CN112033944B - 一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化妆品安全性评价技术领域，针对化妆品刺激性评价方法评价指标主观性较强的问题，公开一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，包括以下步骤：设置正常对照组和测试组，测试组以水溶方式加入待测化妆品，然后取正常对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，统计斑马鱼的皮肤上的中性粒细胞个数，并统计学分析。本发明的评价方法，评价指标选取、获得和处理分析更加客观，而且评价结果可量化，不仅能够评价单一化妆品是否具有刺激性，还可以比较不同化妆品的刺激性强弱；由于斑马鱼饲养成本低，体积小，发育周期短、单次产卵次数高的特点能同时进行多个化妆品的评价，评价效率高，评价成本低，方便实验室评价。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品安全性评价技术领域，具体涉及一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法。
背景技术
目前常见的评价化妆品对皮肤刺激性的方法有人体封闭斑贴测试、动物实验法、鸡胚绒毛***试验法和三维重组皮肤模型等。
人体封闭斑贴测试：选择符合条件的18～60岁的受试者30人，均无皮肤炎症及其他不适宜参加测试的疾病或状况。用去离子水将受试物配制为质量分数1％和5％两个浓度水平。将0.020～0.025mL测试样品滴加在斑试器内附的滤纸片上，将滤纸片置于斑试器内，设置溶剂孔以及空白对照孔。将装有样品的斑试器用无刺激性胶带贴敷于受试者背部，用手掌轻压使其固定，贴敷24h。去除斑试器30min后，待压痕消失后由皮肤科大夫观察皮肤反应，在斑贴试验后24h和48h再分别观察一次，记录反应结果并评分。根据出现不良反应的人数评价受试物刺激性。
动物实验法是皮肤刺激性的标准方法，分为急性皮肤刺激试验和多次皮肤刺激试验。急性皮肤刺激试验：采用健康成年皮肤无损伤的豚鼠或家兔作为受试动物，试验前约24h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取受试物约0.5mL(g)直接涂在皮肤上，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。于清除受试物后的1、24、48和72h观察涂抹部位皮肤反应，按红斑和焦痂形成等级和水肿形成等级进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24、48和72h各观察时点最高积分均值，按积分均值判定受试物皮肤刺激性。多次皮肤刺激性：试验前将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为3cm×3cm，涂抹面积2.5cm×2.5cm。取受试物约0.5mL(g)涂抹在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。一小时后观察结果，按表红斑和焦痂形成等级和水肿形成等级评分，对照区和试验区同样处理。结果按公式计算每天每只动物平均积分，以积分均值判定受试物皮肤刺激性。
鸡胚绒毛***试验法：选取新鲜、干净、完好的鸡胚，质量50g～60g。孵化至9日龄时,应照蛋检查,弃去未受精、无活性或有缺陷的鸡胚，严重畸形、破壳或薄壳鸡胚也不能使用。将受精鸡蛋室温静置24h,孵化9天进行试验,每组试验设置6只鸡胚，同时设置溶剂对照、阴性对照(质量分数为0.9％氯化钠溶液)、阳性对照(质量分数为1％SDS,0.1mol/L氢氧化钠)。试验分为反应时间法和终点评价法。反应世间法：,用移液枪或一次性无菌注射器取0.3mL透明液体受试物直接滴加在***上,尽量覆盖CAM表面并开始计时,观察膜反应情况并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间。按照出血、凝血和血管融解出现的时间通过公式计算刺激评分。终点评价法：用于微粒状、颗粒状、音状等固体和浑浊液体受试物的检测。取0.3mL.经挤压的固体、微粒或颗粒物(已经研磨成微细颗粒)直接作用于CAM,确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖,或直接将涂布膏状物的薄膜与CAM膜接触。作用3min后,用生理盐水轻轻冲洗CAM膜上的受试物,冲洗操作可能很快将CAM膜上轻度的出血变化掩盖,因此应在30s冲洗完成后观察结果。观察并评分出血、凝血和血管融解的等级，按三种毒性效应的评分总和评价受试物皮肤刺激性。
三维重组皮肤模型：将皮肤模型于基础培养基中置于37℃培养箱中培养过夜。将液体原料或固体原料加至皮肤模型表面，使原料与皮肤模型表面充分接触作用15min，以DPBS为阴性对照，5％的SDS为阳性对照。用DPBS缓冲液冲洗受试物终止反应，然后将皮肤模型转至新鲜培养基在37℃孵育42h。孵育结束后，将皮肤模型置于MTT培养基中培养3h，然后将表皮取出加入酸性异丙醇充分萃取。离心，取上清液在570nm测OD值，以酸性异丙醇为空白，计算测得的OD值，根据OD值计算相对活性(％)。按照细胞活性值评价受试物皮肤刺激性。
上述现有的评价方法的评价指标如数量、身体情况、剂量、面积、部位、毒性效应等级、细胞活率生长情况和细胞计数等评判的主观性较强，依赖于实施者的经验，导致试验评分主观性强，对结果有较大的主观干扰因素；同时动物实验方法不符合3R(减少、替代、优化)原则，不符合动物保护和福利的要求。皮肤模型方法中，OECD标准中认可的3D皮肤模型大多为国外生产的，价格昂贵，其培养和运输成本过高。
因此开发评价指标客观化，低成本，操作简洁，且更加人性化的化妆品测试方法无疑具有重要的意义和价值。
发明内容
针对现有的化妆品刺激性评价方法评价指标主观性较强的问题，本发明的目的在于提供一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，能够更加客观的评价化妆品刺激性，而且成本低。
本发明提供如下的技术方案：
一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养；
(2)设置测试组：取与上述步骤同规格的斑马鱼为受试对象，置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，相同条件下培养；
(3)检测：取正常对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件分析图像并采集数据，基于统计学方法获得斑马鱼皮肤上的中性粒细胞个数；
(4)刺激性评价：刺激性作用的量化计算公式为：
其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N(正常对照组)表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值。
作为本发明方法的优选，所用斑马鱼为受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼。
作为本发明方法的优选，所述待测化妆品包括但不限于至少含有甘油、甲基异噻唑啉酮、乙醇和丁二醇中的一种的化妆品。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中加入的待测化妆品的浓度处于待测化妆品对斑马鱼的最大安全浓度范围内。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中每组选取的斑马鱼的尾数≥斑马鱼总尾数的30％。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中的统计学方法为方差分析和Dunnett’s T-检验。
作为本发明方法的优选，斑马鱼在水中培养的时间≥18小时。
作为本发明方法的优选，化妆品对皮肤的刺激性的判断标准为：皮肤刺激作用的显著性差异水平p<0.05时，判断为待测化妆品对皮肤有刺激性作用，否则判断为对皮肤无刺激性作用或刺激性作用不明显。
本发明的评价化妆品皮肤刺激性的方法，以斑马鱼为受试对象，以斑马鱼的皮肤中性粒细胞的统计个数为指标，对化妆品进行评价。中性粒细胞在斑马鱼体内发挥固有免疫作用，且是体内数量最多的白细胞。发明人研究发现，部分化妆品，对斑马鱼的皮肤的刺激性作用与人相近，表现为皮肤炎症，并引起毛细血管扩张、通透性亢进和水肿等征状，如当含有甲基异噻唑啉酮、乙醇等皮肤刺激性成分时，炎症诱导中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。因此，待测化妆品对斑马鱼皮肤的刺激性越强，斑马鱼体皮肤表皮上聚集的中性粒细胞就越多，这样通过图像分析软件统计并采用方差分析和Dunnett’s T-检验，不依赖于实施者的主观经验确定评价指标的状况，排除主观因素和主观指标，通过统计分析斑马鱼受刺激后中性粒细胞的个数就是非常客观的评价指标来评价化妆品对斑马鱼皮肤的刺激性，以及不同化妆品的皮肤刺激性强弱。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种更加客观的评价化妆品刺激性，而且成本低的化妆品皮肤刺激性评价方法：首先提供了一种客观评价化妆品皮肤刺激性的方法，评价指标选取、获得和处理分析更加客观，而且评价结果可量化，不仅能够评价单一化妆品是否具有刺激性，还可以比较不同化妆品的刺激性强弱；
其次，可用于评价含有甲基异噻唑啉酮、乙醇等成分的化妆品，同时也适用于评价组分未知的化妆品；
再次，由于斑马鱼饲养成本低，体积小，发育周期短、单次产卵次数高的特点能同时进行多个化妆品的评价，评价效率高，评价成本低；
最后，本申请的评价方法简洁，操作方便，方便实验室评价。
附图说明
图1是实施例1～4与正常对照组处理后的斑马鱼皮肤中性粒细胞分布图。
图中的白点表示中性粒细胞。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
本发明方法中安全浓度指不会致死斑马鱼、不会引起斑马鱼机体器官损伤的浓度。
实施例1
一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，该化妆品中甘油质量含量为10％，其他组分均温和无刺激性，包括以下步骤：
(1)安全浓度确定：将受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼置于含水的孔板中，水容量3ml、斑马鱼30尾，以水溶方式向不同孔板中加入不同浓度的待测化妆品，浓度依次为1.39、2.78、5.56、11.1、22.2、44.4μL/mL，培养18小时后，统计斑马鱼出现死亡、器官损伤情况，结果表1所示，从而确定该化妆品的安全浓度上限为11.1μL/mL；
(2)设置正常对照组：以受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾为受试对象，置于含3mL水的孔板中培养18小时；
(3)设置测试组：取与步骤(2)同规格的斑马鱼30尾为受试对象置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，浓度为11.1μL/mL，相同条件下培养18小时；
(4)检测：培养结束后，随机取正常对照组、测试组的斑马鱼10尾，置于荧光立体显微镜(Nikon AZ 100，Japan)下拍照并保存图片，如图1所示，然后采用NIS-Elements D3.10高级图像处理软件分析图像，采集数据，基于方差分析和Dunnett’s T-检验统计的统计学方法计算斑马鱼的皮肤上的中性粒细胞个数；
(5)刺激性评价：按下述公式计算皮肤刺激作用：
其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N(正常对照组)表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值，结果见表2所示。
实施例2
一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，该化妆品中甲基异噻唑啉酮含量70ppm，其他组分均温和无刺激性，包括以下步骤：
(1)安全浓度确定：将受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼置于含水的孔板中，水容量为3ml、斑马鱼30尾，以水溶方式向不同孔板中加入不同浓度的待测化妆品，浓度依次为1.39、2.78、5.56、11.1、22.2、44.4μL/mL，培养18小时后，统计斑马鱼出现死亡、器官损伤情况，结果表1所示，从而确定该化妆品的安全浓度上限为5.56μL/mL；
(2)设置正常对照组：以受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾为受试对象，置于含3mL水的孔板中培养18小时；
(3)设置测试组：取与步骤(2)同规格的斑马鱼30尾为受试对象置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，浓度为5.56μL/mL，相同条件下培养18小时；
(4)检测：培养结束后，取正常对照组、测试组的斑马鱼10尾，置于荧光立体显微镜(Nikon AZ 100，Japan)下拍照并保存图片，然后采用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件分析图像、采集数据，如图1所示，基于方差分析和Dunnett’s T-检验统计的统计学方法计算斑马鱼皮肤上的中性粒细胞个数；
(5)刺激性评价：按如下公式计算皮肤刺激作用：
其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N(正常对照组)表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值，结果见表2所示。
实施例3
一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，该化妆品中乙醇含量3％，其他组分均温和无刺激性，包括以下步骤：
(1)安全浓度确定：将受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼置于含水的孔板中，水容量为3ml，斑马鱼30尾，以水溶方式向不同孔板中加入不同浓度的待测化妆品，浓度依次为1.39、2.78、5.56、11.1、22.2、44.4μL/mL，培养18小时后，统计斑马鱼出现死亡、器官损伤情况，结果表1所示，从而确定该测试的安全浓度上限为22.2μL/mL；
(2)设置正常对照组：以受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾为受试对象，置于含3mL水的孔板中培养18小时；
(3)设置测试组：取与步骤(2)同规格的斑马鱼30尾为受试对象置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，浓度为22.2μL/mL，相同条件下培养18小时；
(4)检测：培养结束后，取正常对照组、测试组的斑马鱼10尾，置于荧光立体显微镜(Nikon AZ 100，Japan)下拍照并保存图片，如图1所示，然后采用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件分析图像，基于方差分析和Dunnett’s T-检验统计的统计学方法计算斑马鱼的皮肤上的中性粒细胞个数；
(5)刺激性评价：皮肤刺激作用的计算公式如下：
其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N(正常对照组)表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值，结果见表2所示。
实施例4
一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，该化妆品中丁二醇含量5％，其他组分均温和无刺激性，包括以下步骤：
(1)安全浓度确定：将受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼置于含水的孔板中，水容量为3ml，每孔斑马鱼30尾，以水溶方式向不同孔板中加入不同浓度的待测化妆品，浓度依次为1.39、2.78、5.56、11.1、22.2、44.4μL/mL，培养18小时后，统计斑马鱼出现死亡、器官损伤情况，结果表1所示，从而确定该测试的安全浓度上限为2.78μL/mL；
(2)设置正常对照组：以受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾为受试对象，置于含3mL水的孔板中培养18小时；
(3)设置测试组：取与步骤(2)同规格的斑马鱼30尾为受试对象置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，浓度为2.78μL/mL，相同条件下培养18小时；
(4)检测：培养结束后，取正常对照组、测试组的斑马鱼10尾，置于荧光立体显微镜(Nikon AZ 100，Japan)下拍照并保存图片，如图1所示，然后采用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件分析图像、采集数据，基于方差分析和Dunnett’s T-检验统计的统计学方法计算斑马鱼的皮肤上的中性粒细胞个数；
(5)刺激性评价：皮肤刺激性作用计算公式如下：
其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N(正常对照组)表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值，结果见表2所示。
测试结果
1、安全浓度测试
各实施例的化妆品的安全浓度测试见表1所示。
表1各化妆品安全浓度结果
从表中可知，测试范围内，实施例1中化妆品对斑马鱼的安全浓度上限为11.1μL/mL、实施例2中化妆品对斑马鱼的安全浓度上限为5.56μL/mL、实施例3中化妆品对斑马鱼的安全浓度上限为22.2μL/mL、实施例4中化妆品对斑马鱼的安全浓度上限为2.78μL/mL。
2、皮肤刺激性测试
各实施例化妆品皮肤刺激性作用测试结果见表2。
表2各实施例步骤(3)处理后的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数结果(n＝10)
与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
从上表2并结合图1可以看出，在测试浓度下，基于皮肤刺激作用的显著性差异水p<0.05判断，实施例2和实施例3的化妆品对皮肤的刺激作用明显，实施例1和实施例4的化妆品对皮肤的刺激作用不明显。
Claims (4)
1.一种评价化妆品对皮肤刺激性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设置正常对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养；
（2）设置测试组：取与上述步骤同规格的斑马鱼为受试对象，置于水中，以水溶方式向水中加入待测化妆品，相同条件下培养；
（3）检测：取正常对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件分析图像并采集数据，基于统计学方法获得斑马鱼皮肤上的中性粒细胞个数；
（4）刺激性评价：刺激性作用的量化计算公式为：
其中，N（测试组）表示测试组的斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；N（正常对照组）表示正常对照组中斑马鱼皮肤中性粒细胞个数的统计值；
所用斑马鱼为受精后2天转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼；
待测化妆品中含有甘油、甲基异噻唑啉酮、乙醇和丁二醇中的至少一种；
斑马鱼在水中培养的时间≥18小时；
化妆品对皮肤的刺激性的判断标准为：皮肤刺激作用的显著性差异水平p< 0.05时，判断为待测化妆品对皮肤有刺激性作用，否则判断为对皮肤无刺激性作用或刺激性作用不明显。
2.根据权利要求1所述的评价化妆品对皮肤刺激性的方法，其特征在于，步骤（2）中加入的待测化妆品的浓度处于待测化妆品对斑马鱼的最大安全浓度范围内。
3.根据权利要求1所述的评价化妆品对皮肤刺激性的方法，其特征在于，步骤（3）中每组选取的斑马鱼的尾数≥斑马鱼总尾数的30%。
4.根据权利要求1或3所述的评价化妆品对皮肤刺激性的方法，其特征在于，步骤（3）中的统计学方法为方差分析和Dunnett’s T-检验。
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