CN112029752B - 一种石莼多糖裂解酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石莼多糖裂解酶及其编码基因和应用，本发明提供的所述石莼多糖裂解酶的氨基酸序列如（i）或（ii）所示：（i）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；（ii）（i）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有石莼多糖裂解酶活性。本发明制备的石莼多糖裂解酶实现新的石莼多糖裂解酶重组载体的构建及大肠杆菌高效表达，实现石莼多糖裂解酶的规模化生产，该石莼多糖裂解酶酶活力高，纯度高，理化性质优良，可高效降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖，可广泛用于食品、医药、化工及多糖结构分析等领域具有广泛的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石莼多糖裂解酶及其编码基因与应用。
背景技术
石莼多糖是从石莼细胞壁中提取的一种高度硫酸化的多糖，它主要由硫酸鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖和艾杜糖醛酸组成。研究表明，石莼多糖具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤和免疫调节等多种生理活性，在食品、医药等领域具有广泛的应用价值。但是高分子量的石莼多糖不易吸收，且粘度较大，限制了其开发应用。
目前，关于石莼多糖降解的方法主要是：酸法降解、微波辅助法、抗坏血酸结合过氧化氢法、酶法降解。酸法降解简单易行，但是会导致硫酸基脱落，破坏寡糖的结构，且产物复杂，分离纯化困难，且会污染环境。微波辅助法及抗坏血酸结合过氧化氢法虽然能较好的保留寡糖结构，但是产量低、成本高，不符合大规模生产的要求。酶法降解具有较好的底物专一性，反应过程高效稳定，反应条件温和，酶解产物活性基团保存完好且均一性好，易于分离纯化，产量高且质量优良，相比于物理化学法具有显著的优势。
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，石莼多糖裂解酶可以通过β消除断裂石莼多糖糖链中硫酸鼠李糖和葡萄糖醛酸之间的键，石莼多糖裂解酶根据降解特性和序列相似性可分为三个家族：多糖裂解酶24、25、28家族。Lahaye等人(Carbohydr Res,1997)发现了第一种能够降解石莼多糖的海洋细菌。产石莼多糖裂解酶的菌株主要来源于交替单胞菌属(Alteromonas)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、海洋黄杆菌属(Marineflavobacterium)等。CN105624067公开了一种来源于海洋假交替单胞菌属细菌能够生产硫酸鼠李聚糖酶，该酶能降解硫酸鼠李聚糖生成寡糖，分子量为110.6kDa，但是发酵液酶活力低，仅为3.5U/mL。目前野生菌发酵生产石莼多糖裂解酶存在诸多问题：酶活力低、未得到编码基因，不能进行重组表达和分子改造等；工程菌重组表达成为石莼多糖裂解酶开发应用的新思路，Collén等人(Journal of Biological Chemistry,2011,286)从可以利用石莼生长的菌株Nonlabens ulvanivorans中发现并利用大肠体系表达了一种内切型石莼多糖裂解酶，分子量为46kDa(JN104480)，该酶从属于多糖裂解酶28家族。Kopel(Journal ofBiological Chemistry,2016)等人对来源于Alteromonas sp.LOR的石莼多糖裂解酶(WP_032096165.1)利用大肠杆菌进行重组表达，其表达蛋白分子量为111kDa，从属于多糖裂解酶24家族。Foran(Algal Research,2017)等人对来源于Alteromonas sp.LOR的石莼多糖裂解酶(WP_052010178.1)利用大肠杆菌进行重组表达，从属于多糖裂解酶25家族。但是这些重组表达酶家族中的成员数量总体较少，为了更好的开发利用石莼多糖，发现新的石莼多糖裂解酶，发掘更多的石莼多糖裂解酶基因并实现其工程化表达具有重要的研究前景和意义。
发明内容
针对现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种石莼多糖裂解酶及其编码基因与应用。本发明提供的石莼多糖裂解属于多糖裂解酶25家族，酶蛋白序列与已有酶序列相似度较低，属于新的石莼多糖裂解酶，该酶酶活力高达230U/mL，具有良好的温度稳定性和pH稳定性，具有良好的研究应用前景。
本发明要解决的技术问题是，提供一种新的石莼多糖裂解酶及其基因。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述石莼多糖裂解酶的重组表达制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述石莼多糖裂解酶的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种石莼多糖裂解酶，所述石莼多糖裂解酶氨基酸序列如(i)或(ii)所示：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(ii)(i)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有石莼多糖裂解酶活性。
进一步的，所述石蒓多糖裂解酶具有如SEQ ID NO.1所示的酶的活性，(ii)中氨基酸替代具体为：第112位H替代为A、第141位T替代为V、第162位H替代为F、第200位Y替代为Q、第220位C替代为S、第232位H替代为C中的至少一种。
一种编码所述石莼多糖裂解酶的基因，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的的石莼多糖裂解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组载体，其包含所述的石莼多糖裂解酶的编码基因。所述重组载体质粒为大肠杆菌质粒或枯草芽孢杆菌质粒，优选为大肠杆菌质粒pProEX-HTa。
一种细胞，所述细胞由含有所述重组载体的宿主细胞转化而得，所述宿主细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种制备所述石莼多糖裂解酶的方法，所述制备方法包含以下步骤：
1)石莼多糖裂解酶基因的克隆与分析：提取保藏编号为CCTCC M 2012132的Alteromonas colwelliana基因组，根据基因组序列与功能基因分析，设计引物，以提取的基因组DNA为模板，经过PCR获得石莼多糖裂解酶基因；
2)石莼多糖裂解酶重组载体的构建：将获得的石莼多糖裂解酶基因的核苷酸序列经双酶酶切后与大肠杆菌质粒pProEX-HTa连接，获得重组载体；
3)石莼多糖裂解酶重组细胞的构建：将石莼多糖裂解酶重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到大肠杆菌石莼多糖裂解酶重组细胞；
4)石莼多糖裂解酶的表达与纯化：将含有石莼多糖裂解酶基因的重组载体的细胞接种到生物反应器中进行培养，诱导表达，收集表达产物，通过亲和层析纯化得到透明质酸裂解酶活性蛋白。还可通过离子交换与凝胶过滤纯化得到透明质酸裂解酶。
一种组合物，含有所述的石莼多糖裂解酶。该组合物还含有食品或药品中可接受的辅料或载体。
所述石莼多糖裂解酶基因或重组载体或重组细胞在制备石莼多糖裂解酶上的应用。
所述的石莼多糖裂解酶在催化降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖中的应用。
所述的组合物在催化降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖中的应用。
所述的绿藻多糖包括石莼多糖、浒苔多糖或礁膜多糖。
与现有技术对比，本发明提供的石莼多糖裂解酶及其基因具有以下有益效果：
本发明通过设计同源引物，获得海洋细菌Alteromonas colwelliana A321石莼多糖裂解酶基因，该基因编码区长1314bp，编码437个氨基酸的石莼多糖裂解酶，属于多糖裂解酶25家族，该酶基因序列与已有石莼多糖裂解酶有显著差异，属于一种新的石莼多糖裂解酶。
本发明的技术方案可以实现所述新的石莼多糖裂解酶重组载体的构建及大肠杆菌高效表达，实现石莼多糖裂解酶的规模化生产，石莼多糖裂解酶酶活力高达230U/mL，相比野生菌株酶活力(0.19U/mL)显著提高，明显高于已公开报道的石莼多糖裂解酶的酶活力，而且该酶纯度高，理化性质优良，可高效降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖，可广泛用于食品、医药、化工及多糖结构分析等领域。
保藏信息：细菌Alteromonas colwelliana A321，该菌株于2012年4月23日保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，Alteromonas colwellianaA321的保藏编号为：CCTCC NO.M2012132。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1：石莼多糖裂解酶基因在1％琼脂糖凝胶中的电泳图谱。左侧M为marker，右侧1为样品。
图2：石莼多糖裂解酶氨基酸序列比对图。其中：
ALT3695：本发明石莼多糖裂解酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)；
WP_052010178.1：ulvan lyase(Alteromonas sp.LOR)，PL25家族；
WP_033186995.1：ulvan lyase(Pseudoalteromonas sp.PLSV)，PL25家族；
AMA19991：ulvan lyase(Alteromonas sp.LOR)，PL24家族；
WP_038530530.1：ulvan lyase(Marine flavobacterium)，PL28家族。
图3：重组载体pProEX-HTa-ALT3695。
图4：纯化的石莼多糖裂解酶SDS-PAGE电泳图谱。左侧M为标准蛋白分子量，右侧1为经纯化的石莼多糖裂解酶蛋白。
图5：温度对石莼多糖裂解酶的影响。横坐标为不同温度，纵坐标为相对酶活。
图6：石莼多糖裂解酶温度稳定性。横坐标为不同时间，纵坐标为相对酶活。
图7：pH对石莼多糖裂解酶的影响。横坐标为不同pH，纵坐标为相对酶活。
图8：石莼多糖裂解酶pH稳定性。横坐标为不同pH，纵坐标为相对酶活。
图9：石莼寡糖的质谱图谱。横坐标为m/z，纵坐标为离子流强度。
图10：石莼寡糖的紫外扫描图谱。横坐标为波长，纵坐标为吸光度。
具体实施方式
本发明提供了一种新的石莼多糖裂解酶，实现了新石莼多糖裂解酶的高酶活力重组表达，根据本发明的技术方案，可以实现重组石莼多糖裂解酶规模化生产。
本文所述的“石莼多糖裂解酶活性”是以酶的活力单位来定义的。利用紫外法测定酶活力，取4mL质量体积分数为0.1％的石莼多糖为底物(pH＝8，20mM的Tris-HCl),加入0.1mL的酶液，在35℃下保温5min，立即煮沸5min终止反应，以添加灭活酶液作为空白对照，用紫外分光光度计检测235nm下的吸收值。在实验条件下，每1min降解石莼多糖产生1μmol不饱和双键所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。发酵液酶活力单位定义为：每毫升发酵液含酶活力单位(U/mL)。
本文中出现的各种氨基酸序列中的氨基酸是根据它们公知的三字母或单字母缩写来表示的，如赖氨酸三字母缩写为Lys，单字母缩写为K。出现在各种DNA片段中的核苷酸，是用本领域常规使用的标准的单字母标识来表示的。
本发明包括石莼多糖裂解酶的片段。如本文所用，是指基本上保持本发明的石莼多糖裂解酶相同的生物学功能或活性的蛋白或多肽。本发明的蛋白或多肽片段可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白或多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白或多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白或多肽序列而形成的蛋白或多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
基于本文目的，只要所得到的蛋白质显示有石莼多糖裂解酶活性，氨基酸替代可以在任何的氨基酸进行。氨基酸替代包括保守性替代，其不会消除酶活性。如本文中所描述的，也考虑了改变蛋白质的特性的替代，例如结合位点或催化中心，此类替代一般是非保守的，但会容易地被本领域技术人员完成。
合适的氨基酸保守性替代是本领域技术人员已知的，一般可以在不改变所得分子的生物活性如酶活性的情况下进行。本领域技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非必需区域进行的单个氨基酸的替代基本上不会改变生物学活性，可以进行的保守的氨基酸替代，而且容易被本领域技术人员完成，也属于本发明范围。可以进行的保守氨基酸替代如表1所示：Y35F：氨基酸序列35位Y(Tyr)替代为F(Phe)；D126E:氨基酸序列126位D(Asp)替代为E(Glu)；N150Q:氨基酸序列150位N(Asn)替代为E(Gln)；V167L:氨基酸序列167位V(Val)替代为L(Leu)；S198T:氨基酸序列198位S(Ser)替代为T(Thr)；K313R:氨基酸序列313位K(Lys)替代为R(Arg)等，其他的保守氨基酸替代也是允许的，并可以经验性地确定，或根据已知的保守替代来确定。
表1保守替换
| 替代位置及方式 | 替代前氨基酸 | 替代后氨基酸 | 替代位置及方式 | 替代前氨基酸 | 替代后氨基酸 |
| Y35F | Tyr | Phe | D152E | Asp | Glu |
| D75E | Asp | Glu | F156W | Phe | Trp |
| N76Q | Asn | Gln | W166F | Trp | Phe |
| H77R | His | Arg | V167L | Val | Leu |
| G78A | Gly | Ala | Y168F | Tyr | Phe |
| K79H | Lys | His | D197E | Asp | Glu |
| H91K | His | Lys | S198T | Ser | Thr |
| D126E | Asp | Glu | W199F | Trp | Phe |
| I127V | Ile | Val | Y217F | Tyr | Phe |
| N150Q | Asn | Gln | K313R | Lys | Arg |
| G151A | Gly | Ala |
改变蛋白质特性的替代，可以改变酶蛋白的催化活性、稳定性等生物活性，是酶蛋白替代的重要方式，容易被本领域技术人员完成，也属于本发明范围。可以进行的改变蛋白质特性的氨基酸替代如下所示：H112A：氨基酸序列112位H(His)替代为A(Ala)；T141V：氨基酸序列141位T(Thr)替代为V(Val)；H162F：氨基酸序列162位H(His)替代为F(Phe)；Y200Q：氨基酸序列200位Y(Tyr)替代为Q(Gln)；C220S：氨基酸序列220位C(Cys)替代为S(Ser)；H232C：氨基酸序列232位H(His)替代为C(Cys)；其他的替代也是允许的，并可以经验性地确定，或根据已知的改变蛋白特性替代来确定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.Alteromonas colwelliana A321基因组的提取
取培养到对数生长期的Alteromonas colwelliana A321(该菌株的保藏编号为：CCTCC NO.M2012132)的菌液，根据TIAamp Bacteria DNA Kit(TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD)试剂盒的操作说明进行DNA提取，然后在NanoDrop2000(ThermofisherScientific CO.,)进行基因组DNA浓度和纯度测定，经测定提取的基因组DNA浓度为380ng/mL，OD260/OD280比值为1.82。再经过1％琼脂糖凝胶电泳中进行DNA条带检测，检测条件：上样量5μL，电压120V，电泳30min，在凝胶成像***中观察条带，条带均一性良好。将提取的DNA样品进行测序。
实施例2.石莼多糖裂解酶基因的克隆与分析
以Alteromonas colwelliana A321总DNA为模板，根据测序结果和功能基因分析，以含有限制性内切酶酶切位点的引物F和R扩增石莼多糖裂解酶基因(不含信号肽)：
其中，
为限制性内切酶EcoRⅠ的酶切位点，
为限制性内切酶KpnⅠ的酶切位点。
采用PCR进行扩增，50μL反应体系为：
在50μL的反应体系中含DNA模板，1μL；F(10μM)，1μL；R(10μM)，1μL；dNTP(各2.5mM)，4μL；Taq(2U/μL)，1μL；10×Taq buffer，5μL；ddH2O，加至50μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。
PCR产物经1％琼脂糖电泳检验为单一特异性条带后测序(电泳图谱见附图1)，经过PCR扩增获得长度为1314bp的石莼多糖裂解酶基因，测序序列见序列表SEQ.ID.NO.2所示，将SEQ.ID.NO.2所示基因序列与全基因组序列比对，与全基因组中功能基因序列一致。该基因编码一个由437个氨基酸组成的蛋白质，序列如序列表SEQ.ID.NO.1所示。NCBI数据库中Blast序列分析表明，该蛋白属于多糖裂解酶25家族，其氨基酸序列与其他已报到石莼多糖裂解酶氨基酸序列相似性最高仅达64.14％(假交替单胞菌石莼多糖裂解：WP_033186995.1)，说明该蛋白为一个新蛋白，该基因为一个新基因。本发明石莼多糖裂解酶与已报道石莼多糖裂解酶的氨基酸序列比对结果见附图2，比对结果表明本发明石莼多糖裂解酶基因氨基酸序列与有报道石莼多糖裂解酶氨基酸序列有显著差异，进一步表明该酶蛋白为一个新酶蛋白。
实施例3.石莼多糖裂解酶重组载体的构建
将石莼多糖降解酶基因PCR产物按照Cycle-Pure Kit(OMEGA Bio-Tek Co.)纯化试剂盒要求的操作方法进行纯化。
利用EcoRⅠ、KpnⅠ对纯化后的石莼多糖裂解酶基因与载体pProEX-HTa进行双酶切，酶切条件：37℃，6h。酶切产物进行琼脂糖电泳，电泳条件：80V，1h。按照Gel extractionkit(OMEGA Bio-Tek Co.)胶提取试剂盒要求的操作方法进行切胶回收。
用T4连接酶将酶切后的石莼多糖裂解酶基因序列片段与pProEX-HTa载体连接，连接条件：16℃，16h。得到含有石莼多糖裂解酶基因的重组载体pProEX-HTa-ALT3695(见附图3)。
实施例4.重组石莼多糖裂解酶在大肠杆菌中的表达
将重组载体经热转化(42℃，60s)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，然在含有100μg/mL氨苄青霉素钠LB固体平板上37℃培养12h，未被转化的菌株无法在平板上生长，利用PCR进行阳性菌株筛选。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。将阳性菌株接种于LB液体培养基，37℃培养12h，用Plasmid Mini Kit(OMEGA Bio-Tek Co.)进行质粒提取，获得重组载体pProEX-HTa-ALT3695。
选择大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)作为宿主细胞，先热激转化(42℃，60s)、再孵育(37℃，45min)、最后在含有100μg/mL氨苄青霉素钠LB固体平板上37℃培养12h，挑选菌株利用PCR进行阳性菌株筛选。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。获得阳性克隆菌株ALT3695-BL21(DE3)。
摇瓶发酵：将ALT3695-BL21(DE3)接种于LB液体培养基(100μg/mL氨苄青霉素钠)中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加入IPTG至终浓度为1mM，28℃，180r/min培养24h，将发酵液在4℃下，8000r/min离心10min，弃掉上清，用相同体积pH＝7.5，20mM Tris-HCl重悬菌体，冰浴下破碎细胞，将破碎后的菌液在4℃下，8000r/min离心10min，收集上清液。按照酶活测定方法测定酶活，测得酶活为1.34U/mL。
发酵罐发酵：将ALT3695-BL21(DE3)接种于LB液体培养基(100μg/mL氨苄青霉素钠)中，37℃培养12h后，按照2％接种量接种于装有3L培养基的5L发酵罐(20g/L酵母浸粉、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、10g/L NaCl、2g/L七水硫酸镁、6g/L磷酸氢二钾)，控制pH 7.2，37℃培养，初始培养基中的糖耗尽后加入IPTG至终浓度为1mM，调节温度至28℃，发酵24h后菌体浓度不再增加，停止发酵。将发酵液在4℃下，8000r/min离心10min，弃掉上清，用相同体积pH＝7.5，20mM Tris-HCl重悬菌体，冰浴下破碎细胞，将破碎后的菌液在4℃下，8000r/min离心10min，收集上清液。按照酶活测定方法测定酶活，测得酶活为230U/mL。
实施例5.氨基酸序列突变
根据对石莼多糖裂解酶氨基酸序列(不含信号肽)的保守位点和空间结构的分析，根据SEQ ID NO.1石莼多糖裂解酶氨基酸序列和SEQ ID NO.2石莼多糖裂解酶核苷酸序列，设计该基因突变位置及方式为：H112A、T141V、H162F、Y200Q、C220S、H232C、N76Q、K313R，参照菌株密码子偏好性，利用CE DesignV1.04设计突变引物如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.20所示：
H112A-F：TAATACAGCGTATGGCCGCAATATTCATGCT (SEQ ID NO.5)
H112A-R：GGCCATACGCTGTATTACCTAAAGGGTTTTTGCCA (SEQ ID NO.6)
T141V-F：GGTGTGTATAACCAAGCTGTAAAAATGGATAACG (SEQ ID NO.7)
T141V-R:GCTTGGTTATACACACCAAATACCGATATATTATCTAATTCTTCC (SEQ ID NO.8)
H162F-F：ATGGCGCGTTTAGAAGCGATTGGGTTTATCAAAA (SEQ ID NO.9)
H162F-R：GCTTCTAAACGCGCCATGTCGGTAGAA (SEQ ID NO.10)
Y200Q-F：ATAGTTGGCAGGCCTGGGTAGGTAAAGGACAGG (SEQ ID NO.11)
Y200Q-R：CCAGGCCTGCCAACTATCCACGGCTTTAATATCA (SEQ ID NO.12)
C220S-F：CCATATTAGCTGGGATGGTGGTGCTGGTG (SEQ ID NO.13)
C220S-R：CATCCCAGCTAATATGGTAATCATAAGAAATAATGATATCG (SEQ ID NO.14)
H232C-F：GAGGCTGCACAACTGAACGCCATGATGCC (SEQ ID NO.15)
H232C-R：TTCAGTTGTGCAGCCTCGGCCATTAACACCA (SEQ ID NO.16)
N76Q-F：AATAGATCAGCACGGCAAACCTACCATGTTG (SEQ ID NO.17)
N76Q-R：TGCCGTGCTGATCTATTTTAGAGCGGGTAGGGTCT (SEQ ID NO.18)
K313R-F：TGGGCCACGTCAAACTAGTTATTTCCGTTGGAATGG (SEQ ID NO.19)
K313R-R：TAGTTTGACGTGGCCCACCTGTTTTTTGAC (SEQ ID NO.20)
以含有石莼多糖裂解酶基因的重组载体pProEX-HTa-ALT3695为模板，利用SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.20的引物，采用PCR扩增质粒全长的方法进行突变，50μL反应体系为：
质粒模板，0.5μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；dNTP Mix(10mM each)，1μL；F(10μM)，2μL；R(10μM)，2μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1μL；ddH2O，加至50μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸4min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。
上述PCR反应产物用0.5μL DpnⅠ酶在37℃下酶解2h以消化模板质粒，酶解产物按Cycle-Pure Kit(OMEGA Bio-Tek Co.)纯化试剂盒要求的操作方法进行PCR产物纯化。
上述纯化产物用
II One Step Cloning Kit(诺威赞)进行质粒连接，20μL体系：
5×CE II Buffer，4μL；Exnase II，2μL；纯化产物，5μL；ddH2O，加至20μL。质粒重组条件：37℃，30min。
突变后的重组质粒经热转化(42℃，60s)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含有100μg/mL氨苄青霉素钠LB固体平板上37℃培养12h，未被转化的菌株无法在平板上生长，采用PCR进行突变菌株筛选。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。并测序鉴定突变序列，突变后核苷酸序列如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.28所示，对应突变氨基酸序列如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.36所示。然后将阳性突变菌株接种于LB液体培养基，37℃培养12h，用Plasmid MiniKit(OMEGABio-Tek Co.)进行质粒提取，获得突变重组质粒。
选择大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)作为宿主细胞，先热激转化(42℃，60s)、再孵育(37℃，160rpm，45min)、最后在含有100μg/mL氨苄青霉素钠LB固体平板上37℃培养12h，挑选菌株利用PCR进行阳性菌株筛选。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。获得阳性克隆菌株。
将阳性克隆菌株接种于LB液体培养基(100μg/mL氨苄青霉素钠)中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加入IPTG至终浓度为1mM，28℃，180r/min培养24h，将发酵液在4℃下，8000r/min离心10min，弃掉上清，用相同体积pH＝7.5，20mM Tris-HCl重悬菌体，冰浴下破碎细胞，将破碎后的菌液在4℃下，8000r/min离心10min，收集上清液。按照酶活测定方法测定酶活，酶活力结果见表2：
表2氨基酸突变及酶活力
| 氨基酸突变位置及方式 | 酶活力(U/mL) |
| ALT3695 | 1.34 |
| H112A | 0.22 |
| T141V | 0.15 |
| H162F | 0.43 |
| Y200Q | 12.5 |
| C220S | 0.78 |
| H232C | 13.1 |
| N76Q | 1.38 |
| K313R | 1.31 |
改变蛋白特性突变结果显示，突变体Y200Q和H232C的酶活力较突变前菌株摇瓶发酵酶活力有显著升高，突变体H162F和C220S的酶活力较突变前菌株摇瓶发酵酶活力有一定降低，突变体H112A和T141V的酶活力较突变前菌株摇瓶发酵酶活力有明显下降，说明这些氨基酸位点是酶促反应中的重要氨基酸位点，对酶的活性影响较大。
氨基酸保守替代结果显示，突变体N76Q和K313R的酶活力较突变前菌株的酶活力基本不变。这些氨基酸是维持酶的空间结构必须氨基酸，但对酶活力基本没有影响。
实施例6.重组酶纯化
将实施例4摇瓶发酵上清液用镍柱进行亲和层析(GE公司)，按照镍柱纯化说明书进行初步分离纯化，收集分离纯化产物。将纯化石莼多糖裂解酶进行SDS-PAGE电泳，获得单一蛋白条带(电泳图谱见附图4)，且位置与预测分子量相吻合，分子量约为53kDa。酶活回收率43％，比活2053U/mg，纯化倍数6.7倍。
实施例7.石莼多糖裂解酶酶学性质
1、温度对石莼多糖裂解酶的影响
分别在30，35，40，45，50，55，60℃条件下，按照酶活测定方法测定实施例5制备的样品的酶活，以相对酶活做图比较(最高酶活为100％)。实验结果见附图5，实验结果表明样品在30-55℃的温度范围内均具有良好的酶活，最适反应温度为50℃。
将实施例5制备的样品在25℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃下分别孵育2min、5min、10min、30min、60min、120min，按照酶活测定方法测定酶活，以考察酶的温度稳定性，将未经温度处理(0min)的酶液酶活力定义为100％，以相对酶活做图比较。实验结果见附图6，实验结果表明该酶在低于40℃具有良好的稳定性，2h内酶活都能保持在90％以上，但是在45℃以上酶易失活，应当尽量避免。
2、pH对石莼多糖裂解酶的影响
分别使用pH 4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、10的50mM磷酸盐缓冲液配制石莼多糖底物，按照酶活测定方法测定实施例5制备的样品在不同pH下的酶活，以相对酶活做图比较(最高酶活为100％)。实验结果见附图7，实验结果表明该样品最适pH为8.0，在pH7-9.0的范围内均具有良好的酶活力(相对酶活≥80％)。
在4℃条件下，将实施例5制备的样品在pH 4-10孵育3h，按照酶活测定方法测定酶活，以考察酶的pH稳定性，将未经pH孵育处理的酶液酶活力定义为100％，以相对酶活做图比较。实验结果见附图8，实验结果表明在不同pH下孵育3h，该酶均能保持90％以上的酶活力，pH稳定性较好，适合于工业化应用。
实施例8.石莼多糖裂解酶在制备石莼寡糖中的应用
取1％石莼多糖水溶液10mL，向其中加入1.5×103U纯化的石莼多糖裂解酶酶液，100rpm，35℃水浴酶解8h，沸水浴10min灭酶，10000rpm离心10min，冷冻干燥制备得到石莼寡糖。对制备的石莼寡糖样品进行质谱分析(ESI-MS)。质谱图见附图9，由质谱图可知，m/z:401.1峰代表的是石莼二糖(一分子的硫酸鼠李糖和一分子不饱和葡萄糖醛酸组成)带一个电荷；m/z:577.1为带单电荷的石莼三糖(一分子的硫酸鼠李糖、一分子不饱和葡萄糖醛酸和一分子葡萄糖醛酸组成)；m/z：379峰代表的是石莼四糖(两分子硫酸鼠李糖、一分子不饱和葡萄糖醛酸、一分子木糖组成)带两个电荷；m/z：781.1峰代表的是石莼四糖(两分子硫酸鼠李糖、一分子不饱和葡萄糖醛酸、一分子木糖组成)带一个电荷；质谱结果表明石莼多糖裂解酶降解石莼多糖主要产物为不饱和石莼二糖、三糖和四糖。紫外扫描图谱见附图10，结果表明制备的石莼寡糖在235nm具有特征吸收，表明生成双键；质谱和紫外扫描结果表明该酶为裂解酶，降解石莼多糖的主要产物为不饱和石莼二糖、三糖和四糖。
实施例9.石莼多糖裂解酶在制备浒苔低聚糖中的应用
取1％条浒苔多糖水溶液100mL，向其中加入3×103U纯化的石莼多糖裂解酶酶液，100rpm，35℃水浴酶解。分别在0min、10min、20min、30min、60min取样，沸水浴10min灭酶，10000r/min离心10min，用HPLC测分子量并记录。结果如表3所示，表明可利用该酶制备不同分子量的浒苔低聚糖。
表3浒苔低聚糖分子量
| 时间(min) | 分子量(kDa) |
| 0 | 2700 |
| 10 | 620 |
| 20 | 50 |
| 30 | 3.6 |
| 60 | 1.3 |
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种石莼多糖裂解酶及其编码基因与应用
<130> 2019
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 437
<212> PRT
<213> Alteromonas colwelliana
<400> 1
Pro Asn Asn Thr Val Asp Phe Ala Asn Asn Ala Leu Gly Asn Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Gln His Pro Ala Gly Ile Tyr His Asn Gly Ile Thr Tyr
20 25 30
Val Thr Tyr Gln Gly Pro Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Ala Ala Tyr Asn
35 40 45
His Lys Thr Asp Thr Trp Gln Gly Pro Phe Lys Ala Gly Val Ser Asp
50 55 60
Met Gly Lys Asp Pro Thr Arg Ser Lys Ile Asp Asn His Gly Lys Pro
65 70 75 80
Thr Met Leu Ile Asp Asp Leu Gly Tyr Ile His Ile Phe Phe Gly Gly
85 90 95
His Gly Gly Met Pro Lys His Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asn Thr His
100 105 110
Tyr Gly Arg Asn Ile His Ala Val Ser Lys Asn Pro Gly Asp Ile Thr
115 120 125
Ser Trp Glu Glu Leu Asp Asn Ile Ser Val Phe Gly Thr Tyr Asn Gln
130 135 140
Ala Val Lys Met Asp Asn Gly Asp Ile Tyr Leu Phe Tyr Arg His Gly
145 150 155 160
Ala His Arg Ser Asp Trp Val Tyr Gln Lys Ser Thr Asp His Gly Arg
165 170 175
Thr Phe Ala Glu Pro Val Ser Phe Leu Lys His Lys Arg Arg Ser Asp
180 185 190
Ile Lys Ala Val Asp Ser Trp Tyr Ala Trp Val Gly Lys Gly Gln Gly
195 200 205
Asp Asp Ile Ile Ile Ser Tyr Asp Tyr His Ile Cys Trp Asp Gly Gly
210 215 220
Ala Gly Val Asn Gly Arg Gly His Thr Thr Glu Arg His Asp Ala Tyr
225 230 235 240
Tyr Met Val Phe Asn Thr Lys Asp Asp Thr Trp Arg Asn Val Gln Gly
245 250 255
Asp Asn Leu Asn Leu Pro Ile Thr Arg Glu Thr Ala Asp Glu Lys Thr
260 265 270
Leu Val Ala Arg Thr Gly Lys Asn Trp Thr Phe Asn Gly Ser Ala His
275 280 285
Leu Asp Glu His Gly Tyr Pro His Ile Ala Thr Asn Ile Gly Lys Asp
290 295 300
Leu Gly Gln Lys Thr Gly Gly Pro Lys Gln Thr Ser Tyr Phe Arg Trp
305 310 315 320
Asn Gly Ser Glu Trp Leu Gly Gly Gln Pro Val Asn Pro Gln Val Arg
325 330 335
Ser Leu Asn Ile Asp Ser Arg Gly Asp Phe Phe Val Asn Thr Pro Thr
340 345 350
Asp Val Thr Phe Thr Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Asp Asp Gly Val Ile
355 360 365
Ala Tyr Trp Asn Thr Gln Asp Gly Gly Lys Ser Phe Thr Lys Gly Lys
370 375 380
Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly Ala Gly Trp Ala Leu Thr Ser Ile Ile
385 390 395 400
Glu Asn Ala His Pro Asp Ala Arg Val Ile Val Ala Glu Lys Gln Lys
405 410 415
Gly Thr Asn Trp Ser Lys Val Tyr Leu Leu Gly Asp Lys Gly Pro Ile
420 425 430
Arg Ser Glu Asn Lys
435
<210> 2
<211> 1314
<212> DNA
<213> Alteromonas colwelliana
<400> 2
cccaataata ctgtcgactt cgctaacaat gcattgggta acccacttgc ggttgtccag 60
catccagcgg gtatctacca taatggcatt acgtatgtaa cctatcaagg gccgttagaa 120
gatccttaca ttgcagcgta taatcataaa acagatactt ggcaaggtcc gtttaaggca 180
ggtgtaagtg atatgggtaa agaccctacc cgctctaaaa tagataatca cggcaaacct 240
accatgttga ttgatgattt aggctatatt catatctttt ttggtggtca tggtggcatg 300
cctaaacatg gcaaaaaccc tttaggtaat acacattatg gccgcaatat tcatgctgtt 360
tctaaaaacc cgggtgatat taccagttgg gaagaattag ataatatatc ggtatttggt 420
acttataacc aagctgtaaa aatggataac ggtgatattt atttattcta ccgacatggc 480
gcgcacagaa gcgattgggt ttatcaaaaa tcgacagacc atggtcgtac ttttgctgag 540
cctgtgtcgt ttttaaaaca taaacgacgt agtgatatta aagccgtgga tagttggtat 600
gcctgggtag gtaaaggaca gggtgacgat atcattattt cttatgatta ccatatttgt 660
tgggatggtg gtgctggtgt taatggccga ggccatacaa ctgaacgcca tgatgcctat 720
tatatggtat ttaatacgaa ggatgatact tggcgcaatg ttcaaggtga taatctaaac 780
ttgccaataa cccgtgaaac agcagatgaa aaaacactcg tagccagaac aggtaaaaat 840
tggaccttta acggttcagc ccatttagat gagcatggtt acccgcatat tgcaaccaac 900
ataggtaaag atttgggtca aaaaacaggt gggccaaaac aaactagtta tttccgttgg 960
aatggcagtg agtggcttgg tggtcaacct gttaaccctc aggtacgcag cttaaacata 1020
gattcacgtg gtgatttttt tgtgaatacc ccaacagatg tgacttttac gctgggttat 1080
aaagaaaaag atgatggcgt aattgcttat tggaatacgc aagatggcgg caaaagcttt 1140
actaaaggta aagaattgct tcgtcgccaa ggtgcaggtt gggcgttaac atctatcatt 1200
gaaaatgccc acccagatgc tcgagtaatt gttgctgaaa aacaaaaagg tacaaactgg 1260
agtaaagttt atctcttagg ggataaggga ccaatacgaa gcgagaataa gtaa 1314
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccggaattcc ggcccaataa tactgtcgac ttcgctaaca 40
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggggtacccc ttacttattc tcgcttcgta ttggtcc 37
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
taatacagcg tatggccgca atattcatgc t 31
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggccatacgc tgtattacct aaagggtttt tgcca 35
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggtgtgtata accaagctgt aaaaatggat aacg 34
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gcttggttat acacaccaaa taccgatata ttatctaatt cttcc 45
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
atggcgcgtt tagaagcgat tgggtttatc aaaa 34
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gcttctaaac gcgccatgtc ggtagaa 27
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
atagttggca ggcctgggta ggtaaaggac agg 33
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccaggcctgc caactatcca cggctttaat atca 34
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<211> 29
<212> DNA
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ccatattagc tgggatggtg gtgctggtg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<210> 15
<211> 29
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ttcagttgtg cagcctcggc cattaacacc a 31
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aatagatcag cacggcaaac ctaccatgtt g 31
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tagtttgacg tggcccacct gttttttgac 30
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<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
cccaataata ctgtcgactt cgctaacaat gcattgggta acccacttgc ggttgtccag 60
catccagcgg gtatctacca taatggcatt acgtatgtaa cctatcaagg gccgttagaa 120
gatccttaca ttgcagcgta taatcataaa acagatactt ggcaaggtcc gtttaaggca 180
ggtgtaagtg atatgggtaa agaccctacc cgctctaaaa tagataatca cggcaaacct 240
accatgttga ttgatgattt aggctatatt catatctttt ttggtggtca tggtggcatg 300
cctaaacatg gcaaaaaccc tttaggtaat acagcgtatg gccgcaatat tcatgctgtt 360
tctaaaaacc cgggtgatat taccagttgg gaagaattag ataatatatc ggtatttggt 420
acttataacc aagctgtaaa aatggataac ggtgatattt atttattcta ccgacatggc 480
gcgcacagaa gcgattgggt ttatcaaaaa tcgacagacc atggtcgtac ttttgctgag 540
cctgtgtcgt ttttaaaaca taaacgacgt agtgatatta aagccgtgga tagttggtat 600
gcctgggtag gtaaaggaca gggtgacgat atcattattt cttatgatta ccatatttgt 660
tgggatggtg gtgctggtgt taatggccga ggccatacaa ctgaacgcca tgatgcctat 720
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ttgccaataa cccgtgaaac agcagatgaa aaaacactcg tagccagaac aggtaaaaat 840
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<400> 22
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<210> 23
<211> 1314
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<211> 1314
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<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 32
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435
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<400> 35
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<210> 36
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<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 36
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Gly Thr Asn Trp Ser Lys Val Tyr Leu Leu Gly Asp Lys Gly Pro Ile
420 425 430
Arg Ser Glu Asn Lys
435
Claims (11)
1.一种石莼多糖裂解酶，其特征在于，所述石莼多糖裂解酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶的编码基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示的石莼多糖裂解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.重组载体，其包含权利要求1所述的石莼多糖裂解酶的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体质粒为大肠杆菌质粒或枯草芽孢杆菌质粒。
5.一种细胞，其特征在于，所述细胞由含有权利要求3所述重组载体的宿主细胞转化而得。
6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
7.一种制备如权利要求1所述的石莼多糖裂解酶的方法，其特征在于，所述制备石莼多糖裂解酶的方法包含以下步骤：
（1）石莼多糖裂解酶基因的克隆与分析：提取保藏编号为CCTCC M 2012132的Alteromonas colwelliana A321菌株基因组，根据基因组序列与功能基因的进行比对分析，设计引物，以提取的基因组DNA为模板，经过PCR获得石莼多糖裂解酶基因；
（2）石莼多糖裂解酶重组载体的构建：将步骤（1）获得的石莼多糖裂解酶基因的核苷酸序列经双酶酶切后与大肠杆菌质粒连接，获得大肠杆菌重组载体；
（3）石莼多糖裂解酶重组细胞的构建：将步骤（2）石莼多糖裂解酶重组载体转化大肠杆菌得到大肠杆菌石莼多糖裂解酶重组细胞；
（4）石莼多糖裂解酶的表达与纯化：将含有石莼多糖裂解酶基因的细胞或含有石莼多糖裂解酶基因的重组载体的细胞接种到生物反应器中进行培养，诱导表达，收集表达产物，通过亲和层析纯化或通过离子交换与凝胶过滤纯化得到石莼多糖裂解酶。
8.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的石莼多糖裂解酶。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有食品或药品中可接受的辅料或载体。
10.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶或权利要求8或9所述的组合物在催化降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的绿藻多糖为石莼多糖、浒苔多糖或礁膜多糖。
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| GR01 | Patent grant | ||
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