CN112014367A - AuNPs1-2 pH探针在***中的应用和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了AuNPs1‑2 pH探针在***中的应用和产品，属于生物技术和临床医学检测技术领域。将AuNPs1‑2 pH探针应用制备检测***的产品中，其中，产品包括用于检测***内pH值的试剂，利用AuNPs1‑2 pH探针监测男性***内亚细胞局部pH变化及外界刺激下的pH变化，为临床原因不明不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制。
Description
技术领域
本发明涉及pH探针在***中的应用和产品，尤其涉及将AuNPs1-2 pH探针应用于定性检测***及对应产品，属于生物技术和临床医学检测技术领域。
背景技术
多年来，对男性***的常规分析，一直用于作为判断男性生育力的基本临床指标。而目前临床上对绝大部分的不育症男性患者的真正不育原因仍不清楚，尤其是临床上大约有三分之一不育症男性患者的常规***分析结果均正常或者接近正常，临床上把这类患者归为“不明原因不育症”患者，因此，长期以来，临床对***的检测判断存在极大的困难。
现有技术“CN200510078423.6 一种用于***检测方法的检测试剂”中公开：制备五乙酰氧基葡萄糖苷，采用所得的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷，采用所得的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷；该检测试剂用于***，特别是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法中，以适应仪器自动化分析。
现有技术“CN201711284133.6 EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用”中公开：提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质可以预防男性不育、治疗男性不育、促进***和卵子受精、促进***和去透明带的卵子受精、提高***与胞膜融合的能力、治疗***功能障碍、促进***的成熟、促进***在附睾中的成熟、提高***的运动能力、提高***获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平、促进***的获能、提高***的顶体反应能力、修复***异常形态、恢复钠/钾APT酶的活性、维持***内离子平衡、维持***内Na+平衡、维持***内HCO3平衡、维持***内pH值平衡、提高男性生育能力。
现有技术“CN201610147268.7 一种***质量评估的试剂盒及其使用方法”中公开：试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktail、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；检测缓冲液2为含0.05mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。通过***中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。
发明内容
发明人在长期的研究中发现，不育症男性患者的***内pH值较正常男性的***内pH值小，且不育症男性患者的***为酸性，再结合AuNPs1-2 pH探针分子结构在不同pH环境下发生共轭体系的改变，从而产生不同强度、不同种类的荧光，即pH值越小，红色荧光强度越大；pH值越大，绿色荧光强度越大，其中，AuNPs 1-2 pH探针在pH4.5-8.0的范围内产生较明显的变色效果，而不育症男性患者的***内pH值和正常男性***内pH值均在该范围内，基于此，应用酸性环境中的AuNPs1-2 pH探针分子中荧光共轭体系为红色荧光，并以正常男性***内pH值为检测指标，可明显观察到不育症男性患者***内pH值对应的红色荧光强度更显著。
针对于现有技术的不足，以及临床实际需求，本发明提供AuNPs1-2 pH探针在***中的应用和产品，其中，利用AuNPs1-2 pH探针（纳米级pH探针）监测男性***内亚细胞局部pH变化及外界刺激下的pH变化，为临床不明原因不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，包括所述AuNPs1-2 pH探针在制备用于检测***的产品中的应用。其中，所述产品以正常男性***内pH为检测指标，若***样本基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光异于正常男性***基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光，即***样本的pH异于所述检测指标，则判断***样本来自不育症男性患者；反之，则判断***样本来于正常男性。
进一步的，所述***内pH包括正常情况下的***内亚细胞局部的pH，或者，在外界刺激下***内亚细胞局部的pH；其中，亚细胞包括溶酶体、线粒体等，外界刺激为孕酮刺激、NNC 55-0396刺激等。
进一步的，所述不育症男性患者包括弱精患者，其中，弱精患者的***前向运动小于32。
进一步的，所述不育症男性患者包括不明原因不育症男性患者。不明原因不育症男性患者是指***各项检测指标均合格的不育症男性患者，其中，各项检测指标（***理化特征）包括：禁欲天数2-7天，颜色灰白色，***量≥1.5 mL，pH≥7.2，粘度＜2cm，液化时间＜60min，凝聚结果阴性；***浓度（SC）＞15*10^6/mL，前向运动（PR）＞32%，***活动率（motility）＞40%，存活率（伊红-苯胺黑染色）＞58%，圆细胞浓度（round cell）＜5*10^6/mL，白细胞浓度（WBC）＜1.0*10^6/mL；正常形态***百分比（PNS）＞4%。
AuNPs1-2 pH探针在***中的产品，包括用于检测***内pH值的试剂。
进一步的，所述产品为试剂盒，试剂盒包括：多聚赖氨酸、AuNPs1-2 pH探针和PBS缓冲液，PBS缓冲液pH为7。
进一步的，所述PBS缓冲液包括浓度0.01mol/L 的PO4 3-及质量分数为0.8%的NaCl。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1）本发明首次将AuNPs1-2 pH探针技术应用在离体生殖细胞即***内，并为临床不明原因不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制；
2）本发明可直观、形象、有效的观测正常男性***内pH值及不育症男性患者***内pH值的差异；
3）在本发明中，AuNPs 1-2 pH探针在pH4.5-8.0的范围内产生较明显的变色效果，同时，相较于现有技术中常用的BCECF法测***内pH值，本技术方案具有双显色、对***样本的伤害小、显色灵敏度高及更易观察等特点。
附图说明
图1为AuNPs 1-2 pH探针在不同pH环境下发生共轭结构的改变从而产生不同颜色的荧光图；
图2为正常男性***于40X激光共聚焦显微镜下的效果图；
图3为正常男性***于100X激光共聚焦显微镜下的效果图；
图4为正常男性***与不育症男性患者***分别于40X激光共聚焦显微镜下的效果图（Merge）；
图5为正常男性***与不育症男性患者***分别于40X激光共聚焦显微镜下的效果图（Red channel）；
图6为正常男性***与不育症男性患者***内的pH差异统计图；
图7为伊红染色法对比使用AuNPs 1-2 pH探针以及BCECF法测定***内pH后，***活力结果图（其中，箭头指向为死亡***）；
图8为伊红染色法对比使用AuNPs 1-2 pH探针以及BCECF法测定***内pH后，***活力差异统计图；
图9为伊红染色法对比使用AuNPs 1-2 pH探针以及BCECF法测定***内pH后，分别于40X激光共聚焦显微镜下的效果图。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，包括所述AuNPs1-2 pH探针在制备用于检测***的产品中的应用。其中所述产品以正常男性***内pH为检测指标，若***样本基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光异于正常男性***基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光，即***样本的pH异于所述检测指标，则判断***样本来自不育症男性患者；反之，则判断***样本来于正常男性。
所述***内pH包括正常情况下的***内亚细胞局部的pH，或者，在外界刺激下***内亚细胞局部的pH；其中，亚细胞包括溶酶体、线粒体等，外界刺激为孕酮刺激、NNC 55-0396刺激等。
不育症男性患者包括弱精患者，其中，弱精患者的***前向运动小于32。
不育症男性患者还包括不明原因不育症男性患者。不明原因不育症男性患者是指***各项检测指标均合格的不育症男性患者，其中，各项检测指标（***理化特征）包括：禁欲天数2-7天，颜色灰白色，***量≥1.5 mL，pH≥7.2，粘度＜2cm，液化时间＜60min，凝聚结果阴性；***浓度（SC）＞15*10^6/mL，前向运动（PR）＞32%，***活动率（motility）＞40%，存活率（伊红-苯胺黑染色）＞58%，圆细胞浓度（round cell）＜5*10^6/mL，白细胞浓度（WBC）＜1.0*10^6/mL；正常形态***百分比（PNS）＞4%。
实施例2
AuNPs1-2 pH探针在***中的产品，包括用于检测***内pH值的试剂。
产品为试剂盒，试剂盒包括：多聚赖氨酸、AuNPs1-2 pH探针和PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为7，PBS缓冲液包括浓度0.01mol/L 的PO4 3-及质量分数为0.8%的NaCl。
实施例3
基于实施例2，本实施例提供一种AuNPs1-2 pH探针在***中的产品的使用方法，具体包括如下步骤：
一、取200μL多聚赖氨酸包被3.5 cm玻底培养皿（置于培养皿中心的玻片上即可），避光静置10 min后，弃液体，吸干，置于室温中，18 -26 ℃过夜干燥，或60℃干燥1 h；
二、采用PBS缓冲液分别洗正常男性***及不育症男性患者***，其中，具体为：
取1-2 mL***加入2-3 mL PBS缓冲液中，以520G离心10 min后，弃上清，洗至上清液近透明；
正常男性***及不育症男性患者***（具体为取弱精患者***）均由人类***库直接提供，***类别（正常及弱精）与临床判断指标一致；
三、以PBS缓冲液为溶剂，分别稀释用PBS缓冲液洗后的正常男性***及不育症男性患者***，其中，将***稀释为适宜浓度（以在显微镜下看到游离的单个***为宜），得***稀释液；
分别取200μL***稀释液置于1.5 mLEP管中，分别加入5μL AuNPs1-2 pH探针（由四川大学化学学院绿色化学与技术***重点实验室提供），室温避光孵育5-10 min， 520G离心10 min，去上清，再加入200μL PBS缓冲液，重悬，将***充分混匀在PBS缓冲液中，备用；
四、取3μL已备好的共染正常男性***滴于玻底培养皿上，于40X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照，所得结果如图2所示；于100X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照，所得结果如图3所示。其中，结合图2-3，可知：于40X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照，可看到更多的***，便于统计整体***内荧光强度水平。
五、取3μL已备好的共染不育症男性患者***滴于玻底培养皿上，于40X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照。
结果显示：使用AuNPs 1-2探针处理后，由于不育症男性患者的***内pH小于7（为酸性），而酸性的荧光共轭体系为红色荧光，故而，可明显观察到不育症男性患者***内pH的红色荧光强度更显著（如下表1），且使用统计学软件处理后，得到二者的红色荧光强度有显著的统计学差异（如图6）。
实施例4
基于实施例3，本发明人还设计了伊红染色法对比使用AuNPs 1-2 pH探针以及BCECF法测定***内pH后的***活力，其中，BCECF法测定***内pH的步骤具体包括：
一、取200μL多聚赖氨酸包被3.5 cm玻底培养皿（置于培养皿中心的玻片上即可），避光静置10 min后，弃液体，吸干，置于室温中，18 -26 ℃过夜干燥，或60℃干燥1 h；
二、采用PBS缓冲液分别洗正常男性***及不育男性患者***，其中，具体为：
取1-2 mL***加入2-3 mL PBS缓冲液中，以520G离心10 min后，弃上清，洗至上清液近透明；
正常男性***及不育男性患者***均由人类***库直接提供，***类别（正常及不育症）与临床判断指标一致；
三、以PBS缓冲液为溶剂，分别稀释用PBS缓冲液洗后的正常男性***及不育男性患者***，其中，将***稀释为适宜浓度（以在显微镜下看到游离的单个***为宜），得***稀释液；
分别取200μL***稀释液置于1.5 mLEP管中，分别加入5μL BCECF探针（购自大连美仑生物技术有限公司），室温避光孵育5-10 min， 520G离心10 min，去上清，再加入200μL PBS缓冲液，重悬，将***充分混匀在PBS缓冲液中，备用；
四、取3μL已备好的共染正常男性***滴于玻底培养皿上，于40X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照；
五、取3μL已备好的共染不育症男性患者***滴于玻底培养皿上，于40X激光共聚焦显微镜（OlympusMicro）下拍照。
其中，***活力的测定方法具体包括：
采用伊红染液（购自成都朴华科技有限公司）为***活力检测试剂，取完全液化后的新鲜***10uL于EP离心管中，取30uL伊红染液与***混合均匀，静置30；取10uL混合液于玻片一端，拉片制成涂片，空气干燥。
普通显微镜下立即观察或用非水性封片剂封片后观察，计数不少于200个***；
1）无色透明或被染成淡红色的***为活***，被染成红色或暗红色的***为死***；
2）***存活率=活***数/被计数的总***数×100%；
结果显示，BCECF法中的实验***样本总数593个，使用BCECF法后，存活***数为385个，死亡***数为208个，即***存活率平均值为65.92%；在使用AuNPs 1-2 pH探针检测中的实验***样本总数653个，使用AuNPs 1-2 pH探针后，存活***数为458个，死亡***数为195个，***存活率平均值为70.14%，如图7-8所示，进而可得到：使用AuNPs 1-2 pH探针检测***内pH后，该***活力明显高于使用BCECF法测定***内pH后的***活力。
此外，AuNPs 1-2 pH探针为双向标记pH探针，若***内有碱化过程，则显示绿色，而BCECF探针使用后，仅显示绿色荧光，即其涉及的***内碱化后不易通过颜色加以观察及辨认（如图9所示）。
Claims (8)
1.AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，其特征在于，包括所述AuNPs1-2 pH探针在制备用于检测***的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，其特征在于，所述产品以正常男性***内pH为检测指标，若***样本基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光异于正常男性***基于AuNPs1-2 pH探针检测的荧光，即***样本的pH异于所述检测指标，则判断***样本来自不育症男性患者；反之，则判断***样本来于正常男性。
3.根据权利要求2所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，其特征在于，所述***内pH包括正常情况下的***内亚细胞局部的pH，或者，在外界刺激下***内亚细胞局部的pH。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，其特征在于，所述不育症男性患者包括弱精患者。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的应用，其特征在于，所述不育症男性患者包括不明原因不育症男性患者。
6.AuNPs1-2 pH探针在***中的产品，其特征在于，包括用于检测***内pH值的试剂。
7.根据权利要求6所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒，试剂盒包括：多聚赖氨酸、AuNPs1-2 pH探针和PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为7。
8.根据权利要求7所述的AuNPs1-2 pH探针在***中的产品，其特征在于，所述PBS缓冲液包括浓度0.01mol/L 的PO4 3-及质量分数为0.8%的NaCl。
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