CN112034171A - 检测血清鞘氨醇-1-磷酸的试剂在制备用于区分肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例涉及一种检测血清鞘氨醇‑1‑磷酸的试剂在制备用于区分肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用。血清Sph(d18:1)‑1‑P的上调表现出对HCC良好的诊断性能。特别是Sph(d18:1)‑1‑P也可以作为用于诊断AFP阴性HCC的生物标志物。这些发现有助于非侵入性诊断包括AFP阴性HCC在内的HCC。

Description

检测血清鞘氨醇-1-磷酸的试剂在制备用于区分肝硬化或肝 细胞癌的试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种检测血清鞘氨醇-1-磷酸(Sph(d18:1)-1-P，S1P)的试剂在制备用于区分肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是世界上与癌症相关的死亡中第三大死亡原因，70％～90％的HCC可能从肝硬化患者而来。早期区分出HCC与肝硬化并进一步提供及时的治疗可以显著改善HCC的预后。然而，在HCC的早期阶段没有典型的症状，并且缺少HCC的特异性诊断生物标志物，因此许多患者在被诊断时已处于晚期。这一事实使许多患者错过了进行根治性治疗的最佳机会，例如进行肝切除或肝移植。
迄今为止，在临床实践中，通常使用成像方法和α-甲胎蛋白(AFP)来筛查和诊断HCC。但是，一方面，超声不能提供足够的灵敏度和客观性，可能导致诊断的不准确；而计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)因为会有辐射曝露或成本高昂，并不建议作为HCC的一般筛查工具；另一方面，AFP的阳性率仅限于二分之一到三分之二，即，大约40％的HCC患者无法检测到AFP。此外，AFP可能会受到许多非HCC疾病(例如肝炎、肝硬化、胆管癌等)的影响。总之，目前用血清生物标志物诊断HCC(包括AFP阴性HCC)的效果仍不理想。因此，仍然迫切需要在筛查HCC、特别是AFP阴性HCC的过程中，发现新的生物标志物。
鞘脂代谢高度互联，其中：神经酰胺占据鞘脂代谢网络的核心，神经酰胺可以被糖基化、磷酸化或去酰基化，以产生各种各样的代谢产物；其中：鞘氨醇(Sph)可以在神经酰胺酶的作用下生成，并被鞘氨醇激酶1(SphK1)进一步磷酸化为鞘氨醇-1-磷酸(如图1所示)。
现有研究中检测到的鞘脂的种类和数量并不全面，例如，未包括某些碳链长度的神经酰胺或S1P，这可能会导致错过最佳诊断生物标志物。同时，未给出这些单个标志物的敏感度和特异度，也未评估它们对AFP阴性HCC的诊断作用。此外，鉴于病因不同和种族差异，必须进一步筛选能够以高灵敏度和特异性区分中国人群中各种原因所致的HCC(包括AFP阴性HCC)与肝硬化的鞘脂代谢产物。血清鞘脂筛查或诊断HCC患者的能力仍然有待进一步探讨的问题。
高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)是一种能高度灵敏且特异地分析鞘脂代谢产物的强大工具，可用于该领域。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
为了更有效地区分肝硬化或肝细胞癌，本发明的目的在于提供一种提取或检测血清Sph(d18:1)-1-P的试剂在制备用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了以下技术方案：
本发明实施例的第一方面，提供了一种提取或检测血清Sph(d18:1)-1-P的试剂在制备用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用。
本发明实施例的第二方面，提供了一种血清Sph(d18:1)-1-P在制备或筛选用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂中的应用，所述用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂为提取或检测血清Sph(d18:1)-1-P的试剂。
在一种可能的实现方式中，区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的方法包括以下步骤：获取来自于待测对象的血清样品，通过HPLC-MS/MS检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平；将所得血清Sph(d18:1)-1-P水平与参考值进行比较。
在一种可能的实现方式中，当待测对象所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知时，检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平前不包括对待测对象的肝硬化或肝细胞癌的病因进行判断的步骤；
当检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平前待测对象的肝硬化或肝细胞癌的病因已知时，病因为乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种；可选地，病因为丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种。
在一种可能的实现方式中，所述待测对象的甲胎蛋白为阴性。
在一种可能的实现方式中，将所得血清Sph(d18:1)-1-P水平与参考值进行比较时，血清Sph(d18:1)-1-P的参考值为56.29pmol/0.1ml，当血清Sph(d18:1)-1-P的水平大于56.29pmol/0.1ml时，判断为肝细胞癌；当血清Sph(d18:1)-1-P的水平小于56.29pmol/0.1ml时，判断为肝硬化。
在一种可能的实现方式中，待测对象为中国人口；可选地：待测对象选自以下一种：所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知的中国人口，所患肝硬化或肝细胞癌的病因为乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种的中国人口；进一步可选地，待测对象选自以下一种：所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知的中国人口，所患肝硬化或肝细胞癌的病因为丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种的中国人口。
在一种可能的实现方式中，用于区分肝硬化和肝细胞癌的试剂盒中包括含有血清Sph(d18:1)-1-P的血清样品作为阳性对照。
本发明实施例的第三方面，提供了一种用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的生物标志物，由选自以下生物标志物中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上组成：Cer(d18:1/26:0)、Cer(d18:1/26:1)、Cer(d18:1/16:1)-1-P、HexCer(d18:1/18:0)、HexCer(d18:1/18:1)、dhSph(d18:1/18:0)、dhSph(d18:1/18:0)-1-P、dhCer(d18:0/24:1)-1-P、HexSph(d18:1)、Sph(d18:1)-1-P。
在一种可能的实现方式中，所述生物标志物由Sph(d18:1)-1-P以及选自Cer(d18:1/26:0)、Cer(d18:1/26:1)、Cer(d18:1/16:1)-1-P、HexCer(d18:1/18:0)、HexCer(d18:1/18:1)、dhSph(d18:1/18:0)、dhSph(d18:1/18:0)-1-P、dhCer(d18:0/24:1)-1-P、HexSph(d18:1)中的一种、两种、三种、四种或四种以上组成。
有益效果
本发明实施例中血清Sph(d18:1)-1-P的上调表现出对HCC良好的诊断性能。特别是Sph(d18:1)-1-P也可以作为用于诊断AFP阴性HCC的生物标志物。这些发现有助于非侵入性诊断包括AFP阴性HCC在内的HCC。本发明实施例中血清Sph(d18:1)-1-P作为生物标志物，可以区别所有病因的肝癌与肝硬化，从而使得医生无需对待测人群的病因进行确认即可对HCC进行筛查，应用更加方便且范围更广。
本发明实施例中选取了筛选出来的既能广泛用于诊断肝细胞癌又能针对性用于AFP阴性的肝细胞癌的10种生物标志物。除了Sph(d18:1)-1-P以外，它们也均可以单独使用、也可以相互组合使用用于区分待测对象为肝硬化或AFP阴性的肝细胞癌，其余9种生物标志物Cer(d18:1/26:0)、Cer(d18:1/26:1)、Cer(d18:1/16:1)-1-P、HexCer(d18:1/18:0)、HexCer(d18:1/18:1)、dhSph(d18:1/18:0)、dhSph(d18:1/18:0)-1-P、dhCer(d18:0/24:1)-1-P、HexSph(d18:1)中的一种、两种、三种、四种或四种以上可以与Sph(d18:1)-1-P组合起来用于区分待测对象为肝硬化或AFP阴性的肝细胞癌。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1鞘脂的代谢途径，该图包含了本发明实施例中检测的所有57种鞘脂。
图2A和图2B是血清鞘脂水平的比较图，其中：图2A中给出了肝硬化和HCC患者之间的具有显著差异的血清鞘脂；图2B中给出了肝硬化与AFP阴性HCC患者之间的血清鞘脂的显著差异。数据用平均值±SEM表示。(*P＜0.05,**P＜0.01，Mann-Whitney-U检测)。
图3A和图3B是通过OPLS-DA识别生物标志物的示意图，横坐标表示主要成分的得分值，纵坐标表示正交成分的得分值；其中：图3A是从肝硬化和HCC患者获得的评分图；图3B是从肝硬化和AFP阴性HCC患者获得的评分图。这些点的不同颜色代表不同的组，这些组基于鞘脂的水平很好地分开，表明这些组间的血清鞘脂存在显著差异。
图4A和图4B是ROC曲线分析，其中：图4A是血清Sph(d18:1)-1-P区分HCC与肝硬化患者的ROC曲线分析；图4B是血清Sph(d18:1)-1-P区分APF阴性HCC与肝硬化患者的ROC曲线分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在这项研究中，发明人使用HPLC-MS/MS对72例中国HCC患者(包括24例AFP阴性HCC)和104例中国肝硬化患者的57种血清鞘脂代谢产物进行了定量，目的是探讨中国HCC患者的血清鞘脂代谢产物的表达谱并寻找可以具有特异性和灵敏性地区分各种原因所致的HCC(包括AFP阴性HCC)与肝硬化的鞘脂，即寻找具有普遍适用意义的能区分HCC和肝硬化的鞘脂标志物，而不是必须针对特定原因导致的HCC和肝硬化。
鞘脂***命名法：Sph(d18:1)或Sphingosine(d18:1)代表鞘氨醇，鞘氨醇名称括号中的“d”代表二羟基，其后被冒号分隔的两个数字分别代表鞘氨醇的碳原子数与不饱和键的数量。dhSph(d18:0)代表二氢鞘氨醇。二氢神经酰胺(dhCer)和神经酰胺(Cer)是由14个碳至26个碳的脂肪酸烷基链分别连接二氢鞘氨醇和鞘氨醇的氨基上后形成，对于dhCer和Cer名称中的脂肪酸烷基链的命名，在斜线前表示所连接的二氢鞘氨醇或鞘氨醇的情况；在斜线后，冒号分隔的两个数字分别代表脂肪酸烷基链碳原子数和不饱和键的数量，如Cer(d18:1/24:1)代表鞘氨醇连接了一个包含24个碳原子和一个不饱和键的脂肪酸烷基链。二氢神经酰胺(dhCer)可以经过4,5-E-去饱和进而产生神经酰胺(Cer)。神经酰胺(Cer)脱-N-酰化反应可以产生鞘氨醇，而鞘氨醇可以通过鞘氨醇激酶进一步磷酸化产生鞘氨醇-1-磷酸(Sph(d18:1)-1-P)。
实施例1、患者群体和临床病理数据收集
自2014年7月至2015年5月，在中国首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病及人工肝中心，176例患者相继纳入本研究中。
患者群体纳入及排除标准
(1)HCC的诊断：依据中国原发性肝癌诊断和治疗指南以及EASL-EORTC《肝细胞癌临床管理指南》。肝硬化依据既定标准诊断，主要基于超声、CT、MRI成像的临床数据、肝功能受损和/或组织学证据。在血样采集之前，没有HCC患者接受过HCC的局部或全身治疗(包括介入、手术、放化疗、靶向药物治疗)，目的是消除治疗对鞘脂代谢产物的影响，并且HCC患者中部分患者既往未曾被诊断为肝硬化。排除标准如下：伴有其他严重的活动性身心疾病，包括未被控制的原发性肾脏、心脏、肺脏、血管性、神经性、代谢性疾病(甲状腺功能亢进，严重糖尿病和肾上腺疾病)；脂质代谢异常：严重高脂血症、脂质贮积病、肥胖症(体重指数BMI≥25kg/m2)，免疫缺陷疾病或其他***肿瘤；妊娠期或哺乳期。
肿瘤大小基于组织病理学特征或医学影像定义为单个病变肿块的最大直径或多个病变的两个最大肿瘤直径之和。在这项研究中，根据肿瘤大小(肿瘤尺寸≤2cm和>2cm)将患者分为两组。TNM分期根据美国癌症肝癌TNM分期联合委员定义如下：
Figure BDA0002649481400000051
Figure BDA0002649481400000061
根据巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期***分为早期(A)、中期(B)、晚期(C)和终末期疾病(D)。
AFP阴性HCC的诊断标准：血清AFP浓度≤20ng/ml的HCC。
(2)肝硬化的诊断标准：影像学、生物化学或血液学检查存在肝细胞合成功能障碍或门静脉高压症(如脾功能亢进及食管胃底静脉曲张)证据，或组织学符合肝硬化诊断。所有患者经影像学或肝穿病理检查排除HCC。
本发明研究根据《赫尔辛基宣言》进行。研究方案经首都医科大学附属北京佑安医院医学伦理审查委员会批准。所有参与者均提供了书面同意。
临床特征、生化检测和评分***
使用Olympus自动生化分析仪AU5400(Olympus，东京，日本)测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)；使用自动电化学发光免疫分析(RocheDiagnostics，上海，中国)测定AFP水平。
本研究评估了纳入人群的各种非侵入性标志物，以评价HCC患者和肝硬化患者的肝脏纤维化(纤维化4指数FIB-4、天冬氨酸氨基转移酶与血小板比率指数APRI)及肝病严重程度(TBIL、ALB、终末期肝病模型MELD等)，其均根据纳入时的临床和实验室参数计算得出。MELD评分***参见文献1：Kamath PS,Wiesner RH,Malinchoc M,et al.A model topredict survival in patients with end-stage liver disease，Hepatology2001；33:464–470；文献2：Adnan Said,John Williams,Jeremy Holden,et al.Model for endstage liver disease score predicts mortality across a broad spectrum of liverdisease.J Hepatol,2004,40(6):897-903。APRI和FIB-4评分***参见文献3：W Ray Kim,Thomas Berg,Tarik Asselah,et al.Evaluation of APRI and FIB-4scoring systemsfor non-invasive assessment of hepatic fibrosis in chronic hepatitis Bpatients.J Hepatol,.2016Apr；64(4):773-780；文献4：中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2019年版).中华实验和临床感染病杂志(电子版),2019,13(6):441-466。
统计分析
使用IBM SPSS统计软件包22.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析数据。除非另有说明，否则在两尾试验中P<0.05视为具有统计学意义。连续变量用平均值±标准偏差/标准误差或中位数(范围)表示，这取决于数据是否服从正态分布。二分变量用数字或百分比表示。根据数据特征进行单变量分析，使用t检验或Mann-Whitney-U检验比较两组间的连续定量数据。使用卡方检验进行计数数据集之间的比较。
患者群体的人口统计学、临床特征、生化检测、***评分结果
本分析中包括总共72例HCC患者(包括24例血清AFP阴性HCC患者)和104例肝硬化患者。在这些组中，性别、年龄和肝功能(包括ALT、AST、TBIL、DBIL、TP、ALB)的差异均不显著(所有P>0.05)。肝硬化患者的MELD评分显著高于HCC患者。通过以下事实很容易理解这一点：肝硬化患者经常因各种并发症而就医，但是纳入本研究的HCC患者为首次被诊断。肝硬化和HCC组分别有75例(72.12％)和49例(68.06％)男性患者，平均年龄分别为54.26岁和56.28岁。肝硬化和HCC患者的病因主要包括HBV(47.12％vs 58.33％)、HCV(14.42％vs6.94％)、酒精性肝病(16.34％vs 4.17％)和其他病因(22.12％vs 30.56％)。表1给出了参与者的详细的人口统计学和临床特征。
Figure BDA0002649481400000081
表1中数据用平均值±SD、中位数(范围)或n(％)表示。
Figure BDA0002649481400000091
表示肝硬化和HCC之间的比较。
Figure BDA0002649481400000092
表示肝硬化与AFP阴性HCC之间的比较。P<0.05具有统计学意义。*：其他病因包括原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病、具有两种或多种原因的肝病等。缩略语：HCC：肝细胞癌；SD：标准偏差；AFP：甲胎蛋白；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；TBIL：总胆红素；DBIL：直接胆红素；TP：总蛋白；ALB：白蛋白；MELD：终末期肝病模型；FIB-4：纤维化4评分；APRI：天冬氨酸氨基转移酶与血小板的比率指数；ALD：酒精性肝病。
实施例2、血清鞘脂代谢产物的测定
血清鞘脂的检测：使用HPLC-MS/MS进行血清鞘脂代谢产物的测定，其中HPLC色谱分离采用Spectra C8SR柱(150x 3.0mm)；3微米粒径，Peeke Scientific)，流动相A为含有0.2％甲酸的水作为溶剂的2mM甲酸铵溶液，流动相B为含有0.2％甲酸的甲醇作为溶剂的ImM甲酸铵溶液，流动相洗脱程序如下：
Figure BDA0002649481400000093
使用Agilent 6410B三重四级质谱仪(Agilent Technologies Inc.，SantaClara，CA)进行HPLC-MS/MS，该质谱仪包括配有电喷雾电离接口的三重四极杆质量分析器和Agilent 1200 RRLC***(HPLC-MS/MS)；质谱的参数为：极性＝正，气体温度＝350℃，气体流量＝6L/min，雾化器＝15psi，毛细管＝4000V。
Figure BDA0002649481400000094
Figure BDA0002649481400000101
Figure BDA0002649481400000111
数据分析：使用IBM SPSS统计软件包22.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析数据。除非另有说明，否则在两尾试验中P<0.05视为具有统计学意义。连续变量用平均值±标准偏差/标准误差或中位数(范围)表示，这取决于数据是否服从正态分布。二分变量用数字或百分比表示。根据数据特征进行单变量分析，使用t检验或Mann-Whitney-U检验比较两组间的连续定量数据。使用卡方检验进行计数数据集之间的比较。进行多元逻辑回归分析(前向逐步法)以找出与总HCC或AFP阴性HCC独立相关的鞘脂代谢产物，纳入和移除的P值分别设为0.05和0.1。使用Spearman等级检验进行相关性分析。血清生物标志物的诊断性能通过受试者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve，ROC)下面积计算。
采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)—一种多变量分析，使用SIMCA 13.0软件(Umetrics，Umea，瑞典)从视觉上区分HCC或AFP阴性HCC患者与肝硬化患者。鞘脂数据经均值中心化处理和UV缩放。使用R2Y(cum)和Q2(cum)值检验每个OPLS-DA模型的质量，这两个值(介于0～1)分别用于评估模型的稳定性和可预测性。选择生物标志物的标准如下：变量投影重要性值大于1；刀切法不确定度不为零；S-plot中的P-corr的绝对值为0.58。在正交偏最小二乘判别分析中通过使用100个随机置换的置换检验来计算交叉验证参数Q2，以测试模型对抗过拟合的有效性。
1、HCC或肝硬化患者的血清鞘脂轮廓
在HCC和肝硬化患者之间，有24种鞘脂代谢产物显著不同(P<0.05)，在HCC患者中包括3项下调和21项上调的鞘脂代谢产物。表2和图2A中给出了HCC或肝硬化患者中血清鞘脂轮廓的详细特征。
Figure BDA0002649481400000131
Figure BDA0002649481400000141
Figure BDA0002649481400000151
Figure BDA0002649481400000161
表2中鞘脂水平单位：pmol/0.1mL血清。数据以中位数(范围)表示。
Figure BDA0002649481400000171
为肝硬化和HCC的比较。
Figure BDA0002649481400000172
为肝硬化和AFP阴性HCC的比较。P<0.05认为有统计学意义。
通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结果发现，Sph(d18:1)-1-P可以区分HCC与肝硬化，R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.717和0.604(图3A)。通过Roc分析评估了该血清鞘脂的诊断性能，其AUC为0.85(95％CI：0.79-0.91)(P<0.001)。当Sph(d18:1)-1-P的临界值设为56.29pmol/0.1ml时，灵敏度和特异度分别为79.20％和78.70％。
为了比较Sph(d18:1)-1-P与AFP的诊断价值，我们还评估了AFP的AUC，其为0.83(95％CI：0.77-0.90)(P<0.001)。当Sph(d18:1)-1-P的临界值设为20.32ng/ml时，敏感度和特异度分别为66.70％和88.80％。
尽管Sph(d18:1)-1-P的AUC高于AFP，受试者工作曲线下面积(AUC)分别为0.85和0.83但差异并不显著(P>0.05)(图4A)。Sph(d18:1)-1-P和AFP在区分HCC和肝硬化的功效方面无显著差异。
2、AFP阴性HCC或肝硬化患者的血清鞘脂轮廓
AFP阴性HCC与肝硬化之间的基线临床参数的差异不显著(P>0.05，表1)。十六种鞘脂代谢产物显著地展现出明显的差异(P<0.05)，包括5种下调和11种上调的鞘脂。表2和图2B中显示了AFP阴性HCC患者中血清鞘脂轮廓的详细信息。
进行OPLS-DA以区分AFP阴性HCC与肝硬化。结果表明Sph(d18:1)-1-P也可以区分AFP阴性HCC与肝硬化患者，R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.568和0.464(图3B)。Sph(d18:1)-1-P的AUC为0.79(95％CI：0.68-0.90)(P<0.001)，当Sph(d18:1)-1-P的临界值设为56.29pmol/0.1ml时，灵敏度和特异度分别为62.50％和77.90％(图4B)。
3、血清Sph(d18:1)-1-P与临床参数的相关性
肝硬化患者的AFP水平显著低于HCC患者(P<0.01)，而肝硬化和AFP阴性HCC患者之间的AFP水平差异并不显著(P>0.05)。Spearman等级相关性分析显示，在肝硬化(r＝-0.04，P＝0.71)、总HCC(r＝0.06，P＝0.60)，AFP阳性HCC(r＝-0.09，P＝0.56)或AFP阴性HCC(r＝-0.13,P＝0.55)中，各自的血清Sph(d18:1)-1-P的水平与AFP均不相关。
为了探讨Sph(d18:1)-1-P与肿瘤大小之间的关系，我们根据肿瘤大小将HCC患者分为两组(肿瘤大小≤2cm和>2cm)。这两组间的血清Sph(d18:1)-1-P水平无显著统计学差异(58.09±3.09vs 58.11±2.54pmol/0.1ml，P＝0.476)。此外，我们根据TNM分期***将HCC患者分为四组，即TNM I、TNM II、TNM III和TNM IV。血清Sph(d18:1)-1-P的水平分别为58.18±2.91、57.78±1.57、58.74±3.15和58.20±3.31pmol/0.1ml。这些组之间没有差异(P＝0.771)。此外，两组之间的差异也不显著(所有P>0.05)。然后根据BCLC分期***将HCC患者分为四组，即A、B、C和D。血清Sph(d18:1)-1-P的水平分别为58.45±2.81、57.91±1.62、59.10±3.50和58.30±3.15pmol/0.1ml。同样，两组之间的差异也不显著(所有P>0.05)。
研究发现，与AFP阳性HCC患者相比，AFP阴性HCC患者较少出现肝硬化结节和较差的Edmondson-Steiner等级，相反，他们更有可能形成完整的肿瘤包膜并具有有利的长期预后。此外，我们统计了远处转移、肝内转移和门静脉侵犯的HCC患者的数量。分析结果表明，与AFP阳性HCC患者相比，AFP阴性HCC患者发生远处转移(P<0.001)、肝内转移(P＝0.007)和门静脉侵犯(P＝0.016)的几率更低。因此，为了提高AFP阴性HCC患者的生存率和预后，识别这些患者并及时提供治疗至关重要。
本发明中，发明人创造性地发现血清Sph(d18:1)-1-P可以区分HCC(包括AFP阴性HCC)与肝硬化。据我们所知，这是关于Sph(d18:1)-1-P在有效区分AFP阴性HCC与肝硬化的能力方面的首次报道。
在这项研究中，我们发现包括Sph(d18:1)-1-P在内的10种鞘脂在AFP阴性HCC和肝硬化之间、以及HCC和肝硬化之间均表现出显著差异。除了2个HexCer外，AFP阴性HCC患者中其余8个鞘脂均上调，并且其中大多数属于长链或超长链鞘脂。这一发现为我们进一步研究HCC和AFP阴性HCC的发病机制奠定了初步基础。
值得注意的是，我们检测到了更多类型和数量的鞘脂，这为寻找最佳诊断生物标志物提供了更多机会和更有说服力的证据。此外，我们发现，在中国人群中，Sph(d18:1)-1-P的上调与HCC关系最为密切，不同病因、地区、种族等等的多样性会影响生物标志物的选择。
有趣且重要的是，我们的发现首先表明Sph(d18:1)-1-P可以有效地区分AFP阴性HCC和肝硬化。此外，我们发现肝硬化或HCC患者中Sph(d18:1)-1-P的水平与AFP浓度无关，肝硬化、AFP阳性HCC和AFP阴性HCC患者中，血清Sph(d18:1)-1-P与AFP均不相关。这表明在HCC患者中Sph(d18:1)-1-P的调节机制可能独立于AFP。我们的结果还显示，两组之间血清Sph(d18:1)-1-P的水平差异在统计学上不显著(肿瘤大小≤2cm或>2cm，P＝0.476)。同样，在不同TNM分期和BCLC分期的患者之间也没有差异。因此，从这些结果可以推断出，Sph(d18:1)-1-P可用于识别各种类型的HCC患者，但与肿瘤大小、TNM分期和BCLC分期无关。
综上，血清Sph(d18:1)-1-P的上调表现出对HCC良好的诊断性能。特别是Sph(d18:1)-1-P也可以作为用于诊断AFP阴性HCC的生物标志物。这些发现有助于非侵入性诊断包括AFP阴性HCC在内的HCC。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.提取或检测血清Sph(d18:1)-1-P的试剂在制备用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂盒中的应用。
2.血清Sph(d18:1)-1-P在制备或筛选用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂中的应用，所述用于区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的试剂为提取或检测血清Sph(d18:1)-1-P的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的应用，其特征在于：区分待测对象为肝硬化或肝细胞癌的方法包括以下步骤：获取来自于待测对象的血清样品，通过HPLC-MS/MS检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平；将所得血清Sph(d18:1)-1-P水平与参考值进行比较。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
当待测对象所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知时，检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平前不包括对待测对象的肝硬化或肝细胞癌的病因进行判断的步骤；
当检测血清样品中的血清Sph(d18:1)-1-P水平前待测对象的肝硬化或肝细胞癌的病因已知时，病因为乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种；可选地，病因为丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述待测对象的甲胎蛋白为阴性。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所得血清Sph(d18:1)-1-P水平与参考值进行比较时，血清Sph(d18:1)-1-P的参考值为56.29pmol/0.1ml，当血清Sph(d18:1)-1-P的水平大于56.29pmol/0.1ml时，判断为肝细胞癌；当血清Sph(d18:1)-1-P的水平小于56.29pmol/0.1ml时，判断为肝硬化。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：待测对象为中国人口；可选地：待测对象选自以下一种：所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知的中国人口，所患肝硬化或肝细胞癌的病因为乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种的中国人口；进一步可选地，所患肝硬化或肝细胞癌的病因未知的中国人口，所患肝硬化或肝细胞癌的病因为丙型肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、隐源性肝硬化、肝静脉闭塞性疾病中的一种或多种的中国人口。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：用于区分肝硬化和肝细胞癌的试剂盒中包括含有血清Sph(d18:1)-1-P的血清样品作为阳性对照。
9.一种用于区分待测对象为肝硬化或AFP阴性的肝细胞癌的生物标志物，其特征在于：由选自以下生物标志物中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上组成：Cer(d18:1/26:0)、Cer(d18:1/26:1)、Cer(d18:1/16:1)-1-P、HexCer(d18:1/18:0)、HexCer(d18:1/18:1)、dhSph(d18:1/18:0)、dhSph(d18:1/18:0)-1-P、dhCer(d18:0/24:1)-1-P、HexSph(d18:1)、Sph(d18:1)-1-P。
10.根据权利要求9所述的生物标志物，其特征在于：由Sph(d18:1)-1-P以及选自Cer(d18:1/26:0)、Cer(d18:1/26:1)、Cer(d18:1/16:1)-1-P、HexCer(d18:1/18:0)、HexCer(d18:1/18:1)、dhSph(d18:1/18:0)、dhSph(d18:1/18:0)-1-P、dhCer(d18:0/24:1)-1-P、HexSph(d18:1)中的一种、两种、三种、四种或四种以上组成。
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