CN112057443A - 苯磺酰胺类化合物的医药用途及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苯磺酰胺类化合物的医药用途及其药物组合物，具体如式I～V所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，它们可用于制备具有抑制STING信号通路激活的STING抑制剂或药物以及用于制备预防或治疗STING介导的疾病的药物；

Description

苯磺酰胺类化合物的医药用途及其药物组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及苯磺酰胺类化合物或其药物上可接受的盐或溶剂化物的医药用途及其药物组合物，其可作用于跨膜蛋白173(TMEM173)，也称STING(干扰素基因的刺激因子)，并抑制其信号通路。因此，该类化合物可用于制备预防或治疗STING介导的疾病的药物。

背景技术

机体的固有免疫***的激活由表达在细胞膜上和细胞质中的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别非自身的病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)所介导。PRRs在识别PAMPs后，激活下游免疫信号的传导，促进炎症和免疫细胞因子的释放，进一步激活机体的适应性免疫***协同杀伤并清除入侵的病原微生物(Cold Spring Harbor Symposia on QuantitativeBiology,1989,54:1-13.)。相似的，细胞在异常状态下(应激、受损、衰老或死亡)分泌的损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)也会被模式识别受体识别，进而激活免疫***，促进细胞的再生以及损伤后的修复(Science,2002,296(5566):301-305)。

细胞质中的DNA作为经典的PAMP或DAMP分子在固有免疫***的激活中发挥重要的作用(Curr Opin Immunol,2018,55:31-37.)。细胞质中的DNA受体蛋白cGAS(Cyclic AMP-GMP synthase)能够识别异常暴露的胞浆DNA分子，并以ATP和GTP为底物催化合成2’,3’-cGAMP分子(2’-3’/3’-5’cyclic GMP-AMP)。2’,3’-cGAMP与细菌代谢中形成的信号分子c-di-AMP和c-di-GMP被称为环状二核苷酸类物质(cyclic dinucleotides,CDNs)。这些CDNs分子能特异性的结合到内质网上调控蛋白STING(也被称为TMEM173,MITA,ERIS或MPYS)二聚体形成的“V”形口袋内(Nature,2008,455(7213):674-678；Nature,2011,478(7370):515-518)，进而诱导STING蛋白的多聚化激活(Cell,2013,154(4):748-62)。多聚化的STING蛋白由内质网向高尔基体室转移，并在此过程中招募下游的激酶蛋白TBK1和转录因子IRF3，TBK1在自磷酸化激活后催化STING和IRF3的磷酸化(Nature,2019,567(7748):394-398；Nature,2019,569(7758):718-722)。磷酸化的IRF3进一步二聚化入核，促进I型干扰素(type I interferons)及其相关免疫因子的表达(interferon stimulated genes,ISGs)。此外，STING蛋白也能通过招募TBK1和TRAF6分子，激活NF-κB信号通路，促进TNF-α和IL-6等炎症因子的表达(J Virol,2014,88(10):5328-41)。

尽管STING介导的固有免疫信号通路的激活在机体抵抗病原微生物的入侵过程中发挥重要的作用，持续的STING通路的激活会导致多种自身免疫疾病和炎症疾病的发生和发展(Nature Immunology,2017,18(7):716-724)。AGS综合症(Aicardi-Goutièressyndrome)是一种由TREX1,RNASE H2,SAMHD1,ADAR或IFIH1基因突变引起的全身性的罕见的自身免疫疾病(Am J Med Genet A,2015,167A(2):296-312)。动物模型中研究发现核酸代谢酶TREX1,RNASE H2和SAMHD1的基因突变导致胞浆DNA聚集进而激活cGAS-STING信号通路，且进一步在疾病小鼠体内敲除STING蛋白的表达能显著改善疾病的进展(J Exp Med,2016,213(3):329-36；Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(42):E5699-705；Nature,2018,557(7703):57-61)。在***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)病人中也发现了TREX1基因的突变，且50％～60％的SLE病人血清中I型干扰素高表达(Nat RevRheumatol,2018,14(4):214-228)。在Bloom综合症病人中发现，BLM蛋白突变导致微核的形成，进而激活STING信号通路诱导病人的血清中IFNs和ISGs的高表达(J Exp Med,2019,216(5):1199-1213)。SAVI(STING-associated vasculopathy with onset in infancy)疾病是由STING蛋白中个别氨基酸的突变导致其异常激活诱导的全身性的自身免疫疾病(NEngl J Med,2014,371(6):507-518)。此外，在炎症相关的疾病模型中，如皮肤癌的诱发(Nat Commun,2014,5:5166)、肿瘤转移(Nature,2018,553(7689):467-472)、早衰症(Nature,2017,550(7676):402-406)、脓毒症(Shock,2017,47(5):621-631)、急性胰腺炎(Gastroenterology,2018,154(6):1822-1835)、非酒精性脂肪肝及肝纤维化(Gastroenterology,2018,155(6):1971-1984；Proceedings of the National Academyof Sciences,2017,114(46):12196-12201)、肺炎(Nature Communications,2018,9(1))、慢性肾炎及肾纤维化(Cell Metabolism,2019,DOI:10.1016/j.cmet.2019.08.003)、缺血性再灌注损伤(Nature Medicine,2017,23(12):1481-1487；EMBO Molecular Medicine,2020,7；12(4):e11002)、帕金森病(Nature,2018,561(7722):258-262)、脑外伤(Journalof Neuroscience,2020,40(2):424-446)、外伤或其他疾病诱导的脊髓损伤(Cell，2020，183:1–14；Biochemical and Biophysical Research Communications,2019,517(4):741-748)和亨廷顿病(Journal of Clinical Investigation,2020,130(6):3124-3136；Proceedings of the National Academy of Sciences,2020,117(27):15989-15999)、家族性肌萎缩侧索硬化症(Nature,2020,585(7823):96-101)等，而抑制STING信号通路的激活能显著改善上述疾病的发生发展。总之，靶向STING蛋白的抑制剂的开发具有广泛的临床应用前景。

目前文献已报道的STING小分子抑制剂屈指可数，活性较弱且副作用较大(CellReports 2018,25,3405–3421；ACS Med.Chem.Lett,2019,10(1),92-97)。因此，研制新型的STING小分子抑制剂具有迫切的临床需求。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供如下式I～V任意一种或者多种所示的苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抑制STING信号通路激活的药物中的用途以及在制备预防或治疗STING介导的疾病的药物中的用途。本发明通过虚拟筛选、生物活性评价及作用机制研究，发现如下式I～V所示的苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物能特异性抑制STING信号通路的激活。

本发明还提供一种预防和治疗STING介导的疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的式I～V任意一种或者多种所示的苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抑制STING信号通路的药物中的用途：

本发明所述的式I～V任意一种或者多种苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗STING介导的疾病的药物中的用途。

进一步地，所述STING介导的疾病包括感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病、缺血性心脑血管疾病、神经退行性疾病、脑外伤、脊髓损伤、癌症或癌期综合征中的一种或几种。

在某些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于预防或治疗感染性疾病，包括：结核分枝杆菌感染、衣原体感染、疱疹病毒(单纯疱疹病毒)感染、腺病毒感染、乙肝病毒感染、正粘病毒感染和冠状病毒感染。

在某些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于预防或治疗炎性疾病，包括：代谢性炎症相关疾病(如胰岛素抵抗、代谢综合征、1型或2型糖尿病、高脂血症、肥胖症、动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌梗死、心律失常、冠心病、高血压、心衰、心肌肥大、心肌炎、缺血性脑病、脑卒中、出血性脑病、脑溢血、脑水肿、糖尿病心肌病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变和糖尿病溃疡、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、痛风、中风或脑梗死等)，肌肉骨骼肌炎症(手、腕、肘、肩、颈、膝盖、踝和脚关节炎症，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、急性和慢性感染性关节炎等)，眼部炎症(角膜炎、巩膜炎、结膜炎等)，消化***炎症(结肠炎、肝炎、胆管炎、胆囊炎、胰腺炎、胃炎、肠炎、炎症性肠病、直肠炎)，神经***炎症(脑膜炎、神经性肌强直、多发性硬化、CNS血管炎)，退行性神经***疾病(帕金森病、亨廷顿病、家族性肌萎缩侧索硬化症)，脉管***或者淋巴***炎症(血管炎、***炎、静脉炎)，生殖***炎症(***、子***、***、***、尿道炎)，呼吸***炎症(肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、肺气肿、闭塞性细支气管炎、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病)，器官纤维化疾病(肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心肌纤维化)，其他炎性病症包括阑尾炎、心肌炎、腮腺炎、牙龈炎、***炎、腹膜炎、胸膜炎、血管炎、静脉炎、浮肿、肾炎，脊髓损伤包括外伤或其他疾病引起的脊髓损伤，脑外伤。

在某些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于预防或治疗自身免疫性疾病。包括：Aicardi-Goutières综合征(AGS)、婴儿期发病的STING相关血管炎(SAVI)、伴有脑蛋白营养不良的视网膜血管病变(RCVL)、***性红斑狼疮(SLE)、家族性冻疮狼疮(CHBL)、贝切特氏病、查加斯病、银屑病、多发性硬化症、硬皮症和***等。

在某些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于预防或治疗具有炎性组分的T细胞介导的超敏反应，包括荨麻疹、皮肤过敏、过敏性鼻炎、接触性皮炎和呼吸道过敏等。

在某些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于预防或治疗身体各组织器官的癌症及肿瘤的转移，包括但不限于肺、骨、胰腺、肝、肾、头、子宫、卵巢、胃、结肠、食道、小肠、内分泌***、***、膀胱、宫颈、***的癌症。例如肝癌、肾癌、***、肺癌、皮肤癌、子宫癌、腺癌、***癌、肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤。

在某些优选的实施方案中，所述STING介导的疾病是银屑病、脑卒中、心肌梗死、脑外伤、外伤或其他疾病诱导的脊髓损伤、帕金森病、亨廷顿病、家族性肌萎缩侧索硬化症、非酒精性脂肪性肝炎、***性红斑狼疮、Aicardi-Goutières综合征、类风湿性关节炎、炎症性肠病、婴儿期发生的STING相关的血管疾病(SAVI)或糖尿病及其并发症。

所述式I～V化合物其药学上可接受的盐为金属离子或药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐。

本发明化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可单独使用或可与其他治疗剂组合使用。作为免疫调节剂，本发明的化合物可用于单一治疗或者与其它治疗剂组合使用以治疗与STING蛋白功能异常紊乱相关的疾病，包括感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病、缺血性心脑血管疾病、脑外伤、脊髓损伤、神经退行性疾病、癌症或癌前期综合征。

本发明的化合物可作为药用盐使用。该盐可为下列酸中的至少一种的酸盐：半乳糖二酸、D-葡糖醛酸、甘油磷酸、马尿酸、羟乙磺酸、乳糖酸、马来酸、1,5-萘二磺酸、萘-2-磺酸、新戊酸、对苯二甲酸、硫氰酸、胆酸、正十二烷基硫酸、苯磺酸、柠檬酸、D-葡萄糖，乙醇酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、磷酸、丙酸、盐酸、硫酸、酒石酸、琥珀酸、甲酸、氢碘酸、氢溴酸、甲烷磺酸、烟酸、硝酸、乳清酸、草酸、苦味酸、L-焦谷氨酸、糖精酸、水杨酸、龙胆酸、对甲苯磺酸、戊酸、棕榈酸、葵二酸、硬脂酸、月桂酸、乙酸、己二酸、碳酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、乙基琥珀酸、富马酸、3-羟基萘-2-甲酸、1-羟基萘-2-甲酸、油酸、十一碳烯酸、抗坏血酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二氯乙酸、乙烷磺酸。另一方面，该盐也可以是本发明的化合物与金属(包括钠、钾、钙等)离子或药学上可接受的胺(包括乙二胺、氨丁三醇等)、铵离子或胆碱形成的盐。

本发明包括本发明化合物的各种氘代形式。与碳原子相连的每个可用氢原子可以独立的被氘原子取代。

本发明所述的预防或治疗STING介导的疾病的药物组合物，其包含式I～V任意一种苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物作为活性成分和药学上可接受的辅料。可任意混合的辅料根据剂型、给药形式等可以改变。辅料的例子包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂或甜味剂等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

本发明化合物可以从EnamineStore公司购买得到，也可参照实施例中描述的方法或其改进的方法来制备。所有化合物的HPLC纯度在95％以上。

本发明通过计算机辅助的虚拟筛选的方法筛选可能与STING蛋白结合的化合物，并进一步在细胞水平上对化合物进行生物活性验证。结果发现，式I化合物(SN-011,CAS:2249435-90-1)、式II化合物(SN-001,CAS:727699-84-5)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)能高效、特异性且低毒性地抑制STING信号通路。例如，式I化合物在小鼠原代骨髓分化的巨噬细胞和人原代***成纤维细胞中对IFN-β激活的半数抑制率分别为100nM和500nM左右。进一步的机制研究发现，式I化合物能显著细胞质中DNA诱导的STING蛋白的多聚化激活，抑制其由内质网向高尔基体的转移，抑制对下游接头蛋白TBK1和IRF3的招募，导致转录因子IRF3和NF-κB的磷酸化及其核转录水平的显著降低，进而抑制下游I型干扰素、IL-6和TNF-α的表达。此外，本发明获得并解析了人源STING蛋白和式I化合物的共结晶结构，结果表明，STING蛋白中多个保守的氨基酸位点与式I化合物存在结合作用，包括Tyr167、Ser241、Ser243、Glu260和Thr263。值得注意的是，这些位点均参与STING蛋白与其内源配体分子2’3’-cGAMP的结合。且进一步的竞争性Pulldown实验证实，式I化合物与STING蛋白以非共价的可逆方式结合。表面离子共振分子互作仪(SPR)检测SN-011与人源STING蛋白间的亲和力为4.03nM，而相比之下2’3’-cGAMP与STING蛋白间的亲和力为9.23nM。这说明相比于2’3’-cGAMP，式I化合物对STING蛋白具有更强的结合能力。

据此，本发明提供了式I～V所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抑制STING信号通路激活的药物中的用途。

本发明选取了小鼠Trex1基因敲除的自身免疫疾病模型、SAVI的体外细胞模型、大脑中动脉栓塞(MCAO)诱导的大鼠和小鼠脑卒中模型、高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型和咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型用于本发明化合物的药效学评价。以式I化合物为例进行的研究结果表明：

1.式I化合物能显著改善Trex1敲除小鼠自发性的多组织器官的炎症损伤并抑制机体自反应适应性免疫***的激活，延长疾病小鼠的长期生存率。

2.在SAVI相关的STING点突变体过表达的细胞中，式I化合物能显著抑制细胞I型干扰素及其相关的ISGs和炎症细胞因子的表达。

3.在MCAO制备的大鼠脑卒中模型中，式I化合物能显著下调缺血区脑组织中I型干扰素及其相关的ISGs和炎症细胞因子的表达，并显著改善脑卒中动物的神经行为学功能。

4.在MCAO制备的小鼠脑卒中模型中，式I化合物立即给药能显著下调缺血区脑组织中炎症细胞因子的表达，并显著改善小鼠记忆功能和运动功能；式I化合物于卒中后24小时给药仍然能显著改善卒中小鼠的运动功能。

5.在长期高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型中，式I化合物能显著改善小鼠肝脏的脂质聚集和炎症浸润，改善肝脏的损伤。

6.在BALB/c小鼠建立咪喹莫特诱导的银屑病样炎症模型中，式I化合物可以显著改善银屑病样炎症。

基于以上研究结果，本发明提供了式I～V化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗STING介导的疾病的药物中的用途。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明首次发现式I～V任意一种苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为靶向STING的全新类型小分子抑制剂，能高效、特异性且低毒性地抑制STING信号通路的激活，因而可用于制备抑制STING信号通路激活的药物。

(2)本发明的化合物作用机制明确，其通过直接结合STING蛋白并维持其静息状态下的二聚体构象而抑制STING信号通路的激活。尤其重要的是，本发明的化合物在炎性疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病和缺血性心脑血管疾病等疾病模型上具有显著的体内疗效，因而有望用于制备预防或治疗上述STING介导的疾病的药物。

附图说明

图1是通过虚拟筛选得到的含有苯磺胺酰胺结构的小分子化合物对STING信号通路的抑制效应图及部分化合物的结构：(A)MEF细胞中孵育10μM受试化合物，孵育6小时后，脂质体转染5μg ISD刺激6小时，收取细胞检测Ifnβ基因的表达；(B)MEF细胞中孵育10μM受试化合物，孵育6小时后收取细胞检测Ifnβ基因的表达；(C)化合物SN-001～SN-004和阴性对照化合物SN-100的化学结构；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图2是化合物SN-001(式II化合物)的体外生物活性效应图：(A～D)5～20μM化合物SN-001和SN-100分别孵育L929细胞6小时后，脂质体转染HT-DNA 4μg刺激6小时，收取细胞检测Ifnβ,Ifnα4,Cxcl10和Il6基因的表达；(E～H)5～20μM化合物SN-001和SN-100分别孵育THP-1细胞6小时后，使用HSV-1病毒40μL刺激6小时，收取细胞检测IFNβ,IFNα4,CXCL10和IL6基因的表达；(I)10μM化合物SN-001和SN-100分别孵育L929细胞6小时后，脂质体转染HT-DNA 4μg刺激4小时，收取细胞用蛋白的特异性抗体免疫印迹法检测对应蛋白的表达水平；(J～K)10μM化合物SN-001和SN-100分别孵育L929细胞6小时后，脂质体转染HT-DNA 8μg刺激4小时，免疫荧光发标记转录因子IRF3和P65的入核，细胞核位置用DAPI染色指示，标尺的长度为25μm；(L～N)MEF,L929和THP-1细胞中分别孵育5～20μM化合物SN-001 12或24小时后，用MTS试剂检测SN-001对细胞活力的影响；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图3是化合物SN-011(式I化合物)及相关化合物的体外生物活性效应图：(A)10μMSN-001及相关化合物SN-005～SN-011分别孵育L929细胞6小时，脂质体转染HT-DNA 4μg刺激6小时，收取细胞检测IFN-β基因的表达；(B)化合物SN-001及相关化合物SN-005～SN-011的化合物结构；(C～E)1μM化合物SN-011孵育MEF细胞6小时后，分别使用STING上游的经典激动剂ISD 5μg,HT-DNA 4μg,HSV-1 40μl,c-di-GMP 1μg和2’3’-cGAMP 1μg刺激，刺激完成后检测细胞Ifnβ,Cxcl10和Il6基因的表达；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图4是化合物SN-011(式I化合物)在MEF,BMDM和HFF细胞中的IC₅₀测试效应图：(A～C)MEF,BMDM和HFF细胞中分别孵育梯度浓度的化合物SN-011(5nM～5μM)6小时后，使用2’3’-cGAMP 1μg刺激3小时，刺激完成后检测IFN-β基因的表达，并以基因表达的抑制率作图，拟合出IC₅₀值；(D～F)MEF,BMDM和HFF细胞中分别孵育1.25～20μM化合物SN-011 24或48小时后，用MTS试剂检测SN-011对细胞活力的影响；n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图5是化合物SN-011(式I化合物)特异性地抑制STING信号通路激活的效应图：(A～B)在STING敲除的MEF细胞中孵育SN-011 6小时后，分别使用在细胞中外加LPS 10μg,poly(I:C)100μg,Sendai virus 10μl,IFN-β100U刺激，或脂质体转染CpG-DNA 5μg,poly(I:C)5μg，刺激完成后检测Ifnβ,Il6,Tnfα,Isg15和Isg56基因的表达；(C)HFF细胞分别孵育1～10μM SN-011 12或24小时，孵育完成后分别检测cGAS,STING,TBK1,IRF3蛋白的表达；(D～E)HFF细胞分别孵育1～10μM SN-011 12或24小时，孵育完成后分别检测cGAS(MB21D1)和STING(TMEM173)基因的表达；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图6是化合物SN-011(式I化合物)抑制STING及其介导的下游信号通路激活的效应图：(A)1μM SN-011或SN-100孵育HFF细胞过夜后，使用2’3’-cGAMP 1μg刺激1小时，刺激完成后收取细胞，用免疫印迹法检测STING蛋白的磷酸化和多聚化激活；(B)1μM SN-011或SN-100孵育HFF细胞过夜后，HSV-1病毒40μl感染细胞4小时，刺激完成后收取细胞，用免疫共沉淀法检测STING与其下游蛋白TBK1和IRF3的相互作用；(C)1μM SN-011或SN-100孵育HFF细胞过夜后，使用2’3’-cGAMP 1μg刺激2小时，收取细胞，用蛋白的特异性抗体免疫印迹法检测对应蛋白的表达水平；(D)1μM SN-011或SN-100孵育HFF细胞过夜后，使用2’3’-cGAMP 1μg刺激2小时后，固定细胞，用免疫荧光法检测IRF3蛋白入核，细胞核位置用DAPI染色指示，标尺的长度为25μm；(E)1μM SN-011孵育Hela细胞过夜后，HSV-1病毒40μl感染细胞3小时，刺激完成后用免疫荧光法检测STING蛋白向高尔基体的转移，高尔基***置用GM130染色指示，标尺的长度为25μm；

图7是化合物SN-011(式I化合物)与hSTING-CTD(149-379)蛋白的共结晶结构图：(A)SN-011与hSTING-CTD(149-379)蛋白的共结晶结构示意图，STING蛋白的二聚体结构中的两个单体分子分别用绿色和蓝色表示，二聚体形成的口袋内的SN-011分子以棒状骨架结构表示；(B)SN-011/hSTING-CTD(149-379)共结晶结构(紫色)与apo-hSTING-CTD(149-379)的结晶结构(4EMU)(黄色)比对示意图；(C)SN-011/hSTING-CTD(149-379)共结晶结构(紫色)与2’3’-cGAMP/hSTING-CTD(149-379)的结晶结构(4LOH)(黄色)比对示意图；(D)SN-011/hSTING-CTD(149-379)共结晶结果在晶格中堆积的方式；(E)hSTING-CTD(149-379)蛋白与SN-011结合后，蛋白上的氨基酸与小分子的相互作用示意图；

图8是化合物SN-011(式I化合物)与STING蛋白结合的亲和力及结合位点的验证图：(A～E)SPR法检测小分子SN-011,SN-100和2’3’-cGAMP与hSTING-CTD(149-379)蛋白间的结合曲线，同时检测突变关键结合位点Ser241A,Ser243A和Thr263A突变后蛋白与SN-011分子间亲和力的变化；(F～G)将表达Flag-hSTING及其点突变体Tyr167,Ser241A,Ser243A,Glu260A和Thr263A的质粒各5μg转染至HEK293T细胞中，转染12小时后加入SN-011(10μM)继续孵育12小时，孵育完成后收取细胞检测IFNβ基因的表达，并根据基因表达数值计算出抑制率；(H～I)将表达Flag-hSTING及其点突变体Tyr167,Ser241A,Ser243A,Glu260A和Thr263A的质粒各5μg转染至HEK293T细胞中，转染12小时后加入SN-011(10μM)继续孵育9小时，孵育完成后加入2’3’-cGAMP 1μg刺激3小时，收取细胞检测IFNβ基因的表达，并根据基因表达数值计算出抑制率；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图9是化合物SN-011(式I化合物)抑制Trex1^-/-小鼠原代BMDM细胞中高表达的IFNs和ISGs的效应图：(A)热图分析SN-011(500nM)孵育12小时后，野生型(WT)和Trex1^-/-小鼠BMDM细胞基因表达的RNA-Sequencing测序结果；共72个ISG基因在热图上展示，每个处理组选取两个独立重复实验；(B～E)Trex1^-/-BMDM细胞中分别孵育DMSO,SN-011(500nM)或SN-100(500nM),孵育12h过夜后收取细胞检测Ifnβ,Cxcl10,Isg15和Il6基因的表达；以WTBMDM的基因表达为对照组计算Trex1^-/-BMDM细胞中相关基因表达的增长倍数；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图10是化合物SN-011(式I化合物)减轻Trex1^-/-小鼠多组织器官炎症反应的效应图：(A～D)WT和Trex1^-/-小鼠分别腹腔注射PBS或SN-011(5mg/kg)，每周注射3次连续注射1个月后，分别取小鼠心脏、胃、舌头和肌肉组织，检测组织中Ifnβ,Cxcl10,Isg15和Il6基因的表达；(E)取上述组织，固定后进行石蜡切片和H&E染色，观察各组织的炎症细胞浸润，每组至少对6只小鼠的数据进行统计，实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图11是化合物SN-011(式I化合物)改善Trex1^-/-小鼠***性的自身免疫反应症状的效应图：(A)取注射SN-011(5mg/kg)1个月后的WT和Trex1^-/-小鼠的脾脏，分离脾脏细胞后，流式细胞仪检测脾脏中激活T细胞(CD4⁺CD69⁺,CD8⁺CD69⁺)和记忆T细胞(CD4⁺CD44^highCD62L^low,CD8⁺CD44^highCD62L^low)的含量；(B)对实验组小鼠脾脏中不同亚型的T细胞含量的统计分析图；(C)注射SN-011(5mg/kg)1个月后的WT和Trex1^-/-小鼠的生存率的统计分析图；(D)取注射SN-011 1个月后的WT和Trex1^-/-小鼠的血清，使用抗核抗体检测试剂盒免疫荧光法检测小鼠血清中抗核抗体的含量，每组至少对6只小鼠的数据进行统计，实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图12是化合物SN-011(式I化合物)在小鼠体内的药物代谢动力学评价效应图：(A)单次腹腔注射SN-011(5mg/kg)后24小时内C57BL6小鼠血浆中的药物浓度；(B)药代动力学参数统计表，每个时间点内取3只小鼠的血药浓度进行统计；

图13是化合物SN-011(式I化合物)在小鼠体内的毒理学评价效应图：(A)WT小鼠腹腔注射PBS或SN-011(1mg/kg)，每周注射3次连续注射10周后体重统计分析图；(B)上述小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)统计分析图；(C)上述小鼠血清中血尿素氮(BUN),血清肌酸酐(CREA)统计分析图；(D)上述小鼠分别取小鼠心脏、肾、胃和肝，固定后进行石蜡切片和H&E染色，观察各组织的病理学变化，每组至少对6只小鼠的数据进行统计，实验取平均值并作方差为误差线：n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图14是化合物SN-011(式I化合物)抑制SAVI相关的STING点突变体诱导的炎症基因表达的效应图：(A～C)HEK293T细胞中转染表达Flag-hSTING及SAVI相关的点突变体V155M,N154S,G166E,C206Y,R281Q和R284G的质粒各5μg，转染12小时后孵育化合物SN-011(10μM)，化合物孵育12小时后收取细胞检测IFN-β,CXCL10和TNF-α基因的表达；(D)HEK293T细胞中转染表达Flag-hSTING及SAVI相关的点突变体V155M,G166E,C206Y,R281Q和R284G的质粒各5μg，转染6小时后孵育化合物SN-011(10μM),化合物孵育12小时后收取细胞，用免疫共沉淀法检测STING对下游靶蛋白TBK1和IRF3的招募；(E)HEK293T细胞中转染表达Flag-hSTING及SAVI相关的点突变体V155M,G166E,C206Y,R281Q和R284G的质粒各5μg，转染6小时后孵育化合物SN-011(10μM),化合物孵育12小时后收取细胞，用免疫印迹法检测TBK1和IRF3蛋白的磷酸化表达；(F)HEK293T细胞中转染表达Flag-hSTING及SAVI相关的点突变体V155M,G166E,C206Y,R281Q和R284G的质粒各5μg，转染6小时后孵育化合物SN-011(10μM),化合物孵育12小时后收取细胞用非变性凝胶电泳的方法检测STING多聚化表达；所有数据均为三次平行实验取平均值并作方差为误差线：n.s.,无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01；

图15是化合物SN-011(式I化合物)改善急性脑缺血诱导的大鼠脑损伤的效应图：(A)大脑中动脉阻塞(MCAO)诱导大鼠急性脑缺血24小时后，用TCC染色法检测大脑的梗死面积正常区域为红色，梗死区域为白色；(B～C)大鼠大脑中动脉阻塞6小时和24小时分别对大鼠的行为学进行评分统计；(D～I)大脑中动脉阻塞诱导大鼠急性脑缺血24小时后，取大脑皮层区域组织检测Ifnβ,Ifnα4,Cxcl10,Mcp1,Tnfα和Il6基因的表达；大鼠在造模时和造模12小时后腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(3mg/kg)，每组4只大鼠的实验结果进行统计分析，n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01，给药组与MCAO组比较；

图16化合物SN-011(式I化合物)是改善急性脑缺血诱导的小鼠脑损伤的效应图：(A)小鼠大脑中动脉阻塞后立即腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(2mg/kg)，24小时后，取大脑皮层区域组织检测Mcp-1,Il6和Tnfα基因的表达；(B)小鼠大脑中动脉阻塞后立即腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(2mg/kg)，72小时后，取大脑皮层区域组织检测Mcp-1,Il6和Cxcl10基因的表达；(C)小鼠大脑中动脉阻塞后立即或24小时后再腹腔注射SN-011(2mg/kg)，连续给药至卒中后第七天，使用转棒实验测定小鼠运动功能的改变；(D)小鼠大脑中动脉阻塞后立即或24小时后再腹腔注射SN-011(2mg/kg)，连续给药至卒中后第七天，使用Morris水迷宫实验测定小鼠记忆功能的改变。每组不少于5只小鼠的实验结果进行统计分析，n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01，给药组与MCAO后给与Vehicle组比较；

图17是化合物SN-011(式I化合物)改善高脂饮食(HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的进展的效应图：(A～B)高脂饮食诱导的小鼠NAFLD模型及给药后各组小鼠血清中ALT和AST含量的变化；(C～D)各组小鼠血清中TC和TG的含量；(E)各组小鼠体重的变化；(F)各组小鼠肝脏重量的变化；(G)各组小鼠内脏脂肪重量(肾周脂肪)的变化；(H～I)各组小鼠肝脏中TC和TG的含量；(J～O)各组小鼠肝脏中Ifnβ,Cxcl10,Mcp-1,Tnfα,Fas和Srebp-1c基因表达的变化；(P)各组小鼠肝脏病理切片的H&E染色结果分析；C57BL6小鼠高脂饮食诱导20周，从第10周开始腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(2mg/kg)进行干预，每组至少8只小鼠的实验结果进行统计分析，n.s.，无显著性差异；*,P<0.05；**,P<0.01,给药组与HFD组比较；

图18是化合物SN-011(式I化合物)对咪喹莫特诱导银屑病样炎症小鼠右耳及背部的影响图：对照组、模型组、SN-011 250mg/kg组和SN-011 50mg/kg组小鼠的外观表现；

图19是化合物SN-011(式I化合物)对咪喹莫特诱导银屑病样炎症小鼠耳厚度的影响图：对照组、模型组、SN-011 250mg/kg组和SN-011 50mg/kg组小鼠右耳厚度，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，n＝8；

图20是化合物SN-011(式I化合物)对咪喹莫特诱导银屑病样炎症小鼠右耳及背部的效应图：A.小鼠耳部皮肤H&E染色图；B.小鼠背部皮肤H&E染色图,比例尺50μm(x200)；C.取小鼠耳部皮肤进行H&E染色，对棘皮厚度进行分析,比例尺20μm(x400)；D.取小鼠背部皮肤进行H&E染色，对棘皮厚度进行分析,比例尺20μm(x400)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.n＝8；

图21是化合物SN-011(式I化合物)抑制STING信号通路激活的作用机制示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明不受到这些实施例的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

1、化学合成试剂、材料

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售获得。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或(和)质谱(MS)来确定的。NMR的测定是用(Bruker)核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

柱层析一般使用青岛海洋化工厂分厂硅胶200-300目硅胶为载体。

本发明的已知起始原料可以采用或按照本领域已知的方法合成，或可购买于乐研、毕得医药、阿拉丁、安耐吉等公司。

2、细胞及细胞培养

本发明所使用的细胞系包括人肾胚细胞HEK293T，小鼠胚胎成纤维细胞MEF和L929，人***细胞Hela，人原代***成纤维细胞HFF等。除特别指出外，所有的细胞使用含有10％胎牛血清(Gibco)及50U/mL盘尼西林和50μg/mL的链霉素(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)培养，L929使用1640培养基培养。骨髓来源的巨噬细胞BMDM由小鼠股骨造血干细胞分化得到。分化时间一般是7天，用含L929上清的条件培养基培养，分化完成后即可进行相应的刺激。

3、小鼠品系及体内药效学、药动学及毒理学评价

6～8周的C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物研究所，Trex1杂合小鼠由Dr.NanYan(University of Texas Southwestern Medical Center)惠赠。纯合基因敲除小鼠由杂合小鼠杂交得到(Cell Reports 2018,25,3405–3421)。BALB/c小鼠(用于抗银屑病药效实验)，雌性，日龄56-62天，由浙江维通利华实验动物有限公司提供。实验中大鼠和小鼠在中国药科大学药物安全评价中心的SPF级动物房饲养。动物实验严格按照中国药科大学动物管理委员会所制定的操作守则执行。

在Trex1^-/-小鼠自发的自身免疫疾病模型中，小鼠从第4周开始腹腔注射待测化合物SN-011，给药剂量是5mg/kg小鼠体重，用终浓度2％的Tween20和2％的DMSO促进化合物溶解，溶解液为PBS，每周注射三次，连续给药30天。

评价SN-011在C57BL6J小鼠体内的药物代谢动力学实验中，腹腔注射5mg/kg SN-011后，分别在0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,24小时取小时的血浆用于血药浓度的检测。

化合物SN-011在小鼠体内的毒理学评价实验使用C57BL6J小鼠腹腔注射1mg/kgSN-011每周三次，连续注射10周，注射完成后检测小鼠血清生化指标及组织器官的病理学变化。

在大鼠中动脉阻塞诱导的急性脑缺血模型中，取体重280-300g的雄性SD大鼠，分别在手术前和手术后12小时给予化合物SN-011，低剂量为1mg/kg，高剂量为3mg/kg。手术后24小时进行相关指标的检测。分别在手术后6小时和24小时对实验组大鼠进行行为学评分。评分规则如下：抓起尾巴只向左侧弯曲为1分。在地上抓住尾巴只向左侧转圈为2分，放开尾巴也只向左侧转圈为3分。左半身瘫痪为4分。

小鼠中动脉阻塞诱导的急性脑缺血模型中，取体重25-30g的雄性C57/6J小鼠，在手术后立即给药或手术后24小时给予化合物SN-011，每天给药1次持续至实验终结，低剂量为1mg/kg，高剂量为2mg/kg。

在高脂饮食(HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中，取4～6周龄的雄性C57BL6J小鼠饲养高脂饲料(research diets，60％Kcal High-Fat Diets,D12492)。高脂饲料喂养10周后，开始腹腔注射化合物SN-011，低剂量为1mg/kg，高剂量为2mg/kg。每周三次给药，连续给药10周，模型组给予含2％的Tween20和2％的DMSO的PBS溶液。第20周给药完成后进行相关指标的检测。

在化合物改善咪喹莫特诱导的银屑病样炎症药效学实验中，BALB/c小鼠，雌性，日龄56-62天，共32只。于普通环境下饲养，自由摄食饮水。化合物SN-011药物软膏的配制：250mg/kg组：1)将560mg化合物SN-011溶于1ml的DMSO中；2)将羊毛脂(11.2g)和凡士林油(11.2g)加入1mL***，在34℃下加热溶解；3)将1)的溶液加入到2)的混合物中，再加入3ml乙醇搅拌均匀，加热若干分钟；4)将溶于0.4ml***的尼泊金甲酯0.05g和尼泊金丙酯0.02g加入到3)的混合物中，用200l***刷洗1-2次再加入混合物中；5)将4)的混合物在88℃下加热60分钟，蒸除乙醇和***，即制得软膏。50mg/kg组：1)将112mg化合物SN-011溶于500l的DMSO中；2)将羊毛脂(11.2g)和凡士林油(11.2g)加入1mL***，在34℃下加热溶解；3)将1)的溶液加入到2)的混合物中，再加入3ml乙醇搅拌均匀，加热若干分钟；4)将溶于0.4ml***的尼泊金甲酯0.05g和尼泊金丙酯0.02g加入到3)的混合物中，用200 l***刷洗1-2次再加入混合物中；5)将4)的混合物在88℃下加热60分钟，蒸除乙醇和***，即制得软膏。将32只BALB/c小鼠按体重随机分为空白对照组(Control组)、模型对照组(Model组)、SN-011250mg/kg组和SN-011 50mg/kg组，每组8只，用剃毛器去除背部毛发，露出2cm×3cm的皮肤区域。5％咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)乳膏(局部剂量62.5mg)每天对右耳及背部给药。实验第一天至第五天，上午造模下午给药，实验第六天至第七天，上午下午均给药，中午造模，实验周期为7天。从咪喹莫特乳膏涂抹造模开始，每天对小鼠进行拍照并观察小鼠右耳及背部情况。每天测量每只小鼠的右耳厚度。取小鼠背部及右耳皮肤标本浸泡于4％多聚甲醛中，石蜡包埋。用苏木精和伊红染色(H&E)。银屑病皮损面积和疾病严重程度(PASI)评分、右耳厚度等均采用graphpad prism 5软件进行数据处理，多组间采用单因素方差分析(One-WayANOVA)处理。

4、小鼠组织切片及相关病理学评价

取小鼠组织切片，H&E染色评价组织的损伤及炎症细胞浸润。具体实验步骤如下：1)小鼠给药周期完成后，取小鼠的各个脏器组织，用4％PFA固定过夜备用；2)取材：将固定后的组织按观察部位的需要对组织横截面进行相应的修整，放入包埋框内，梯度脱水；3)脱水完成后，用石蜡包埋组织，保存组织样本的蜡块；4)修片：修出完整的组织切面后即可切片，切片的厚度为5μm；5)将切片放在水上展片后，用玻片捞起，56℃烘片使样本上的石蜡溶解；6)梯度复水后H&E染色，梯度脱水，封片，保存；7)正置显微镜下观察组织的病理变化，拍照记录即可。

5、血清生化指标的检测

小鼠血清的生化指标包括ALT,AST,TC,TG,GLU,BUN和CREA，上述指标检测均在中国药科大学药物安全评价中心使用Dimention X-Pand plus生化分析仪检测。

6、小鼠肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量的检测

小鼠肝脏中的TC和TG的含量使用TG含量检测试剂盒(solarbio,BC0625)和TC含量检测试剂盒(solarbio,BC1985)按照说明书要求进行检测。

7、脾脏T细胞含量的检测

流式细胞术检测SN-011对Trex1^-/-小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺T细胞含量的影响。实验步骤如下：1)脾细胞过200目的滤网上后用10ml的PBS冲洗滤网上的细胞至离心管内，重悬细胞，1200rpm离心5分钟；2)用4ml的红细胞裂解液裂解细胞；3)封闭，每管加入20μl的Fcblocking，4℃封闭10分钟，1200rpm离心后，PBS洗一次，PBSA(1％BSA in PBS)重悬细胞；4)抗体染色，抗体1:100稀释到PBSA内混匀后与细胞混合，Antibody mix for T memorycells(CD4-FITC,CD8-PE,CD44-APC,CD62L-Brilliant Violet 421)，Antibody mix for Tactivator cells(CD4-FITC,CD8-PE,CD69-APC)；5)抗体加入后混匀，4℃避光孵育30分钟后加入PBS洗一遍，用500μl的PBS重悬即可上机(Attune NxT cytometer,Thermo Fisherscientific)检测相应T细胞亚型含量。

8、小鼠血清中自身免疫抗体的检测

使用ANA(HEp-2)antigen substrate slide kit(MBL-BION)检测试剂盒检测血清抗核抗体(ANA)方法如下：1)从试剂盒里取出铺满HEp-2细胞的基质片，室温下平衡；2)用2％BSA in PBS 1:50稀释血清后用其孵育HEp-2细胞，室温反应30分钟后用PBS洗去血清；3)用吸水纸将孔径周围的水吸干，加上FITC标记anti-mouse IgG二抗，室温反应30分钟后用PBS洗去二抗；4)用防荧光猝灭的封片剂Dako封片，镜检。

9、分子对接法筛选结合STING蛋白的小分子化合物

hSTING-CTD结晶结构PDB:4EF5用于分子对接筛选，分子对接的软件使用DOCK3.7，虚拟筛选使用小分子虚拟数据库ZINC15(http://zinc15.docking.org)。本实验所使用柔性对接程序计算小分子配体和蛋白受体间的分子能量状态energy score，即通过打分的方式评价小分子与受体间的范德华能和静电能量。实验过程如下：1)蛋白晶体结构：从PDB数据库中选取hSTING-CTD结构文件4KSY，删除蛋白上存在的配体后，在Dock Pre框架下去除结构中的金属离子、溶剂分子并在结构上加上氢原子和电荷完成受体蛋白分子的准备；2)配体小分子的准备：从ZINC15中下载包含小分子结构的数据后，用Marvin软件在小分子结构中加氢后用Corina软件将小分子转化为3D空间结构，小分子单体能量状态用AMSOL软件计算；3)将准备好的配体和蛋白晶体文件上传到计算机服务器上；4)在2’,3’-cGAMP与蛋白结合的口袋处产生Grid用于评价该空间区域内的能量状态；5)计算格点能量状态：AMBER用于计算范德华能，QNIFFT用于计算静电能量；6)虚拟筛选：将数据库中的小分子结构在受体格点的口袋内进行分子对接，查看对接结果，判断蛋白和化合物结合的可能性。

10、细胞活力的评价

检测化合物在细胞中的毒性作用，使用Promega的Cell Proliferation Assay试剂盒检测。实验过程如下：1)根据细胞生长速度的快慢不同，将不同个数的细胞提前一天点至96孔板内；2)待细胞长至合适的密度75％以上时，分别孵育不同浓度的化合物相应的时间；3)化合物孵育完成后每孔加入20μl的MTS工作液反应1小时后，在490nm的波长处检测吸光值并计算化合物对细胞生存率的影响。

11、细胞的转染

将目的质粒转染进细胞内的表达方法有两种，氯化钙-HEPES钙转体系和脂质体转染体系，钙转主要针对293T细胞，脂质体转染主要将ISD，HT-DNA等刺激物转入细胞质内。钙转方法如下：待细胞长至密度为70％左右时开始钙转，将目的质粒与CaCl₂混匀后加入HEPES溶液吹打混匀，然后逐滴滴加入细胞内，转染24小时使质粒在细胞内表达。脂质体转染方法如下：将刺激物与lipo 2000以1：1的比例分别加入到Opti-MEM溶液中，静置5分钟后将刺激物加入lipo2000溶液内，混匀加入细胞内，即可完成转染。刺激6小时后，收取细胞即可进行后续实验操作。

12、CDNs激活细胞内STING信号通路

细胞在培养板中贴壁生长，孵育相应浓度的待测化合物过夜，孵育完成后用含有50mM HEPES(pH＝7.0)，100mM KCl，3mM MgCl₂，0.1mM DTT，85mM蔗糖的缓冲液，溶解CDNs刺激物，以及(0.2％(m/v)BSA，1mM ATP，0.1mMGTP,10μg/ml Digitonin)，配成工作液孵育细胞透膜，使CDNs分子进入细胞质中，进而激活内质网上的STING蛋白，CDNs刺激细胞3小时后收取细胞检测相关基因的表达。

13、检测化合物在细胞中的半数抑制率(IC₅₀)

HFF细胞在培养板中贴壁生长，待细胞长至80％丰度时开始化合物的孵育，分别孵育待测化合物(化合物溶于DMSO中，化合物在培养基中的初筛终浓度：1和10μM。IC₅₀测试浓度：5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.078125，0.039μM)过夜，空白对照组只加DMSO。孵育完成后用含有2'3'-cGAMP刺激物的洋地黄皂苷溶液(2'3'-cGAMP终浓度：1μg/mL)处理细胞，使2'3'-cGAMP分子进入细胞质中，进而激活内质网上的STING蛋白，2'3'-cGAMP刺激细胞3小时后收取细胞，检测Ifnb基因的表达。化合物在1和10μM浓度下对2'3'-cGAMP刺激后STING信号通路的抑制率依据Ifnb基因表达倍数计算得到：1-[Ifnb(化合物组)/Ifnb(DMSO组)]。IC₅₀值按照化合物处理组相对DMSO空白对照组抑制Ifnb基因表达的比率曲线拟合得到。

14、质粒构建

STING，TBK1，IRF3，cGAS相关的序列信息在NCBI的Genbank中查询，质粒的cDNA用PCR的方法从胸腺cDNA文库中获得，并克隆到相应的真核表达载体中得到相应的质粒。所有质粒的点突变体均使用QuickChange XLsite-directed mutagenesis methods(Stratagene)。质粒的克隆方法如下：1)设计对应质粒片段的克隆引物，保护碱基-酶切序列-目标引物(20-25bp)；2)使用DNA聚合酶KOD对目的基因序列进行PCR扩增；3)扩增的DNA产物琼脂糖凝胶回收；4)回收产物和使用的载体进行双酶切和连接；5)连接产物涂板，挑取阳性克隆，抽取质粒测序比对目的基因序列的正确性即完成质粒的克隆。

15、免疫印迹法检测目的蛋白的表达

免疫印迹法(western blot)的实验流程如下：1)细胞用蛋白裂解液(0.5％TritonX-100，1mM EDTA,1％Cocktail溶解于TBS缓冲液)裂解后高速离心，取上清蛋白裂解液检测蛋白浓度，利用BCA法检测蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度后，根据蛋白浓度拉平样本的体积和浓度；2)样本中加入5×loading buffer制样，根据目的蛋白分子量大小跑相应浓度的SDS-PAGE凝胶；3)转膜，将凝胶上分离的蛋白湿转至PVDF膜上；4)封闭，普通蛋白用5％脱脂牛奶封闭，磷酸化蛋白用5％BSA封闭；5)一抗孵育，抗体按照相应的浓度稀释后4℃孵育2小时或过夜后用TBST缓冲液洗6遍，每次6分钟，以洗去非特异性吸附；6)二抗孵育，对应属性的二抗按照相应的浓度稀释后室温孵育1小时后，用TBST缓冲液洗6遍，每次6分钟，以洗去非特异性吸附；7)显色，ECL发光液孵育后用Bio-Rad的ChemiDoc检测蛋白的化学发光条带即可反应蛋白的表达。

16、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的二聚化和多聚化表达水平

实验方法如下：1)配置相应浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中不含SDS；2)将配置好的非变性胶在缓冲液(25mM Tris,192mM Glycine,pH8.4，内槽液中加入0.2％的脱氧胆酸钠)中以40mA预电泳30分钟，用电泳液平衡非变性胶；3)细胞用蛋白裂解液(0.5％TritonX-100，1mM EDTA,1％Cocktail溶解于TBS缓冲液)裂解后，加入5×native的上样缓冲液制样；4)电泳条件为25mA恒流1-1.5小时，后续按照标准的免疫印迹法检测即可。

17、免疫共沉淀法检测蛋白质间的相互作用

蛋白质的相互作用用免疫共沉淀法(Co-IP)检测方法如下：1)向细胞内加入蛋白裂解液(0.5％TritonX-100，1mM EDTA,1％Cocktail溶解于TBS缓冲液)裂解后超声至细胞裂解液澄清，4℃13000rpm离心15分钟，收取上清蛋白液；2)特异性识别目的蛋白，向蛋白裂解液中加入目的蛋白抗体1μl，4℃摇匀4小时孵育；3)钓取目的蛋白，向蛋白裂解液中加入预制好Protein G Agarose20μl放回4℃继续孵育2小时，使Beads与抗体结合，用缓冲液(0.5％TritonX-100，1mM EDTA)洗去agarose上的非特异性吸附蛋白；5)制样，向管内加入蛋白5×loading buffer，95℃6分钟使蛋白变性，后续按标准的免疫印迹法检测兴趣蛋白的表达，即可判断出目的蛋白和兴趣蛋白有无存在相互作用。

18、免疫荧光

细胞的免疫荧光实验操作如下：1)将细胞铺在盖玻片上生长至合适的密度；2)细胞进行对应的化合物孵育与刺激后加入4％多聚甲醛室温固定1小时，PBS洗两遍后用破膜缓冲液(0.25％Triton，1mM EDTA溶解于PBS)透膜20-30分钟；3)将玻片转移至暗合内，加入封闭液(5％BSA溶解于PBS)封闭至少1小时后孵育上相应检测蛋白的一抗(1:1000稀释于PBST)，4℃过夜；4)一抗孵育完成后，加PBS洗去非特异性吸附后加入荧光标记的二抗，室温避光孵育1小时；5)孵育完成后用DAPI染细胞核1分钟；6)核染后，使用防荧光淬灭剂封片，避光保存，激光共聚焦显微镜Carl Zeiss LSM700的63x NA1.4油镜下观察细胞内蛋白的荧光分布。

19、His-hSTING-CTD(149-379)蛋白的原核表达和纯化

在大肠杆菌表达目的蛋白片段的实验方法如下：1)构建包含目的蛋白片段的表达载体质粒His-STING-149-379；2)1μg质粒经转化，转接，18℃下用终浓度0.5mM的IPTG诱导蛋白在大肠杆菌中大量表达；3)用缓冲液(25mM Tris8.0，150mM NaCl,pH＝8.0)细菌收取后，超声破碎细菌15分钟，至菌液稍澄清即可；4)高速离心(18000rpm，30分钟)，收取上层蛋白液；5)挂1.5ml Ni柱吸附目的蛋白至Ni柱上，随后洗去非特异性结合；6)过梯度咪唑，80mM，250mM，500mM的梯度咪唑将目的蛋白从Ni-NTA Agarose上洗脱下来；7)跑SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色，检测目的蛋白的表达；8)收集目的蛋白溶液，用50KD超滤管浓缩蛋白溶液后将浓缩蛋白液过Akata蛋白纯化***，将杂蛋白除去后收取目标蛋白；9)用于结晶实验的His-STING-149-379蛋白预先用TEV酶切His-tag标签后，过分子排阻色谱柱纯化无标签的目的蛋白后浓缩至15mg/ml的浓度；10)纯化后的目的蛋白浓缩至合适的浓度，分装，液氮速冻后置于-80℃保存。

20、SN-011与hSTING-CTD(149-379)蛋白共结晶及数据的处理与结构解析

15mg/ml的STING-CTD(149-379)蛋白溶解在25mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl的溶液中，在100μL的蛋白溶液中加入1μL的SN-011(50mM)，孵育1小时后，高速离心取上清蛋白液用于结晶。使用悬滴法将1μL的蛋白液与1μL的池液(0.1M HEPS-NaOH,pH 7.0,0.1Msodium formate,25％PEG3350)混合，在16度环境中使晶体生长，晶体长成后用含30％PEG3350的冻存液将捞取的晶体在液氮中保存。X射线衍射在上海国家光源中心进行，衍射数据的收取，整合和处理使用HKL3000软件，以apo-STING(PDB:4F5W)为模版使用分子替换的方法进行结构的解析。共结晶结构使用COOT软件进行调整并使用CCP4软件进行结构的精修。

21、表面等离子共振技术(SPR)检测SN-011与His-STING-CTD(149-379)蛋白间的亲和力

SPR实验温度25℃，实验仪器为Biacore T200 SPR instrument(GEHealthcare)。纯化的2μg/ml hSITNG-CTD蛋白及其突变体在ph＝5.5条件下，使用Amine Coupling Kit固定在Sensor Chip CM5(carboxymethylated dextran surface)芯片上。SN-01梯度稀释(nM)：15.6,7.81,3.91,1.85,0.93和cGAMP梯度稀释(nM)：125,62.5,31.3,15.6,7.81，以30μl min^-1的速度流经芯片表面,结合解离时间都是90s。实验中使用的缓冲液都是含有0.05％Tween 20的PBS。所有数据都在相同的条件下重复了两次。最终亲和力数据利用软件Biacore T200 Evaluationsoftware version 3.0(GE Healthcare)中的1:1结合模型拟合得到。

22、转棒试验(Rotarod test)

用XR1514型号的大小鼠转棒疲劳测试仪(购自上海欣软信息科技有限公司)进行检测，设置转速为24r/min，最长记录时间为5min，超5min一律登记为5min。在正式实验前先将小鼠训练3次。正式实验为记录小鼠在转棒上的运动时间，测试3次取平均值为最终结果。

23、Morris水迷宫测试

1)将小鼠头朝池壁放入水中，将平台置于第四象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。记录动物找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导小鼠到平台。让其在平台上停留10s.

2)将小鼠移开、擦干。每只小鼠每天从不同象限入水训练，两次训练之间间隔15～20min，连续训练5天。

3)最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练。将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录小鼠在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和和运动路程占总时间和运动路程的比例，以此作为空间记忆的检测指标；

24、RNA抽提及实时荧光定量PCR技术检测目的基因的表达

细胞或组织中总RNA的抽提过程如下：1)取适量的细胞和组织用TRIzol(Invitrogen)充***解后，1:5加入氯仿萃取裂解液中的RNA，4℃12000g 15分钟离心；2)上层水相溶液中加入相同体积异丙醇将溶液中的RNA沉淀下来；3)RNA沉淀用1ml 75％的乙醇洗去杂质；4)RNA干燥透明后用适量的DEPC水55℃溶解，OD260处检测RNA浓度。总RNA抽提完成后即可用于后续的荧光定量PCR检测目的基因的表达，实验步骤如下：RNA与引物OligodT混合后在反转录酶试剂盒的作用下转录成cDNA，cDNA与目的基因的引物以及DNA聚合酶和荧光染料FastStart Universal SYBR GREEN MASTER MIX(Roche)混合后，在ABIQuantStudio 3仪器中进行扩增和检测，GAPDH为基因表达的内参，2^-ΔΔCT法进行相对定量计算目的基因的表达。检测目的基因所使用的引物序列见下表1：

表1、qPCR primer sequences

25、RNA-Sequencing

从6～8周WT或Trex1^-/-的小鼠的大腿股骨中分离骨髓细胞后，使用含L929上清的条件培养基将细胞诱导分化至BMDMs。诱导完成后按实验组别设计分别孵育SN-011(500nM)12小时，提取细胞中RNA并按照标准的Illumina RNA-seqprotocol将RNA整合至cDNA文库。产生的cDNA文库用Illumina HiSeq2000以1×100 bp run进行测序，测序结果处理后与小鼠的基因组进行比对，做热图反应基因表达的差异并进一步聚类分析。

实施例1

N-(3-((4-氟苯基)磺酰氨基)-4-羟基苯基)-[1,1'-联苯]-4-甲酰胺(化合物I)

将化合物1(2.00g,13.0mmol)和吡啶(1.54g,19.5mmol,1.57mL)溶解在40mL的二氯甲烷中，在0℃条件下逐滴加入溶解在20mL二氯甲烷中的4-氟苯磺酰氯1A(3.04g,15.68mmol)，混合后在25℃搅拌反应12小时。随后用薄层色谱法(TLC)鉴定反应完全，流动相为石油醚:乙酸乙酯＝2:1。溶剂在减压下蒸发除去，粗产物用硅胶色谱柱纯化(流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:1～2:1，V/V)，得淡黄色固体产物化合物2(2.74g,67.6％收率)。¹HNMR:(DMSO-d₆,400MHz)δ8.04(d,J＝2.4Hz,1H),7.94～7.92(m,1H),7.83～7.80(m,2H),7.41～7.37(m,2H),6.89(d,J＝8.8Hz,1H).LCMS(m/z):312.02[M+H]⁺.

将化合物2(1.50g,4.80mmol)溶解在15mL的甲醇中，加入10％Pd/C(0.1g)，在25℃氢气氛围下反应16小时，反应产物用LC-MS鉴定判断反应完全。反应液用硅藻土填充柱过滤，减压除去溶剂，得1.4g黄色固体产物化合物3。¹H NMR:(DMSO-d₆,400MHz)δ8.44(br.s,1H),7.81～7.77(m,2H),7.37～7.33(m,2H),6.51(d,J＝2.4Hz,1H),6.42(d,J＝8.4Hz,1H),6.19(dd,J1＝2.4Hz,J2＝8.4Hz,1H),4.60(br.s,1H),3.17(s,1H).LCMS(m/z):282.05[M+H]⁺.

在10mL二氯甲烷中溶解990mg的化合物3，随后加入229mg的咪唑并逐滴滴入溶解在1mL二氯甲烷中的507mg的TBSCl(叔丁基二甲基氯硅烷)。反应在15℃条件下搅拌12小时，LC-MS鉴定反应产物判断反应完全。反应液用水(20mL x 3)洗，无水Na₂SO₄干燥，在减压条件下将溶剂蒸除。粗产物用Al₂O₃填充色谱柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇＝10:1，V/V)，得红棕色固体化合物4。¹H NMR:(CDCl₃,400MHz)δ7.78～7.75(m,2H),7.10～7.06(m,2H),6.97(d,J＝2.8Hz,1H),6.78(s,1H),6.52(d,J＝8.4Hz,1H),6.28(dd,J1＝2.8Hz,J2＝8.8Hz,1H),3.48(s,2H),0.93(s,9H),0.08(s,6H).LCMS(m/z):396.13[M+H]⁺.

在5mL的二氯甲烷中加入185mg的化合物4A，215mg EDCl(1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐)，139mg HOBt(1-羟基苯并三氮唑)和181mg的DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)，最后加入370mg的化合物4。反应在15℃条件下搅拌16小时，LC-MS鉴定反应产物判断反应完全。反应产物用10mL的二氯甲烷稀释，用水(20mL x 3)洗，无水Na₂SO₄干燥，在减压条件下将溶剂蒸除，得400mg红棕色固体粗产物化合物5，不经纯化直接用于后续反应。

在15mL的二氯甲烷中加入630mg的化合物5和176mg的Et₃N.3HF，反应在15℃条件下搅拌3小时，LC-MS鉴定反应产物判断反应完全。向反应液中加入25mL的二氯甲烷稀释，用水(20mL x 2)洗，无水Na₂SO₄干燥，在减压条件下将溶剂蒸除。残余物用硅胶色谱柱法纯化(流动相为石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，得类白色固体化合物I(260mg,51.5％收率)。¹H NMR:(DMSO-d₆,400MHz)δ10.13(s,1H),9.38(s,2H),8.03(d,J＝8.4Hz,2H),7.83～7.71(m,7H),7.51～7.35(m,6H),6.70(d,J＝8.8Hz,1H).LCMS(m/z):462.10[M+H]⁺.

实施例2

N-(3-((4-氟苯基)磺酰氨基)-4-甲氧基苯基)-[1,1'-联苯]-4-甲酰胺(化合物II)

将化合物6(0.54g,3.2mmol)，吡啶(0.5mL)加入二氯甲烷(10mL)中，冰水浴下滴加4-氟苯磺酰氯(1A：0.744g,3.84mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，滴毕，室温反应8h。减压蒸除溶剂，加入乙酸乙酯(50mL)和水(20mL)，摇匀分液，有机相分别用1N HCl(10mL)、水(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸除溶剂得残留物，粗产物用硅胶色谱柱纯化(流动相为石油醚:乙酸乙酯＝10:1～2:1，V/V)，得淡黄色固体产物化合物7(0.74g,71％)。

将化合物7(0.5g,1.53mmol)，10％Pd/C(50mg)加入MeOH(20mL)中,H₂氛围反应12h。滤除Pd/C，用MeOH洗涤滤饼，滤液减压蒸除溶剂，得黄褐色固体产物化合物8(0.43g)。

将化合物4A(119mg,0.60mmol)和DIPEA(0.16mL,0.96mmol)加入THF(4mL)中，加入HATU(O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(291mg,0.77mmol)，室温反应1h后，加入化合物8(237mg,0.80mmol)，室温反应5h。加入乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)，分液，有机相分别用1N HCl(5mL)、水(10mL)和饱和食盐水(10mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸除溶剂得残留物，经硅胶柱层析纯化(流动相为石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，得类白色固体化合物II(117mg,41％)。¹H NMR:(DMSO-d₆,400MHz)δ10.25(s,1H),9.59(s,1H),8.15(d,J＝8.4Hz,2H),7.87～7.73(m,7H),7.65～7.35(m,6H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H)，3.48(s,3H).LCMS(m/z):477.5[M+H]⁺.

实施例3

4-([1,1'-联苯基]-4-甲酰胺基)-2-((4-氟苯基)磺酰氨基)苯基乙酸酯(化合物V)

将由实施例1制备的化合物I(200mg,0.43mmol)溶于THF(5mL)，加入吡啶(52μL,0.65mmol)，室温下滴加乙酰氯(37μL,0.52mmol)，室温反应10h。用水(10mL)淬灭，EtOAc(30mL)提取，有机相依次用1N HCl(10mL)、水(10mL)和饱和食盐水(10mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得白色固体，经硅胶柱层析(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得白色固体即化合物V(76mg,35％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm 10.39(s,1H),10.01(s,1H),8.06(d,J＝8.3Hz,2H),7.96(d,J＝2.2Hz,1H),7.86-7.8(m,4H),7.77(d,J＝7.4Hz,2H),7.62(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.52(dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.44(d,J＝5.3Hz,1H),7.40(dd,J＝7.9,7.9Hz,2H),7.01(d,J＝8.8Hz,1H),2.14(s,3H).ESI-MS:m/z 461.1[M-CH₃CO]^-.

实施例4

4'-((3-((4-氟苯基)磺酰氨基)-4-甲氧基苯基)carbamoyl甲酰胺基)-[1,1'-联苯基]-4-基乙酸酯(化合物III)

参照实施例2的方法制得化合物III：ESI-MS:m/z 491.3[M-CH₃CO]^-.

实施例5

N-(4-甲氧基-3-(苯磺酰胺基)苯基)-[1,1'-联苯基]-4-甲酰胺(化合物IV)

参照实施例2的方法制得化合物IV：ESI-MS:m/z 459.1[M+H]⁺.

实施例6

基于STING蛋白晶体结构的虚拟筛选及体外活性评价

本发明基于人源STING蛋白C端结构域晶体结构的解析(hSTING-CTD-139-379,PDB:4EF5)，进行了计算机模拟筛选潜在的与STING结合的小分子。使用DOCK3.7软件将ZINC15(http://zinc15.docking.org)虚拟化合物数据库中小分子与hSTING-CTD结构进行对接筛选，筛选完成后共有152个小分子响应hSTING-CTD的结合。通过分析筛选出的小分子化合物发现有一类含有1-磺胺-3-酰胺-苯环骨架结构的小分子化合物对hSTING-CTD结构具有很好的响应性。在此基础上，从EnamineStore公司购买了具有此特征结构的小分子化合物进行体外生物学活性评价。结果发现，在DNA类似物ISD或HT-DNA等诱导刺激的MEF细胞或L929细胞中，式I化合物(SN-011)、式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)能够显著抑制Ifnb等免疫炎症因子基因的表达(图1A，图2A～2H，图3A，图3C，图3E)，且不影响静息状态下Ifnb基因的表达(图1B)。化合物SN-100(CAS:1384744-19-7)不影响ISD诱导的MEF细胞中IFN-β基因的表达，因此，选择此化合物作为阴性对照化合物用于后续的实验。此外，在HT-DNA刺激的L929细胞中，SN-001显著抑制STING，TBK1，IRF3，P65，IκBα的磷酸化表达和IRF3蛋白的二聚化(图2I)，随后转录因子IRF3和P65的入核在孵育化合物后也显著降低(图2J～2K)，而阴性对照化合物SN-100均不影响上述蛋白的磷酸化表达与转录因子的入核。为了排除SN-001的细胞毒性对其生物学活性的影响，在MEF，L929和THP-1细胞中用MTS法检测化合物对细胞活力的影响，结果表明，SN-001(5μM～20μM)孵育至24小时均不影响细胞的活力(图2L～2N)。图1C和图3B显示了通过虚拟筛选后所购买的部分化合物的结构。需要说明的是，图1A和1B中的化合物ZINC72311784等化合物均为商业购买的化合物(有些化合物的结构并未显示)。图1和3中部分化合物的CAS号如下：SN-001/ZINC08686914(CAS:727699-84-5)、SN-003/ZINC15418850(CAS:1385921-05-0)、SN-004/ZINC00991157(CAS:681834-84-4)、SN-007(CAS:568569-75-5)、SN-008(CAS:2249106-01-0)、SN-100/ZINC78992473(CAS:1384744-19-7)。

在MEF细胞中，使用STING信号通路的经典激动剂ISD,HT-DNA,HSV-1,c-di-GMP和2’3’-cGAMP进行刺激，预孵育化合物SN-011(式I化合物)能显著下调上述刺激物诱导的Ifnb,Cxcl10和Il-6基因的表达(图3C～3E)。

进一步通过评价SN-011(式I化合物)在不同细胞中的半数抑制率(IC₅₀)研究化合物的体外生物活性。在MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)，BMDM(小鼠骨髓原代巨噬细胞)和HFF(人原代***成纤维细胞)中，SN-011的IC₅₀数值分别为127.5±5.5nM,121.7±32.2nM和502.8±94.5nM(图4A～4C)。SN-011在体外同样具有很好的安全性，具体表现为在MEF，BMDM和HFF细胞中孵育化合物最高至20μM的浓度至48小时，均不表现出对细胞活力的影响(图4D～4F)。在STING敲除的MEF细胞中，预孵育SN-011并不影响LPS,CpG-DNA,poly(I:C)和SendaiVirus激活的IFR3和NF-κB下游基因Ifnb,Tnf-α和Il-6的表达(图5A～5B)。此外，预孵育SN-011也不影响Ifnβ激活STING敲除MEF细胞中Isg15和Isg56基因的表达(图5B)。

以上结果表明，本发明的式I～V化合物能高效、安全且特异性地抑制cGAS-STING信号通路的激活。

实施例7

SN-011(式I化合物)抑制STING蛋白的激活及其介导的下游信号传导

静息状态下STING蛋白以同源二聚体的形式以其N端跨膜区(amino acid1-137)锚定在内质网上，当STING与其配体CDNs分子如2’,3’-cGAMP结合后，STING二聚体的空间构象发生变化，具体表现为C端结构(amino acid 138-379)相对于跨膜区发生180°的旋转后，以并肩排列的方式多个二聚体分子形成四聚体及更高的多聚体形式(Nature,2019,567(7748):389-393)。多聚化的STING蛋白由内质网向高尔基体转移，在此过程中STING多聚体以其C末端区域的PLPLRT/SD序列招募激酶蛋白TBK1并促进TBK1(Ser172)的自身磷酸化激活(Nature,2019,567(7748):394-398；Nature,2019,569(7758):718-722)。激活的TBK1进一步磷酸化STING多聚体pLxIS366序列中的丝氨酸，进而促进转录因子IRF3的招募，IRF3招募到多聚体复合物后进一步被TBK1磷酸化激活(Science,2015,347(6227):aaa2630；Proceedings of the National Academy of Sciences,2016,113(24):E3403-E3412)，这就是蛋白水平STING的激活及其介导下游信号传递的过程。以此为依据，本发明发现，预孵育SN-011能显著抑制2’,3’-cGAMP诱导的HFF细胞中STING的多聚化、磷酸化(图6A)及其向高尔基体上的转移(图6E)。此外，SN-011能显著减少STING蛋白对下游TBK1和IRF3的招募(图6B)，与之一致的是2’,3’-cGAMP诱导的TBK1,IRF3,P65和IκBα蛋白的磷酸化和IRF3的二聚化水平(图6C)及IRF3的入核在HFF细胞预孵育SN-011后显著降低(图6D)。相比之下，阴性对照化合物SN-100并不影响上述蛋白水平的变化。作为对照，进一步检测SN-011在细胞静息状态下对cGAS，STING,TBK1和IRF3蛋白稳定性的影响，结果表明，SN-011不影响HFF细胞内上述蛋白的基态表达(图5C)，以及cGAS基因(MB21D1)和STING基因(TMEM173)的表达(图5D～5E)。这表明SN-011的作用机制是通过直接影响蛋白质的功能而不是影响STING信号通路蛋白的稳定性。以上研究表明，SN-011能抑制细胞内STING蛋白的激活及其介导的下游信号传导。

实施例8

SN-011(式I化合物)与STING-CTD(149-379)蛋白的共结晶结构

为了研究化合物SN-011与STING蛋白结合的结构基础，本发明获得并解析了SN-011与STING-CTD(149-379)蛋白的共结晶结构，分辨率为

C末端区域(amino acid341-379)在共结晶结构中不可见可能是由于该段结构空间不稳定性。在共结晶结构中每一个对应的结构单元包含两个STING蛋白单体形成的同源二聚体和在蛋白二聚体CDNs结合口袋中的结合的两个SN-011分子(图7A)。从结构上看，SN-011分子反相平行地结合在STING二聚体表面，小分子结构上的联苯环结合在二聚体口袋的底部，4-氟-苯磺胺基团延伸到蛋白二聚体口袋的顶部。与apo-STING-CTD蛋白的结晶结构相似，STING-CTD(149-379)与SN-011结合后仍维持“V”字型的二聚体结构，且在口袋两侧的His185氨基酸的距离为

(图7B)。相比之下，STING-CTD蛋白结合2’3’-cGAMP和c-di-AMP后其口袋两侧的单体会在小分子的牵引下相互接近，使蛋白二聚体口袋变成封闭的“U”型且在口袋两侧的His185氨基酸的距离缩短至为

(图7C)(Cell,2019,178:1-12)。随后，进一步分析了SN-011结合后STING-CTD蛋白在晶格中堆积的方式，共结晶结构以类似“头尾对应”的方式堆积在晶格中(图7D)，这种堆积方式也出现在未激活的STING结构中(ACS Med Chem Lett,2019,10(1):92-97)，且此堆积方式明显不同于2’3’-cGAMP和c-di-AMP结合后STING-CTD蛋白在晶格中的“并肩排列”的堆积方式(Nature,2019,567(7748):389-393)。综上所述，在与SN-011分子结合后，STING蛋白的空间构象并未发生显著变化，仍维持其在静息状态下的二聚体构形。

进一步的结构解析表明，SN-011通过与STING蛋白二聚体口袋内的特定氨基酸形成氢键和堆积作用而稳定在口袋内。SN-011结构中的联苯环与蛋白Tyr167氨基酸侧链的苯环形成π-π堆积作用。SN-011结构中连接酚羟基的苯环同样能与周围的Glu260和Ser241氨基酸形成共轭或氢键作用而稳定。而SN-011中的酚羟基和磺胺键能进一步与Ser243氨基酸侧链上的羟基形成氢键作用(图7E)。据此，本发明解析的SN-011与STING蛋白的共结晶结构不仅明确了该化合物在蛋白中结合的位置，也提供了二者相互作用的方式和结合位点信息。

以上结果表明，本发明的化合物能通过直接结合STING蛋白并维持其静息状态下的二聚体构象而抑制STING信号通路的激活。

实施例9

突变与SN-011(式I化合物)结合的氨基酸位点影响小分子的结合及其发挥的生物活性

为了进一步确定由共结晶结构分析出的氨基酸位点对SN-011结合的影响，用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)检测相关氨基酸位点突变后对小分子与蛋白间亲和力的影响。SPR的检测结果表明，SN-011与hSTING-CTD蛋白间的亲和力约为4.03nM，优于2’3’-cGAMP与之结合的亲和力(Kd～9.23nM)。值得注意的是，hSTING-CTD结合位点的单突变体S243A和三突变体蛋白S241A,S243A和T263A显著减弱hSTING-CTD与SN-011间的相互作用，Kd分别为176.2nM和1.36μM(图8A～8E)。hSTING-CTD-Y167A和hSTING-CTD-E260A在大肠杆菌中由于溶解性问题无法纯化，所以在此实验体系中无法评价Y167和E260对小分子与蛋白间亲和力的影响。

随后，在HEK293T细胞中过表达hSTING蛋白及其相关点突变体蛋白以评价结合位点突变后对SN-011的生物学活性的影响。实验结果表明，相比于野生型hSTING，SN-011对其点突变体S241A，S243A，T263A和3A诱导的IFN-β基因表达的抑制活性显著降低，且在2’3’-cGAMP刺激条件下突变上述氨基酸位点同样能减弱SN-011的抑制活性(图8F～8I)。hSTING-Y167A和hSTING-E260A突变体在HEK293T细胞中过表达后并不能激活下游IFN-β基因表达，也不响应外源2’3’-cGAMP刺激(图8G，8I)，所以也无法评价这两个位点突变对SN-011生物活性的影响。以上研究结果表明，本发明化合物通过几个关键氨基酸残基(Tyr167、Glu260、Ser241和Ser243)与STING蛋白结合，进而抑制STING信号通路的激活。因此，本发明式I～V所示的苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于制备抑制STING信号通路激活的药物。

实施例10

SN-011(式I化合物)改善TREX1^-/-自身免疫疾病小鼠的***性炎症损伤

TREX1在细胞质内发挥核酸外切酶的作用，用于降解细胞质中异常ssDNA，当其基因突变导致蛋白丧失正常酶的功能后，细胞质中聚集的DNA能激活胞浆的cGAS-STING信号通路，诱导I型IFNs的表达，促进细胞炎症的发生。在动物模型上发现，将小鼠cGAS或STING蛋白的表达敲除后能显著改善TREX1突变诱导各组织器官的炎症病变程度和疾病的致死(Nat Genet,2007,39(9):1065-7；Cell,2008,134(4):587-98)。以此为依据，本发明在Trex1^-/-小鼠体内评价SN-011对***性炎症损伤的潜在药效学活性。首先，在Trex1^-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中孵育化合物SN-011后，用RNA-Seq技术检测对细胞内mRNA转录本进行分析，实验结果表明：(1)在野生型(WT)小鼠BMDMs中，孵育SN-011并不能显著影响细胞静息状态下ISGs基因的表达；(2)相比于WTBMDMs细胞，Trex1^-/-BMDMs细胞中的ISGs表达水平显著升高，且在孵育SN-011后能显著抑制相关ISGs基因的表达；(3)进一步分析细胞转录本基因表达的变化发现，SN-011在细胞内主要影响的也是ISGs基因的表达，从侧面说明该化合物作用的特异性(图9A)。随后，使用qPCR技术检测细胞内Ifnb,Cxcl10,Isg15和IL-6基因的表达情况，检测结果也进一步验证了化合物SN-011对Trex1^-/-BMDMs细胞中ISGs基因表达的抑制作用(图9B～9E)。

在体外研究基础上，将SN-011(5mg/kg)腹腔注射到Trex1^-/-小鼠体内，在持续1个月的给药后检测小鼠心脏、胃、舌头和肌肉的炎症浸润。结果表明：(1)相比于野生型(WT)小鼠，Trex 1^-/-小鼠心脏、胃、舌头和肌肉的免疫(Ifnβ,Cxcl10,Isg15)和炎症因子(Il6)基因都有显著的上升；(2)在野生型小鼠中给予化合物SN-011不影响上述组织中免疫和炎症因子基因的表达；(3)相比于Trex 1^-/-的自身免疫疾病模型组，给予化合物SN-011能显著降低Trex 1^-/-小鼠心脏、胃、舌头和肌肉的免疫(Ifnβ,Cxcl10,Isg15)和炎症因子(Il6)基因的表达(图10A～10D)。进一步对上述组织器官进行病理切片评价组织的炎症损伤，结果表明，SN-011能显著改善Trex 1^-/-小鼠组织的炎症损伤和免疫细胞浸润(图10E)。取实验组小鼠的脾脏分散脾脏细胞后进行T细胞抗体染色，流式细胞仪检测T细胞亚型含量。检测结果表明：相比于对照的Trex1^-/-小鼠，腹腔注射化合物SN-011能显著降低激活的CD8 T(CD69⁺)细胞和记忆的CD4 T(CD62L^lowCD44^high)细胞和CD8(CD62L^lowCD44^high)T细胞在Trex1^-/-小鼠脾脏中的含量，而并不影响激活的CD4 T(CD69⁺)细胞的含量(图11A～11B)。此外，SN-011给药后Trex 1^-/-小鼠血清中的抗核抗体显著减少(图11D)，且持续给药1个月能显著延长Trex1^-/-小鼠的生存率(图11C)。以上研究结果表明，SN-011能改善TREX1^-/-自身免疫疾病小鼠的***性炎症损伤并阻止疾病的进展。此外，式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)都具有与式I化合物(SN-011)相类似的效应。

综上所述，本发明的式I～V化合物可用于制备预防或治疗STING介导的自身免疫性疾病和炎症性疾病的药物。

实施例11

SN-011(式I化合物)在小鼠体内的药物代谢动力学研究

在单次腹腔注射给予雄性C57BL6J小鼠化合物SN-011(5mg/kg)后，分别在24小时内设置不同的时间点进行采血，随后用LC-MS/MS检测血浆中的血药浓度并计算相关的药代参数。实验结果表明：小鼠腹腔注射注射SN-011后血浆中药物的半衰期T_1/2是1.03小时，最大血药浓度Cmax为837.02ng/mL，达到药峰浓度所需的时间T_max为0.25小时，血药浓度-时间曲线下面积AUC为850ng/mL(图12A～12B)。

实施例12

SN-011(式I化合物)在小鼠体内的毒理学评价

为了评价化合物SN-011在小鼠体内长期给药后的潜在毒性，我们在雄性C57BL6J小鼠内腹腔注射SN-011(1mg/kg)每周给药三次，持续给药10周，给药完成后检测小鼠体内脏器和血清生化指标的变化。实验结果表明：给药10周内对照组和给药组的小鼠体重无显著变化(图13A)，小鼠血清中反应肝脏损伤的ALT和AST指标在给药后也没有显著的增加(图13B)。此外，反应肾脏损伤的血清指标BUN和CREA在给药后也没发生显著变化(图13C)。对小鼠的心脏、肾脏、胃和肝脏做病理切片，结果表明，在10周给药后上述器官均未发生明显的实质性损伤(图13D)。以上结果表明，化合物SN-011在小鼠体内具有很好的安全性，长期给药后在小鼠体内也未表现出毒副作用。

实施例13

SN-011(式I化合物)抑制SAVI相关STING点突变诱导的炎症细胞因子的表达

编码STING蛋白的基因TMEM173在人体内发生突变诱发的一类自身免疫疾病，即在婴儿期发生STING激活相关血管病变(STING-associated vasculopathy with onset ininfancy,SAVI)。SAVI病人的临床表征主要为早发于婴儿时期，皮肤红疹和呼吸急促，发热等***性的炎症，外周血管病变，肺部炎症和血液中存在自身免疫抗体等。随后的基因测序结果发现，此类病人的TMEM173基因的多个位点发生突变而导致蛋白的自激活，突变体包括N154S,V155M,G166E,C206Y,R281Q和R284G(J Allergy Clin Immunol,2017,140(2):543-552；Ann Rheum Dis,2017,76(2):468-472)。本发明通过克隆的方法构建上述点突变体的质粒，在HEK293T细胞(本身无STING蛋白的表达)中过表达上述突变体，进而研究化合物SN-011对上述突变体诱导的STING信号通路激活的影响。实验结果表明，细胞预孵育SN-011能显著抑制上述突变体诱导的Ifnb,Cxcl10和Tnfa基因的表达(图14A～14C)。在蛋白水平预孵育SN-011同样能减弱过表达的STING点突变体对下游靶蛋白TBK1和IRF3的招募及降低P-TBK1和P-IRF3的表达水平(图14D～14E)。近期的研究表明，SAVI相关的STING点突变体能通过解除STING二聚体的自抑制形态而使蛋白发生不依赖与配体结合的多聚化激活(Nature,2019,567(7748):389-393)，以此为依据，进一步检测化合物SN-011对上述点突变体的多聚化的影响，结果表明，SN-011能显著抑制STING突变体的多聚化表达(图14F)。综上所述，SN-011能通过抑制SAVI相关的STING点突变的多聚化激活而减少下游炎症细胞因子的表达，进而降低组织或细胞的炎症损伤。此外，式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)都具有与式I化合物(SN-011)相类似的效应。

因此，本发明的式I～V化合物可用于制备预防或治疗婴儿期发生的STING相关的血管疾病(SAVI)的药物。

实施例14

SN-011(式I化合物)改善大鼠脑缺血损伤

组织的缺血性损伤伴随大量实质细胞的死亡，随之释放的损伤相关的分子模式(DMAP)进一步促进损伤部位免疫***的激活，释放的炎症因子加重组织的损伤。最近研究发现，在小鼠的心肌缺血模型中受损的心肌细胞产生的细胞碎片被心脏组织中的巨噬细胞摄取，激活巨噬细胞内cGAS-STING介导的固有免疫信号通路，促进ISGs的表达，且基因敲除cGAS或STING后能显著改善心肌缺血导致心脏炎症损伤，改善心脏功能进而延长疾病小鼠的生存率(Nature Medicine,2017,23(12):1481-1487；Circulation,2018,137(24):2613-2634)。据此，本发明人在大鼠的脑缺血模型中评价化合物SN-011的潜在治疗效果。实验结果表明，大鼠在中动脉阻塞(MCAO)24小时后，模型组大鼠的脑梗死区域显著增大，而给予低剂量(1mg/kg)和高剂量(3mg/kg)的SN-011均能显著改善脑梗死面积(图15A)。分别在手术后6小时和24小时后对大鼠的运动能力进行评价，给予SN-011能显著改善脑卒中后的大鼠运动功能障碍(图15B～15C)。进一步检测大鼠脑皮层组织炎症基因的表达，结果发现，大鼠中动脉阻塞后大脑皮层内Ifnb,Ifna4,Cxcl10,Mcp-1,Tnf-a和Il-6的基因表达显著升高，与之相比，SN-011能显著抑制缺血损伤诱导的大脑皮层组织中上述基因的表达(图15D～15I)。以上研究结果表明，化合物SN-011能显著改善缺血诱导的实质器官损伤。此外，式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)都具有与式I化合物(SN-011)相类似的效应。

这提示本发明的式I～V化合物可用于制备预防或治疗STING介导的缺血性心脑脑血管疾病的药物。

实施例15

SN-011(式I化合物)改善小鼠鼠脑缺血损伤

脑卒中可迅速导致小胶质细胞的激活和外周免疫细胞的浸润，且在卒中病人脑脊液中DNA的含量显著上升。最近的研究表明脑卒中后cGAS-STING通路发生激活，并介导卒中后的损伤(EMBO Molecular Medicine,2020,7；12(4))。实验结果显示：小鼠在中动脉阻塞后立即腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(2mg/kg)，24小时后，化合物SN-011显著抑制Mcp-1,Il-6和Tnf-α基因的表达(图16A)；小鼠在中动脉阻塞后立即腹腔注射低剂量SN-011(1mg/kg)和高剂量的SN-011(2mg/kg)，72小时后，化合物SN-011显著抑制Mcp-1,Il-6和Cxcl10基因的表达(图16B)；小鼠大脑中动脉阻塞后立即或24小时后再腹腔注射SN-011(2mg/kg)，连续给药至卒中后第七天，化合物SN-011立即给药或延迟24小时给药均可显著改善卒中小鼠的运动协调性(图16C)；小鼠大脑中动脉阻塞后立即或24小时后再腹腔注射SN-011(2mg/kg)，连续给药至卒中后第七天，化合物SN-011立即给药或延迟24小时给药均可显著改善卒中小鼠的运动协调性(图16D)；

实施例16

SN-011(式I化合物)改善高脂饮食诱导的小鼠肝损伤及脂质聚集非酒精性脂肪肝(NAFLD)主要表现为肝脏的脂肪聚集诱导肝脏脂肪变性，在未得到有效控制时，过度聚集的脂肪会诱导肝脏炎症损伤和纤维化进而疾病进展为非酒精脂肪肝炎(NASH)。流行病学研究表明NASH是导致肝硬化和肝癌发生的最常见因素，而目前尚无有效的治疗NASH的药物。近期的研究发现，在NAFLD病人的肝脏中STING的表达显著升高，主要集中在肝脏的非实质细胞如巨噬细胞和枯否细胞内，且在动物模型中敲除骨髓细胞STING蛋白的表达能显著改善高脂饮食诱导的小鼠NAFLD疾病进展(Gastroenterology,2018,155(6):1971-1984；Journal of Clinical Investigation,2018,129(2):546-555)。据此，本发明人在高脂饮食诱导的NAFLD模型中评价SN-011的药效。用高脂饲料(HFD)喂养4～6周龄的C57BL6J雄性小鼠10周后开始给予低剂量(1mg/kg)和高剂量(2mg/kg)的SN-011进行干预，连续给药10周后检测小鼠血清生化指标。结果表明，与正常饮食喂养的小鼠相比，HFD小鼠血清中ALT,AST,TC和TG的含量显著升高，且给药后小鼠血清中上述指标显著降低，说明SN-011能改善HFD饮食诱导的肝损伤并减少血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量(图17A～17D)。SN-011给药后能显著减少小鼠的体重、肝脏重量和肾周内脏脂肪重量(图17E～17G)，且肝脏内的总胆固醇和甘油三酯的含量在给药后也显著降低(图17H～17I)。以上结果证实了SN-011对小鼠体内脂代谢的调控作用。进一步检测肝脏中STING激活的免疫和炎症细胞因子与调控脂代谢蛋白基因的表达水平，结果表明，高脂饮食诱导的肝脏Ifnb,Cxcl10,Mcp-1和Tnfa基因的上调在SN-011给药后都显著得到改善(图17J～17M)，这表明SN-011能改善肝脏炎症反应，且也能显著抑制HFD诱导肝脏调控脂质合成的蛋白脂肪酸合酶(FAS)和固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)基因的上调(图17N～17O)。进一步对实验组小鼠的肝脏进行病理切片以评价组织的炎症损伤和脂质空泡，结果表明，SN-011能显著改善HFD小鼠肝组织的炎症细胞浸润及脂质聚集形成的大泡样脂肪变性(图17P)。此外，式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)都具有与式I化合物(SN-011)相类似的效应。

以上结果提示，本发明的式I～V化合物可用于制备预防或治疗STING介导的非酒精性脂肪性肝病(包括NASH)的药物。

实施例17

SN-011(式I化合物)改善咪喹莫特诱导的银屑病样炎症用BALB/c小鼠建立咪喹莫特诱导的银屑病样炎症模型，观察化合物SN-011是否能逆转咪喹莫特诱导的银屑病样炎症。将BALB/c小鼠随机分为空白对照组(Control组)、模型对照组(Model组)，SN-011250mg/kg组和SN-011 50mg/kg组。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(PASI)评分来观察疾病进展，并测量右耳厚度。H&E染色观察各组小鼠右耳及背部皮肤表皮厚度，Munro微脓肿情况。实验结果表明(图18和图19)，Model组小鼠耳厚度明显高于Control组，化合物SN-011组耳厚度低于Model组，且有显著性差异。H&E染色结果表明(图20)，化合物SN-011降低了小鼠棘皮厚度，且有显著性差异。此外，式II化合物(SN-001)、式III化合物(SN-005)、式IV化合物(SN-006)和式V化合物(SN-010)都具有与式I化合物(SN-011)相类似的效应。

以上结果提示，本发明的化合物可以改善银屑病样炎症，可用于制备预防或治疗STING介导的银屑病的药物。

综上所述，本发明式I～V化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以应用在制备预防或治疗STING介导的疾病的药物中。

本发明化合物的作用机制如图21所示。以化合物SN-011(式I化合物)为例，在正常情况下，细胞质中异常的DNA被cGAS识别后产生2’3’-cGAMP分子，2’3’-cGAMP随后与内质网调控蛋白STING结合，诱导STING蛋白的构象变化进而发生多聚化激活，随后多聚化的STING蛋白转移到高尔基体上招募下游蛋白TBK1和IRF3，TBK1在自磷酸化后促进IRF3和NF-κB磷酸化，随后入核促进干扰素和炎症细胞因子的表达；在加入SN-011分子后，SN-011能特异性结合到STING二聚体形成的口袋内，进而阻止CDNs分子对STING蛋白的激活，阻断信号的传递。

实施例18

片剂

将实施例1中制得的式I化合物(50g)、羟丙甲基纤维素E(150g)、淀粉(200g)、聚维酮K30适量和硬脂酸镁(1g)混合，制粒，压片。

此外，可以根据药典2015版常规制剂法，将本发明的式I～V化合物赋予不同的药物辅料制成胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂等。

Claims (7)

1.如下式I～V任意一种或者多种所示的苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抑制STING信号通路激活的药物中的用途：

2.一种权利要求1所述的式I～V任意一种或者多种苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗STING介导的疾病的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，所述STING介导的疾病包括感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病、缺血性心脑血管疾病、退行性神经***疾病、脑外伤、脊髓损伤、癌症或癌期综合征。

4.根据权利要求2所述的用途，所述STING介导的疾病是银屑病、脑卒中、脑外伤、外伤或其他疾病引起的脊髓损伤、帕金森病、亨廷顿病、家族性肌萎缩侧索硬化症、心肌梗死、非酒精性脂肪性肝炎、***性红斑狼疮、Aicardi-Goutières综合征、类风湿性关节炎、炎症性肠病、婴儿期发生的STING相关的血管疾病(SAVI)或糖尿病及其并发症。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述式I～V化合物其药学上可接受的盐为金属离子或药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐。

6.一种预防或治疗STING介导的疾病的药物组合物，其包含式I～V任意一种或者多种苯磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物作为活性成分和药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物优选为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

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