CN112011642B

CN112011642B - 一种甘薯内参基因tua及引物和应用

Info

Publication number: CN112011642B
Application number: CN202011061446.7A
Authority: CN
Inventors: 李国良; 邱思鑫; 张鸿; 林赵淼; 许泳清; 许国春; 李华伟; 纪荣昌; 刘中华; 罗文彬; 邱永祥; 汤浩
Original assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112011642A

Abstract

本发明公开了甘薯不同组织部位中稳定表达内参基因及引物和应用，所述内参基因为IbTUA；其中，所述内参基因IbTUA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明中甘薯稳定表达的内参基因IbTUA是在不同类型甘薯的不同组织部位最稳定的内参基因，该基因表达的稳定性优于现有技术中的其他基因，作为荧光定量内参基因能为甘薯获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。

Description

一种甘薯内参基因TUA及引物和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及不同类型甘薯的不同组织部位荧光定量内参基因及应用。

背景技术

甘薯在我国种植区域广泛，既可以作为粮食作物，也可以作为新型能源作物开发利用。据报道甘薯是世界卫生组织推荐的最佳蔬菜之一，富含类胡萝卜素、花青素、淀粉等多种营养物质。研究甘薯营养物质积累的分子机制是科学家们感兴趣的领域。

荧光实时定量PCR(RT-qPCR) 由于其敏感性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究，已有不同的科学家采用RT-qPCR技术研究了甘薯类胡萝卜素合成基因、花青素合成基因和淀粉合成基因的表达。然而，RT-qPCR结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。理想的内参基因应该在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参基因根本不存在。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获得准确的qRT-PCR 实验结果是非常重要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种甘薯不同组织稳定表达的内参基因，并揭露了利用该甘薯内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR 引物。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种甘薯不同组织稳定表达的内参基因：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；且该内参基因是以甘薯DNA 为模板、并以如下引物对进行PCR 扩增反应所得的；

其中引物对为：

正向引物5'-ATGAGAGAGTGCATTTCAAT-3'，

反向引物5'-TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG-3'。

进一步地，以上述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件、并遵循实时荧光定量PCR 引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR 引物；

且该实时荧光定量PCR 引物为：

正向引物5'- TGTCCTGTCAACCCATTCC-3'，

反向引物5'- TGAGGGCACCATCAAACC-3'。

本发明的优点在于：

本发明提供了一种甘薯不同组织稳定表达内参基因TUA，同时揭露了利用该甘薯内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR 引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于甘薯不同组织部位基因表达分析时，稳定性高于已报道的甘薯内参基因，能够提高甘薯基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测甘薯组织表达的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1为甘薯TUA基因的电泳图；

图2为候选内参基因电泳图；

图3为RT-qPCR中TUA的溶解曲线;

图4为geNorm 软件分析个候选内参基因的表达稳定值；

图5为geNorm软件分析甘薯中最佳的内参基因数量；

图6为NormFinder软件分析个候选内参基因的表达稳定值；

图7为BestKeeper软件分析个候选内参基因的表达稳定值。

具体实施方式

本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国ABI QuantStudio 5 实时荧光定量仪，美国ABI Veriti96-well 热循环仪，NanoDrop2000紫外分光光度计，DNA、RNA试剂盒，逆转录试剂盒，2×EasyTaq PCR SuperMix，实时荧光定量PCR试剂盒均购于北京全式金生物技术有限公司，其余生化试剂均为国产分析纯。

实施例1 内参基因TUA的获得

根据甘薯二倍体公布基因组数据库（http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/）设计一对引物，由福州博尚生物技术有限公司合成，该对引物(如SEQ ID NO：2、3所示) ：正向引物5'- ATGAGAGAGTGCATTTCAAT-3'，反向引物5'-TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG-3'。

DNA提取：根据DNA提取试剂盒说明书EasyPure® Plant Genomic DNA Kit (含RNase A）(北京全式金生物技术有限公司，北京)，将甘薯叶片在液氮下研磨后，用试剂盒抽提，之后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA 质量，最后将DNA 稀释至50ng.L^-1，并于-20℃冰箱中保存备用。

以甘薯DNA为模板，PCR扩增获得TUA基因组序列。PCR反应体系均为：2×EasyTaqPCR SuperMix 10μL，正反向引物(浓度为10μmol/L)各1μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 7μL，共计20 μL。PCR反应条件均为：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 30 s为1个循环，共经历30个循环；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃ 保存。最后通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。

实施例2实时荧光定量PCR 设计和检测

以实施例1 获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件，并遵循实时荧光定量PCR 引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为185bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物(如SEQ ID NO ：4、5 所示) ：正向引物5'- TGTCCTGTCAACCCATTCC-3'，反向引物5'-TGAGGGCACCATCAAACC-3'。

提取甘薯总RNA，并按照逆转录试剂盒TransScript® One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京)的方法合成cDNA 第一链，即将RNA 反转录为cDNA ；之后以所得cDNA 为模板、以实时荧光定量PCR 引物为引物对进行PCR 扩增，且PCR 扩增的反应体系与反应程序和实施例1相同，检测结果如图2 所示；由图2 可知，PCR 扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带(图2)，经测序大小为185bp，符合预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR 引物验证。

实施例3 内参基因稳定性验证

通过搜索甘薯18S rRNA rRNA、EF1α、eIF4α、GADPH、TIP41、TUA和TUB等基因的保守序列，根据qRT-PCR引物设计原则，设计出8种内参基因的目的片段引物。以及文献中的ARF、COX、GAP、RPL和UBI的引物对序列共12对，由福州博尚生物技术有限公司合成

表1.候选内参基因的引物序列

ACT-F	GTTATGGTTGGGATGGGACA
		ACT-R	GTGCCTCGGTAAGAAGGACA
ARF-F	CTTTGCCAAGAAGGAGATGC
		ARF-R	TCTTGTCCTGACCACCAACA
COX-F	ACTGGAACAGCCAGAGGAGA
		COX-R	ATGCAATCTTCCATGGGTTC
GAP-F	ATACTGTGCACGGACAATGG
		GAP-R	TCAGCCCATGGAATCTCTTC
RPL-F	TTTGACCGAAATGCCCTTAG
		RPL-R	TTCTGGTTCACCCCAACATT
UBI-F	TCGACAATGTGAAGGCAAAG
		UBI-R	CTTGATCTTCTTCGGCTTGG
18S rRNA -F	AGCAAGCCTACGCTCTGT
		18S rRNA -R	CTGGTCGGCATCGTTTAT
EF1α-F	TGCCTTGTGGAAGTTTGA
		EF1α-R	GGAGTATTTGGGAGTGGTG
elF4A-F	TACGAAACCCTTGCCATTA
		elF4A-R	ACACGGGAGGACCCAGAT
GADPH-F	CTGTTTGGCGAGAAGTCA
		GADPH-R	GAGCAAGGCAGTTGGTAG
TIP41-F	CTCAACTCCGCAAATCGT
		TIP41-R	GGAACTTCAACAGGTGGC
TUA-F	TGTCCTGTCAACCCATTCC
		TUA-R	TGAGGGCACCATCAAACC
TUB-F	CCCACGTCTTCATTTCTTC
		TUB-R	ATCCCACATTTGCTGAGTAG

本实验以合成的甘薯cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，荧光定量反应体系及程序参照说明书(北京全式金生物技术有限公司，北京)，反应体系为：2×TansStartTopGreen qPCR supermix(+Dye I) 10μL，正反向引物(浓度为10μmol/L)各0.4μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O 7μL，共计20 μL。反应程序为：94 ℃ 预变性30 s；94 ℃ 5 s，60℃ 20s，72℃ 30s为1个循环，共经历40个循环。在ABI QuantStudio 5 Real-Time PCR System（ABI, Foster City, CA, USA）上进行反应。每个反应设4次重复，使用QuantStudio^TMDesign & Analysis 软件获得 Ct值、扩增曲线及熔解曲线（图3）。

根据实时荧光定量PCR国际化标准-MIQE指南，Ct 值反映了内参基因在该物种某一部位的表达丰度，Ct 值越小说明该基因的表达量越高，内参基因Ct 值过高(＞25)或过低(＜10)均不适用于后续目的基因的分析。结果表明候选的内参基因都符合指南的要求（表1）。

试验数据采用Excel软件进行处理和分析，使用Delat CT、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对内参基因的稳定性进行评价。根据公式 Q =2^-ΔCt，利用Excel计算出每个样品的相对表达量Q，其中ΔCt = Ct _sample - Ct_min ， Ct_min表示所有样品的最小Ct值。将8种内参基因在甘薯不同组织器官中计算所得相对表达量 Q 值导入GeNorm计算出各内参基因的平均变异度M值，根据M值大小进行基因稳定性排序，M值越小基因稳定性越高。18s rRNA和TUA的M值较小，表明这两个基因在不同品种和部位中表达较为稳定（图4）。geNorm软件同时还对内参基因最适合的数目进行评价，如图5所示，不同叶色甘薯的不同组织中，越多参考基因结果越准确。

同样将相对表达量Q值导入NormFinder进行统计学分析，计算得出基因表达稳定值(S值)并根据S值确定最适内参基因，S值越小基因越稳定，使用NormFinder软件进行内参基因稳定性评价时，数据处理同geNorm。结果显示，M值大小排序为GADPH>eIF1a>TIP41>ACT>TUB>18s rRNA>TUA>EF1a，因此，稳定性相应的为GADPH<eIF1a<TIP41<ACT<TUB<18s rRNA<TUA <EF1a（图6）。

BestKeeper可直接输入平均Ct 值运算得出相关系数并进行稳定性比较。综合分析比较5个软件的计算结果，最终筛选出最稳定表达的甘薯qRT-PCR的内参基因。使用Bestkeeper软件评价内参基因稳定性时，可以直接使用各个基因的Ct值进行计算，通过标准偏差（SD）和变异系数（CV）评价内参基因的稳定性。SD和CV的数值越小，表示内参基因的表达越稳定。BestKeeper软件分析结果如图7所示，18s rRNA、EF1a、TUA、TUB的SD值均小于1，表明这4个候选内参基因的稳定性较好，而ACT、eIF4a、GADPH和TIP41的SD值大于1，表明这4个候选内参基因的稳定性较差（图7）。

综合qRT-PCR结果和5个软件对候选内参基因的评价结果分析（表3），TUA在不同甘薯品种和组织器官中表达水平一致性较好，最为稳定，适合作为相关目的基因表达研究的内参基因组合。

表2 个候选内参基因在甘薯不同品种和组织中的平均Ct 值

表3 内参基因在甘薯不同组织部位稳定性评价

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院作物研究所

<120> 一种甘薯内参基因TUA及引物和应用

<130> 29

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagagagt gcatttcaat ccacattggt caggccggta tccaggtcgg aaatgcttgc 60

tgggaacttt actgcctcga gcacggcatt caggtatcta catttctgtt tctctttagc 120

tgcggacatg cgttttagct tacagtgtag catttgcata gatctgtgct agattactgt 180

tcccgtatac gtatatgtag tgtatttatg tagatccgtt tgaatctttt gctgatttct 240

gtagatctgt gtggattagt attatttacg tgtaggtttg ggttatcttt tgctgatttc 300

tgtggatctg tgttaatgag tattatgtac gtgtaggttt aagtttatac taatttccgc 360

ttacatttct atgataattg cgtttatttg cctaagtcgt catgaaattt ggtttcgatt 420

gatggtttaa atagttgaat tgaatgtata ttaatccatc cgcctgattt gaaacaaatt 480

gctgttattt tgtatagatc ttcctggcgt ttatttagtt tatcgatact tgaagttaga 540

tctgcaattt tgttgtatat tgcatatggt ggtcaccgac aactccaaat tggttgttaa 600

ttaagtagat ctgcaatgaa gcttgaatag agtgtttgtt actgaatgaa tttgtatcat 660

atgtcttcca cagcctgatg gccagtgccc tccgacaaga ctgttggagg aggtgatgat 720

gcattcaaca ccttcttcag tgaactggag ctggaaagca cgttcctcgt gctgtgtttg 780

ttgatctgga acccactgtc attatgaggt gaggaccgga ccatacagac aattgtttca 840

ccctgagcag ctgatcagtg gcaaggaaga tgcagccaac aactttgccc gaggccatta 900

cacaagtaaa tatcttctca attgtatatt tggtttatgt tttattagta taaacagaat 960

tcttataaat taactgttct ctgtctgctt ggtgtgtgtg cagttgggaa ggagattgtt 1020

gacctttgct tggatcggat ccgtaaactt gctgacaact gcactggtct tcaaggattt 1080

ctcgtcttca atgctgtagg aggtggcact ggttcaggcc ttgggtctct tctgcttgag 1140

cgtctctctg ttgactatgg aaagaaatcg aaacttggtt tcaccattta cccttcgccc 1200

caggtttcaa cctctgttgt tgagccatac aacagtgtcc tgtcaaccca ttcccttctc 1260

gagcacactg atgtggcagt tcttcttgac aatgaggcca tttatgacat ctgccgccgc 1320

tcccttgaca ttgagcgccc aacctatcac aaccttaaca gacttatttc acaggtatat 1380

gtgcagccct tggcacaata tcaatcagtg cttgtatcag tttaagatga tggcactgat 1440

gctaatctat gctttcttgt gcaggttatc tcttcattga ctgcctctct caggtttgat 1500

ggtgccctca atgttgatgt gaatgagttc cagaccaacc ttgtgccata ccctaggatt 1560

catttcatgc tttcctcata tgcccctgtc atttcagctg agaaagccta ccatgaacaa 1620

ctctctgttg ctgagatcac caacagtgct tttgagccat catctatgat ggtgaagtgc 1680

gaccctcgcc atggcaaata catggcatgc tgcctga 1717

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagagagt gcatttcaat 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaggcagca tgccatgtat ttg 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtcctgtca acccattcc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgagggcacc atcaaacc 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttatggttg ggatgggaca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgcctcggt aagaaggaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctttgccaag aaggagatgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcttgtcctg accaccaaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

actggaacag ccagaggaga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgcaatctt ccatgggttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atactgtgca cggacaatgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcagcccatg gaatctcttc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttgaccgaa atgcccttag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttctggttca ccccaacatt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcgacaatgt gaaggcaaag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cttgatcttc ttcggcttgg 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agcaagccta cgctctgt 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctggtcggca tcgtttat 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgccttgtgg aagtttga 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggagtatttg ggagtggtg 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tacgaaaccc ttgccatta 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acacgggagg acccagat 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctgtttggcg agaagtca 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gagcaaggca gttggtag 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctcaactccg caaatcgt 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaacttcaa caggtggc 18

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cccacgtctt catttcttc 19

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atcccacatt tgctgagtag 20

Claims

1.一种用于甘薯不同组织基因表达分析的内参基因TUA，其特征在于，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述内参基因是以甘薯DNA为模板，以如下引物对进行PCR扩增反应所得：

正向引物：5'-ATGAGAGAGTGCATTTCAAT-3'，

反向引物：5'-TCAGGCAGCATGCCATGTATTTG-3'。

2.一种如权利要求1所述内参基因TUA的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述实时荧光定量PCR引物序列如下：

正向引物：5'-TGTCCTGTCAACCCATTCC-3'，

反向引物：5'-TGAGGGCACCATCAAACC-3'。