CN112034056A - 一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是包括如下步骤：包括采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC‑MS/MS），以十八烷基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以乙腈为有机相与挥发性盐试剂溶液为水相混合作为流动相，进行洗脱，以质谱检测器进行检测。本发明的目的在于提供一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，该方法专属性好，灵敏度高，样品配制简单，快速、准确的检测有机药物中四丁基溴化铵的含量，从而保证药物的质量可控，从而也确保了药品的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及药品左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的分析方法，具体是一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法。
背景技术
控制杂质含量是确保药品安全的重要方法。在药品杂质分析中，基因毒性杂质对人体的危害是极大的。基因毒性杂质能直接或间接的损害细胞的DNA，产生致突变和致癌作用的物质。基因毒性杂质主要来源于药品合成中的起始原料、中间体、试剂和反应副产物中，同时在药品制剂和储存环节中，药品也有可能降解产生基因毒性杂质。在2006年，欧洲药物管理局颁布了《基因毒性杂质限度指南》，随后ICH和美国食品和药品管理局也颁布了基因毒性杂质的控制法规，加强了对基因毒性杂质的监管。
四丁基溴化铵又名TBAB，是一种季铵盐，广泛应用于各类药品的合成过程中，如抗感染药物巴氨西林、舒他西林，抗糖尿病药物达格列净等列净药物。然而，研究发现，四丁基溴化铵具有基因毒性，在盐酸帕罗西汀药物中，需要严格控制四丁基溴化铵限度（25ppm）,才能保证药品在临床应用的安全性。基于四丁基溴化铵的含量限度极低， 需要一种灵敏性高、专属性好的分析方法是非常迫切的。
由于四丁基溴化铵无紫外吸收且不易挥发，因此无法用常规的液相色谱紫外检测和气相色谱检测，目前，检测方法主要有离子色谱法和溴离子选择电极法。
溴离子选择电极法1）灵敏度差：极低含量的四丁基溴化铵会超出仪器的线性范围；2）专属性差：易受药品中其他溴离子杂质的干扰；3）变量因素多：检测过程中待测液温度、搅拌速度和电极变量因素均对四丁基溴化铵含量的准确度有很大影响。
离子色谱法：1）样品处理复杂：离子色谱检测需要样品易溶于水，四丁基溴化铵易溶于水，但有机药物在水的溶解度较差，需要很复杂的样品处理来保证分析准确性；2）专属性差:离子色谱法也是通过检测溶液中的溴离子来确定四丁基溴化铵的含量，受药品中其他溴离子杂质的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，该方法专属性好，灵敏度高，样品配制简单，快速、准确的检测有机药物中四丁基溴化铵的含量，从而保证药物的质量可控，从而也确保了药品的有效性和安全性。
本发明的技术方案如下：
一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是包括如下步骤：包括采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS），以十八烷基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以乙腈为有机相与挥发性盐试剂溶液为水相混合作为流动相，进行洗脱，以质谱检测器进行检测。
所述挥发性盐试剂溶液的浓度为5～ 30mmol/L；所述挥发盐试剂为甲酸铵，pH 值调节剂甲酸，pH 值调节剂含量为0.01～0.5%。
所述水相的洗脱体积比为18%～22%。
所述流动相的流速为0.27ml/min～0.33ml/min。
所述色谱柱的柱温为37℃～43℃。
所述有机药物为西坦类药物，所述西坦类药物为抗癫痫类药。
所述本发明的方法，进一步包括以下步骤 ：
（1）取有机药物适量，加乙腈超声溶解稀释制成每 1ml 中含0.1～2mg的溶液，优选0.2mg，过0.22µm的有机滤膜，取续滤液精密移取0.1ml至10 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取四丁基溴化铵对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含0.5～10ng的溶液，优选1ng，作为对照品溶液；
（2）取供试品溶液和对照品溶液各1～10μl，优选5μl，注入串联四级杆液质联用仪；
（3）洗针溶液为乙腈、50%乙腈溶液、50%甲醇、甲醇、甲醇：水：甲酸（500:500:1)，优选甲醇：水：甲酸（500:500:1)。
（4）质谱条件为离子源为ESI（+），检测方式为多反应监测（MRM）方式，喷雾电压5500 V，离子源温度550℃，Curtain Gas 25 psi，Ion Source Gas1 50 psi，Ion SourceGas2 60 psi，驻留时间100 msec；其它MRM 参数见表1。
表1四丁基溴化铵含量检测MRM参数表
（5）采用外标法以峰面积计算有机药物中四丁基溴化铵的含量，定量离子采用丰度最大的二级碎片。
本发明的方法，有益效果或优势在于 ：
①专属性强，能够提供四丁基溴化铵的定量结果，同时溶剂、有机药物，药物的杂质不会干扰测定 ；
②灵敏度高，本发明中四丁基溴化铵最低检测浓度为 0.05ng/ml，能够保证微量杂质的检出 ；
③耐用性好，微调色谱条件中柱温和流速等参数在本发明的范围内波动，不会对检测结果产生显著影响；
④实用性强，本发明中仅需5min 即可完成四丁基溴化铵测定，且检测过程简单、便捷。
附图说明
图 1为空白溶剂的质谱图 ；
图2为对照品溶液的质谱图；
图3是供试品溶液的质谱图；
图4是样品加标溶液的质谱图。
附图5为四丁基溴化铵的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
如图1至图5。
实施例1
实验条件：
1）液相色谱条件：色谱柱：Waters HILIC 2.1*100mm,1.7um。流动相：A 为10.0mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）水溶液，B 为乙腈，等度洗脱：0～5.0 min，80％流动相B，流速：0.3 ml/min；柱温40℃；进样体积：5μl，洗针溶液：甲醇：水：甲酸（500:500:1）。
2）质谱条件：离子源为ESI（+），检测方式为多反应监测（MRM）方式，质谱条件具体为：喷雾电压5500 V，离子源温度550℃，Curtain Gas25 psi，Ion Source Gas1 50 psi，Ion Source Gas2 60 psi，驻留时间100 msec；其它MRM 参数见表2。
表2四丁基溴化铵含量检测MRM参数表
实验步骤：
储备液1：精密称取25mg 四丁基溴化铵至25 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液1（1mg/ml）。
储备液2：精密移取0.1ml储备液1至50 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液2（2μg/ml）。
储备液3：精密移取0.5ml储备液2至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液3（0.1μg/ml）。
对照品溶液（***适用性溶液）：将100µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为对照品溶液。（1ng/ml）。
供试品溶液：取样品约5.0mg，精密称定，于25ml量瓶中，用乙腈溶解超声3min，稀释至刻度。过0.22µm的有机滤膜，取续滤液精密移取0.1ml至10 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
样品加标溶液：取样品约5.0mg，精密称定，于25ml量瓶中，用乙腈溶解超声3min，稀释至刻度，过0.22µm的有机滤膜，取续滤液精密移取0.1ml至10 ml量瓶中，加入100µL储备液3，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为样品加标溶液。
结果表示：空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、样品加标溶液均无干扰，说明专属性好。
实施例2
实验条件：同实施例1。
实验步骤：
线性溶液-10%：将10µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
线性溶液-50%：将50µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
线性溶液-80%：将80µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
线性溶液-100%：将100µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
线性溶液-150%：将150µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
线性溶液-300%：将300µL储备液3至10 ml量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度摇匀。
实验结果：以浓度C对峰面积A进行线性回归，试验结果见表3。四丁基溴化铵在0.00010~0.00297μg/ml的浓度范围内，浓度与峰面积呈线性关系，线性回归方程为：y = 1,208,476,505.0000x - 56,902.5736 (r= 0.997，n= 6)，响应因子RSD为13.3%，Y轴截距在100%响应值的5.0%。符合要求。
表3四丁基溴化铵标准曲线
实施例3
实验方法：同实施例1。
实验步骤：
定量限溶液：精密移取储备液3 5µl至10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀。精密量取5µl注入串联四级杆液质联用仪，将测出的信号与基线噪音进行比较，以检测信噪比S/N≥ 10时作为定量限。
检出限溶液：精密移取储备液3 2.5µl至10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀。精密量取5µl注入串联四级杆液质联用仪，将测出的信号与基线噪音进行比较，以检测信噪比S/N≥ 3时作为检出限。
实验结果：S/N≥ 3时，四丁基溴化铵为0.000025μg/ml。S/N≥ 10 时，四丁基溴化铵为0.00005μg/ml，满足检测要求，且定量限浓度项下进样精密度试验中，四丁基溴化铵的峰面积的RSD不大于 20%，保留时间的RSD不大于 2%，符合要求。
表4检出限结果
表5定量限结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是包括如下步骤：
包括采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS），以十八烷基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以乙腈为有机相与挥发性盐试剂溶液为水相混合作为流动相，进行洗脱，以质谱检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述挥发性盐试剂溶液的浓度为5～ 30mmol/L；所述挥发盐试剂为甲酸铵，pH 值调节剂甲酸，pH 值调节剂含量为0.01～0.5%。
3.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述水相的洗脱体积比为18%～22%。
4.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述流动相的流速为0.27ml/min～0.33ml/min。
5.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述色谱柱的柱温为37℃～43℃。
6.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述有机药物为西坦类药物，所述西坦类药物为抗癫痫类药。
7.根据权利要求1所述的一种检测左乙拉西坦中四丁基溴化铵含量的检测方法，其特征是所述本发明的方法，进一步包括以下步骤 ：
（1）取有机药物适量，加乙腈超声溶解稀释制成每 1ml 中含0.1～2mg的溶液，优选0.2mg，过0.22µm的有机滤膜，取续滤液精密移取0.1ml至10 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取四丁基溴化铵对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含0.5～10ng的溶液，优选1ng，作为对照品溶液；
（2）取供试品溶液和对照品溶液各1～10μl，优选5μl，注入串联四级杆液质联用仪；
（3）洗针溶液为乙腈、50%乙腈溶液、50%甲醇、甲醇、甲醇：水：甲酸（500:500:1)，优选甲醇：水：甲酸（500:500:1)；
（4）质谱条件为离子源为ESI（+），检测方式为多反应监测（MRM）方式，喷雾电压5500 V，离子源温度550℃，Curtain Gas 25 psi，Ion Source Gas1 50 psi，Ion Source Gas2 60psi，驻留时间100 msec；其它MRM 参数见表1：
表1四丁基溴化铵含量检测MRM参数表
（5）采用外标法以峰面积计算有机药物中四丁基溴化铵的含量，定量离子采用丰度最大的二级碎片。
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