CN112048444A - 产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用。产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，包含18S rDNA基因片段‑酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列(GAP‑p)‑漆酶基因‑酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子序列(GAP‑t)‑放线菌酮(CYH)抗性基因。本发明整个表达***的全部遗传元件均来自益生菌产朊假丝酵母和无毒无害的真菌，不携带抗生素抗性基因，不存在抗性基因的漂移、扩散及整合，也不携带其他有毒蛋白基因，不会对环境或人和动物带来生物安全性的危害，达到了食品级，可直接添加到食品、药物和饲料中应用。

Description

产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌 及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体、其构建方法、重组工程菌及其应用。

背景技术

内蒙古有着丰富的秸秆资源，全区年产各类农作物秸秆达35亿公斤，相当于全区天然草原打草量的2倍。当前绝大多数秸秆还是以简单的粉碎、压成颗粒及青贮制作方式饲喂家畜。奶牛对简单加工玉米秸秆中的干物质(DM)的表观消化率为63.38﹪，中性洗涤纤维(NDF)的表观消化率为62.06﹪，酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率为50.36﹪。肉牛对简单粉碎小麦秸秆中的中性洗涤纤维的表观消化率为56.87﹪，酸性洗涤纤维的表观消化率为49.04﹪。就是说秸秆饲料饲喂当中，至少有近37﹪的干物质、38﹪～46﹪的中性洗涤纤维、49﹪～51﹪酸性洗涤纤维经粪便流失掉。我国玉米的种植面积持续增涨较快，在玉米产量提升的同时，产生大量的玉米秸秆，但是仅有不到20％的玉米秸秆被有效加工。所以，攻克秸秆饲料消化利用率的关键技术是解决我区畜牧业生产中粗饲料资源不足和利用率低，降低养殖成本，提高牛、羊饲养数量和养殖经济效益的有效途径。

由于秸秆营养成分利用率低,适口性差，利用价值不高,每年都有大量秸秆直接还田或焚烧,用作饲料的仅占一小部分,这不仅造成资源浪费,而且焚烧还污染环境。造成农作物秸秆用作饲草利用率低的原因之一是：随着农作物的成熟，木质化程度也越高，秸秆细胞壁中木质素含量也增加。

木质素的基本结构单元是苯丙烷，通过醚键和碳碳键连接形成复杂的无定形高聚物。典型木质素是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇这3种不同的醇作为先体物质组成基本结构。木质素能与半纤维素分子紧密交联形成疏水的网状结构，整个细胞壁就成为一个紧密的网状，增加了细胞壁的机械强度和对微生物的抵抗能力。与此同时，也阻碍了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素接触，从而降低纤维多糖的降解效率。因此木质素被认为是抑制秸秆利用率的主要限制性因素。玉米秸秆中木质素含量可达到19％～23％，直接影响玉米秸秆的利用效率。原因之二是：目前已开发应用的酸处理、碱处理、蒸汽***、热水处理、氨纤维***、挤出预处理、微波预处理等，虽然这些预处理方法提高了秸秆利用率，但是其高昂的设备费用使秸秆在实际应用中受到制约。

到目前为止，仅有少数微生物可以降解木质素，其中绝大部分是真菌，少数是细菌，但是后者仅有较弱的木质素降解能力。由于白腐真菌能高效地选择性降解木质素，因此被认为是去除木质素最有应用前景的一大类真菌。已知白腐真菌分泌木质素降解有关的几类主要过氧化物酶：漆酶(Laccase；EC 1.10.3.2)，锰过氧化物酶(MnP；EC 1.11.1.13)(这两个酶首先在黄孢原毛平革菌中发现)，多功能过氧化物酶(在杏鲍菇中首先发现)，木质素过氧化物酶(LiP；EC 1.11.1.14)和多种辅助酶。一些白腐菌产生上述中的3种分解木质素的酶，而大多数白腐菌仅产生2种甚至1种分解木质素的酶，因此表明上述4种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的。研究表明，木质素过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶都能与低分子量的中介体共同作用，即酶产生具有攻击木质素结构能力的反应中间产物，间接地引起木质素的氧化反应，从而导致木质素的分解，这已被提出作为木质素的降解机制。

白腐真菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产。在蛋白质表达体系中，异源宿主表达高效更能满足工业化生产的需要。研究者们希望利用基因工程技术提高过氧化物酶的产量，因此对白腐菌的多个过氧化物酶基因进行克隆和异源宿主的表达。以黄孢原毛平革菌为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，将该基因在大肠杆菌中表达，漆酶活力比原菌酶活力提高了近39％。孙亚范将木质素过氧化物酶基因在毕赤酵母(甲醇酵母)中表达，木质素过氧化物酶活力提高了122.1％。王娇将锰过氧化物酶基因在毕赤酵母中表达，木质素降解率提高了31.38％。由于毕赤酵母的表达***研究的比较成熟，所以将木质素过氧化物酶基因在该酵母表达的研究较多。但是，毕赤酵母不是食品级微生物，它的应用受到限制。

发明内容

为此，本发明提供一种产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌及其应用，解决现有技术中异源表达木质素降解酶的微生物菌种不满足食品级要求、应用受限的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，包含18S rDNA基因片段-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列(GAP-p)-漆酶基因-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子序列(GAP-t)-放线菌酮(CYH)抗性基因。

优选的，所述漆酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

本发明还提供一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)漆酶(Lac)基因的克隆：提取云芝栓孔菌中总RNA，以提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得目的基因并与pMD19-T载体连接，转化提取，得到重组质粒；

(2)酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)GAP-p GAP-t基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得酵母GAP启动子(GAP-p)片段、GAP终止子(GAP-t)片段，将目的片段GAP-p、GAP-t分别连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-GP、pT-GT，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(3)放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)CYH敏感基因(L41)序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，及一对反向互补引物；以产朊假丝酵母基因组为模板,PCR扩增出L41上游片段、下游片段,这2片段的一端具有碱基重叠区；以这两上游片段、下游片段等量混合为模板,进行套叠PCR,即获得CYH抗性基因；将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-CYH，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(4)18S rDNA基因片段的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)18S rDNA基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得18S rDNA片段，将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上获得质粒载体pT-rD，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(5)同源整合表达载体的构建：提取pT-GP、pT-GT和pBR322质粒,分别进行酶切,回收目的片段，用T4 DNA连接酶将这3片段同时连接,获得质粒pBR-GAP；提取pT-CYH和pBR-GAP质粒,分别进行酶切，回收目的片段,用T4DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-L；提取pBR-G-L质粒和漆酶(Lac)基因重组质粒，分别进行酶切，回收目的片段,用T4 DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-Q-L；提取pT-rD和pGQL质粒，分别进行酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶进行连接,获得产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR。

优选的，所述酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆中，引物设计如下：

启动子(GAP-p)：

GAP-p1:GGATATCTTACAGCGAGCACTCAA；

GAP-p2:GCTCTAGAATGTTGTTTGT；

终止子(GAP-t)：

GAP-t1：CTAGCTAGCTATGACTTTTAT；

GAP-t2：GGGATCCTTCATTCATCCCTCACTATCG。

优选的，所述放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆中，引物设计如下：

P 4:CGTCGACAGTAAGTATGAAAAGAGC；

RM4:GGGATCCGG GTTTGGTCTATGTTGCT；

在引物P4中引入Sal Ⅰ酶切位点，在引物RM4中引入BamH Ⅰ酶切位点；

反向互补引物设计如下：

P5:AACCAAGCAAGTTTTCCAC；

R5:GTGGAAAACTTGCTTGGTT。

优选的，所述18S rDNA基因片段的克隆中，引物设计如下：

P3:CGATATCTGCCAGTAGTCATATGC；

R3:CGATATCTGACTTGCGCTTACTAG；

在引物P3中引入EcoR Ⅴ酶切位点，在引物R3中引入EcoR Ⅴ酶切位点。

本发明还提供一种产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，将上述含漆酶基因的产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR，重新拼接后得到序列为ZHQX1的产朊假丝酵母重组子，进行电转化，构建得到重组酵母菌株。

优选的，以pGQLR载体为模板进行引物设计，将片段序列分为两个片段，重新拼接后得到序列为ZHQX1，设计引物如下：

优选的，所述产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR中删除来自原核的DNA序列，所述DNA序列包括抗药性标记Amp在内的细菌质粒序列的DNA片段。

本发明还提供一种产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌在食品、制药以及畜禽饲料中的应用。

有益效果：

本发明提供的产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，其整个表达***的全部遗传元件均来自益生菌产朊假丝酵母和无毒无害的真菌，不携带抗生素抗性基因，不存在抗性基因的漂移、扩散及整合，也不携带其他有毒蛋白基因，不会对环境或人和动物带来生物安全性的危害，达到了食品级，可直接添加到食品、药物和饲料中应用。产朊假丝酵母工程菌表达的漆酶活性达到原云芝栓孔菌的10倍。

附图说明

图1为本发明实施例pGQL酶切产物鉴定结果示意图；

图2为本发明构建的表达载体pGQLR图谱；

图3为本发明实施例pGQL R酶切产物鉴定结果示意图；

图4为本发明实施例产朊假丝酵母菌整合表达载体中删除原核序列后的PCR电泳结果示意图；

图5为本发明实施例产朊假丝酵母重组子ZHQX1基因组PCR产物鉴定结果示意图；

图6为本发明实施例检测外源基因遗传稳定性PCR电泳结果示意图；

图7为本发明重组酵母菌(ZHQX1)漆酶蛋白SDS-PAGE检测结果示意图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

本说明书中所采用的试剂、原料，除特殊说明外，均为市售产品。

本发明漆酶基因来源于云芝栓孔菌Trametes versicolor：BNCC190652。

实施例1

本实施例提供一种产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，包括：

1、构建含漆酶基因(LAC)的表达载体；

2、产朊假丝酵母菌整合表达载体中删除来自原核微生物的DNA片段；

3、删除原核DNA序列后转化至酵母菌株。

具体过程如下：

1构建含漆酶基因(LAC)的表达载体

1.1漆酶基因的克隆

从云芝栓孔菌Trametes versicolor中提取总RNA(参照天根(TIANGEN)RNA提取试剂盒法)；以提取的云芝菌总RNA为模板，采用BCabest RNA PCR扩增试剂盒进行RT-PCR扩增。引物序列如下：

LAC-R1：CAACATGTCGAGGTTTCACTCTC；

LAC-R2：CCATTTACTGGTCGCTGGGGT。

使用E.L.N.ATm Gel Extraction Kit(D2500-01)凝胶回收试剂盒进行RT-PCR产物的胶回收；将目的基因与pMD19-T Vector(宝生物)载体的连接；连接产物转化Trans-5α(全式金)感受态细胞，得重组质粒进行PCR鉴定，漆酶基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。

1.2酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆

根据GenBank中公布的酵母GAP-p、GAP-t基因序列结合pBR322质粒序列特征设计相应引物并引入合适的酶切位点，以产朊假丝酵母(C.utilis)基因组为模板，分别以相应引物进行PCR(采用试剂盒完成)，获得酵母GAP启动子(GAP-p)片段、GAP终止子(GAP-t)片段。回收目的片段连接至载体pMD19-T simple(宝生物)vector上(分别命名为pT-GP、pT-GT)，连接产物转化DH5α(全式金)感受态细胞中，阳性克隆进行菌液PCR鉴定。

引物序列如下：

克隆到的启动子序列GAP-p的核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示。

克隆到的终止子序列GAP-t的核苷酸序列见SEQ ID NO.3所示。

GAP-p，GAP-t基因的PCR扩增：

目的基因与pMD19-T simple(宝生物)载体的连接体系：

16℃连接过夜，连接产物转化DH5α(全式金)感受态细胞中。

重组子进行菌液PCR鉴定

1.3放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆(采用定点突变法)

根据GenBank中公布的酵母中CYH敏感基因(L41)序列结合pBR322质粒序列特征设计相应引物，并引入合适的酶切位点，同时设计一对反向互补引物。先以C.utilis基因组为模板，PCR扩增出L41上游片段、下游片段，这2片段的一端具有碱基重叠区。以这两上游片段、下游片段等量混合为模板，进行套叠PCR，即可获得CYH抗性基因。回收目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上(命名为pT-CYH))转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定。

设计引物如下：

以酵母基因组为模板，分别以P4/R5，P5/RM4为引物，进行PCR实验。

反应条件：

以两组回收产物为模板进行PCR实验：

PCR反应条件同上。

目的基因与pMD19-T Vector载体的连接体系：

轻轻混匀，瞬时离心后，16℃连接过夜。连接产物转化Trans-5α(全式金)感受态细胞中。

用接菌环挑取10个单克隆菌体，进行菌液PCR鉴定。

PCR反应程序同上。

克隆到的放线菌酮抗性基因CYH的核苷酸序列见SEQ ID NO.4所示。

1.4 18S rDNA基因片段的克隆

根据GenBank中公布的酵母18S rDNA基因序列结合pBR322质粒序列特征设计相应引物，并引入合适的酶切位点，以C.utilis基因组为模板，以相应引物进行PCR，获得18SrDNA片段。回收目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上(命名为pT-rD)转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定。

18SrDNA基因引物设计如下：

PCR扩增反应体系(25μL)：

反应条件：

克隆到的18S rDNA基因片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.5所示。

1.5 pBR322-GAP(pBR-GAP)载体的构建：

GAP-p、GAP-t与pBR322质粒分别用EcoRV/XBa I，XBa I/BamH I和EcoRV/BamH I进行酶切，回收目的片段。采用3片段连接法，用T4 DNA连接酶将这3片段同时连接，获得质粒pBR-GAP。

GAP-p酶切体系如下：

GAP-t酶切体系如下：

PBR322酶切体系如下：

将胶回收纯化的目的片段和载体通过T4 DNA连接酶进行连接，10μL连接反应体系如下：

离心混匀后，16℃水浴过夜，连接连接产物转化DH5α感受态细胞中。

挑取10个单克隆菌体，进行PCR扩增，反应体系和条件如下：

挑取菌液鉴定阳性克隆，放于含有5mlLB培养液(+AMP)的三角瓶内，200rpm 37℃过夜培养。然后提取质粒进行EcoRV和BamHI酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切2h，提取酶切正确的质粒进行测序。

1.6 pBR322-GAP-L41(pBR-G-L)载体的构建

提取pT-CYH和pBR-GAP质粒，分别采用引入酶切位点的相应酶进行酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接，获得质粒pBR-G-L。

CYH酶切体系如下：

pBR-GAP酶切体系如下：

将胶回收纯化的目的片段和载体通过T4DNA连接酶进行连接，10μL连接反应体系如下：

离心混匀后，16℃水浴过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞中。

挑取10个单克隆菌体，进行PCR扩增，反应体系和条件如下。

94℃预变性5min，94℃变性30sec

56℃退火30sec，72℃延伸2min30sec共30个循环。72℃延伸10min。

挑取菌液鉴定阳性克隆，放于含有5mlLB培养液(+Amp)的三角瓶内，200rpm 37℃过夜培养。然后提取质粒进行Sal I和BamH I酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切2h，提取酶切正确的质粒进行测序，命名为PBR-G-L。

1.7含漆酶基因(LAC)基因的pBR322-GAP-L41-Q(pGQL)载体的构建

1)提取pBR-G-L质粒，用XBa I/Nhe I进行酶切，回收目的片段；

pBR-G-L酶切体系如下：

2)Lac基因的克隆及酶切；

克隆体系如下：

酶切体系如下：

3)将Lac基因片段与pBR-G-L酶切片段通过T4DNA连接酶进行连接，10μL连接反应体系如下：

离心混匀后，16℃水浴过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞中。

4)重组子菌液PCR鉴定

挑取10个单克隆菌体，进行PCR扩增，反应体系和条件如下。

5)酶切鉴定

挑取菌液鉴定阳性克隆，放于含有5ml LB培养液(+AMP)的三角瓶内，200rpm 37℃过夜培养。然后提取质粒进行XBa I和Nhe I酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切20min，提取酶切正确的质粒进行测序，命名为pBR-G-Q-L(pGQL)，酶切结果参见图1，其中，M为Trans 2K Ⅱ Marker；1为pGQL酶切产物。

1.8 pBR322-GAP-L41-Q-R18(pGQLR)载体的构建

提取pT-rD和pGQL，分别采用引入酶切位点的相应酶进行酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接，获得同源整合表达载体(pGQLR)。转化大肠杆菌DH5a，提取质粒后采用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆。

18SrDNA酶切体系如下：

pGQL酶切体系如下：

将胶回收纯化的目的片段和载体通过T4 DNA连接酶进行连接，10μL连接反应体系如下：

离心混匀后，16℃水浴过夜连接，连接产物转化感受态细胞中。

挑取10个单克隆菌体，进行PCR扩增，反应体系和条件如下。

质粒进行EcoRV酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切15min，提取酶切正确的质粒进行测序，命名为pGQLR，表达载体图谱如图2所示；酶切产物鉴定结果如图3所示，M为1kb Marker；1为pGQLR酶切产物。

2产朊假丝酵母菌整合表达载体中删除来自原核微生物的DNA片段

以pGQLR载体为模板进行引物设计，将片段序列分为两个片段，通过重叠延伸PCR实验技术删除来自原核的DNA序列(包括抗药性标记Amp在内的细菌质粒序列的DNA片段)，重新拼接后的序列命名为ZHQX1。

设计的引物如下：

分别以P1-1S、P1-1AS、P2-1S、P2-1AS为引物进行A、B两组PCR实验。

体系为：

PCR反应条件：

以A和B两组回收产物为模板进行PCR实验。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像***观察结果，如图4所示，M为Trans2K Ⅱ Marker；QX为删除原核序列后的PCR电泳结果。

3删除原核DNA序列后转化至酵母菌株

将已删除来自原核的DNA序列的整合表达载体(ZHQX1)进行电转化，构建重组酵母菌株。

感受态的制备：取5ul产朊假丝酵母加入到含3ml YPD培养基(含葡萄糖)的100ml摇瓶内，30℃，100rpm摇菌培养过夜(OD600约6-10)。从上一步取100μl菌液加到含有10mlYPD培养基(含PTT)的250ml摇瓶中，100rpm、30℃进行培养，直到OD值为1.0-1.3。

处理液(1ml)的配制：

取1ml过夜培养物分装到1.5ml EP管内，4℃、10000g、1min离心，弃上清。沉淀用4℃预冷的无菌水洗涤，同条件离心，弃上清。

菌体处理：加入1ml处理液，室温放置20min。离心(同条件)，弃上清。

加入1ml 1M的Sorbitol，离心(同条件)，弃上清。

用1M的Sorbitol洗涤2次，到最终体积约为80ul。

外源基因转化：

加入1ug外源基因，混匀后转入预冷的(冰浴中)电击杯中。1.5Kv、25uF、200Ω条件下进行电转。电击后立即加入1ml预冷的1M Sorbitol，轻柔悬浮。吸出，移入1.5ml EP管内。28℃静置培养2h。离心浓缩后，全部涂在YPD固体平板(YPD+PTT+CYH)上。28℃避光培养。2-3d开始统计和挑去转化子。

产朊假丝酵母重组子ZHQX1基因组PCR产物鉴定结果如图5所示，M为DL2000marker；1-6为产朊假丝酵母重组子ZHQX1基因组PCR产物；7为pGQLR质粒PCR产物(阳性对照)；8为未转化质粒的产朊假丝酵母基因组PCR产物(阴性对照1)；9为水PCR产物(阴性对照2)。

本实施例制得的产朊假丝酵母基因工程菌检测

1酶活测定

材料：

云芝栓孔菌Trametes versicolor：BNCC190652，购自北纳创联生物技术有限公司。

pGQLR：本实验室构建保存。

培养基及试剂：

⑴酶活培养基(g/L)：

葡萄糖：10g

酒石酸铵：0.1g

KH₂PO₄：0.2g

MgSO₄.7H₂O：0.5g

MnSO₄：0.035g

CuSO4.5H₂O：0.007g

加水至1L，121℃灭菌20min。

⑵PDA培养基：

9.76g PDA

200ml水

高压灭菌，备用。

⑶溶液：

20mmol/L H₂O₂，10mmol/L藜芦醇，50mmol/L的酒石酸缓冲液(pH3)，50mmol/L的琥珀酸缓冲液(pH4.5)，0.4mmol/L的愈创木酚。

1.2方法

漆酶的酶活测定：采用愈创木酚法。

缓冲溶液常用琥珀酸钠溶液，终浓度为50mmol/L。缓冲溶液的pH为4.5。底物愈创木酚的终浓度0.4mmol/L。反应温度为30℃，反应时间是30min。测定465nm处OD值变化。

1.3结果如下表1。

表1 465nm处OD值变化

(U/L)

可见，本发明克隆到的漆酶基因经产朊假丝酵母表达后具有降解木质素的活力，且明显高于来源于云芝栓孔菌的漆酶基因。

2整合基因的遗传稳定性测定

2.1酵母基因组PCR检测

将酵母重组子用YPD(无CYH)液体培养基进行接种传代培养后，选取第1天，第15天的酵母提取酵母基因组PCR检测目的基因，测定外源基因遗传稳定性。

2.2外源基因遗传稳定性测定结果

提取重组酵母基因组DNA，通过目的基因引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，结果证明目的基因稳定存在，结果如图6所示：M为DL2000 marker；1为YPD(无CYH)培养基中生长的酵母(Day15)；2：阳性对照：PGMLR质粒PCR产物3：菌阴性对照(一)未转化质粒的产朊假丝酵母基因组PCR产物；4:阴性对照(二)水PCR产物，由该结果可知，在酵母菌传代100代时仍含有目的条带，表明外源基因没有丢失，在传代培养过程中保持了较高的遗传稳定性。

3重组酵母菌(ZHQX1)漆酶蛋白SDS-PAGE检测

采用Yeast Protein Extraction Reagent提取ZHQX1的总蛋白质。具体操作过程如下：

①取1～5×10⁶的液体酵母菌细胞至1.5ml的离心管中，8000g 4℃离心2分钟。

②小心除去上清，向沉淀中缓慢加入1ml冰预冷的灭菌水，用移液枪轻轻反复吹打，使沉淀重悬。

③8000g，4℃离心2分钟。小心除去上清，尽量除净液体。

④向沉淀中加入25μL的Yeast Protein Extraction Reagent，用移液枪轻轻反复吹打，使沉淀重悬。

⑤放入30℃水浴中温浴30分钟以上，期间轻轻振荡离心管1～2次。

⑥将离心管从30℃水浴中取出，12000g，4℃离心5分钟。小心除去上清，再向沉淀中加入25μL的PBS溶液，25μL的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer，涡旋振荡2分钟，使沉淀重悬。

⑦取12.5μL上述悬浊液到新的1.5ml离心管内，在100℃条件下温浴10分钟后取10μL进行电泳检测。

SDS-PAGE结果如图7所示，泳道M是蛋白分子量标准；泳道1、2、3、4为4组从重组酵母菌(ZHQX1)中提取的蛋白，其中P指向的蛋白为漆酶蛋白。

产朊假丝酵母被美国FDA认证为可作为食品添加剂的酵母,能运用于食品、制药业以及畜禽的饲料中。本发明将木质素降解酶基因，即漆酶基因，转化到产朊假丝酵母中，并应用于发酵秸秆，可破坏木质素的包裹作用，使纤维素和半纤维素暴露出来，利于瘤胃微生物降解和利用秸秆饲料；可以作为安全的单细胞蛋白，改善秸秆饲料中的营养成分含量；其发酵产品不必经过分离纯化,省时且经济实惠。通过产朊假丝酵母异源表达木质素降解酶，也是为提高其产量，为工业化生产打基础。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>内蒙古自治区农牧业科学院

<120>产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌及其应用

<160>5

<170> Patent-In 3.5

<210>1

<211>1571

<212>DNA

<213>云芝栓孔菌（Trametes versicolor）

<400>1

caacatgtcg aggtttcact ctcttctcgc tttcgtcgtt gcttccctta cggctgtggc 60

ccacgctggt atcggtcctg tcgccgacct caccatcacc aacgcagcgg tcagccccga 120

cgggttttct cgccaggccg tcgtcgtgaa cggcggcacc cctggccctc tcatcaccgg 180

taacatgggg gaccgcttcc agctcaatgt catcgacaac ctcaccaacc acacgatgct 240

gaagagcacc agtattcact ggcacggttt cttccagaag ggcacgaact gggccgacgg 300

tcccgccttc atcaaccagt gcccgatctc atctggtcac tcgttcctgt acgacttcca 360

ggttcctgac caggctggca ccttctggta ccacagtcac ttgtccacgc agtactgtga 420

tggtctgagg ggtccgttcg ttgtttacga cccgaacgac ccagccgccg acttgtacga 480

cgtcgacaac gacgacactg tcattaccct cgtggattgg taccacgtcg ccgcgaagct 540

gggccccgcc ttccctctcg gcgccgatgc taccctcatc aacggtaagg gacgctcccc 600

cagcacgact accgcggacc tctctgttat cagcgtcact ccgggtaaac gctaccgttt 660

ccgcctggtg tccctgtcgt gcgaccccaa ctacacgttc agcatcgatg gtcacaacat 720

gacgatcatc gaaaccgact cgatcaacac ggcgcccctc gtcgtcgact ccattcagat 780

cttcgccgcc cagcgttact ccttcgtgct cgaggccaac caggccgtcg acaactactg 840

gattcgcgct aacccgaact tcggtaatgt cgggttcacc ggcggcatca actcggctat 900

cctccgctac gatggtgccg ctgccgtcga gcccaccacc acgcaaacca cttcgaccga 960

gccgctcaac gaggtcaacc tgcacccgct ggttgccacc gctgttcctg gctctcccgt 1020

tgcgggtggt gttgacctgg ccatcaacat ggcgttcaac ttcaacggca ccaacttttt 1080

catcaacggc gcgtctttca cgcccccgac cgtgcctgtc ctcctccaga tcatcagcgg 1140

cgcgcagaac gcgcaggacc tcctgccctc cggcagcgtc tactcgctcc cctcgaacgc 1200

cgacatcgag atctccttcc ccgccaccgc cgccgccccc ggcgcgcccc accccttcca 1260

cttgcacggg cacgcgttcg cggtcgtccg cagcgccggc agcacggtct acaactacga 1320

caaccccatc ttccgcgacg tcgtcagcac ggggacgcct gcggccggtg acaacgtcac 1380

catccgcttc cgcaccgaca accccggccc gtggttcctc cactgccaca tcgacttcca 1440

cctcgaggcc ggcttcgccg tcgtgttcgc ggaggacatc cccgacgtcg cgtcggcgaa 1500

ccccgtcccc caggcgtggt ccgacctctg cccgacctac gacgcgctcg accccagcga 1560

ccagtaaatg g 1571

<210>2

<211>971

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttacagcgag cactcaaatc tgccctccga gccctccggc cctctcttca acaaactcgc 60

gctgcacttc gtcgtcagtg gtgccaatca cccaacgtgg aggtatcaag aggtgctcca 120

gcccacaaag cgacatcaaa gacaacaacc ctgccggcat acgtcctaca caccctggtg 180

atcgcagaca ttgtacaagg tgccacgcaa taacctacag gcaccgcaca tgacgatggc 240

cttggttgtg caaccagtga cttccacggt ccacgcagca acatgaacca caccacccag 300

aatcgatgcg cgcaacaaca gttgttccgg ttcactcagc cccacagcga gtcgctggca 360

gaacacgagc ctgagggcgg aaagagggta gaggaaagcg caaggacagg ggacaacctg 420

gcccaattga tgtcatataa accctctcga tcaattgagc acactcatcc gccaattgac 480

ccctgttcgc agctccacgc cccatgttcc tcgtccctgg tgtagcttct cccctaaatt 540

ccagcgcttg gttccgccct ccctgtctcc cgggtttaac gaacgtgtgt accatctgat 600

ggtaatccgc tcccgtccgc gcaacacaac tcacaagcag atcacacctc tacacgccgc 660

tgctgatgcg cccaatttaa tttttttttc tctcaatgta ggggagaagc cttgggagct 720

cccgactccc agttgggcac agctgccacc tcatgacttt tcctgtgtgt gcctgtctga 780

cgttacgtgt gatgtagtgg cccccgtccg gtgtgttttc gcctgttgcg ctgtgccccc 840

cttaaaagta taaaaggaag tgcaattgct gtttgtgttg attgttgatc cttgtttcct 900

ctgttttctc ctcatcacac aagaaaggtt tcttctttcc aacagataca aaacacactt 960

acaaacaaca t 971

<210>3

<211>447

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tatgactttt atttatggga ttacgttata aattatgatc ctcatggatt atcttattaa 60

gtctccatct tgtagcttgt aatatgatga acactcgtga gttttccagg taattcaccg 120

tgcctcgtcc atgcactttt atcagcctcg acgtcataca ttgcattgtg agtaactggt 180

aaacggcttt ttacgttctg ttgtatatgg ctaaacgctt ctatggcacg gcgctattaa 240

cctgtctgac atttcaacct ggtgttgatg gcttaaacga taatacggtg agatatatag 300

ctaacagaat gggggtgacg cactgattcc actgtatata taggcgatat gtgttgttgg 360

atggacgttt ctttgtctcc tgatccacaa tagtagctca gctccgtgcc aactggttcg 420

ctggtacgat agtgagggat gaatgaa 447

<210>4

<211>1940

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgtcgacagt aagtatgaaa agagccaatg ttgagagtct caggaaccac atcgacttct 60

tcgtgccatc ctcccacatt ctgaagccca agaacccaca aatcatcaaa caccaacacg 120

atgcggacgc caacccgagt tgtaacgcca caaagtacgg gtacgaccct gttccaggag 180

ggctcacgcc gcaatcaaca accaaagtcg ccacgatcaa cgccagtatc aagtaaaaga 240

agaatagcat ctccagtctt ccgatagctg tgtacttcga tctgacgttg tagatgatga 300

tgatcatgat cacaagggca ccaatgttga caaaggcgtt accaatctgg aatatcacgg 360

tattggcaac gtctatcgga cgggcgtagc actcagggat gatcccttcg ttcaggtgcg 420

tgaactgctc gttcgtcgtt gccttcacaa cctggcacaa cgggagcggc gtgttgtggc 480

atagcgagtt gaaatcaccg aatgccattg tgttttatcg ttagggagac ctgtttgaag 540

ctgacagcgg gatgaagatg aggaaggaga gcacaacagc tgagcggaag tctctgtgat 600

gcttggtgga ccgggtgtag gtggaatctc cctggtgagc gtacttgcaa cggtgctcag 660

cgacttcttc tcgagaggaa acgtaaacaa agaggtttca atgttgatgt tgatgtgtat 720

ttttgttaca aaagcagaaa ttgtaaacaa aaaggtataa ttagggctct ggtgtaatga 780

tgggcacgtg acgttaccgt gctggtcgat tttagggcta ttggttcgcg tcccgctggt 840

gtccgggtta gcgtgtcaat gtggcgcctc ccgattatta cataagaaaa cacccaccca 900

cgcaacacct ggtgtctgga tgttgacgct ttgtatgcgt gtgtgtgttt tttcttccgt 960

cttgttgggc cactctgcgc gagcgttggc gactcaccgg tgaaatttat cgaaaacttt 1020

caggctcagg cccttttcaa cactaccctt tgagatcaca tcaagcagta atcaaacaca 1080

atgggtatgt gggaaacgac gacgtgtgcg gtgtgtgaat gccattagtg ggatatgtgg 1140

tagtctcgag cgtggatatt atcgataggg atggtgcttg ttctatacgt cttgctggga 1200

aggaagaaag cgatgaagta tgtgggaaga aggggtggtt taagagagga agtagacatg 1260

taacaagtgt gttcagagaa caaggacgga aatatcacct atatgacgta cacatcacga 1320

actgctcctg gaggaagcga caagatgaat atcaacaggc atcatcatat ctctacaatg 1380

gctcgttccc aaagcacacg cacaaacaaa tccgagactt ttgtactaac agctgtatct 1440

ctgacaaata gttaacgttc caaagaccag aagaacctac tgtaagggta aggagtgcag 1500

aaagcacact caacacaagg ttacccagta caaggctggt aaggcttccc tctttgccca 1560

gggtaagcgt cgttatgacc gtaagcaatc cggttacggt ggtcaaacca agcaagtttt 1620

ccacaaaaag gctaaaacca ccaagaaggt tgttttgcgt ttggagtgtg ttgtctgcaa 1680

gaccaaggcc caattggctt tgaagcgttg taagcacttc gagttgggtg gtgacaagaa 1740

gcaaaagggt caagctttgc aattctaagc ttaagacaat tgttgaaagt tttattatta 1800

tcactacact gtgtttttga tgtcatctaa tgtaaaagcg tttatattac cacttggttc 1860

ggtatcctgt agaagaatac ggcctgtagc gtagcattcc cacaggagga tcacagcaac 1920

atagaccaaa cccggatccc 1940

<210>5

<211>1587

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgatatctgc cagtagtcat atgcttgtct caaagattaa gccatgcatg tctaagtata 60

agcaatttat acagtgaaac tgcgaatggc tcattaaatc agttatagtt tatttgatag 120

taccttacta cttggataac cgtggtaatt ctagagctaa tacatgctaa aaaccccgac 180

tgcttgggag gggtgtattt attagataaa aaatcaatgc cctcgggctc tttgatgatt 240

cataataact tgtcgaatcg catggcttta cgccggcgat ggttcattca aatttctgcc 300

ctatcaactg tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta acggggaata 360

agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag 420

gcgcgcaaat tacccaatcc taattcaggg aggtagtgac aataaataac gatacagggc 480

ccttctgggt cttgtaattg gaatgagtac aatgtaaata ccttaacgag gaacaattgg 540

agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tattaaagtt 600

gttgcagtta aaaagctcgt agttgaactt tgggcctggc aggccggtcc gctttttggc 660

gagtactgac cctgccgggc ctttccttct ggctaccctc ccctctggag aggcgaacca 720

ggacttttac tttgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc ctttgctcga atatattagc 780

atggaataat agaataggac gtttggttct attttgttgg tttctaggac catcgtaatg 840

attaataggg acggtcgggg gcatcagtat tcagttgtca gaggtgaaat tcttggattt 900

actgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggacgt tttcattaat caagaacgaa 960

agttagggga tcgaagatga tcagataccg tcgtagtctt aaccataaac tatgccgact 1020

agggatcggg tgttgttttt ataatgactc actcggcacc ttacgagaaa tcaaagtctt 1080

tgggttctgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1140

caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg gggaaactca ccaggtccag 1200

acacaataag gattgacaga ttgagagctc tttcttgatt ttgtgggtgg tggtgcatgg 1260

ccgttcttag ttggtggagt gatttgtctg cttaattgcg ataacgaacg agaccttaac 1320

ctactaaata gcgcgactag cttttgctgg tgctgacgct tcttagaggg actatcgatt 1380

tcaagtcgat ggaagtttga ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagac gttctgggcc 1440

gcacgcgcgc tacactgacg gagccagcga gtctagcctt ggccgagagg tcatgggtaa 1500

tcttgtgaaa ctccgtcgtg ctggggatag agcattgcaa ttattgctct tcaacgagga 1560

attcctagta agcgcaagtc agatatc 1587

Claims (10)

1.一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，其特征在于，包含18S rDNA基因片段-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列(GAP-p)-漆酶基因-酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子序列(GAP-t)-放线菌酮(CYH)抗性基因。

2.根据权利要求1所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体，其特征在于，所述漆酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.一种产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，

(1)漆酶(Lac)基因的克隆：提取云芝栓孔菌中总RNA，以提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得目的基因并与pMD19-T载体连接，转化提取，得到重组质粒；

(2)酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)GAP-p GAP-t基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得酵母GAP启动子(GAP-p)片段、GAP终止子(GAP-t)片段，将目的片段GAP-p、GAP-t分别连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-GP、pT-GT，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(3)放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)CYH敏感基因(L41)序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，及一对反向互补引物；以产朊假丝酵母基因组为模板,PCR扩增出L41上游片段、下游片段,这2片段的一端具有碱基重叠区；以这两上游片段、下游片段等量混合为模板,进行套叠PCR,即获得CYH抗性基因；将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上得到质粒载体pT-CYH，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(4)18S rDNA基因片段的克隆：根据GenBank数据库中产朊假丝酵母(C.utilis)18SrDNA基因序列结合pBR322质粒序列特征设计引物，以产朊假丝酵母基因组为模板,经PCR获得18S rDNA片段，将目的片段连接至载体pMD19-T simple vector上获得质粒载体pT-rD，转化大肠杆菌，阳性克隆进行菌液PCR鉴定并保存备用；

(5)同源整合表达载体的构建：提取pT-GP、pT-GT和pBR322质粒,分别进行酶切,回收目的片段，用T4 DNA连接酶将这3片段同时连接,获得质粒pBR-GAP；提取pT-CYH和pBR-GAP质粒,分别进行酶切，回收目的片段,用T4 DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-L；提取pBR-G-L质粒和漆酶(Lac)基因重组质粒，分别进行酶切，回收目的片段,用T4 DNA连接酶进行连接,获得质粒pBR-G-Q-L；提取pT-rD和pGQL质粒，分别进行酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接,获得产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR。

4.根据权利要求3所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，所述酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子(GAP-p)和终止子(GAP-t)的克隆中，引物设计如下：

启动子(GAP-p)：

GAP-p1:GGATATCTTACAGCGAGCACTCAA；

GAP-p2:GCTCTAGAATGTTGTTTGT；

终止子(GAP-t)：

GAP-t1：CTAGCTAGCTATGACTTTTAT；

GAP-t2：GGGATCCTTCATTCATCCCTCACTATCG。

5.根据权利要求3所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，所述放线菌酮(CYH)抗性基因的克隆中，引物设计如下：

P 4:CGTCGACAGTAAGTATGAAAAGAGC；

RM4:GGGATCCGG GTTTGGTCTATGTTGCT；

在引物P4中引入SalⅠ酶切位点，在引物RM4中引入BamHⅠ酶切位点；

反向互补引物设计如下：

P5:AACCAAGCAAGTTTTCCAC；

R5:GTGGAAAACTTGCTTGGTT。

6.根据权利要求3所述产漆酶的产朊假丝酵母菌表达载体的构建方法，其特征在于，所述18S rDNA基因片段的克隆中，引物设计如下：

P3:CGATATCTGCCAGTAGTCATATGC；

R3:CGATATCTGACTTGCGCTTACTAG；

在引物P3中引入EcoRⅤ酶切位点，在引物R3中引入EcoRⅤ酶切位点。

7.一种产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，其特征在于，将权利要求1至6任一所述含漆酶基因的产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR，重新拼接后得到序列为ZHQX1的产朊假丝酵母重组子，进行电转化，构建得到重组酵母菌株。

8.根据权利要求7所述产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，其特征在于，以pGQLR载体为模板进行引物设计，将片段序列分为两个片段，重新拼接后得到序列为ZHQX1，设计引物如下：

9.根据权利要求7所述产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌，其特征在于，所述产朊假丝酵母菌表达载体pGQLR中删除来自原核的DNA序列，所述DNA序列包括抗药性标记Amp在内的细菌质粒序列的DNA片段。

10.一种如权利要求1至9任一所述产漆酶的产朊假丝酵母基因工程菌在食品、制药以及畜禽饲料中的应用。

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