CN112007016B - 一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用 - Google Patents

一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳米缓释制剂，属于纳米材料技术领域。本发明提供的纳米缓释制剂包括右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，以及包覆在所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒外层的丝素蛋白。在本发明中，右旋糖苷包裹的氧化铈纳米颗粒有良好的水溶分散性，并且具有优异的抗氧化活性和携氧能力，能够显著改善因缺氧和氧化损伤导致的神经元丢失，恢复线粒体的形态和结构；丝素蛋白具有良好的生物相容性，使用丝素蛋白包裹右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，可以达到缓慢释放纳米颗粒的功效，避免药物浓度瞬间过高且代谢快的缺点；同时，丝素蛋白具有生物降解性，其降解物安全、无污染。

Description

一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障 碍疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，特别涉及一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用。
背景技术
线粒体是由线粒体外膜OMM和线粒体内膜IMM包被的细胞器，是真核生物进行氧化代谢的部位。线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一，呼吸链受到抑制、酶活性降低、线粒体DNA损伤以及线粒体膜受损都会引起线粒体功能障碍(mitochondrialdysfunction，MD)。MD一般表现为线粒体数量、大小和形态的改变，数量上，线粒体会出现增生，这是对慢性非特异性细胞损伤产生的适应性反应，在急性损伤或线粒体自噬和溶解的情况下线粒体的数量会较少。细胞损伤时最常见的改变为线粒体肿大。大小上，细胞损伤时最常见的是线粒体肿大，这是器官功能负荷增加引起的适应性肥大，而器官萎缩时，线粒体则缩小。形态上，MD时线粒体嵴会出现不同程度的破坏，变短变小甚至消失，而线粒体发挥功能大部分酶分布在线粒体嵴上。
目前已知的和线粒体功能障碍相关的疾病有很多，例如弗里德赖希共济失调症(FRDA)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等。以弗里德赖希共济失调症(FRDA)为例，它的的发病机制是FXN基因的第一个内含子上GAA序列的高倍数重复扩展，导致frataxin蛋白水平的降低，同时研究指出frataxin蛋白的缺陷会导致线粒体中铁硫簇的继发性缺乏，而铁硫簇是三羧酸循环和线粒体电子呼吸链酶促反应中一系列酶的关键组成部分，如线粒体复合物I，II和III，顺乌头酸酶，铁调蛋白I等。同时，因铁硫簇合成缺陷导致的铁累积使得线粒体中游离的亚铁离子无法被平衡而处于高浓度水平状态，在芬顿反应的作用下会导致活性氧ROS增加，加剧线粒体的氧化应激损伤。因此，最终的病理表现为线粒体功能障碍继而引发的神经和心肌细胞的退行性病变。
目前治疗线粒体功能障碍相关疾病的药物有环孢菌素A(CSA)和环孢素A类似物、线粒体辅酶Q10、α-硫辛酸等，但是环孢菌素A穿透血脑屏障的能力差，限制了其治疗效果；线粒体辅酶Q10能够清除线粒体内的活性氧ROS水平，但只能缓解疾病，不能根治；α-硫辛酸是一种线粒体的抗氧化剂，但其也存在只能缓解不能根治的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用。本发明提供的纳米缓释制剂能够恢复线粒体的形态和结构，对线粒体功能障碍疾病具有显著疗效。
为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种纳米缓释制剂，包括右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，以及包覆在所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒外层的丝素蛋白。
优选的，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的尺寸为1～30nm；所述纳米缓释制剂的水动力尺寸为80～120nm。
本发明提供了上述纳米缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液；
(2)将丝素蛋白与溴化锂溶液混合，依次进行水解和第一透析，透析袋内得到丝素蛋白溶液；
(3)将所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，得到混悬液；
(4)将所述混悬液进行冻存、融化和第二透析，得到纳米缓释制剂；
所述步骤(1)和(2)没有时间顺序的限制。
优选的，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液中铈元素的质量浓度为1～5mg/mL。
优选的，所述溴化锂溶液的摩尔浓度为8.5～10mol/L；所述丝素蛋白的质量与溴化锂溶液的体积比为1g：1～5mL。
优选的，所述水解的温度为20～70℃，时间为30～360min；
所述第一透析用透析袋截留的分子量为12000～14000。
优选的，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒中铈元素的质量与丝素蛋白溶液的体积比为1mg:1～5mL；
所述超声的功率为100～300W，时间为10～60min。
优选的，所述冻存的温度为-80～-20℃，时间为24～48h；
所述第二透析用透析袋截留的分子量为5000～10000。
本发明提供了上述纳米缓释制剂在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用。
优选的，所述线粒体功能障碍疾病包括弗里德赖希共济失调症、阿尔茨海默病、帕金森病或肌萎缩侧索硬化中的一种或几种。
本发明提供了一种纳米缓释制剂，包括右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，以及包覆在所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒外层的丝素蛋白。在本发明中，右旋糖苷包裹的氧化铈纳米颗粒有良好的水溶分散性，并且具有优异的抗氧化活性和携氧能力，能够显著改善因缺氧和氧化损伤导致的神经元丢失，恢复线粒体的形态和结构；丝素蛋白具有良好的生物相容性，使用丝素蛋白包裹右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，可以达到缓慢释放纳米颗粒的功效，避免药物浓度瞬间过高且代谢快的缺点；同时，丝素蛋白具有生物降解性，其降解物安全、无污染。实施例结果表明，本发明提供的纳米缓释制剂具有缓释作用，用于制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物时，对线粒体功能障碍疾病具有显著疗效，具体表现为：(1)可以恢复FRDA小鼠的小脑中浦肯野细胞的数量和形态，且心肌细胞内铁累积现象消失；(2)可以恢复FRDA小鼠的线粒体形态和功能，其线粒体大小形态恢复正常，线粒体内膜嵴的有序排列，线粒体产生ATP的功能得到恢复；(3)可以将线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基的蛋白表达水平恢复正常，同时线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ的活性也恢复正常。
本发明提供了上述纳米缓释制剂的制备方法，本发明将右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，使丝素蛋白对氧化铈纳米颗粒进行包裹，自组装成复合纳米颗粒；通过将超声后混悬液进行冻存，达到稳定复合纳米颗粒的效果，经融化和透析后，得到纳米缓释制剂。本发明提供的制备方法简单，易于实现工业化批量生产。
附图说明
图1为实施例1所得纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs的SEM图；
图2为实施例1所得纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs的水动力尺寸；
图3为SF@CeO2 NPs的药物释放率；
图4为SF@CeO2 NPs腹腔给药1个月期间小鼠的体重变化；
图5为SF@CeO2 NPs给药后小鼠的行为学—木梁实验测试结果图；
图6为SF@CeO2 NPs给药后小鼠的行为学—旋转疲劳仪测试结果图；
图7为SF@CeO2 NPs给药后小鼠的行为学—悬挂实验测试结果图；
图8为SF@CeO2 NPs给药后小鼠小脑的切片H&E染色图；
图9为SF@CeO2 NPs给药后小鼠心脏的普鲁士蓝染色图；
图10为SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中ATP含量；
图11为SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ亚基的蛋白表达水平；
图12为SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅰ的活性；
图13为SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅱ的活性。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米缓释制剂，包括右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，以及包覆在所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒外层的丝素蛋白。
在本发明中，所述所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的尺寸优选为1～30nm，更优选为5～20nm，进一步优选为10～15nm；在本发明中，所述纳米缓释制剂的水动力尺寸优选为80～120nm，更优选为90～110nm，进一步优选为100nm。
在本发明中，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒优选具有核壳结构，其内核为氧化铈纳米颗粒，修饰外壳为右旋糖苷；在本发明中，所述右旋糖苷的厚度非常薄，其厚度可以忽略不计。
在本发明中，右旋糖苷包裹的氧化铈纳米颗粒有良好的水溶分散性，并且具有优异的抗氧化活性和携氧能力，能够显著改善因缺氧和氧化损伤导致的神经元丢失，恢复线粒体的形态和结构；丝素蛋白具有良好的生物相容性，使用丝素蛋白包裹右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，可以达到缓慢释放纳米颗粒的功效，避免药物浓度瞬间过高且代谢快的缺点；同时，丝素蛋白具有生物降解性，其降解物安全、无污染。
本发明提供了上述纳米缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液；
(2)将丝素蛋白与溴化锂溶液混合，依次进行水解和第一透析，透析袋内得到丝素蛋白溶液；
(3)将所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，得到混悬液；
(4)将所述混悬液进行冻存、融化和第二透析，得到纳米缓释制剂；
所述步骤(1)和(2)没有时间顺序的限制。
本发明提供右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液。本发明对所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的制备方法没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的制备方法即可，作为本发明的一个具体实施例，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的制备方法参照英文文献《Dextran-coated Cerium Oxide Nanoparticles:A Computed TomographyContrast Agent for Imaging the Gastrointestinal Tract and Inflammatory BowelDisease》。
在本发明中，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液的制备方法优选包括以下步骤：
将右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒与醇溶剂混合，得到右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液。
在本发明中，所述醇溶剂优选为甲醇、乙醇和丙醇中的一种或几种，更优选为甲醇。在本发明中，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液中铈元素的质量浓度优选为1～5mg/mL，更优选为2～4mg/mL。
本发明将丝素蛋白与溴化锂溶液混合，依次进行水解和第一透析，透析袋内得到丝素蛋白溶液。在本发明中，所述丝素蛋白的制备方法优选通过天然蚕丝纤维用碱脱丝胶制备得到。在本发明中，所述溴化锂溶液的摩尔浓度优选为8.5～10mol/L，更优选为9～9.5mol/L；所述丝素蛋白的质量与溴化锂溶液的体积比优选为1g：1～5mL，优选为1g：2～4mL。
在本发明中，所述水解的温度优选为20～70℃，更优选为30～60℃；时间优选为30～360min，更优选为60～240min。本发明通过所述水解，能够使丝素蛋白均匀分散在水溶液中。本发明对所述第一透析用透析袋的材质没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知材质的透析袋即可；所述第一透析用透析袋截留的分子量优选为12000～14000，更优选为13000。本发明通过所述第一透析，能够除去杂质分子，得到纯净的丝素蛋白。
得到所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液和丝素蛋白溶液后，本发明将所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，得到混悬液。本发明优选在超声的条件下进行所述混合；在本发明中，所述混合的方式优选为将丝素蛋白溶液逐滴缓慢加入右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液中。
在本发明中，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒中铈元素的质量与丝素蛋白溶液的体积比优选为1mg:1～5mL，更优选为1mg:2～4mL；所述超声的功率优选为100～300W，更优选为200W，时间优选为10～60min，更优选为20～40min；本发明优选在室温下进行所述超声。本发明通过所述超声，能够使丝素蛋白对氧化铈纳米颗粒进行包裹，自组装成复合纳米颗粒。
得到所述混悬液后，本发明将所述混悬液进行冻存、融化和第二透析，透析袋内得到纳米缓释制剂。在本发明中，所述冻存的温度优选为-80～-20℃，更优选为-60～-40℃，时间优选为24～48h，更优选为30～36h。本发明通过所述冻存，能够起到稳定复合纳米颗粒的效果。本发明对所述融化的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的融化方式即可，具体的如室温融化或水浴融化。在本发明中，所述透析优选在水中进行。本发明对所述第二透析用透析袋的材质没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知材质的透析袋即可；所述第二透析用透析袋截留的分子量优选为5000～10000，更优选为6000～8000。
得到所述纳米缓释制剂后，本发明优选对其进行冻干保存。本发明对所述冻干的方法没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冻干方法即可。
本发明提供了上述纳米缓释试剂在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用。在本发明中，所述线粒体功能障碍疾病包括弗里德赖希共济失调症(FRDA)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)中的一种或几种。在本发明中，当所述纳米缓释试剂用于制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物时，所述纳米缓释试剂的浓度优选为0.2～1mg/mL；以纳米缓释试剂中铈元素的质量计算，所述纳米缓释制剂的给药剂量优选为1～5mg/kg，更优选为2～4mg/kg。
下面结合实施例对本发明提供的纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)天然蚕丝纤维(购自南通鑫源有限公司)用碱脱丝胶后，剩下的棉花状膨松固体为丝素蛋白；取20g丝素蛋白，再使用50mL、9M溴化锂(购自阿拉丁公司)水解，水解时间为240min，水解温度为60℃。通过截留分子量为12000～14000透析袋除去杂质分子，得到丝素蛋白溶液；
(2)将直径为1～10nm的右旋糖苷修饰的氧化铈纳米粒子(制备方法参照《Dextran-coated Cerium Oxide Nanoparticles:A Computed Tomography ContrastAgent for Imaging the Gastrointestinal Tract and Inflammatory Bowel Disease》)与无水乙醇溶液混合，得到铈元素浓度为1mg/mL的右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液；
(3)在200W超声条件下，将丝素蛋白溶液逐滴缓慢加入右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液中，室温超声60min并搅拌，得到混悬液；
(4)将混悬液放入-20℃下冻存48h，室温或水浴融化后，使用截留分子量为5000-10000kDa的透析袋在水中进行透析，得到缓释纳米制剂SF@CeO2 NPs。
对所得缓释纳米制剂SF@CeO2 NPs进行扫描电镜(SEM)测试，扫描电镜参数为：
型号：JEM-2100，日本；
检测条件：在钯溅射涂覆之后在15kV的加速电压下进行检测。
所得扫描电镜图如图1所示，由图1可以看出，内层的颗粒为右旋糖酐修饰的CeO2纳米颗粒，其外层包裹有丝素蛋白。
使用Nano ZS90纳米粒度仪器对所得SF@CeO2 NPs的水动力尺寸进行测试，结果如图2所示。由图2可以看出，SF@CeO2 NPs的水动力尺寸在80nm左右。
测试例1 SF@CeO2 NPs缓释制剂的药物释放率试验
吸取200μL的实施例1所得SF@CeO2纳米缓释制剂，放入10mL蛋白酶XIV(Sigma UK)中。在37℃水浴锅中孵育，每两天更换一次新鲜的酶溶液。取时间点为6h、12h、24h、48h、96h和196h，用ICP(电感耦合等离子体质谱法)检测Ce元素含量，Ce元素的释放速率如图3所示。从图3中可以看出，本发明制备的纳米缓释制剂有缓释的效果。
测试例2 小鼠的体重变化实验
使用实施例1所得SF@CeO2 NPs纳米缓释制剂对FRDA转基因小鼠YG8R(#012253)进行腹腔给药，给药小鼠记为YG8R+NPs；以纳米缓释试剂中铈元素的质量计算，给药剂量为5mg/kg，5天注射一次，给药周期为一个月。
使用丝素蛋白对FRDA转基因小鼠YG8R进行腹腔给药(给药剂量为5mg/kg，5天注射一次，给药周期为一个月)，作为对照组，记为YG8R+SF；使用未注射药物的FRDA转基因小鼠YG8R作为损伤组；使用未注射药物的对照小鼠Y47(#024097)作为正常组进行对比。实验过程中使用的FRDA转基因小鼠YG8R(#012253)和对照小鼠Y47(#024097)购自Jackson实验室。
所得小鼠的体重变化图如图4所示，由图4可以看出，本发明提供的SF@CeO2 NPs不会对小鼠体重造成影响，说明本发明提供的SF@CeO2纳米缓释制剂具有体内生物安全性。
测试例3 SF@CeO2 NPs给药后小鼠的行为学评分
FRDA疾病会使小鼠的平衡能力、爪子的握力都受到影响。
采用木梁实验、旋转疲劳仪测试、悬挂实验对给药小鼠的行为学进行测试。实验过程中使用的FRDA转基因小鼠YG8R(#012253)和对照小鼠Y47(#024097)购自Jackson实验室。
采用腹腔给药的方法纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs注射至FRDA转基因小鼠YG8R腹腔内(以纳米缓释试剂中铈元素的质量计算，给药剂量为5mg/kg，5天注射一次，给药周期为一个月)，对其进行行为学测试，以对照组、损伤组和正常组作为对比。行为学测试方法如下：
木梁实验：木梁长度为1m，宽度为12mm和22mm，记录小鼠从木梁上经过的时间以评估协调能力。小鼠接受了3次训练，重复测试四次，每次测试之间至少间隔5分钟。
旋转疲劳仪测试：使用旋转杆疲劳仪(Bi AngsiCo.Ltd.)进行测试以评估运动协调性。至少进行了四个实验，每个测试之间的间隔时间不少于200秒。旋转杆的速度从4rpm逐渐增加到400rpm，最长时间设置为400s。记录鼠标从旋转棒上掉下的时间。
悬挂实验：将一根用1毫米直径的金属丝编织的金属网固定在离地面1.5米的位置，并在其正下方放置保护性物品，以防止小鼠坠伤。小鼠紧握金属网后开始测试，并记录小鼠掉下的时间。测试四次，每次测试之间至少间隔5分钟。
所得木梁实验测试结果图如图5所示，旋转疲劳仪测试结果图如图6所示，悬挂实验测试结果图如图7所示。图5～图7中的数据均以Mean SEM表示，n＝10。
由图5～7可以看出，本发明提供的纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs可以完全恢复疾病小鼠的行为学评分。
测试例4 SF@CeO2 NPs给药后组织的切片染色
SF@CeO2 NPs腹腔给药一个月后，将小鼠全脑矢量切片，进行H&E染色(苏木素和伊红染料)，观察小鼠小脑内的浦肯野细胞(小脑皮质中最大的神经元)，以损伤组和正常组作为对比。结果如图8中箭头处所示。由图8可以看出，给药后浦肯野细胞的数量和形态明显得到恢复。
SF@CeO2 NPs腹腔给药一个月后，将小鼠心脏进行切片，进行普鲁士蓝染色，染色方法参照国家标准(GB/T 17816-1999，4.10)，以损伤组和正常组作为对比，染色结果如图9所示，由图9可以看出，给药后小鼠的心脏铁累计现象消失，说明本发明提供的纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs能够在体内发挥铁重分布的功效。
测试例5 SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中ATP含量
SF@CeO2 NPs腹腔给药一个月后，取小鼠下中枢***组织大脑、小脑、脑干、海马和脊髓，非中枢***组织心、肝、脾、肺、肾和骨骼肌，将各组织用组织裂解液(碧云天P0013)完全裂解，取澄清上清液，ATP含量的测定严格按照ATP检测试剂盒(Sigma公司试剂盒)说明书进行操作，以损伤组和正常组作为对比。
小鼠各组织中ATP含量图如图10所示，由图10可以看出，本发明提供的纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs可以恢复线粒体产生ATP的功能。
测试例6 SF@CeO2 NPs给药后线粒体复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ亚基的蛋白表达水平
蛋白表达水平用Western blotting方法检测，操作步骤如下：收集细胞并离心(1000rpm，5min)去上清，用PBS清洗一遍。根据细胞量，加入适量的NP40细胞裂解液，重悬细胞，置于冰上裂解10min，期间震荡2～3次。15000rpm，4℃，离心10min。将离心后上清转移至新的已预冷的eppendorf(EP)管中，并用Bradford工作液测定蛋白浓度，已确保每个样品的上样量一致，并加入适量5×SDS-loading buffer，100℃加热5min，使蛋白充分变性。将样品短暂离心后，用微量进样器将样品加入到SDS-PAGE凝胶加样孔中，电压100V进行电泳。电泳结束后将凝胶从装置上取下，除去浓缩胶，将分离胶上的蛋白用电转仪在稳流250mA条件下转移到NC膜上。转膜结束后，将膜放入丽春红染色液中进行染色2min，用pH 5.5的酸水洗去未与蛋白结合的染色液，对染好的NC膜进行拍照。接着将膜置于含5％脱脂奶粉的Tris-PM中，室温下封闭1h。封闭结束后，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜。孵育结束后回收一抗，并用Tris-PM洗膜，每次10min，洗4次。将膜与适当稀释的二抗室温下孵育1h。孵育结束后用Tris-PM洗4次，每次10min。膜上蛋白与化学发光底物结合，用Western blot化学发光成像***曝光并拍照。
图11为SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ亚基的蛋白表达水平，数据均以Mean SEM表示，n＝3。由图11可以看出，本发明提供的纳米缓释制剂SF@CeO2NPs可以将线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基的蛋白表达水平恢复正常。
测试例7 SF@CeO2 NPs给药后线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ的活性
SF@CeO2 NPs腹腔给药一个月后，取下中枢***组织大脑、小脑、脑干、海马和脊髓，非中枢***组织心、肝、脾、肺、肾和骨骼肌，将各组织用组织裂解液(碧云天P0013)完全裂解，取澄清上清液，分别使用线粒体复合体I活性检测试剂盒(Abcam)，线粒体复合体II活性检测试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)对复合物Ⅰ和Ⅱ的活性进行检测，线粒体复合物I和II活性的测定均严格按照试剂盒说明书进行，以损伤组和正常组作为对比。
SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅰ的活性如图12所示，其数据均以Mean SEM表示，n＝3。
SF@CeO2 NPs给药后小鼠各组织中线粒体复合物Ⅱ的活性如图13所示，其数据均以Mean SEM表示，n＝3。
由图12和图13可以看出，本发明提供的纳米缓释制剂SF@CeO2 NPs可以将线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ的活性恢复正常。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种纳米缓释制剂，其特征在于，包括右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒，以及包覆在所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒外层的丝素蛋白；
所述纳米缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液；
(2)将丝素蛋白与溴化锂溶液混合，依次进行水解和第一透析，透析袋内得到丝素蛋白溶液；
(3)将所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，得到混悬液；
(4)将所述混悬液进行冻存、融化和第二透析，得到纳米缓释制剂；
所述步骤(1)和(2)没有时间顺序的限制。
2.根据权利要求1所述的纳米缓释制剂，其特征在于，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的尺寸为1～30nm；所述纳米缓释制剂的水动力尺寸为80～120nm。
3.权利要求1所述的纳米缓释制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液；
(2)将丝素蛋白与溴化锂溶液混合，依次进行水解和第一透析，透析袋内得到丝素蛋白溶液；
(3)将所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液与丝素蛋白溶液混合，进行超声，得到混悬液；
(4)将所述混悬液进行冻存、融化和第二透析，得到纳米缓释制剂；
所述步骤(1)和(2)没有时间顺序的限制。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒的醇分散液中铈元素的质量浓度为1～5mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溴化锂溶液的摩尔浓度为8.5～10mol/L；所述丝素蛋白的质量与溴化锂溶液的体积比为1g：1～5mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述水解的温度为20～70℃，时间为30～360min；
所述第一透析用透析袋截留的分子量为12000～14000。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述右旋糖酐修饰的氧化铈纳米颗粒中铈元素的质量与丝素蛋白溶液的体积比为1mg:1～5mL；
所述超声的功率为100～300W，时间为10～60min。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冻存的温度为-80～-20℃，时间为24～48h；
所述第二透析用透析袋截留的分子量为5000～10000。
9.权利要求1或2所述纳米缓释制剂或权利要求3～8任意一项制备方法制备得到的纳米缓释制剂在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述线粒体功能障碍疾病包括弗里德赖希共济失调症、阿尔茨海默病、帕金森病或肌萎缩侧索硬化中的一种或几种。
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