H)，6.75(s，1H)，6.38(s，1H)，4.44-4.32(m，2H)，4.22(s，3H)，3.89(s，3H)，3.22-3.06(m，2H)，2.64(s，6H)。
实施例18：合成2-(4-(环丙基甲氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000275
步骤A：合成2-(4-(环丙基甲氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑
Figure GPA0000295864850000281
详见通用合成步骤L。6-甲氧基-2-(5-甲氧基[5，4-d]噻唑-2-基)苯并呋喃-4-醇(40毫克，0.12毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(6毫升)，2-溴甲基环丙烷(64毫克，0.48毫摩尔)和碳酸钾(66毫克，0.48毫摩尔)。-得到7.7毫克淡黄色固体2-(4-(环丙基甲氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-5-甲氧基咪唑并[5，4-d]噻唑(收率：16.5％)。MS(ESI)M/Z：389[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3，ppm)δ7.28(s，1H)，6.70(s，1H)，6.32(s，1H)，4.22(s，3H)，3.95(d，J＝6.6Hz，2H)，3.88(s，3H)，1.40-1.30(m，1H)，0.72-0.66(m，2H)，0.44-0.40(m，2H)。
实施例19：
体外筛选实验-FLIPR方法检测化合物抑制PAR4活性测试
1、准备试剂：
实验材料
1)PAR4的激动剂及抑制剂
PAR4的选择性激动剂TFLLR-NH2、2-Furoyl-LIGRLO-NH2和AYPGKF-NH2由SangonBiotech合成并购买或从Sigma-Aldrich直接购买。在FLIPR钙离子外流试验中它们对PAR4的EC50分别为2.0μM、0.2μM和1.3μM。SAL02-001-00和SAL02-002-00为高活性的PAR4选择性抑制剂，在FLIPR钙离子外流试验中其对PAR4的IC50值为5-10nM。
2)PAR4表达细胞系
利用常规转染的方法将包含人源PAR4cDNA的哺乳动物细胞表达载体分别导入Flp-In-TREx-293细胞，经相应的抗生素筛选获得稳定高表达的Flp-In-TREx-293-PAR4细胞系并利用PAR4 FLIPR钙离子外流实验进行功能验证。据文献报道HEK293细胞本身内源性高表达PAR4，因此Flp-In-TREx-293-PAR4细胞系可以用来进行PAR4小分子抑制剂的筛选实验。
实施例20
利用FLIPR钙离子外流实验检测化合物对人源PAR4的抑制活性
Flp-In-TREx-293-PAR4细胞培养于DEME高糖(Gibco)、10％胎牛血清、2mMGlutaMAX、1％青霉素-链霉素、15μg/ml blasticidin和200μg/ml潮霉素的培养基中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。细胞接种至经poly-d-lysine处理过的384孔细胞培养板(Corning，3845)中，接种密度为8,000个细胞/孔/25μl细胞接种基质(DMEM高糖、10％胎牛血清、2mM GlutaMAX)于细胞培养箱培养过夜。加入25μl等体积的2X(400ng/ml)四环素诱导基质继续培养24h。实验当天，将培养板中的诱导基质更换为实验缓冲液(HBSS+20mMHEPES)，随后加入20μl等体积的2X Calcium 6dye，于37℃孵育2小时后置于室温待用。利用实验缓冲液将待测化合物和PAR4激动剂稀释至6X浓度，加入10μl 6X待测化合物至384孔细胞培养板，于室温孵育30分钟后，利用FLIPR Tetra将10μl6X PAR4激动剂加入384孔细胞培养板，进行数据的测定和分析。整个反应体系为60μl，PAR4激动剂的终浓度为1.3μM(EC50)，DMSO的终浓度为0.3％。
实验结果如下：
Figure GPA0000295864850000282
Figure GPA0000295864850000291
注：A：0.1-20nM；B：20-100nM。
结果显示：本发明所述化合物具有高活性
实施例21PAR4拮抗剂抗血小板凝聚试验
人洗涤血小板样品的制备：
1.健康人全血样品的采集：使用5mL离心管(海门市昊瑞实验器材经营部)，每管加入600uL体积的ACD缓冲液(北京百奥莱博科技有限公司，ACD抗凝剂)。每管采集全血样品至4mL刻度(约采集全血3.4mL)，温和颠倒4-5次混匀，样品采集后20分钟内离心，离心前处于常温保存。
2.富血小板血浆(PRP)的制备：全血样品在170g，常温条件下离心(Eppendorf5810R型号离心机)14分钟，离心后收集上层较澄清液体至另一洁净空5mL离心管(海门市昊瑞实验器材经营部)，作为富血小板血浆样品。
3.血小板初次富集及洗涤：富血小板血浆样品在1300g(Eppendorf5810R型号离心机)，常温条件下离心6分钟；离心后弃去上层澄清液体，使用ACD缓冲液小心缓慢地重悬、洗涤沉淀物一次。
4.人洗涤血小板样品的制备：将重悬后的血小板样品在1300g，常温条件下离心6分钟；离心后弃去上层澄清液体，使用台式液(北京百奥莱博科技有限公司)小心缓慢地重悬沉淀，至洗涤后血小板终浓度为2-4X108/mL，常温保存待当天用。
5.(选做)乏血小板血浆(PPP)的制备：#2步骤后的下层血液样品，在1800g(Eppendorf 5810R型号离心机)、常温条件下离心10分钟；离心后，收集上清至另一洁净空5mL离心管(海门市昊瑞实验器材经营部)，作为乏血小板血浆样品，常温保存待用。
受试物与人洗涤血小板样品的孵育：
1.孵育前准备：37℃水浴锅(常州国华电器有限公司，HH-4数显恒温水浴锅)，血小板聚集分析仪(北京世帝科学仪器有限责任公司，LG-PABER-I半自动凝血分析仪)开机预热。
2.受试物与人洗涤血小板样品的孵育：取一洁净500uL规格的离心管，标明待测受试物名称及浓度；取276uL人洗涤血小板样品加入其中，再加入60uL待测受试物，温和混匀4-6次后，放置于水浴锅内孵育，并开始计时。水浴孵育20分钟。
血小板最大聚集率(MAR％)的测定：
1.测定基线：使用台式液或乏血小板血浆(PPP)作为基线物质，取300uL，加入比色杯(北京世帝科学仪器有限责任公司)进行基线值的测定，该数值仅用于仪器自动计算最大聚集率的测定。
2.孵育后的目标洗涤血小板的测定：测定时间设定为600s，测定模式为Aggr模式；取280uL孵育后的洗涤血小板样品，加入至比色杯(北京世帝科学仪器有限责任公司)中，加入一枚震荡珠(北京世帝科学仪器有限责任公司)并预热1分钟。预热完成后，将比色杯置于测试通道，按开始按钮10秒中后，缓缓加入20uL的PAR4-AP激动剂或20ul先导化合物，加入过程中枪头不进入液面下很深的位置，得到MAR值。
3.阴性激动剂对照：如2的操作，仅将最后加入的PARP-AP激动剂更换为激动剂所用的溶媒(15％HBSS+20mM HEPES的生理盐水溶液)，试验结果作用为阴性激动剂对照。
血小板最大聚集率及抑制率的计算：
1.血小板最大聚集率＝(600s时比浊度值-基线值)/(10s内比浊度值-基线值)
2.血小板聚集抑制率(％)＝1-(待测化合物MAR％-阴性激动剂MAR％)/(阴性对照MAR％-阴性激动剂MAR％)*100％
体外血小板凝聚试验数据如下：
化合物编号 IC50in PAgT(nM)
BMS-986120 2.6，n＝11
SAL02-119 1.79，n＝1
结果显示：本发明所述化合物抗血小板凝聚作用优于参比化合物BMS986120。
实施例22
Caco-2细胞渗透性试验
1.试验材料
1.1待测化合物由委托方提供。对照组化合物地高辛购自当地供应商，***购自Sigma公司.
1.2非必需氨基酸(NEAA)，HEPES和Hank’s平衡缓冲液(HBSS)购自Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自Corning公司。青霉素/链霉素混合溶液(100x)和胰蛋白酶/EDTA溶液购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 HTS 96-well transwell细胞培养板购自Corning公司。电阻仪购自WorldPrecision Instruments公司。Infinite 200 PRO酶标仪购自Tecan。MTS2/4混合器购自IKA公司。
2.试验方案
Caco-2于Transwell上培养14-18天，然后开始待测化合物双向渗透试验。测定化合物由顶端到基底端的转运速率，以及基底端到顶端的转运速率，共孵育2小时。使用LC-MS/MS测定顶端和基底端的化合物浓度，并计算化合物的表观渗透系数。
3.试验步骤
细胞培养
1)使用含L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基，添加10％胎牛血清、1×青霉素/链霉素混合溶液以及1×非必需氨基酸用于细胞培养。
2)Caco-2培养于T-75细胞培养瓶。培养箱设置为37℃、5％CO2、保证相对湿度95％。细胞汇合度达到70-90％时可用于接种Transwell。
3)细胞接种前，向Transwell上室每孔中加入50μL细胞培养基，下层培养板内加入25mL细胞培养基。将培养板置于37℃，5％CO2培养箱内孵育1小时后可用于接种细胞。
4)使用5mL PBS轻轻清洗细胞。弃掉PBS，加入1.5mL含EDTA的胰酶，于37℃孵育5到10分钟至细胞完全脱落。加入含血清的培养基终止消化。
5)吸取细胞混悬液转移至圆底离心管，于120×g离心10分钟。
6)使用培养基重悬细胞，终浓度为6.86×105cells/mL。
Caco-2细胞接种
1)将上述细胞悬液以50μL每孔加入到96孔Transwell培养板上室中，最终接种密度为2.4×105cells/cm2。
2)接种后48小时开始换液，培养14-18天，隔一天换一次培养基。
3)更换培养基过程如下，将Transwell小室与接收板分开，先弃掉接收板中培养基然后再弃掉Transwell小室培养基，最后每个小室加入100μL新鲜培养基，接收板加入25mL新鲜培养基。细胞单层膜完整性的评价
1)Caco-2经过14天培养后，应完全汇合并完成分化。此时，可应用于穿透试验。
2)用电阻仪测量单层膜电阻，记录每孔电阻。
3)测定结束后，将Transwell培养板放回培养箱。
4)电阻值的计算：
测定电阻值(ohms)x膜面积(cm2)＝TEER值(ohm·cm2)
若TEER值＜230ohms·cm2，则该孔不能用于穿透试验。
溶液配制
1)配制1L HBSS(10mM HEPES，pH 7.4)，分别称取2.38g HEPES，0.35g碳酸氢钠，加900mL纯水让其溶解，然后加100mL 10×HBSS搅拌均匀，调PH至7.4，最后过滤。
2)配制待测药和对照药的10mM DMSO储备液，用HBSS(10mM HEPES，pH 7.4)稀释得到5μM工作液。对于亲脂性或低溶解度的化合物，通过向HBSS缓冲液中加3％BSA来提高化合物的回收率。
药物穿透试验
1)从培养箱中取出Transwell培养板。使用HBSS(10mM HEPES，pH 7.4)缓冲液润洗细胞单层膜两次，37℃条件下孵育30分钟。
2)测定化合物由顶端到基底端的转运速率。向上层小室(顶端)每孔加入75μL含待测化合物的HBSS(10mM HEPES，pH 7.4)缓冲液，下层小室(基底端)每孔加入235μLHBSS(10mM HEPES，pH 7.4)缓冲液。
3)测定化合物由基底端到顶端的转运速率。向上层小室(顶端)每孔加入75μLHBSS(10mM HEPES，pH 7.4)缓冲液，下层小室(基底端)每孔加入235μL含待测化合物的HBSS(10mM HEPES，pH 7.4)缓冲液。转运体系置于涡旋器上于150转/分钟、37℃条件下孵育2小时。
4)孵育完成后，分别从Transwell培养板上室和下室每孔取样50μL加入到新的样品管中。向样品管内加入4倍体积含内标的乙腈(100nM阿普***，200nM咖啡因，200nM拉贝洛尔，2μM酮洛芬)，涡旋10分钟后，于3,220g离心30分钟。吸取上清液100μL，与等体积水稀释之后进行LC-MS/MS分析。各样品均采用双平行孵育。
实施例23
肝微粒体稳定性试验
1.试验材料
维拉帕米(货号：V4629-1G；批号：021M1429V)购于Sigma。混合的人肝微粒体和混合雄性大鼠肝微粒体购于康宁。混合雄性猴肝微粒体购于瑞德。贮存在-80℃冰箱备用。其他试剂购买于当地供应商。
2.试验方案
配置反应体系，加入NADPH启动反应，并于37℃进行水浴孵育，分别在0、15、30、45和60分钟进行取样。用LC-MS/MS检测待测药和阳性药，测定剩余百分比。计算待测化合物的半衰期以及体外固有清除率。
3.试验步骤
1)主要反应体系的配置见表.
表.主要反应体系的配置
Figure GPA0000295864850000311
Figure GPA0000295864850000321
2)将该反应体系放在37℃水浴中预孵育10分钟。向反应体系中加入40μL10mMNADPH溶液来启动反应，NADPH的最终浓度为1mM。用40μL超纯水代替NADPH溶液作为阴性对照。阴性对照的作用是排除化合物自身化学稳定性的影响。
3)在0，15，30，45和60分钟分别取出50μL反应样品，用4倍的含有内标(200nM阿普***，200nM拉贝洛尔，2μM酮洛芬，200nM咖啡因)的乙腈淬灭。样品在4，000转/分钟转速下离心40分钟。离心完成后取100μL上清液和100μL超纯水混匀用于LC-MS/MS分析检测。
体外相关结果统计如下：
Figure GPA0000295864850000322
结果显示：本发明所述化合细胞膜渗透好，肝微粒体内稳定性提高。
根据已有文献报道，BMS-986120参比化合物水溶性很差，蛋白结合率高，使化合物在血浆游离浓度很低，从而要高剂量给药产生药效，大大降低了药物安全性窗口。
通过体外活性测试，本发明系列化合物体外活性高，尤其抗凝血活性高，与参比化合物活性相当，或者更优。另外，细胞膜渗透性，蛋白结合率，与参比化合物相似。体内药代药动力学参数也与参比化合物相当。
本发明化合物中的双环核心结构新颖是本专利所特有的。结构的独特性可能带来具有与参比化合物相比不同的药理药效，甚至不同的适应症。

Claims (6)

1.作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的母核如下：
Figure FDA0003702830660000011
其中X、Z选自CH或者N；
Y选自O或者CH；
R0选自甲氧基；
R1选自甲氧基；
R2选自甲氧基、
Figure FDA0003702830660000012
甲氧乙氧基、
Figure FDA0003702830660000013
2.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述权利要求1化合物与无机酸或有机酸成盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、氢碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟萘酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁酸、酒石酸和对甲苯磺酸。
3.作为用于治疗血小板聚集的蛋白酶激活受体4(PAR4)抑制剂的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，选自以下化合物：
Figure FDA0003702830660000014
4.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和一种以上药学上可接受的载体。
5.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗血栓相关疾病的药物用途。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于，所述血栓相关疾病选自动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、脑血管血栓栓塞性病症、和心脏腔室或外周循环中的血栓栓塞性病症。
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