CN112062810A - 一种包涵体复性集约装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包涵体复性集约装置，复性液泵设置与变性液泵相连接后进入滤筒中的滤芯中，将过滤后的复性液滤除复性液中的杂质，包括菌体碎片宿主DNA以及复性不完全不溶包涵体颗粒性杂质，同时复性液在滤筒中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间，澄清后的复性蛋白通过滤出泵控制滤出速度进入超滤循环泵浓缩与超滤储液混合后通过进入中空纤维超滤柱后进入超滤存储袋，中空纤维超滤柱还设置与超滤透出泵相连接。本发明可放大适合稀释1000L中试和生产规模的包涵体复性集约装置，按比例可控稀释复性包涵体，澄清浓缩复性正确有活性目标蛋白，同时去除复性失败包涵体颗粒、宿主DNA和菌体碎片颗粒。

Description

一种包涵体复性集约装置
技术领域
本发明涉及包涵体复性集约技术领域，尤其涉及的是，一种包涵体复性集约装置。
背景技术
大肠杆菌表达重组蛋白，具有生长速度快，表达产率高，生产量大，成本低优点；但大肠杆菌表达的重组蛋白多是包涵体形式，包涵体是大肠杆菌高效表达时，由于胞内新生成的多肽浓度过高，无时间正确折叠成天然结构，形成高密度不溶性蛋白质颗粒。包涵体是无活性蛋白，所以需要使用盐酸胍/尿素等变性剂溶解包涵体称为变性，然后加入复性液在可控复性环境中正确折叠恢复蛋白活性称为复性。包涵体复性：包涵体复性有两种形式：稀释复性，需要大量液体百倍稀释，体积增加大，复性蛋白浓度很低；另一种使用透析或超滤去除变性剂。透析适合实验室小体积复性，无法放大；超滤复性是现在生产工艺常使用的方法，但如果复性过程中有复性失败的沉淀，超滤法容易在膜上出现聚集变性(是由不可逆变性蛋白、细胞碎片、宿主DNA引起聚集)，造成膜堵塞。稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加巨大，复性后蛋白浓度被稀释；体积大混合不迅速导致变性剂去除过程不稳定，不易控制，容易局部浓度高，产生聚集沉淀。工业规模包涵体复性使用阶段比例稀释复性，受限于需要低温和巨大稀释罐体积限制，只能使用小倍数、分步稀释复性，不能使用1：100倍高效稀释复性方法，影响了活性蛋白回收。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明提供了一种包涵体复性集约装置，解决了现有技术中存在的问题。
本发明的技术方案如下：一种包涵体复性集约装置，存储复性液的复性液泵设置与存储包涵体变性液的变性液泵相连接，将相同体积的变性包涵体及复性液混合后，变性包涵体进入复性液后开始折叠进入滤筒中的滤芯中，将过滤复性液，滤除复性液中的杂质，包括菌体碎片、宿主DNA以及复性不完全不溶的包涵体颗粒性杂质，同时复性液在滤筒中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间；澄清后的复性蛋白通过滤出泵控制滤出速度，滤出液通过超滤循环泵进入中空纤维超滤柱后浓缩，再进入超滤存储袋闭环循环超滤，中空纤维超滤柱透出端设置超滤透出泵控制超滤透出速度。
进一步而言，以超滤透出泵泵出的速度作为速度控制标杆，后端超滤出去多少废液，装置前端进入相同体积的混合好的包涵体变性液和复性液，变性包涵体进入复性液后开始折叠，正确折叠的包涵体形成溶解状态活性蛋白，没有正确折叠的依然是颗粒沉淀，混浊的复性液进入滤筒中，过滤澄清后的复性液通过超滤循环泵进入超滤浓缩，缩小活性蛋白体积。
进一步而言，所述澄清颗粒物，是指变性液与复性液混合后需要短暂时间，供变性蛋白改变结构，由变性蛋白的线性结构，弯曲折叠成有活性的立体三维结构，包括二硫键、氢键形成。蛋白结构折叠过程中有些变性蛋白没有折叠成天然活性结构，错误折叠成为没有活性的不溶杂质，所以需要滤芯滤除不溶的杂质颗粒。
进一步而言，由于超滤透出速度远远慢于滤芯过滤速度，为保持超滤***进出液平衡，和提高超滤效果，所以控制过滤滤出泵与超滤透出泵速度相同，过滤滤出泵与超滤透出泵选用双泵头泵，由一个电机带动，保证进出超滤***液体速度相同；复性液泵+变性液泵的速度总和＝过滤出泵的速度＝超滤透出泵速度，以保证装置通量平衡。
进一步而言，所述复性液泵与变性液泵，使用双泵恒流可控大比例混合变性液/稀释液，在滤筒中混合复性完全；复性液泵与变性液泵分别使用两个蠕动泵将变性包涵体液和复性液泵后混合，变性液泵速度是复性液泵速度99，保证1：100比例复性。
进一步而言，所述滤筒中的滤芯为折叠滤芯，用于过滤澄清，滤除复性液中的杂质，防止堵塞超滤柱，包括菌体碎片宿主DNA以及复性不完全不溶包涵体颗粒性杂质，同时复性液在过滤器中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间。
进一步而言，所述滤筒底部一侧的进口及底部中央出口，滤芯在滤筒中央，滤芯底部有密封圈，滤芯插在滤筒中央插座中，插座密封滤芯起到分隔滤前和滤后，外壳上部设置有压力表、放气阀用于调节内部压力；滤筒底部密封圈有卡箍，用于紧箍连接。
进一步而言，所述中空纤维超滤柱，为10Kd，纤维内径为0.5mm，处理1000L复性液中空纤维膜面积2.5m2，纤维内体积660ml，超滤浓缩能够去除多余复性液，使活性蛋白浓度提高，达到目的蛋白体积为复性前的1/10，中空纤维柱自带外壳省去了膜包超滤器的不锈钢夹套；中空纤维超滤柱纤维管内部通透，处理的1000L复性体积的装置可以放在4度低温柜中。所述中空纤维柱纤维内体积为660ml。
采用本发明的技术方案，可放大适合稀释1000L中试和生产规模的包涵体复性集约装置，按比例可控稀释复性包涵体，澄清浓缩复性正确有活性目标蛋白，同时去除复性失败包涵体颗粒、宿主DNA和菌体碎片颗粒。集约设计能复性超滤1000L***可放入实验室双门层析冷柜。
附图说明
图1为本发明实施例中集约装置示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例一
本发明提供一种包涵体复性集约装置，如图1所示，图1中存储复性液的复性液泵1设置与存储包涵体变性液的变性液泵2相连接，将相同体积的变性包涵体及复性液混合后，变性包涵体进入复性液后开始折叠进入滤筒8中的滤芯9中，将过滤复性液，滤除复性液中的杂质，包括菌体碎片、宿主DNA以及复性不完全不溶的包涵体颗粒性杂质，同时复性液在滤筒8中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒8中延长了复性时间；澄清后的复性蛋白通过滤出泵3控制滤出速度，滤出液通过超滤循环泵4进入中空纤维超滤柱6后浓缩，再进入超滤存储袋7闭环循环超滤，中空纤维超滤柱6透出端设置超滤透出泵5控制超滤透出速度。
进一步而言，以终末端超滤透出泵5泵出的速度作为集成连续***速度控制标杆，后端超滤出去多少废液，装置前端进入相同体积的混合好的包涵体变性液和复性液，变性包涵体进入复性液后开始折叠，正确折叠的包涵体形成溶解状态活性蛋白，没有正确折叠的依然是颗粒沉淀，混浊的复性液进入滤筒8中，过滤澄清后的复性液通过超滤循环泵4进入超滤***浓缩，缩小活性蛋白体积(可以浓缩到原变性体积的1/10)。由于装置体积小到可放入4度冰柜，保证了复性好的蛋白活性，对生产持续时间没有限制，***可连续不断稀释复性包涵体，并浓缩活性蛋白，***处理复性液体积可远超过1000L。
上述中澄清颗粒物，是指变性液与复性液混合后需要短暂时间，供变性蛋白改变结构，由变性蛋白的线性结构，弯曲折叠成有活性的立体三维结构，包括二硫键、氢键形成。蛋白结构折叠过程中有些变性蛋白没有折叠成天然活性结构，错误折叠成为没有活性的不溶杂质，所以需要滤芯滤除不溶的杂质颗粒。
上述中由于超滤透出速度远远慢于滤芯过滤速度，为保持超滤***进出液平衡，和提高超滤效果，所以控制过滤滤出泵3与超滤透出泵5速度相同，过滤滤出泵3与超滤透出泵5选用双泵头泵，由一个电机带动，保证进出超滤***液体速度相同。复性液泵1+变性液泵2的速度总和＝过滤出泵3的速度＝超滤透出泵5速度相同，保证***通量平衡。
所述复性液泵1与变性液泵2，使用双泵恒流可控大比例混合变性液/稀释液，在滤筒8中混合复性完全，解决直接稀释复性法倾倒稀释混合比例不均匀、工艺重复性差问题。复性液泵1与变性液泵2分别使用两个蠕动泵将包涵变性液和复性液泵后混合，变性液泵2速度是1复性液泵1速度99，保证1：100比例混合复性。
滤筒8及滤筒8中的滤芯9，滤芯9为折叠滤芯，用于过滤澄清，滤除复性液中的杂质，防止堵塞超滤柱，包括菌体碎片宿主DNA以及复性不完全不溶包涵体颗粒性杂质，同时复性液在过滤器中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间。滤筒8底部一侧的进口及底部中央出口，滤芯在滤筒中央，滤芯底部有密封圈，滤芯插在滤筒中央插座中，插座密封滤芯起到分隔滤前和滤后，外壳上部设置有压力表、放气阀用于调节内部压力；滤筒底部密封圈有卡箍，用于紧箍连接。
超滤浓缩过程发生在超滤柱，液体流经中空纤维管，管内压力大，液体中小分子透过膜渗出，中空纤维管内的液体体积变小，就等于浓缩了，浓缩了的液体从中空纤维柱上方回流到储液容器7中，中空纤维超滤柱6，为10Kd，纤维内径为0.5mm，处理1000L复性液中空纤维膜面积2.5m2，纤维内体积660ml，超滤浓缩能够去除多余复性液，使活性蛋白浓度提高，达到目的蛋白体积为复性前的1/10，中空纤维柱自带外壳省去了膜包超滤器的不锈钢夹套，节省空间和成本；中空纤维超滤柱6纤维管内部通透，即使有细微颗粒物也堵不死(中空纤维柱6纤维内体积仅有660ml)；处理的1000L复性体积的装置可以放在4度低温柜中，保证了包涵体复性过程低温环境，适合实验室中试及放大生产使用。
本发明中包涵体复性是一个十分复杂的过程，受诸多因素的制约。实验中各种试剂和蛋白质的浓度、操作温度和复性时间、缓冲液的成分和pH值等因素都对实验结果有着至关重要的作用。本发明连续集约复性***，精确掌握每一个因素，可重复获得稳定高收率的活性蛋白。
用以下实验数据进一步说明本发明技术方案：
大肠杆菌生产菌株诱导表达产生的无活性重组包涵体蛋白,溶解于10升变性液尿素中变性后进行大比例稀释复性。蛋白质浓度、复性温度、pH值、复性缓冲液成分、还原剂浓度对目标蛋白的复性效果都有影响。具体而言：如图1所示，复性液泵1与变性液泵2泵后相连，变性包涵体1：100稀释复性后进入滤筒8中，滤芯9滤除复性液中的杂质，包括菌体碎片宿主DNA以及复性不完全不溶包涵体颗粒性杂质，同时复性液在滤筒8中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的复性蛋白暂存在滤筒8中延长了复性时间；澄清后的复性蛋白通过滤出泵3控制滤出速度进入超滤***，滤出液与超滤储液混合后进入中空纤维超滤柱6浓缩，再进入超滤存储罐7，中空纤维超滤柱6还设置有超滤透出泵5控制超滤***透出速度。
将1000g包涵体蛋白溶解于10升4℃变性液pH 9.5的7mol/L的尿素,含有5mmol/Lβ-巯基乙醇形成变性包涵体储存液连接变性液泵2；冰柜外配制室温25℃、pH 8.0的纯化水复性液连接冰柜内复性液泵1；调节变性液泵2的泵速为12.5ml/min，复性液泵1泵速为1237.5ml/min；
滤筒8中的滤芯9为20英寸0.22um折叠滤芯，过滤速度由过滤滤出泵3控制为1250ml/min,；
中空纤维超滤柱6为10Kd 2.5M2,纤维内径0.5mm柱内体积370ml，超滤循环泵4超滤循环速度10L/min，超滤存储罐7体积30L，超滤透出泵5透出速度1250ml/min排出冰柜，超滤透出液泵5与过滤滤出泵3双泵头控制中空纤维超滤柱6透出速度和滤芯9过滤速度(超滤透出泵5过滤滤出泵3的补料速度)都是1250ml/min。经过14小时在冰柜中稀释复性，过滤澄清，超滤浓缩取得最高的复性活性，活性收率超过80％，最终收获浓缩成5升的目标重组蛋白。建立了适宜中试和放大生产大比例稀释复性方法。
采用本发明的技术方案，可放大适合稀释1000L中试和生产规模的包涵体复性集约***，按比例可控稀释复性包涵体，澄清浓缩复性正确有活性目标蛋白，同时去除复性失败包涵体颗粒、宿主DNA和菌体碎片颗粒。集约设计能复性超滤1000L***可放入实验室双门层析冷柜。
需要说明的是，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；并且，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种包涵体复性集约装置，其特征在于，存储复性液的复性液泵设置与存储包涵体变性液的变性液泵相连接，将相同体积的变性包涵体及复性液混合后，变性包涵体进入复性液后开始折叠进入滤筒中的滤芯中，将过滤复性液，滤除复性液中的杂质，包括菌体碎片、宿主DNA以及复性不完全不溶的包涵体颗粒性杂质，同时复性液在滤筒中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间；澄清后的复性蛋白通过滤出泵控制滤出速度，滤出液通过超滤循环泵进入中空纤维超滤柱后浓缩，再进入超滤存储袋闭环循环超滤，中空纤维超滤柱透出端设置超滤透出泵控制超滤透出速度。
2.如权利要求1所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，以超滤透出泵泵出的速度作为速度控制标杆，后端超滤出去多少废液，装置前端进入相同体积的混合好的包涵体变性液和复性液，变性包涵体进入复性液后开始折叠，正确折叠的包涵体形成溶解状态活性蛋白，没有正确折叠的依然是颗粒沉淀，混浊的复性液进入滤筒中，过滤澄清后的复性液通过超滤循环泵进入超滤浓缩，缩小活性蛋白体积。
3.如权利要求2所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述澄清颗粒物，是指变性液与复性液混合后需要短暂时间，供变性蛋白改变结构，由变性蛋白的线性结构，弯曲折叠成有活性的立体三维结构，包括二硫键、氢键形成；蛋白结构折叠过程中有些变性蛋白没有折叠成天然活性结构，错误折叠成为没有活性的不溶杂质，所以需要滤芯滤除不溶的杂质颗粒。
4.如权利要求2所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，由于超滤透出速度远远慢于滤芯过滤速度，为保持超滤***进出液平衡，和提高超滤效果，所以控制过滤滤出泵与超滤透出泵速度相同，过滤滤出泵与超滤透出泵选用双泵头泵，由一个电机带动，保证进出超滤***液体速度相同；复性液泵+变性液泵的速度总和＝过滤出泵的速度＝超滤透出泵速度，以保证装置通量平衡。
5.如权利要求4所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述复性液泵与变性液泵，使用双泵恒流可控大比例混合变性液/稀释液，在滤筒中混合复性完全；复性液泵与变性液泵分别使用两个蠕动泵将变性包涵体液和复性液泵后混合，变性液泵速度是复性液泵速度99，保证1：100比例复性。
6.如权利要求5所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述滤筒中的滤芯为折叠滤芯，用于过滤澄清，滤除复性液中的杂质，防止堵塞超滤柱，包括菌体碎片宿主DNA以及复性不完全不溶包涵体颗粒性杂质，同时复性液在过滤器中进一步正确折叠复性，澄清颗粒物的同时，稀释后的蛋白暂存在滤筒中延长了复性时间。
7.如权利要求6所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述滤筒底部一侧的进口及底部中央出口，滤芯在滤筒中央，滤芯底部有密封圈，滤芯插在滤筒中央插座中，插座密封滤芯起到分隔滤前和滤后，外壳上部设置有压力表、放气阀用于调节内部压力；滤筒底部密封圈有卡箍，用于紧箍连接。
8.如权利要求7所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述中空纤维超滤柱，为10Kd，纤维内径为0.5mm，处理1000L复性液中空纤维膜面积2.5m2，纤维内体积660ml，超滤浓缩能够去除多余复性液，使活性蛋白浓度提高，达到目的蛋白体积为复性前的1/10，中空纤维柱自带外壳省去了膜包超滤器的不锈钢夹套；中空纤维超滤柱纤维管内部通透，处理的1000L复性体积的装置可以放在4度低温柜中。
9.如权利要求8所述的包涵体复性集约装置，其特征在于，所述中空纤维柱纤维内体积为660ml。
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