CN112004546A - Ptd-smad7融合蛋白治疗剂 - Google Patents
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Abstract
本技术提供了用于治疗炎性和/或组织损伤病症的方法和组合物。特别地,描述了局部或全身递送至炎症和/或组织损伤部位的截短的Smad7组合物的用途。另一些具体实施方案涉及治疗或预防由辐射和/或化学治疗引起的副作用,包括但不限于口腔和胃黏膜炎。还提供了编码Smad7融合蛋白的密码子优化的核酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月30日提交的美国临时专利申请序列No.62/612,439的权益,其通过引用并入本文。
政府权益声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R44DE024659和R44DE028718的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
口腔黏膜炎是一种重度口腔溃疡,是对于骨髓移植的大剂量辐射或者对于癌症的颅面放射治疗的常见副作用。重度口腔黏膜炎可需要饲管、控制剧烈的疼痛以及过早停止放射治疗。过度炎症和上皮消融是口腔黏膜炎的关键特征。
帕利夫明(palifermin)是一种KGF(人角质形成细胞生长因子)重组蛋白,已被批准用于在骨髓移植患者中预防口腔黏膜炎。在头颈癌患者中进行的两项帕利夫明临床试验表明,帕利夫明将重度口腔黏膜炎的发病率分别从67%和69%降低到51%和54%。临床试验或临床前研究中的其他口腔黏膜炎药物包括生长因子、辐射防护剂、抗炎剂或免疫调节剂。
帕利夫明和上述类别中正在开发的药物的适度作用凸显了对鉴定用于新治疗的生物标志物的需求。然而,缺乏来自口腔黏膜炎患者的常规诊断性活检物或丢弃组织已经阻碍了这一努力。
皮肤伤口愈合通过三个重叠的阶段进行:炎症、组织形成和组织重塑。这些是涉及表皮、白细胞、细胞外基质(ECM)和真皮成纤维细胞之间的相互作用的动态过程。响应于皮肤损伤,伤口中的血块、浸润的炎性细胞和其他细胞类型释放多种细胞因子和趋化因子。这些细胞因子引起成纤维细胞增殖和ECM的合成,其填充伤口缺损并导致伤口闭合。
同时,伤口边缘的角质形成细胞开始增殖并迁移以覆盖伤口表面。在重新上皮化的表皮下,称为肉芽组织的新基质开始填充伤口空间,其包含临时的ECM、炎性细胞、成纤维细胞和血管。一旦伤口区域被肉芽组织填充并被新上皮化的表皮覆盖,伤口闭合过程即完成。随后,伤口通过组织重塑逐渐恢复到正常的强度和肌理(texture)。
与损伤相关的纤维化疾病包括烧伤诱导的(包括化学物质的)皮肤和软组织瘢痕形成和收缩、辐射诱导的皮肤和器官瘢痕形成、癌症后的治疗性放射治疗以及瘢痕疙瘩(皮肤)。
重度放射性皮炎造成皮肤糜烂、溃疡、抗阿片类药物的疼痛(opiate-resistantpain),并且对于癌症治疗可能是剂量限制的。放射性皮炎的发病率和严重性随着癌症群体的增加以及靶向治疗(例如免疫治疗)与放射治疗(RT)的组合使用而增加。放射性皮炎的复杂性(RT损伤、皮炎和溃疡的组合)使其难以治疗。目前,除了症状控制以外,没有促进放射性皮炎愈合的治疗。
辐射诱导的肺疾病(RILD)是针对胸壁或胸内恶性肿瘤的胸部放射治疗的常见并发症,并且可具有多种表现,这尤其取决于对患者进行成像的时间。描述了急性期和晚期,其分别对应于放射性肺炎和放射性纤维化。这些发生在放射治疗完成后的不同时间,并且具有不同的影像学特征和鉴别诊断。具有辐射诱导的肺病症(例如,放射性肺炎)的对象通常表现出非生产性咳嗽、短气(shortness of breath)和低烧。经评价,发现对象的总肺容量、残余容量和肺活量降低,但空气流入和流出肺不受限制。
急性纤维化(通常具有突然和严重发作以及短持续时间)是对多种形式的创伤的常见响应,所述创伤包括意外损伤(特别是对脊柱和中枢神经***的损伤)、感染、手术、缺血性疾病(例如心脏病发作后的心脏瘢痕形成)、烧伤、环境污染物、酒精和其他类型的毒素、急性呼吸窘迫综合征、辐射和化学治疗。
在烧伤的愈合中经常发生包含胶原蛋白的组织(其也可包含其他细胞外基质组分)的收缩。烧伤可以是化学烧伤、热烧伤或辐射烧伤,并且可以是眼睛、皮肤表面或皮肤和下层组织的烧伤。也可存在内部组织烧伤的情况,例如由放射治疗引起。烧伤组织的收缩通常是一个问题,并且可导致身体和/或美容问题,例如运动损失和/或毁容。
在肺中,对损伤的异常伤口愈合响应导致了纤维化肺疾病的发病机制。纤维化性肺疾病(例如特发性肺纤维化(IPF))与高发病率和高死亡率相关。
在已知影响伤口愈合的许多分子中,转化生长因子β(TGF-β)具有最广泛的作用谱,影响伤口愈合所有阶段涉及的所有细胞类型(Feng et al.,Annu Rev Cell Dev Biol21:659-693,2005)。TGF-β的多种功能由许多信号传导分子(包括Smad家族成员)介导。当配体与TGF-β I型和II型受体(TGFβRI和TGF-βRII)结合时,TGF-βRI使Smad2和Smad3磷酸化。磷酸化的Smad2和Smad3与共同的Smad(Smad4)结合形成异聚Smad复合物,并转移到细胞核中以调节TGF-β靶基因的转录。
据报道,TGF-β信号传导对伤口愈合具有正作用和负作用二者(Wang et al.,JInvestig Dermatol Symp Proc 11:112-117,2006)。例如,其中TGF-β信号传导被部分废除的Smad3缺陷小鼠表现出加速的伤口愈合(Ashcroft et al.,Nat Cell Biol 1:260-266,1999)。相反,在兔皮肤溃疡模型中,将外源Smad3引入伤口部位以增强TGF-β信号传导也加速了伤口愈合(Sumiyoshi et al.,J Invest Dermatol 123:229-236,2004)。Smad4缺陷小鼠的皮肤伤口的炎症和血管生成显著增加,导致伤口闭合延迟并形成过多的瘢痕(Owenset al.,Am J Pathol 176:122-133,2010)。Smad7(TGF-β信号传导的拮抗剂)在角膜上皮和基质中的瞬时腺病毒基因转移导致角膜伤口愈合加速和炎症降低(Saika et al.,Am JPathol 166:1405-1418,2005)。此外,Smad7基因转移到晶状体上皮和基质阻止了损伤诱导的晶状体上皮细胞的上皮-间质转化,并提示Smad7在预防囊性纤维化中的潜在作用(Saikaet al.,Lab Invest 84:1259-1270,2004)。然而,将Smad7用腺病毒载体递送至大鼠颈动脉的球囊损伤导致血管愈合降低(Mallawaarachchi et al.,Arterioscler Thromb VascBiol 25:1383-1387,2005)。这些研究表明,TGF-β信号传导组分(例如Smad7)对伤口愈合的作用是复杂和高度情景特异性的。另外,Smad7的作用可不总是由其在TGF-β信号传导中的作用来解释。例如,已显示Smad7与Wnt/β-连环蛋白(Han et al.,Dev Cell Biol 11:301-312,2006)和TNFβ/NF-κB(Hong et al.,Nat Immunol 8:504-513,2007)家族的组分相互作用。
发明内容
本技术提供了包含密码子优化的人Smad7 cDNA核苷酸序列(例如Tat-PY-C-Smad7融合蛋白)的核酸分子(图1A和1B)。在一些实施方案中,密码子优化的人Smad7核苷酸序列可以包含对于在一种或更多种细菌或酵母中表达优化的精氨酸的一个或更多个密码子,包含对于在一种或更多种细菌或酵母中表达优化的丝氨酸的一个或更多个密码子,和/或包含对于在一种或更多种细菌或酵母中表达优化的组氨酸的一个或更多个密码子。在一些实施方案中,密码子优化的人Smad7核苷酸序列可以包含对于在一种或更多种细菌或酵母中表达优化的28个丝氨酸密码子、6个组氨酸密码子和9个精氨酸密码子。在一些实施方案中,人Smad7氨基酸序列可以包含在SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、80、82、84、86、88、90、91、94、96和100的任一个中所示的氨基酸序列,或由其组成。在一些实施方案中,Smad7核苷酸序列可以是SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、79、81、83、85、87、89、92、93、95、97、98、99、101、102、103、104和105中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中,密码子优化的人Smad7核苷酸序列可以是SEQ ID NO:57、59、90、92、93、95、98、99、101、102、103、104和105中所示的任一个核苷酸序列。在一些实施方案中,密码子优化的人Smad7核苷酸序列可以与人Smad7 cDNA具有约65%至75%的同源性,可以包含编码SMAD7的N末端片段的核苷酸序列,可以包含编码SMAD7的C末端片段的核苷酸序列,或者可以包含编码人Smad7蛋白的第203至426位氨基酸的核苷酸,或者可以包含选自本公开内容的第81至134页所示的任何序列的任何Smad7蛋白或其片段(或编码其的核苷酸序列)。在一些实施方案中,前述任一种还可包含编码蛋白质转导结构域(例如Tat)的核苷酸序列。在一些实施方案中,前述任一种还可以进一步包含编码表位标签或纯化标签中的一个或更多个,例如V5、谷胱甘肽-S-转移酶或6-组氨酸(SEQ ID NO:56)的核苷酸序列。
在一些实施方案中,前述任一种可以被分离和/或纯化。在一些实施方案中,前述任一种还可编码具有选自以下的一种或更多种生物学活性的多肽:降低或消除Smad2的磷酸化、降低或消除NF-κB p50亚基的核易位、提高细胞增殖、降低凋亡、降低辐射诱导的DNA损伤、降低炎症、降低血管生成、促进口腔黏膜炎愈合、促进伤口愈合以及治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中,提供了包含上述核酸分子和一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中,提供了包含与启动子可操作地连接的上述核酸分子的表达载体,以及包含这样的表达载体的宿主细胞,以及包含这样的载体和宿主细胞以及一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物。
在一方面中,提供了蛋白质分子,其包含在216位具有亮氨酸的人Smad7蛋白。在一些实施方案中,人Smad7蛋白可以在C末端截短,或在N末端截短。在一些实施方案中,截短的人Smad7蛋白可包含全长Smad7序列的约50%,或可包含全长Smad7序列的约13%。在一些实施方案中,人Smad7蛋白可包含人Smad7蛋白的第203至426位氨基酸或由其组成。在一些实施方案中,蛋白质分子可具有选自以下的一种或更多种生物学活性:降低或消除Smad2的磷酸化、降低或消除NF-κB p50亚基的核易位、提高细胞增殖、降低凋亡、降低辐射诱导的DNA损伤、降低炎症、降低血管生成、促进口腔黏膜炎愈合、促进伤口愈合以及治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中,前述任一种还可包含蛋白质转导结构域,例如Tat。在一些实施方案中,前述任一种还可进一步包含表位标签或纯化标签中的一个或更多个,例如V5、谷胱甘肽-S-转移酶或6-组氨酸(SEQ ID NO:56)。在一些实施方案中,提供了包含前述任一种蛋白质分子和一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物。
在另一方面中,提供了用于在对象中治疗或预防炎性病症的方法,其包括向所述对象提供治疗有效量的上述药物组合物。在一些实施方案中,炎性病症可以是慢性伤口、急性伤口、黏膜炎、皮肤炎症、银屑病或自身免疫性疾病中的一种或更多种。在一些实施方案中,组合物可以通过抑制TGF-β和NF-κB信号传导来降低炎症。该方法可以包括治疗或预防损伤相关的纤维化疾病,包括烧伤诱导的(包括化学物质的)皮肤和软组织瘢痕形成和收缩、辐射诱导的皮肤和器官瘢痕形成、癌症后的治疗性放射治疗以及瘢痕疙瘩(皮肤)。在一些实施方案中,辐射诱导的皮肤和器官瘢痕形成可包括放射性皮炎和辐射诱导的肺疾病(RILD)。在一些实施方案中,损伤相关的纤维化疾病可包括急性纤维化、包含胶原蛋白的组织的收缩和包括IPF的纤维化肺疾病。在一些实施方案中,慢性伤口可包括糖尿病性溃疡、压力性溃疡、静脉性溃疡或口腔溃疡中的一种或更多种,急性伤口可包括创伤诱导的伤口、手术伤口或瘢痕形成中的一种或更多种,黏膜炎可包括辐射诱导的黏膜炎或化学治疗诱导的黏膜炎中的一种或更多种,并且黏膜炎可包括口腔黏膜炎或肠黏膜炎中的一种或更多种。
在另一方面中,提供了用于在对象中预防或治疗疾病或障碍的方法,其包括在所述对象中的以下一种或更多种:提高细胞增殖或细胞迁移中的一种或更多种或者预防凋亡或DNA损伤中的一种或更多种,包括向所述对象提供治疗有效量的上述药物组合物,其中提高细胞增殖或细胞迁移中的一种或更多种或者预防凋亡或DNA损伤中的一种或更多种中的一种或更多种可用于预防或治疗疾病或障碍。在一些实施方案中,疾病或障碍可包括慢性伤口、急性伤口、黏膜炎、皮肤炎症、银屑病或自身免疫性疾病中的一种或更多种。在一些实施方案中,慢性伤口可包括糖尿病性溃疡、压力性溃疡、静脉性溃疡或口腔溃疡中的一种或更多种,急性伤口可包括创伤诱导的伤口、手术伤口或瘢痕形成中的一种或更多种,黏膜炎可包括辐射诱导的黏膜炎或化学治疗诱导的黏膜炎中的一种或更多种,并且黏膜炎可包括口腔黏膜炎或肠黏膜炎中的一种或更多种。该方法可以包括治疗或预防损伤相关的纤维化疾病,包括烧伤诱导的(包括化学物质的)皮肤和软组织瘢痕形成和收缩、辐射诱导的皮肤和器官瘢痕形成、癌症后的治疗性放射治疗以及瘢痕疙瘩(皮肤)。在一些实施方案中,辐射诱导的皮肤和器官瘢痕形成可包括放射性皮炎和辐射诱导的肺疾病(RILD)。在一些实施方案中,损伤相关的纤维化疾病可包括急性纤维化、包含胶原蛋白的组织的收缩和包括IPF的纤维化肺疾病。
预期本文中描述的任何方法或组合物可以相对于本文中描述的任何其他方法或组合物来实施。
在权利要求书和/或说明书中,当与词“包含/括”结合使用时,未用数量词限定的名词的使用可表示“一个/种”,但是其也符合“一个/种或更多个/种”,“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。词语“约/大约”是指所指示数字的正负5%。
通过以下详细描述,本技术的其他目的、特征和优点将变得明显。然而,应该理解,尽管指示了本技术的特定实施方案,但是详细描述和特定实例仅以举例说明的方式给出,因为根据详细描述,在本技术的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
本公开内容包括以下序列(使用单字母氨基酸缩写显示肽)。该表提供了可用于本公开内容的技术中的序列的部分列表:
附图简述
以下附图构成了本说明书的一部分,并且被包括在内以进一步说明本技术的某些实施方案。通过参考这些附图中的一个或更多个结合本文中给出的具体实施方案的详细描述,可以更好地理解实施方案。
图1A描绘了可用于本公开内容方法中的示例性Smad7蛋白融合构建体。如所指出的,这些融合蛋白可包含融合蛋白伴侣,例如GST、MBP或Trx;蛋白质转导结构域(PTD),例如Tat或PEP;对抗体染色或Western印迹具有特异性的标签,例如HA或V5;以及用于蛋白质纯化的标签,例如6XHis。图1B举例说明了PY-C-Smad7融合蛋白功能结构域和预测的功能。
图2A至2D证明了Tat-PY-C-Smad7对小鼠中的口腔黏膜炎的治疗作用。通过18Gy颅面辐射诱导口腔黏膜炎。从辐照之后第6天开始直至第10天,每天向口腔施用50%甘油中1μg/小鼠的Tat-Smad7(203至426)(处理)或单独50%甘油(对照)。在第10天对小鼠实施安乐死,并通过组织学分析舌。图2A的左图示出了经处理的和对照舌的H&E染色的组织学切片,显示使用Tat-PY-C-Smad7使得溃疡尺寸减小和病理学炎症降低(虚线突出溃疡)。图2A的右图示出了经处理的皮肤中溃疡尺寸减小的图示(p=0.0079)。图2B的左图示出了使用针对BrdU(白色)和角蛋白14(灰色)的抗体染色,来自对照和经处理的动物的舌切片中的上皮增殖。使用Tat-PY-C-Smad7使BrdU+上皮细胞增加(K14:角蛋白14)。图2C的右图示出了与对照细胞相比,经处理的基底膜中BrdU+细胞的增加的数目/mm的定量(p=0.0070)。图2C的左图示出了来自对照和经处理的小鼠的pH2AX(白色)/DAPI(灰色)染色的舌切片,表明Tat-PY-C-Smad7减少了DNA损伤(pH2AX+)细胞(虚线突出了上皮/基质边界)。图2C的右图示出了与对照细胞相比,经处理的基底膜中pH2AX+细胞的减少的数目/mm的定量(p=0.0232)。图2D的左图示出了来自对照和经处理的小鼠的pSmad2(白色)/DAPI(灰色)染色的舌切片,显示用Tat-Smad7(203至426)处理降低了Smad2的磷酸化(pSmad2)。虚线突出了上皮/基质边界。图2D的右图示出了与对照细胞相比,经处理的基底膜中pSmad2+细胞的减少的数目/mm的定量(p=0.0142)。比例尺:图2A中为150μm,图2B、2C和2D中为50μm。
图3A和B示出了Tat-PY-C-Smad7对辐射诱导的皮炎的治疗作用。通过对于小鼠腿的35Gy辐射诱导皮炎。从辐射后第16天开始,每周3次以1μg/小鼠皮下注射Tat-Smad7(203至426)。在第35天收获皮肤活检物。图3A示出了来自用PBS处理的对照小鼠的皮肤并且在第35天(D35)的H&E染色。图3B示出了用Tat-Smad7(203至426)处理的小鼠的皮肤的H&E染色。比例尺:200μm。
图4A至4C示出了Tat-PY-C-Smad7减轻银屑病小鼠模型K5.TGFβ1转基因小鼠中的皮肤炎症。在存在外源性病原体的情况下,K5.TGFβ1转基因小鼠还是接触性皮炎或特应性皮炎的模型。在两组K5.TGFβ1小鼠中,用Tat-PY-C-Smad7(s.c.2μg/小鼠,3x/周)处理K5.TGFβ1皮肤,并每天拍照。在第13天收获皮肤活检物。图4A示出了来自第0、3、6和10天的照片。Tat-Smad7(203至426)处理的皮肤显示出相对于炎症明显的总体缓解。图4B示出了从第0天到第13天的H&E染色的皮肤切片。在处理之前(第0天),表皮显示出由大量浸润的白细胞和过度增殖的成纤维细胞诱导的明显增生。这些皮肤表型在没有处理的情况下恶化。Tat-PY-C-Smad7处理的皮肤减少了表皮增生、炎症和纤维化响应。比例尺:100μm。图4C的左图示出了处理前(第0天)K5.TGFβ1转基因小鼠皮肤的真皮中有许多肥大细胞(吉姆萨染色),这是释放组胺以诱导变应性/特应性皮炎的免疫细胞类型。图4C的右图示出了Tat-Smad7(203至426)处理在用Tat-Smad7(203至426)处理的第13天减少了K5.TGFβ1皮肤中的肥大细胞数量。在开始处理之前(第0天,图4C左图)获取皮肤活检物并且在第13天(图4C右图)再次获取皮肤活检物。
图5示出了Tat-Smad7(203至426)减轻了小鼠耳皮肤(银屑病的小鼠模型)中咪喹莫特诱导的炎症。暴露于咪喹莫特的皮肤也可出现重度接触性皮炎。每天将5%的咪喹莫特乳膏施用于小鼠耳。一小时后,每天用1μg PBS(载剂对照)或Tat-Smad7(203至426)表面处理。在第6天获取耳活检物。图5A示出了皮肤切片的H&E染色。来自PBS处理的耳的切片(左图)显示出咪喹莫特诱导的明显的表皮增生和基质中的大量炎性细胞。来自Tat-Smad7(203至426)处理的耳的切片(右图)没有表皮增生或炎症。图5B示出了皮肤切片中肥大细胞(真皮中的暗紫色细胞)的吉姆萨染色。来自PBS处理的耳的切片(左图)中有许多肥大细胞,而在来自Tat-Smad7(203至426)处理的耳的切片(右图)中只有很少。比例尺:100μm。
图6示出了Tat-Smad7(203至426)对人成纤维细胞扩增的剂量依赖性作用。用2.5μg/ml、5μg/ml和7.5μg/ml的Tat-Smad7(203至426)或者用单独载剂(PBS)培养原代人皮肤成纤维细胞。5μg/ml和7.5μg/ml降低了成纤维细胞的扩增(与对照相比,各自P<0.0001),与Tat-Smad7(203至426)的体内抗成纤维细胞活化和抗纤维化作用一致。
图7示出了用Tat-Smad7(203至426)处理对糖尿病小鼠中伤口的作用。在穿刺活检(第0天)之后立即开始,每隔一天以1μg/伤口表面施用Tat-Smad7(203至426)或载剂对照(PBS)。每隔一天拍摄照片。在第10天获取愈合伤口的活检物。来自第0、2、4、6、8和10天的照片示出了对照和经处理小鼠(上图)中6mm切除伤口的总体外观的实例。到第10天,在PBS处理的伤口中未见明显愈合,但在Tat-Smad7(203至426)处理的伤口中可见愈合。
图8A至8C示出了由与Tat融合的全长人Smad7构成的融合蛋白构建体(Tat-Smad7)对小鼠中辐射诱导的皮炎的治疗作用。通过向小鼠腿的35Gy辐射诱导皮炎。从辐射之后第7天开始,每周3次以1mg/小鼠皮下注射Tat-Smad7。处理之后每天使用通过癌症治疗评价程序(Cancer Therapy Evaluation Program)建立的评分标准(即1为溃疡最轻,5为溃疡最严重)评估皮炎的严重程度。在第18天收获皮肤活检物。图8A提供了皮炎评分的图示,显示到第16天经处理的病灶具有较不严重的皮炎(*;p<0.05)。图8B示出了使用对Tat-Smad7具有特异性的抗体对来自对照(PBS)和经处理的(Tat-Smad7)皮肤的第18天皮肤切片的免疫荧光染色,表明Tat-Smad7(浅灰色)渗透到真皮细胞和表皮细胞二者中。K14抗体染色(深灰色)突出了表皮。图8C示出了H&E染色的第18天皮肤切片,表明与载剂对照(PBS)相比,经处理的皮肤(Tat-Smad7)具有愈合的溃疡并且炎症和纤维化响应减少。垂直线突出了PBS对照中未治愈的溃疡。虚线突出了Tat-Smad7处理治愈的溃疡。
图9A和9B示出了全长Tat-Smad7在完全逆转K5.TGFβ1转基因小鼠中的皮肤炎症之前减少了肥大细胞的数目,K5.TGFβ1转基因小鼠是银屑病的小鼠模型,其也可以表现出特应性皮炎。图9的左图示出了在处理之前(第0天)K5.TGFβ1转基因小鼠皮肤中有大量肥大细胞。图9的右图示出了全长Tat-Smad7在完全逆转K5.TGFβ1转基因小鼠中的皮肤炎症之前减少了肥大细胞的数目。在第1、3和5天用Tat-Smad7以1μg/小鼠s.c.处理K5.TGFβ1皮肤。在开始处理之前(第0天,图9,左图)获取皮肤活检物并且在逆转表皮增生和炎症之前在第6天(图9,右图)再次获取皮肤活检物。在这些切片中,可以看到肥大细胞为深灰色(甲苯胺蓝)染色。比例尺:100μm。
图10示出了Tat-Smad7(203至217)减轻了TGFβ1诱导的皮肤炎症和纤维化。每天将Tat-Smad7(203至217)肽以磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的15μg s.c.注射到K5.TGFβ1小鼠的皮肤中。未经处理的K5.TGFβ1皮肤会逐渐劣化,并且用单独载剂(PBS)处理并不能减轻该表型。在处理之前(第0天)和处理之后(第18天)获取皮肤活检物。从处理之后2周开始,发炎的皮肤从宏观上逐渐好转,并且到3周时总体上明显(上图;“总体”)。在组织学上(H&E染色的切片),经肽处理的皮肤显示出白细胞浸润和表皮增生减少(中间图;“组织学”)。另外,肽处理减少了α-平滑肌肌动蛋白(αSMA),这是活化的成纤维细胞的标志物(下图,“αSMA”)。
图11示出了Tat-Smad7(203至217)促进小鼠中RT诱导的皮肤伤口和溃疡的愈合。从RT(腿30Gy)之后第10天开始进行每天处理。总体(上图)、组织学(H&E染色;中间图)和免疫荧光标记(pH2AX/K14;下图)示出了从辐照之后的第10天开始,与s.c.30μg/天的Tat-Smad7(203至217)相比,用对照肽Tat以15μg/天处理的作用。在第26天获取皮肤活检物。虚线突出了在对照肽(单独Tat)处理的皮肤中的溃疡,但是在Tat-Smad7(203至217)处理的皮肤(中间图)中没有。与Tat-Smad7(203至217)处理的皮肤相比,对照肽处理的皮肤中皮肤更厚(由于纤维化和炎症)。与对照肽处理的皮肤切片(下图)相比,在Tat-Smad7(203至217)处理的皮肤切片中具有核pH2AX(浅灰色,DNA损伤标志物)的细胞更少。K14(深灰色)是对比染色,以突出皮肤的上皮层(下图)。
图12示出了Tat-Smad7(203至217)减轻了小鼠耳皮肤(银屑病的小鼠模型)中咪喹莫特诱导的炎症。暴露于咪喹莫特的皮肤也出现了重度接触性皮炎。每天将5%的咪喹莫特乳膏施用于小鼠耳,并且在一小时之后用或不用30μg Tat-Smad7(203至217)对耳进行表面处理。在第6天获取耳活检物。肥大细胞(真皮中的暗灰色细胞)的吉姆萨染色显示在咪喹莫特处理的耳中有大量肥大细胞,而在Tat-Smad7(203至217)处理的耳中很少有肥大细胞。在这一阶段没有逆转表皮增生,但是基于图10和图11中所示的数据,再进一步处理之后可看到。比例尺:100μm。
图13示出了Tat-Smad7(259至426)减轻了TGF-β1诱导的皮肤炎症和纤维化。每周三次将Tat-Smad7(259至426)以磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg s.c.注射到K5.TGFβ1小鼠的皮肤中。未经处理的K5.TGFβ1皮肤会逐渐劣化。在处理之前(第0天)和处理之后(第19天)获取皮肤活检物。处理之后发炎的皮肤逐渐好转,并且到3周时总体上明显(顶部图)。在组织学上(H&E染色的切片),经处理的皮肤显示出白细胞浸润和纤维化明显减少(下图)。
发明详述
如本文进一步描述的,本公开内容尤其提供了蛋白质转导结构域(PTD)-Smad7融合蛋白及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217),编码这样的蛋白质的核酸,包含这样的核酸的载体,以及包含载体、核酸和/或蛋白质的细胞,所有这些均用于配制药物以及用于治疗和/预防一种或更多种疾病或障碍。还提供了用于制备和用于筛选可用于治疗和/或预防一种或更多种疾病或障碍的PTD-Smad7蛋白及其生物活性片段和衍生物的方法。还提供了使用与暴露于PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物有关的一种或更多种标志物来预测和/或评价对治疗的响应的方法。这样的标志物可以包括但不限于用于细胞迁移的Rac1、用于炎症的NF-κB和用于生长阻滞和炎症的TGF-β。
PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)可治疗的疾病和障碍可以包括包含以下一种或更多种的那些:降低的细胞增殖、降低的细胞迁移、提高的细胞死亡、过度炎症、辐射损伤和/或DNA损伤。PTD-Smad7可治疗的疾病和障碍可以包括其中利用具有以下一种或更多种活性的PTD-Smad7蛋白及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)进行治疗的那些:包括但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移。这样的疾病和/或障碍可以包括但不限于急性(例如,通过手术、搏斗、创伤、糖尿病)和慢性伤口(例如溃疡,例如糖尿病性、压力性、静脉性)、瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、纤维化(包括肺纤维化和肺癌患者中辐射诱导的肺纤维化)以及异常愈合、黏膜炎(例如口腔和/或胃肠道黏膜炎,以及癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)、口炎(包括复发性口疮性口炎(口疮)、直肠炎、自身免疫性疾病(例如银屑病、关节炎)、辐射诱导的皮炎(放射性皮炎或RT皮炎)、特应性皮炎、接触性皮炎、变应性皮炎、间质性肺纤维化(ILF)以及导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射)。
对于口腔黏膜炎的预防和治疗,关键是克服由于大量凋亡和迟缓的角质形成细胞增殖导致的上皮消融。当上皮细胞的强效生长抑制剂和凋亡诱导剂TGF-β1增加时,与正常口腔黏膜中相比,PTD-Smad7在口腔黏膜炎中的增殖和抗凋亡作用更明显。
减轻过度炎症产生了用于口腔黏膜炎愈合的微环境。PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)对于TGF-β和NF-κB信号传导二者的拮抗作用使得PTD-Smad7成为比仅靶向NF-κB的其他药剂更有效的抗炎分子。由于炎性细胞会产生进一步活化TGF-β和NF-κB的细胞因子,因此在辐射后K5.Smad7、K5.Smad7(203至426)或PTD-Smad7或PTD-Smad7(203至426)处理的口腔黏膜中发现的降低的TGF-β和NF-κB信号传导反映了Smad7对这两个途径的直接拮抗作用以及来自浸润白细胞的炎性细胞因子减少的结果。然而,PTD-Smad7并未将NF-κB或TGF-β信号传导降低到低于其正常生理条件。NF-κB或TGF-β信号传导的这种不完全阻断可对口腔黏膜炎的愈合有益,因为任一途径的完全丧失可引起过度炎症。
使用生长因子在癌症患者中治疗口腔黏膜炎的主要障碍是促进癌细胞生长的潜在风险。大多数人口腔癌在肿瘤上皮细胞中丧失TGF-β信号传导。因此,通过PTD-Smad7的抗Smad相关细胞增殖和迁移在癌细胞中无效。在具有完整TGF-β信号传导的肿瘤中,其他致癌途径的激活可超过TGF-β诱导的肿瘤抑制作用。这两种情况可以解释为什么没有观察到PTD-Smad7在具有突变或完整TGF-β信号传导组分的口腔癌细胞中增加增殖和迁移。
另外,在TGF-β诱导的肿瘤抑制丧失后,TGF-β信号传导主要通过Smad非依赖性机制促进肿瘤侵袭。因此,在癌细胞中通过PTD-Smad7阻断TGF-β信号传导可消除TGF-β介导的肿瘤促进作用,其行为类似于目前在用于晚期癌症的临床试验中使用的TGF-β抑制剂。此外,PTD-Smad7的强效抗炎作用可以降低肿瘤进展的风险。因此,长期的PTD-Smad7(203至426)或Tat-Smad7(203至426)应用也可有助于癌症的治疗。
尚未观察到K5.Smad7小鼠中的自发肿瘤形成。由于Smad7不是分泌蛋白,因此局部和短期的PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)蛋白质递送在口腔黏膜炎治疗中应具有很少的全身作用。在口腔上皮不含癌细胞的骨髓移植患者中,PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)的表面施用可适合于口腔黏膜炎的预防和治疗二者。
尽管不希望受到任何理论的束缚,但PTD-Smad7-及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)介导的口腔黏膜炎愈合显示是靶向由一种或更多种分子介导的多种致病过程的结果,类似于Smad7(参见例如,Han G,Bian L,Li F,Cotrim A,Wang D,Lu J,et al.Preventive andtherapeutic effects of Smad7 on radiation-induced oral mucositis.NatMed.2013;19(4):421-8;美国专利申请No.14/773,167,公开No.US 2016/0039894,其通过引用整体并入本文)。认为这些分子(例如,TGF-β、NF-κB、CtBP1、Rac1)中的一种或更多种也可用作患者中口腔黏膜炎的预测和治疗响应标志物。
A.核酸、载体和宿主细胞
在另一个实施方案中,本公开内容还提供了编码PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)的基因。除了野生型人SMAD7基因(GenBank登录号AH011391.2)以及多种密码子优化的基因之外,应该清楚的是,本技术不限于本文中公开的特定核酸。如下所述,“Smad7基因”可以包含多种不同的碱基,并且仍然产生与本文中公开的人基因在功能上没有区别并且在一些情况下在结构上相同的相应多肽。
1.编码Smad7的核酸
根据本技术的核酸可以表示完整的Smad7基因、与例如蛋白转导结构域(例如Tat)的融合物、Smad7的截短的部分和/或片段(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217),其表达具有与Smad7相关的一种或更多种活性的多肽,所述活性例如但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移,以及治疗或预防如本文进一步所述的其中这样的治疗可有用的一种或更多种疾病或障碍。这样的活性可以使用一种或更多种测定进行评估,包括但不限于以下能力:阻断Smad2的磷酸化和/或NF-κB p50亚基的核易位,提高细胞增殖,降低凋亡和/或辐射诱导的DNA损伤,降低炎症和/或血管生成,促进口腔黏膜炎、手术伤口、糖尿病伤口和/或与小鼠中慢性炎症相关的伤口的愈合。核酸可来源于基因组DNA,即从特定生物体的基因组直接克隆。然而,在一些特定的实施方案中,核酸将包含互补DNA(cDNA)。还提供了cDNA加上天然内含子或来源于另一基因的内含子;这样的改造分子有时被称为“小基因(mini-gene)”。至少,本技术的这些和其他核酸可以用作例如凝胶电泳中的分子量标准。
术语“cDNA”旨在指使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或者从基因组的未处理的或部分处理的RNA模板聚合的DNA相比,使用cDNA的优点是cDNA主要包含相应蛋白质的编码序列。有时完整或部分基因组序列是优选的,例如在需要非编码区以最佳表达的情况下,或者在反义策略中靶向非编码区(例如内含子)的情况下。
如本申请中所使用的,术语“编码Smad7的核酸”可以指已经从总细胞核酸分离的核酸分子和/或可以指编码Smad7多肽及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)的cDNA。如本文所用,术语“从总细胞核酸分离”意指核酸分子相对于其他细胞核酸分子为约或至少约75%纯、80%纯、85%纯、90%纯、95%纯、96%纯、97%纯、98%纯、99%纯或100%纯,如使用标准生物化学技术(例如但不限于琼脂糖凝胶电泳)确定的。如本文中所用,术语“从总细胞蛋白质分离”意指蛋白质分子相对于其他细胞核酸分子为约或至少约75%纯、80%纯、85%纯、90%纯、95%纯、96%纯、97%纯、98%纯、99%纯或100%纯,如使用标准生物化学技术(例如western印迹)确定的。在一些示例性实施方案中,本技术涉及基本上如以下所示和/或包含以下所示的任一个核苷酸序列的核酸序列:SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、79、81、83、85、87、89、92、93、95、97、98、99、101、102、103、104或105。
可以使用重组DNA技术(例如,聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成来产生分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物,包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子,其中核苷酸以使这样的修饰提供期望效果(例如,在非人表达***中产生Smad7蛋白)的方式***、缺失、替换和/或倒置。
术语“基本上如一个或更多个核酸序列中所示”意指核酸序列基本上对应于一个或更多个核酸序列(例如SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、79、81、83、85、87、89、92、93、95、97、98、99、101、102、103、104和105)的至少一部分,并且在一些情况下,对应于其整体。在一些实施方案中,基本对应于核酸序列的至少一部分的序列可以对应于本文中所述的一个或更多个序列的约或至少约50个核酸、75个核酸、150个核酸、200个核酸、250个核酸、300个核酸、350个核酸、400个核酸、450个核酸、500个核酸、550个核酸、600个核酸、650个核酸、700个核酸、750个核酸、800个核酸、900个核酸、1000个核酸、1100个核酸、1200个核酸或1250个核酸。在一些实施方案中,基本对应于核酸序列的至少一部分的序列可以对应于本文中所述的一个或更多个序列的约以下范围:约50至1250个核酸、75至1250个核酸、150至1250个核酸、200至1250个核酸、250至1250个核酸、300至1250个核酸、350至1250个核酸、400至1250个核酸、450至1250个核酸、500至1250个核酸、550至1250个核酸、600至1250个核酸、650至1250个核酸、700至1250个核酸、750至1250个核酸、800至1250个核酸、900至1250个核酸、1000至1250个核酸、1100至1250个核酸、1200至1250个核酸、至少约50至75个核酸、75至150个核酸、75至200个核酸、75至250个核酸、75至300个核酸、75至350个核酸、75至400个核酸、75至450个核酸、75至500个核酸、75至550个核酸、75至600个核酸、75至650个核酸、75至700个核酸、75至750个核酸、75至800个核酸、75至900个核酸、75至1000个核酸、75至1100个核酸、75至1200个核酸、或75至1250个核酸或1250个核酸。
在一些实施方案中,基本对应于核酸序列的至少一部分的序列包含与核酸序列的该部分相同的序列。在一些实施方案中,基本上对应于核酸序列的至少一部分或核酸序列的整体的序列可以包含一个或更多个功能上等同的密码子。本文中使用的术语“功能上等同的密码子”是指编码相同氨基酸的一个或更多个密码子,例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子,并且在一些实施方案中,是指编码生物学上等同的氨基酸的密码子,例如在以下页中讨论的。本文中使用的术语“生物学上等同的”氨基酸是指一个或更多个氨基酸,当其相对于人Smad7野生型蛋白质的氨基酸序列中存在的氨基酸改变时,不会改变本文中所述的Smad7的一种或更多种(或在一些实施方案中任何)生物学活性,例如但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移,以及治疗或预防如本文中进一步所讨论的其中这样的治疗可有用的一种或更多种疾病或障碍。这样的疾病和/或障碍可以包括但不限于急性(例如,通过手术、搏斗、创伤)和慢性伤口(例如溃疡,例如糖尿病性、压力性、静脉性)、瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、纤维化(包括肺纤维化和肺癌患者中辐射诱导的肺纤维化)以及异常愈合、黏膜炎(例如口腔和/或胃肠道黏膜炎,以及癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)、口炎(包括复发性口疮性口炎(口疮))、直肠炎、自身免疫性疾病(例如银屑病、关节炎)、辐射诱导的皮炎(放射性皮炎或RT皮炎)、特应性皮炎、接触性皮炎、变应性皮炎、间质性肺纤维化(ILF)、导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射)。
在一些实施方案中,考虑到遗传密码的简并性,具有约或至少约60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和/或99%的与任一个密码子优化的核酸序列(例如SEQ ID NO:57、59、90、92、93、95、98、99、101、102、103、104和105)之核苷酸相同的核苷酸的序列可被认为是基本上对应的核酸序列。与任一个核酸序列(例如,SEQ IDNO:)中所示的序列基本相同的序列也可以在功能上定义为能够在多种标准条件下与包含SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、79、81、83、85、87、89、92、93、95、97、98、99、101、102、103、104或105之互补序列的核酸片段杂交的序列。
对于需要高选择性的应用,通常希望采用相对高严格度条件来形成杂交体。例如,相对低的盐和/或高温条件,例如由约50℃至约70℃的温度下约0.02M至约0.10M的NaCl提供。这样的高严格度条件容许非常少(如果有的话)的探针或引物与模板或靶标链之间的错配,并且特别适合于分离特定基因或用于检测特定mRNA转录本。一般认为,可以通过添加逐渐增加量的甲酰胺使条件更加严格。
对于某些应用,应当理解,较低严格度的条件是优选的。在这些条件下,即使杂交链的序列不是完全互补,而是在一个或更多个位置错配,也可发生杂交。可以通过增加盐浓度和/或降低温度使条件变得不太严格。例如,可以由约37℃至约55℃的温度下约0.1至0.25M NaCl提供中等严格度条件,而可以由约20℃至约55℃的温度下0.15M至约0.9M的盐提供低严格度条件。杂交条件可以根据期望结果容易地进行操作。
在另一些实施方案中,可以在例如约20℃至约37℃的温度下在例如50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、1.0mM二硫苏糖醇的条件下实现杂交。使用的其他杂交条件可以包括在约40℃至约72℃的温度下约10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mMMgCl2。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比,将序列出于最佳比较目的而比对(例如,在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后可以比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同源性是序列共有的相同位置的数目的函数(%同一性=相同位置的数目/位置的总数(例如,重叠位置×100)。在一些实施方案中,两个序列具有相同的长度。
为了确定两个序列之间的百分比同源性,可以使用Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法,在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中进行修改。这样的算法被引入到了Altschul etal.(1990)J.Mol Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。使用NBLAST程序(分数=100,字长=12)进行BLAST核苷酸搜索,以获得与本文中描述或公开的核酸分子同源的核苷酸序列。使用XBLAST程序(分数=50,字长=3)进行BLAST蛋白质搜索。为了出于比较目的而获得有空位的比对,可以如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述使用空位BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和空位BLAST程序时,将使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。有关进一步细节,参见美国国家生物技术信息中心的网站(在万维网ncbi.nlm.nih.gov上)。适用于本文中所述方法的蛋白质还包括与本文中所述的任何蛋白质的氨基酸序列相比,具有1至15个氨基酸变化,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白质。在另一些实施方案中,改变的氨基酸序列与本文中所述的任何蛋白质抑制剂的氨基酸序列具有至少75%同一性,例如77%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%同一性。这样的序列变体蛋白质适合于本文中所述的方法,只要改变的氨基酸序列保留足够的生物学活性以在本文中所述的组合物和方法中起作用即可。在某些情况下,利用保守氨基酸替换。氨基酸之间的示例性保守替换在以下各个组内:(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,(3)丝氨酸和苏氨酸,(4)天冬氨酸和谷氨酸,(5)谷氨酰胺和天冬酰胺以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是来自蛋白质序列片段的约2,000个局部多重比对的氨基酸替换矩阵,代表了相关蛋白的超过500个组的高度保守的区域(Henikoffet al.(1992),Proc.Natl Acad.Sci.USA,89:10915-10919)。BLOSUM62替换频率可用于定义保守氨基酸替换,在一些实施方案中,其被引入到本文中描述或公开的氨基酸序列中。尽管可以仅基于化学性质设计氨基酸替换(如上所讨论),但是语言“保守氨基酸替换”优选是指由大于-1的BLOSUM62值表示的替换。例如,如果氨基酸替换由BLOSUM62值为0、1、2或3表征,则所述替换是保守的。根据此体系,优选的保守氨基酸替换由BLOSUM62值为至少1(例如,1、2或3)表征,而更优选的保守氨基酸替换由BLOSUM62值为至少2(例如2或3)表征。
本技术的DNA片段包括编码如上所述的生物学功能等同的Smad7蛋白和肽(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)的那些。这样的序列可由于已知在核酸序列和由此编码的蛋白质中天然发生的密码子冗余和氨基酸功能等同而产生。或者,可以通过应用重组DNA技术来产生功能上等同的蛋白质或肽,其中可以基于对所交换氨基酸的特性的考虑来改造蛋白质结构的变化。如其他地方所述,人为设计的变化可以通过应用定点诱变技术引入,或者可以随机引入并随后针对期望功能进行筛选。
如下文更详细描述的,Smad7核酸序列(以及编码其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)的那些片段)已经针对在替代宿主生物体(例如非人)中的表达进行了优化。尽管如上所述,遗传密码是简并的,但如此频繁地,一种氨基酸可以由两种或更多种核苷酸密码子编码。因此,多个核酸序列可以编码一个氨基酸序列。尽管这产生了相同的蛋白质,但是核酸本身是不同的,并且可以具有不同的特性。如本文中所述,密码子使用的选择的一个方面可以是(但不限于)在非天然细胞中表达蛋白质(例如,细菌或酵母中的人蛋白质)的能力,或在这样的细胞中的表达水平。为了获得足够的蛋白质用于纯化、测试以及在体外测定、动物模型以及最终在临床开发中使用,需要在非人***中的有效蛋白质表达。
已经鉴定了在由AGG(1.7%密码子使用率;9个残基)、AGA(2.8%密码子使用率;2个残基)、CGA(3.5%密码子使用率;4个残基)或CGG(5.4%密码子使用率;8个残基)中的一个或更多个编码的人Smad7蛋白序列中的一系列23个精氨酸氨基酸,并且已经确定,为了具有从非人来源(例如但不限于细菌和/或酵母)的有效蛋白质表达,一个或更多个并且潜在地所有精氨酸密码子都应修饰为CGT(20.6%密码子使用率)。因此,在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22个或23个已改变为CGT的精氨酸密码子。在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含在核酸序列第7至9、43至45、169至171、403至405、490至492、526至528、526至528、823至825、1057至1059、16至18、136至138、199至201、598至600、31至33、112至114、316至318、772至774、940至942、973至975、1135至1137、1276至1278、637至639或814至816位处的改变为CGT的一个或更多个或所有精氨酸密码子。
已鉴定了在由TCC或TCG(9%)编码的人Smad7蛋白序列中的一系列33个丝氨酸残基,并且已经确定,对于从非人来源(例如但不限于细菌和/或酵母)的有效蛋白质表达和纯化可能有益的是,一个或更多个并且潜在地所有丝氨酸密码子都修饰为AGC(15%密码子使用率)。因此,在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32或33个已改变为(AGC)的丝氨酸密码子。在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含在核酸序列第19至21、46至48、133至135、292至294、349至351、451至453、454至456、460至462、511至513、514至516、544至546、595至597、616至618、634至636、691至693、694至696、739至741、745至747、775至777、847至849、907至909、919至921、943至945、1006至1008、1009至1101、1030至1032、1054至1056、1093至1095、1126至1128、1192至1194、1237至1239、1240至1242、1273至1275位处的一个或更多个或所有丝氨酸密码子。其中的23个密码子(19至21、292至294、349至351、451至453、454至456、460至462、511至513、514至516、544至546、616至618、634至636、691至693、694至696、739至741、745至747、775至777、847至849、907至909、919至921、1009至1101、1030至1032、1054至1056、1093至1095)可以改变,而不会引入潜在的替代开放阅读框。
还已经鉴定了在由CAC(9.6%密码子使用率)编码的人Smad7蛋白序列中的一系列12个组氨酸残基,并且已经确定,对于从非人来源(例如但不限于细菌和/或酵母)的有效蛋白质表达和纯化可能有益的是,一个或更多个并且潜在地所有丝氨酸密码子都修饰为CAT(任选地至12.5%使用率)。因此,在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或12个已改变为(CAT)的组氨酸密码子。在一些实施方案中,Smad7密码子优化的核酸序列包含在核酸序列第142至144、214至216、217至219、220至222、226至228、289至291、589至591、778至780、1072至1074、1147至1149位处的一个或更多个或所有丝氨酸密码子。其中的4个密码子(第217至219、220至222、589至591、778至780位核苷酸)可以改变,而不会引入潜在的替代开放阅读框。
在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸可包含以下一种或更多种:至少1和多至22的任何整数个修饰为CGT的其精氨酸密码子,至少1和多至28的任何整数个修饰为AGC的其丝氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰),或至少1和多至12的任何整数个修饰为CAT的其组氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰)。在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸可包含至少1和多至22的任何整数个修饰为CGT的其精氨酸密码子,至少1和多至28的任何整数个修饰为AGC的其丝氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰),和至少1和多至12的任何整数个修饰为CAT的其组氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰)。在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸可包含22个修饰为CGT的其精氨酸密码子,28个修饰为AGC的其丝氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰),和12个修饰为CAT的其组氨酸密码子(任选地,能够通过引入开放阅读框进行修饰)。在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸还可在Met216的密码子(ATG)中具有核苷酸替换,以形成Leu216的密码子(CTG)。
在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸可与人Smad7野生型cDNA(SEQ ID NO:2)具有约65%至75%、约65%至68%、约68%至75%、或约68%至71%的同源性。在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸可与人Smad7野生型cDNA(SEQ IDNO:2)具有约65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%或75%的同源性。在一些实施方案中,一种或更多种密码子优化的核酸还可在Met216的密码子(ATG)中具有核苷酸替换,以形成Leu216的密码子(CTG)。
已经鉴定了甲硫氨酸密码子(Met216;ATG),其具有被翻译机器(例如但不限于细菌或酵母)作为替代开放阅读框感知的潜力。尽管不希望受到理论的束缚,但认为第二潜在开放阅读框的存在可降低Smad7蛋白的表达。在一些实施方案中,一种或更多种Smad7核酸序列在核苷酸位置(646至648)处被修饰以编码其中Met216(ATG)被修饰为Leu216(CTG)的人Smad7蛋白。
还发现Smad7蛋白的多种截短形式和片段(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)保留了全长人Smad7的一种或更多种活性,例如但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移,以及治疗或预防如本文进一步所讨论的其中这样的治疗可有用的一种或更多种疾病或障碍。这样的疾病和/或障碍可以包括但不限于急性(例如,通过手术、搏斗、创伤、糖尿病)和慢性伤口(例如溃疡,例如糖尿病性、压力性、静脉性)、瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、纤维化(包括肺纤维化和肺癌患者中辐射诱导的肺纤维化)以及异常愈合、黏膜炎(例如口腔和/或胃肠道黏膜炎,以及癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)、口炎(包括复发性口疮性口炎(口疮))、直肠炎、自身免疫性疾病(例如银屑病、关节炎)、辐射诱导的皮炎(放射性皮炎或RT皮炎)、特应性皮炎、接触性皮炎、变应性皮炎、间质性肺纤维化(ILF)、导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射)。这样的活性可以在使用一种或更多种测定进行评估,包括但不限于以下能力:阻断Smad2的磷酸化和/或NF-κBp50亚基的核易位,提高细胞增殖,降低凋亡和/或辐射诱导的DNA损伤,降低炎症和/或血管生成,促进口腔黏膜炎、手术伤口、糖尿病伤口和/或与小鼠中慢性炎症相关的伤口的愈合。
此外,在一些实施方案中,Smad7蛋白的多种截短形式和片段仅保留全长人Smad7的一种或更多种活性的子集。例如,Smad7的C末端MH2结构域可主要介导Smad7的抗炎作用。具有这种抗炎功能的Smad7肽对于治疗与例如但不限于口腔黏膜炎、口炎、关节炎和银屑病等慢性炎症相关的病症可以是足够的并且任选地是一种改善。N末端MH1结构域可主要介导细胞迁移和/或阻断TGF-β诱导的生长阻滞和/或纤维化反应。具有这种细胞迁移和增殖功能的Smad7肽对于增强与过度炎症无关的愈合可以是足够的并且任选地是一种改善。可以从这种治疗形式中受益的伤口类型包括但不限于手术伤口、纤维化瘢痕形成和糖尿病伤口、愈合缺陷和/或瘢痕形成等。
在一些实施方案中,核酸分子(任选地如上文和本文中所述的密码子优化的核酸分子)编码Smad7蛋白的片段或截短形式(任选地包含Leu216)。在一些实施方案中,Smad7蛋白的这些片段和/或截短形式保留了全长人Smad7蛋白的一种或更多种或全部活性。在一些实施方案中,这样的截短的核酸序列编码Smad7蛋白的N末端部分。在一些实施方案中,这样的截短的核酸序列编码Smad7蛋白的C末端部分。在一些实施方案中,核酸序列的这样的片段(第610至1278位核苷酸)编码人Smad7蛋白的第203至426位氨基酸。
如本文中关于核酸分子所使用的术语“截短的”是指包含编码相应蛋白质的天然N末端的核苷酸序列(具有或不具有切割的前导序列)但是缺少从分子的C末端编码部分开始的一个或更多个核苷酸的分子,或者包含编码相应蛋白质的天然C末端的核苷酸序列(具有或不具有切割的前导序列)但是缺少从分子的N末端编码部分开始的一个或更多个核苷酸的分子。在一些实施方案中,特别提供了缺少编码来自一个或另一个末端的至少约25个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、或至少约350个、或至少约400个氨基酸的核苷酸的分子。类似地,术语“截短的”也可以用于指由截短的核酸分子编码的蛋白质分子。在一些实施方案中,“截短的”分子具有生物学活性,具有一种或更多种本文中所述的Smad7活性(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)和PTD-Smad7(259至426)(或编码具有该活性的多肽)。
如本文关于核酸分子所使用的术语“片段”是指包含全长序列的连续残基但缺少全长序列的一些5’和/或3’序列的分子(包括但不限于PTD-Smad7(203至217))。在一些实施方案中,“片段”包含一种或更多种本文中所述的全长序列的一部分。在一些实施方案中,“片段”不包含编码N末端或C末端的序列,而仅包含内部片段。在一些实施方案中,“片段”编码具有本文中所述的一种或更多种Smad7活性的生物学活性多肽。在一些实施方案中,核酸片段可以编码具有至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150个氨基酸的蛋白质。类似地,“片段”也可以用于指由Smad7核酸片段编码的蛋白质分子。
如本文所用,术语“N末端部分”是指相应蛋白质的片段,其包含蛋白质的N末端,但缺少C末端至内部残基的所有序列。
如本文所用,术语“C末端部分”是指相应蛋白质的片段,其包含蛋白质的C末端,但缺少N末端至内部残基的所有序列。
发明人之前开发了包含与来自HIV-1 Tat蛋白的小肽融合的人Smad7的生物制剂,其在接触后迅速渗透细胞(Han G,Bian L,Li F,Cotrim A,Wang D,Lu J,etal.Preventive and therapeutic effects of Smad7 on radiation-induced oralmucositis.Nat Med.2013;19(4):421-8;美国专利申请No.14/773,167,公开No.US 2016/0039894,其通过引用整体并入本文)。此后,发明人制备数种Tat-Smad7截短的变体(美国专利申请No.15/208,424;美国公开No.2017/0000851,其通过引用整体并入本文),并显示其通常保留了全长Tat-Smad7构建体的一些但不是全部活性。此外,如可预期的,活性通常低于全长Tat-Smad7构建体,这可能是由于三级结构的变化、降解特性或缺少与蛋白质其他部分(例如提供在细胞核与胞质之间运输的能力的序列)的相互作用。图1B总结了Tat-PY-C-Smad7的多功能性质的潜在分子机制。
甚至更出乎意料地,发明人发现包含人Smad7的氨基酸203至426aa的Tat-PY-C-Smad7具有比US 2016/0039894中描述的Tat-Smad7片段构建体显著更高的生物学活性。在多种医学适应证中,这种新的构建体Tat-PY-C-Smad7也出乎意料地具有与全长Tat-Smad7类似或更好的活性。例如,在最近的出版物(Li et al.,Journal of InvestigativeDermatology,doi:10.1016/j.jid.2018.10.031.[Epub ahead of print]PMID:30423327)中,由发明人主导的研究表明,全长Tat-Smad7需要18天来显示出对K5.TGFβ1皮肤中皮肤炎症的总体缓解,并且需要28天来完全逆转该模型中的皮肤炎症。相比之下,本申请中的图4显示,在同一模型中,Tat-PY-C-Smad7(203至426)仅需要6天就总体上缓解皮肤炎症,并且仅需要13天完全逆转皮肤炎症。该发现是完全出乎意料的,因为发明人的先前数据均未提供任何指示表明,与全长人Smad7-Tat融合构建体相比,在该融合构建体中连接的人Smad7片段的氨基酸203至426aa具有显著更高,甚至显著不同的治疗活性。
在一些实施方案中,PTD位于Smad7核酸序列的3’端,并且在一些实施方案中,PTD位于Smad7核酸序列的5’端。在一些实施方案中,存在连接PTD和Smad7核酸序列的编码1、2、3、4、5或6个氨基酸的接头序列。
在一些实施方案中,PTD核酸序列是Tat核酸序列。编码GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:6)的ggccgtaaaaaacgccgtcaacgccgccgt(SEQ ID NO:52)、编码YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)的tatggccgtaaaaaacgccgtcaacgccgccgt(SEQ ID NO:53)、或编码GRKKRRQ(SEQ ID NO:55)的ggccgtaaaaaacgccgtcaa(SEQ ID NO:54)。替代地或另外地,PTD核酸序列可以是PEP肽序列(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:29))。
在一些实施方案中,核酸序列还包含编码表位标签或纯化标签中的一种或更多种的核苷酸序列。在一些实施方案中,表位标签是V5。在一些实施方案中,纯化标签是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或6-组氨酸(H6)(SEQ ID NO:56)中的一种或更多种。
如本文中关于核酸分子所使用的术语“表位标签”是指编码被抗体或片段的可变区识别并结合的肽序列的核苷酸。在一些实施方案中,表位标签不是天然蛋白质的一部分。在一些实施方案中,表位标签是可去除的。在一些实施方案中,表位标签不是蛋白质天然生物学活性所固有的。表位标签的实例包括但不限于V5。
如本文中关于核酸分子所使用的术语“纯化标签”是指编码促进蛋白质纯化但是通常对于蛋白质的生物学活性不是必需的肽序列的核苷酸。在一些实施方案中,纯化标签可以在蛋白质纯化后去除。纯化标签的实例包括但不限于GST和H-6(SEQ ID NO:56)。
2.用于克隆、基因转移和表达的载体
在某些实施方案中,使用表达载体表达Smad7多肽产物,然后可以将该产物纯化以用于多种用途。在另一些实施方案中,表达载体用于基因治疗。表达需要在载体中提供适当的信号,并且其包括多种调节元件,例如驱动目的基因在宿主细胞中表达的来自病毒和哺乳动物来源二者的增强子/启动子。还定义了设计成优化信使RNA在宿主细胞中的稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用许多显性药物选择标志物来建立表达产物的永久的稳定细胞克隆的条件,以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。
在整个本申请中,术语“表达构建体”旨在包括含有编码基因产物的核酸的任何类型的遗传构建体,其中核酸编码序列的一部分或全部能够被转录。转录本可以翻译成蛋白质,但不是必须的。在某些实施方案中,表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物二者。在另一些实施方案中,表达仅包括编码目的基因的核酸的转录。
术语“载体”用于指运载体核酸分子,其中可以***核酸序列以引入到细胞中,在细胞中其可以进行复制。核酸序列可以是“外源的”,这意味着其对于引入载体的细胞是外来的,或者该序列与细胞中的序列同源,但是在宿主细胞核酸内通常未发现该序列的位置处。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如,YAC)。本领域技术人员将做好充分的准备来通过标准的重组技术构建载体,所述技术描述在例如Sambrook,et al.,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Lab Press,1989),和Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Wiley,1994)中,二者均通过引用并入本文。
术语“表达载体”是指含有编码能够被转录的基因产物的至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况下,RNA分子然后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在另一些情况下,例如在反义分子或核酶的产生中,这些序列不翻译。表达载体可以包含多种“控制序列”,其是指对于可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中的转录和可能的翻译来说必需的核酸序列,包括启动子和增强子。除了控制转录和翻译的控制序列外,载体和表达载体还可包含具有其他功能的核酸序列,例如转录终止信号和聚腺苷酸化位点。
某些病毒载体有效感染或进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定表达病毒基因的能力导致了许多不同病毒载体***的开发和应用。Robbins,et al.,Pharmacol.Ther.80:35-47(1998)。病毒***当前用作离体和体内基因转移的载体。例如,目前正在评价腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体以用于治疗疾病,例如癌症、囊性纤维化、戈谢病(Gaucher disease)、肾病和关节炎。Robbins,et al.,Pharmacol.Ther.80:35-47(1998);Imai,et al.,Nephrologie 19:379-402(1998);美国专利5,670,488。取决于特定的基因治疗应用,多种病毒载体表现出特定的优点和缺点。
认为用于本技术的用于核酸递送以转化细胞器、细胞、组织或生物体的合适的非病毒方法包括几乎任何可以将核酸(例如DNA)引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的方法,如本文中所述或如本领域普通技术人员已知的。这样的方法包括但不限于直接递送DNA,例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859,各自通过引用并入本文),包括显微注射(Harland和Weintraub,1985;美国专利5,789,215,通过引用并入本文);通过电穿孔(美国专利5,384,253,通过引用并入本文);通过磷酸钙沉淀(Graham,et al.,Virology 52:456-467(1973);Chen,et al.,Mol.Cell Biol.7:2745-2752(1987);Rippe,et al.,Mol.CellBiol.10:689-695(1990));通过使用DEAE-右旋糖酐然后聚乙二醇(Gopal,Mol.CellBiol.5:1188-1190(1985));通过直接声加载(Fechheimer,et al.,PNAS 84:8463-8467(1987));通过脂质体介导的转染(Nicolau,et al.,Biochim.Biophys.Acta 721:185-190(1982);Fraley,et al.,PNAS 76:3348-3352(1979);Nicolau,et al.,MethodsEnzymol.149:157-176(1987);Wong,et al.,Gene 10:87-94(1980);Kaneda,et al.,J.Biol.Chem.264:12126-12129(1989);Kato,et al.,J.Biol.Chem.266:3361-3364(1991));通过微粒轰击(PCT申请No.WO 94/09699和95/06128;美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880,各自通过引用并入本文);通过用碳化硅纤维搅动(Kaeppler,et al.,Plant Cell Rep.9:415-418(1990);美国专利5,302,523和5,464,765,各自通过引用并入本文);或通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh,et al.,Plant Mol.Biol.21:415-428(1993);美国专利4,684,611和4,952,500,各自通过引用并入本文);通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus,et al.,Mol.Gen.Genet.199:169-177(1985))。通过应用诸如这些技术,可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
3.表达***
存在包含以上讨论的组合物的至少一部分或全部的许多表达***。基于原核生物和/或真核生物的***可用于本技术以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的***是商业上可广泛获得的。
昆虫细胞/杆状病毒***可产生异源核酸片段的高水平的蛋白表达,例如美国专利5,871,986和4,879,236中所述,二者均通过引用并入本文,并且其可例如从以名称和从以BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM购买。
表达***的另一些实例包括的COMPLETE CONTROLTM诱导型哺乳动物表达***,其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体,或其pET表达***,该***是大肠杆菌(E.coli)表达***。诱导型表达***的另一个实例可从获得,其携带T-REXTM(四环素调节的表达)***,该***是使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达***。还提供了称为甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达***的酵母表达***,其被设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员将知道如何表达载体(例如表达构建体),以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
原代哺乳动物细胞培养物可以以多种方式制备。为了使细胞在体外并与表达构建体接触时保持活力,必需确保细胞与正确比例的氧气和二氧化碳和营养物质维持接触,但要保护其免受微生物污染。细胞培养技术已有文献充分记载。
前述的一个实施方案涉及使用基因转移使细胞永生化以用于产生蛋白质。可如上所述将目的蛋白的基因转移到合适的宿主细胞中,随后在合适的条件下培养细胞。几乎任何多肽的基因均可以以该方式使用。以上讨论了重组表达载体的产生以及其中包含的元件。或者,待产生的蛋白质可以是通常由所讨论细胞合成的内源性蛋白质。
可用哺乳动物宿主细胞系的一些实例是Vero和HeLa细胞以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞。另外,选择调节***序列的表达或以所期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这样的修饰(例如,糖基化)和加工(例如,切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择合适的细胞系或宿主***以确保表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。
可使用许多选择***,包括但不限于分别在tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。同样,抗代谢物抗性可用作选择以下的基础:dhfr,其赋予抗性;gpt,其赋予对霉酚酸的抗性;neo,其赋予对氨基糖苷G418的抗性;以及hygro,其赋予对潮霉素的抗性。
如本文中使用的,术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语也包括其后代,即任何和所有的后代。应理解的是由于有意或无意的突变,所有后代可不相同。在表达异源核酸序列的情况中,“宿主细胞”是指原核或真核细胞,并且其包括能够复制载体和/或表达载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并且已经用作载体的接受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”,这是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。
根据所期望的结果是载体的复制还是载体编码的核酸序列的部分或全部表达,宿主细胞可来源于原核生物或真核生物(例如,细菌或酵母)。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞,并且其可通过美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得,ATCC是作为活的培养物和遗传材料的档案库的组织(atcc.org)。本领域技术人员可基于载体骨架和期望的结果确定合适的宿主。例如,可将质粒或黏粒引入到原核宿主细胞中用于复制许多载体。用作用于载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8,以及许多可商购的细菌宿主,例如感受态细胞和SOLOPACKTM金细胞(La Jolla)。或者,细菌细胞(例如大肠杆菌LE392)可用作噬菌体病毒的宿主细胞。
用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的一些实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自多种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可获得的,并且是本领域技术人员已知的。类似地,病毒载体可与真核或原核宿主细胞联合使用,特别是允许载体复制或表达的宿主细胞。
一些载体可使用允许其在原核和真核细胞二者中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步理解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。还理解和已知的是允许大规模产生载体以及产生由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
B.Smad7蛋白和蛋白质片段
先前通过包括以下的数种机制将母亲抗十五褶同源物7(mothers againstdecapentaplegic homolog 7,Smad7)鉴定为TGF-β信号传导的拮抗剂:(a)阻断TGF-β受体介导的磷酸化和信号传导Smad的核易位;(b)通过特定的泛素-蛋白酶体途径提高TGF-β受体的降解和信号传导Smad;以及(c)抑制信号传导Smad与Smad结合元件(Smad bindingelement,SBE)的结合。Smad7还拮抗其他信号传导途径,如NF-κB途径。
Smad7蛋白由以上讨论的SMAD7基因编码。如同许多其他TGF-β家族成员一样,Smad7也参与细胞信号传导。其是TGF-β1型受体拮抗剂。其阻断TGF-β1和与受体相关的活化素,从而阻断接近Smad2。其是抑制性Smad(inhibitory Smad,I-SMAD)并被SMURF2增强。Smad7还增强肌肉分化。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或更多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文中使用的,该术语涵盖任何长度的氨基酸链,包括其中氨基酸残基通过共价肽键连接的全长蛋白质。
在一个实施方案中,本技术涉及Smad7蛋白组合物。除整个Smad7分子之外,本技术还涉及保留与Smad7相关的一种或更多种活性的多肽的截短部分和片段(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)),所述活性例如但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移,以及治疗或预防其中如本文中进一步讨论的这样的治疗将是有用的一种或更多种疾病或障碍。这样的疾病和/或障碍可包括但不限于:急性(例如,通过手术、搏斗、创伤、糖尿病)和慢性伤口(例如,溃疡,例如糖尿病性、压力性、静脉性)、瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、纤维化(包括肺纤维化和肺癌患者中的辐射诱导的肺纤维化)以及异常愈合、黏膜炎(例如口腔和/或胃肠道黏膜炎,以及癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)、口炎(包括复发性口疮性口炎(口疮))、直肠炎、自身免疫性疾病(例如,银屑病、关节炎)、辐射诱导的皮炎(放射性皮炎或RT皮炎)、特应性皮炎、接触性皮炎、变应性皮炎、间质性肺纤维化(ILF)、导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射)。可使用一种或更多种测定来评估这些活性,包括但不限于以下的能力:阻断Smad2磷酸化和/或NF-κB p50亚基核易位、提高细胞增殖、降低凋亡和/或辐射诱导的DNA损伤、降低炎症和/或血管生成、促进口腔黏膜炎、手术伤口、糖尿病伤口和/或与小鼠中慢性炎症相关的伤口的愈合。
蛋白质片段可通过编码区内翻译终止位点的遗传改造(以下讨论)产生。或者,用称为蛋白酶的蛋白水解酶处理Smad7分子可产生多种N末端、C末端和内部片段。这些片段可根据已知方法,例如沉淀(例如,硫酸铵)、HPLC、离子交换色谱法、亲和色谱法(包括免疫亲和色谱法)或多种尺寸分离(沉降、凝胶电泳、凝胶过滤)纯化。
如本文中使用的,在本实施方案中提及的分离的蛋白质或多肽包括全长蛋白质、融合蛋白、嵌合蛋白或者这样的蛋白质的任何片段(截短形式、部分)或同源物。更特别地,分离的蛋白质可以是已经从其自然环境中移除(即已经受人操纵)的蛋白质(包括多肽或肽),并且可包括但不限于纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组产生的蛋白质、与脂质复合的蛋白质、可溶性蛋白质、合成产生的蛋白质以及与其他蛋白质相关的分离的蛋白质。因此,“分离的”不反映蛋白质已经被纯化的程度。优选地,分离的蛋白质是重组产生的。
还提供了Smad7的变体-这些变体可以是替换、***或缺失变体。缺失变体缺少天然蛋白质的对于活性不必需的一个或更多个残基,包括上文和本文中所述的截短突变体。替换变体通常在蛋白质内的一个或更多个位点包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换,并且可被设计以调节多肽的一种或更多种特性,例如针对蛋白水解性切割和/或翻译和/或转录(蛋白表达)的稳定性,而不丧失其他功能或特性。这种替换优选是保守的,即一个氨基酸被类似形状和电荷的一个氨基酸替代。保守替换是本领域中公知的并且包括,例如每个氨基酸可被不同的氨基酸改变或替换。在制造替换变体时,通常要考虑亲水性指数、亲水性、电荷和尺寸。
特别考虑的Smad7的缺失变体包括截短和片段,例如,包含具有N末端序列但不具有C末端序列的多肽分子、具有C末端序列但不具有N末端序列的多肽分子或者具有内部序列但不具有N末端或C末端序列的多肽分子。特别地,考虑的Smad7多肽截短或片段包括但不限于包含与天然人Smad7蛋白序列(SEQ ID NO:1)对应的氨基酸残基第203至426位、第259至426位和第203至217位的分子。
如本文中关于蛋白质序列使用的术语“截短的”是指包含相应蛋白质的天然N末端(具有或不具有切割的前导序列)但缺少起始于该分子C末端的一个或更多个氨基酸的分子,或包含相应蛋白质的天然C末端(具有或不具有切割的前导序列)但缺少起始于该分子N末端的一个或更多个氨基酸的分子(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)和PTD-Smad7(259至426))。在一些实施方案中,特别提供了缺少来自一个末端或另一末端的至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300或至少约350或至少约400个氨基酸的分子。在一些实施方案中,“截短的”分子是具有生物活性的,具有本文中所述的一种或更多种Smad7活性。
如本文中关于多肽序列使用的术语“片段”是指包含全长序列的连续残基但缺少全长序列的一些N末端和/或C末端残基的分子。在一些实施方案中,“片段”包含本文中所述的一个或更多个全长序列的一部分。在一些实施方案中,“片段”不包含编码N末端或C末端的序列,而仅包含内部片段。在一些实施方案中,“片段”编码具有生物活性的、具有本文中所述的一种或更多种Smad7活性的多肽(包括但不限于PTD-Smad7(203至217))。在一些实施方案中,多肽片段具有至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150个氨基酸。
一种特殊种类的变体是融合蛋白。该分子通常具有天然分子的全部或大部分,在N或C末端与第二多肽的全部或部分连接。然而,在一些实施方案中,融合蛋白可包含本公开内容通篇所描述的片段和/或截短的(N末端、C末端)Smad7蛋白中的任一种(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))。例如,融合可使用来自其他物种的前导序列以允许蛋白质在异源宿主中的重组表达。另一种可用的融合包括添加任选的功能活性结构域,例如但不限于抗体表位和/或纯化标签(例如,V5:GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:3);Flag:KYKDDDDK(SEQ ID NO:4);HA:YPYDVPDYA(SEQ IDNO:5))。融合的另一种类型包括附接可作为活化或灭活配体的靶标的结构域,从而一旦递送至对象就允许控制融合蛋白的功能。这样的结构域包含,例如类固醇配体结合(例如ER、PR、GR),其可被小分子(例如,4-羟基他莫昔芬或RU486)活化,所述小分子独特地能够活化那些类固醇配体结合结构域和/或在自然中不存在并因此将能够通过这些小分子的存在而完全控制Smad7功能。
融合蛋白的另一种形式是包含Smad7片段的Smad7蛋白与蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)的融合,所述结构域也称为细胞递送结构域或细胞转导结构域。这样的结构域在本领域中已有描述,并且通常被表征为短的两亲性或阳离子肽和肽衍生物,通常包含多个赖氨酸和精氨酸残基(Fischer,Med.Res.Rev.27:755-795(2007))。PTD可以是来自HIV的Tat蛋白的一种或更多种变体(GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:6),YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)或GRKKRRQ(SEQ ID NO:8))或替代地HSV VP16。可使用Tat的替代形式。PTD可以是PEP(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:28))或其功能性变体。接头可用于连接一个或更多个PTD和Smad7蛋白。PTD(任选地Tat)在框架中融合或连接至上述Smad7全长、片段和/或截短的(N末端、C末端)蛋白质(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))中的任一种的N末端和/或C末端末尾。在本公开内容的方法中与Smad7蛋白用作融合蛋白的PTD的另一些实例在下表中示出:
在一些具体实施方案中,本技术提供了其中一个或更多个残基已被改变的Smad7的序列变体。例如,在一个实施方案中,将在人Smad7序列的第216位处发现的甲硫氨酸残基修饰为亮氨酸残基(ATG至CTG)。
C.治疗方法
PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))可治疗的疾病和障碍可包括包含降低的细胞增殖、降低的细胞迁移、提高的细胞死亡、过度炎症和/或DNA损伤中的一种或更多种的那些。Smad7相关的疾病和障碍可包括其中用具有以下一种或更多种活性的PTD-Smad7蛋白及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))治疗有帮助的那些:包括但不限于提高增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移。这样的疾病和/或障碍可包括但不限于:急性(例如,通过手术、搏斗、创伤、糖尿病)和慢性伤口(例如,溃疡,例如糖尿病性、压力性、静脉性)、瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)、纤维化(包括肺纤维化和肺癌患者中的辐射诱导的肺纤维化)以及异常愈合、黏膜炎(例如口腔和/或胃肠道黏膜炎,以及癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)、口炎(包括复发性口疮性口炎(口疮))、直肠炎、自身免疫性疾病(例如,银屑病、关节炎)、辐射诱导的皮炎(放射性皮炎或RT皮炎)、特应性皮炎、接触性皮炎、变应性皮炎、间质性肺纤维化(ILF)、导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射),以及癌症。
在一些实施方案中,可通过向需要这样的治疗的对象提供治疗有效量的本公开内容中所述的一种或更多种PTD-Smad7蛋白(例如,全长或具有生物活性的截短的(例如N末端或C末端)或其片段,包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))来预防、治疗和/或改善本文中所述的一种或更多种疾病和/或障碍。在一些实施方案中,一种或更多种Smad7蛋白是包含PTD结构域的融合蛋白。在一些实施方案中,一种或更多种Smad7蛋白包含Leu216。在一些实施方案中,Smad7蛋白构成包含一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物的一部分。
在一些实施方案中,可通过向需要这样的治疗的对象提供治疗有效量的一种或更多种核酸分子来预防、治疗和/或改善本文中所述的一种或更多种疾病和/或障碍,所述核酸分子编码本公开内容中所述的一种或更多种PTD-Smad7蛋白(例如,全长或具有生物活性的截短的(例如,N末端或C末端))或其片段,包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))。在一些实施方案中,一种或更多种核酸分子包含密码子优化的核苷酸序列和/或编码Leu216的序列。在一些实施方案中,一种或更多种PTD-Smad7核酸分子及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))以包含表达载体的构建体提供给对象。在一些实施方案中,Smad7核酸分子及其生物活性片段和衍生物(任选地表达载体的一部分)构成包含一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物的一部分。
如本文中使用的,术语“对象”或“患者”是指需要使用本文中所述的一种或更多种治疗进行治疗和或预防的人或非人动物。在一些实施方案中,非人动物包含实验动物,例如猴、小鼠、大鼠和兔;家养宠物,例如狗和猫;以及家畜,例如牛、马、猪、山羊和绵羊。
1.慢性伤口
慢性伤口是指不像大多数伤口那样在一组有序阶段和可预测的时间量内愈合的伤口;三个月内未愈合的伤口通常被认为是慢性的。慢性伤口显示滞留在伤口愈合的一个或更多个阶段中。例如,慢性伤口通常在炎性阶段保持的时间过长。在急性伤口中,在分子(例如胶原蛋白)的产生和降解之间存在精确的平衡;在慢性伤口中,这种平衡丧失并且降解起太大作用。
如本文中其他地方更详细描述的,PTD-Smad7及其一种或更多种生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))已经在小鼠皮肤模型、糖尿病小鼠伤口模型、放射性皮炎小鼠模型和黏膜模型中表现出增强伤口愈合。PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))的应用通过表面途径(这对于伤口治疗是理想的)以及用局部注射是有效的。尽管不希望受到理论的束缚,但认为PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))可通过多种途径发挥作用来治疗或改善伤口(包括慢性伤口),其可包括降低炎症、提高细胞增殖(例如,角质形成细胞)、提高细胞迁移(例如,角质形成细胞)或降低纤维化(例如,通过调节胶原蛋白)等。
慢性伤口可能永不愈合或者可能花费数年才能愈合。这些伤口引起患者严重的情绪和身体压力,并且对患者和整个医疗***造成重大的经济负担。急性和慢性伤口处于一系列以不同的速率朝愈合进展的伤口愈合类型的相对端。绝大多数慢性伤口可分为三种类别:静脉性溃疡、糖尿病伤口和溃疡以及压力性溃疡。少数不属于这些类别的伤口可能是由于例如辐射中毒(例如,辐射诱导的皮炎)或缺血的原因。
静脉和动脉性溃疡。静脉性溃疡通常在腿中发生,约占慢性伤口的70%至90%并且主要影响老年人。其被认为是由于由存在于静脉内以防止血液回流的瓣膜功能不当引起的静脉高血压。缺血起因于功能障碍,与再灌注损伤组合引起导致伤口的组织损伤。
糖尿病伤口,包括溃疡。慢性伤口的另一个主要原因(即糖尿病)的患病率正在增加。由于慢性伤口(包括溃疡),糖尿病患者的截肢风险比一般群体高15%。PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))已经在本文中表现出在治疗糖尿病伤口方面比目前FDA批准的治疗RegranaxTM更有效。糖尿病引起神经病变,其抑制伤害感受和疼痛知觉。因此患者最初可能没有注意到腿和足的小伤口,并且因此可能无法预防感染或反复损伤。此外,糖尿病导致免疫受损和小血管损伤,从而阻止组织的充分氧合作用,这可以导致慢性伤口。压力也在糖尿病性溃疡形成中发挥作用。
压力性溃疡。慢性伤口的另一种主要类型是压力性溃疡,其通常发生在患有例如瘫痪的病症的人中,所述病症抑制了通常承受压力的身体部位(例如脚跟、肩胛骨和骶骨)的运动。压力性溃疡由当组织上的压力大于毛细血管中的压力时发生并因此限制血液流入该区域的缺血引起。比皮肤需要更多氧气和营养物质的肌肉组织表现出因长期受压导致的最坏的影响。与其他慢性溃疡一样,再灌注损伤也损害组织。
慢性伤口可仅影响表皮和真皮,或者其可一直影响组织一直至筋膜。其最初可能是由引起急性伤口的相同事物(例如手术或意外创伤)形成的,或者其可能是由于全身感染、血管、免疫或神经功能不全或者合并症(例如瘤形成或代谢障碍)而形成的。尽管不希望受到理论的束缚,但伤口变成慢性的原因是身体应对损伤的能力被一些因素(例如反复创伤、持续的压力、缺血或疾病)压垮。导致慢性伤口的一些主要因素包括但不限于缺血、再灌注损伤和细菌定植。
缺血。缺血是伤口形成和持续的重要因素,特别是当其反复发生(通常如此)或当与患者的高龄相结合时。缺血导致组织发炎和细胞释放吸引中性粒细胞的因子,例如白介素、趋化因子、白三烯以及补体因子。
尽管其对抗病原体,中性粒细胞也释放炎性细胞因子和损伤细胞的酶。其重要功能之一是产生活性氧类(Reactive Oxygen Species,ROS)以杀伤细菌,为此其使用称为髓过氧化物酶的酶。由中性粒细胞和其他白细胞产生的酶和ROS通过损伤加速愈合的DNA、脂质、蛋白质、ECM和细胞因子而损伤细胞并阻止细胞增殖和伤口闭合。中性粒细胞在慢性伤口中比其在急性伤口中保持更长时间,并且有助于慢性伤口具有更高水平的炎性细胞因子和ROS的事实。因为来自慢性伤口的伤口流体中具有过量的蛋白酶和ROS,所以流体自身可通过抑制细胞生长并分解ECM中的生长因子和蛋白质来抑制愈合。
细菌定植。由于伤口环境中更多的氧气允许白细胞产生ROS来杀伤细菌,因此组织氧合作用不足的患者(例如在手术期间遭受低温的那些)处于感染之高风险中。宿主对存在细菌的免疫应答延长炎症、延迟愈合并损伤组织。感染不仅导致慢性伤口,还导致坏疽、被感染的肢体丧失以及患者死亡。
如同缺血一样,细菌定植和感染通过引起大量中性粒细胞进入伤口部位而损伤组织。在患有慢性伤口的患者中,对抗生素具有抗性的细菌可具有时间来发育。另外,携带药物抗性细菌菌株(例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA))的患者具有更多的慢性伤口。
生长因子和蛋白水解酶。在组成中慢性伤口也与急性伤口不同,不同之处在于其蛋白水解酶(例如弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP))水平更高,而其生长因子(例如血小板来源的生长因子和角质形成细胞生长因子)的浓度更低。
因为生长因子(growth factor,GF)在伤口愈合中是必需的,所以GF水平不足可能是慢性伤口形成的重要因素。在慢性伤口中,可阻止生长因子的形成和释放,这些因子可能被隔离并且不能进行其代谢作用,或者被细胞蛋白酶或细菌蛋白酶过度降解。
慢性伤口(例如糖尿病性溃疡和静脉性溃疡)也是由成纤维细胞不能产生足够的ECM蛋白和角质形成细胞使伤口上皮化引起的。成纤维细胞基因表达在慢性伤口和在急性伤口中不同。
尽管所有伤口均需要一定水平的弹性蛋白酶和蛋白酶用于适当愈合,但是过高的浓度是损伤性的。伤口区域中的白细胞释放弹性蛋白酶(提高炎症、破坏组织、蛋白聚糖和胶原蛋白)并损伤生长因子、纤连蛋白和抑制蛋白酶的因子。弹性蛋白酶的活性通过人血清白蛋白提高,所述人血清白蛋白是在慢性伤口中发现的最丰富的蛋白质。然而,白蛋白不足的慢性伤口特别不可能愈合,因此调节伤口的该蛋白质的水平将来可证明有助于治愈慢性伤口。
由白细胞释放的过量基质金属蛋白酶也可导致伤口变成慢性的。MMP分解ECM分子、生长因子和蛋白酶抑制剂,并因此提高降解同时降低构建,使产生和降解之间的微妙折衷失衡。
2.急性伤口/创伤
物理创伤是严重的且改变身体的物理损伤,例如肢体的移除。钝力创伤是一种由或用钝性物体施加的冲击力或其他力造成的物理创伤,而穿透性创伤是其中皮肤或组织被物体刺穿的一种物理创伤。创伤也可以描述为计划外的(例如事故)或者计划的(在手术的情况下)二者。二者的特征均可以是轻度至重度组织损伤、失血和/或休克,并且二者均可导致随后的感染,包括脓毒症。本技术提供了创伤的治疗,包括预治疗(在医学程序的情况下)以及在创伤损伤已发生之后的治疗二者。
如本文中其他地方更详细描述的(和以上简要提及的),PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))已经在一个或更多个小鼠皮肤模型、糖尿病伤口小鼠模型、放射性皮炎模型和黏膜模型中表现出增强伤口愈合。PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))的应用通过表面途径(这对于伤口治疗是理想的)以及通过局部注射在这些模型中的一个或更多个中是有效的。尽管不希望受到理论的束缚,但认为PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217)可通过多种途径发挥作用来治疗或改善伤口,所述途径可包括以下中的一种或更多种:降低炎症、提高细胞增殖(例如,角质形成细胞)、提高细胞迁移(例如,角质形成细胞)或降低纤维化(例如,通过胶原蛋白的调节)等。如以下简要描述的,降低的炎症可显著有助于加速伤口愈合,任选地通过降低血管生成和胶原蛋白产生和/或降低白细胞浸润,导致降低通常由白细胞释放的细胞因子和趋化因子,其是促血管生成的和促纤维生成的。用Smad7的暂时性治疗可允许伤口修复所需的早期血管生成和胶原蛋白产生,同时防止延长的血管生成和胶原蛋白产生。这些变化可潜在地加速伤口基质重塑,并防止由于非消散性炎症(unresolvedinflammation)或胶原蛋白过度产生引起的过度瘢痕形成。对于手术程序(以及日常损伤),特别是在瘢痕形成的潜在性是一个问题(包括例如瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)的情况下,用本公开内容的Smad7蛋白融合构建体及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))进行治疗可以是有益的。
口腔溃疡。口溃疡(也称为口腔溃疡或黏膜溃疡)是发生在口腔黏膜上的溃疡。更简单地说,口溃疡是口中的疮(sore)或开放性病变。口溃疡非常常见,与许多疾病联合并通过许多不同的机制而发生,但通常没有严重的深层原因。口腔溃疡的两种最常见原因是局部创伤(例如,从填充物的锋利边缘摩擦)和口疮性口炎(“口疮”),所述口疮性口炎是特征在于由于大量未知原因而反复形成口溃疡的病症。一些人认为一般术语口腔溃疡中包括唇上或口周围皮肤上的溃疡(例如,由唇疱疹,即冷疮引起的水疱破裂留下的溃疡)。口溃疡通常引起疼痛和不适,并可在愈合发生时改变人对食物的选择(例如,避免酸性或辛辣的食物和饮料)。口溃疡可单独出现或可同时出现多个溃疡(一“群(crop)”溃疡)。一旦形成,可通过炎症和/或继发感染来维持溃疡。罕有地,口溃疡持续许多周而不愈合可能是口腔癌的体征。其他原因包括烧伤、化学损伤或感染。
黏膜溃疡是特定地发生在黏膜上的溃疡。溃疡是已穿透上皮-***边界的组织缺陷,其中其深层次的基底位于黏膜下层中,或者甚至在肌肉或骨膜内。溃疡是比糜烂(erosion)或脱皮(excoriation)更深的上皮裂口(breech),并且涉及对上皮和固有层二者的损伤。糜烂是上皮的表面破裂,对下面的固有层具有很小的损害。黏膜糜烂是特定地发生在黏膜上的糜烂。仅表皮的或黏膜的表面上皮细胞丧失,并且病变可达到基底膜的深度。在没有瘢痕形成的情况下糜烂愈合。脱皮是有时用于描述比糜烂更深但比溃疡更浅的上皮破裂的术语。这种类型的病变与钉突(rete peg)相切,并表现为由暴露的毛细血管回路引起的点状(小针头点)出血。
手术。手术对患者使用操作性的手动和仪器技术以研究和/或治疗病理病症(例如疾病或损伤)从而帮助改善身体功能或外观,或有时候用于一些其他原因。本技术可解决由手术造成的创伤,如以下进一步定义的。
一般来说,当涉及切割患者的组织或封闭以前持续的伤口时,程序被认为是手术。不一定列入该标题的其他程序,例如血管成形术或内窥镜检查,如果其涉及常用手术程序或设备,例如使用无菌环境、麻醉、抗菌条件、典型手术仪器以及缝合或缝折(stapling),则可认为它们是手术。所有形式的手术均视为侵入性程序;所谓的非侵入性手术通常是指不穿透正在被处理结构的切除(例如,角膜的激光消融)或是指辐射手术程序(例如肿瘤辐照)。手术可持续数分钟到数小时。
手术程序通常通过紧急性、程序类型、所涉及的身体***、侵入程度和专用仪器分类。进行选择性手术以纠正非危及生命的病症,并按照患者的要求,根据外科医生和手术设施的可用性进行。紧急手术是这样的手术,其必须立即进行以挽救生命、肢体或功能能力。进行探查性手术以辅助或确认诊断。治疗性手术治疗先前诊断的病症。
截肢包括切掉身体部位,通常是肢体或指/趾。再植包括重新接上被切断的身体部位。重建手术包括重建身体的受损、残缺或变形的部位。进行整容手术以改善在其他方面正常的结构的外观。切除是从患者切除器官、组织或其他身体部位。移植手术是通过向患者体内***来自不同的人(或动物)的另一个器官或身体部位来替换器官或身体部位。从活的人或动物中取出器官或身体部位用于移植也是一种手术类型。
当对一个器官***或结构进行手术时,其可由所涉及的器官、器官***或组织分类。一些实例包括心脏手术(对心脏进行)、胃肠道手术(在消化道及其附属器官内进行)和矫形手术(对骨和/或肌肉进行)。
微创手术涉及较小的外切口以将小型化仪器***体腔或结构内,如腹腔镜手术或血管成形术中那样。相比之下,开放性手术程序需要大切口以接近目的区域。激光手术涉及使用激光用于切割组织而不是手术刀或类似的手术仪器。显微手术涉及使用手术显微镜以供外科医生查看小结构。机器人手术使用手术机器人例如Da Vinci或Zeus手术***来在外科医生的指导下控制仪器。
3.自身免疫性/炎性疾病
本技术考虑多种自身免疫性和/或炎性疾病状态的治疗,例如脊柱关节病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激病、炎性肠病、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、家族性地中海热、肌萎缩性侧索硬化、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、早期关节炎、病毒性关节炎、多发性硬化或银屑病。这些疾病的诊断和治疗在文献中充分记载。
通常,自身免疫性疾病与身体针对通常存在于体内的物质和组织的过度活跃的免疫应答相关,并且通常不是免疫应答的重点。存在多于80种自身免疫性疾病,其中一些具有类似的症状,并且其均可由类似的深层原因引起。自身免疫性疾病的经典体征是炎症,如本文中所述,炎症适合用PTD-Smad7(任选地其生物活性片段及衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))组合物进行治疗。本文中PTD-Smad7(203至426)或Tat-Smad7(203至426)表现出在银屑病模型中有效。
4.化学治疗、放射治疗和细胞因子治疗毒性
多种形式的癌症治疗,包括化学治疗、辐射和细胞因子,在癌症患者中均与毒性相关,有时是严重的。本公开内容的方法在以下方面也是有效的:通过施用本技术的药物组合物来治疗或降低这种毒性的严重程度,从而降低或减轻患者部位上的不适,以及允许更高的治疗剂量。因此,本公开内容的方法包括治疗、预防和改善辐射诱导的损伤包括例如辐射诱导皮炎(“放射性皮炎”或“RT皮炎”)和导致肺纤维化的放射性肺炎(例如,由于治疗癌症的放射)的方法。本文中PTD-Smad7(203至426)或Tat-Smad7(203至426)表现出在小鼠模型中有效治疗放射性皮炎。
如本公开内容通篇详细描述的,已经发现PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))在小鼠模型中用于治愈以及预防口腔黏膜炎。在直接比较中PTD-Smad7及其一种或更多种生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))表现出比帕利夫明(现有的已批准用于预防口腔黏膜炎的药物)更有效。
口腔癌是全球第六大最常见的癌症,其是头颈癌的亚型,并且包括位于口腔中的任何癌组织生长。其可作为起源于任何口腔组织的原发性病变,通过从远处起源部位转移,或通过从邻近的解剖结构(例如鼻腔)延伸而产生,或者口腔癌可来源于口的任何组织,并且可以是不同的组织学类型:畸胎瘤、来源于大唾液腺或小唾液腺的腺癌、来自扁桃体或其他淋巴组织的淋巴瘤、或者来自口腔黏膜色素产生细胞的黑素瘤。口腔癌有数种类型,但约90%是鳞状细胞癌,起源于内衬于口和唇的组织。口腔癌或口癌最常涉及舌。其也可以发生在口底、颊内层、牙龈(齿龈)、唇或腭(口顶)上。大多数口腔癌在显微镜下看起来非常类似并被称为鳞状细胞癌。这些是恶性的并且倾向于快速扩散。
超过80%的口腔癌患者用放射治疗进行治疗并且这些个体中的至少75%将发生口腔黏膜炎(即癌症治疗诱导的口腔黏膜炎)。口腔黏膜炎是慢性口腔溃疡。该疾病经常发生在所有癌症类型的放射治疗的患者中,包括但不限于对器官移植物进行放射治疗(以消除移植物的排斥反应)的患者和进行常规化学治疗的患者。重度口腔黏膜炎极度疼痛并有损食物/液体的摄入,因此通常是癌症治疗最严重的并发症。口腔黏膜炎是确定对头颈区域的放射和化学治疗可能的最大剂量的主要因素;其会使癌症治疗明显复杂化、延长住院时间、降低生活质量并提高成本。
目前,尚无有效治疗重度口腔黏膜炎的既定治疗。迄今为止,帕利夫明人角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)的重组蛋白,是FDA批准的用于骨髓移植患者中的重度口腔黏膜炎的用于静脉内(intravenous,i.v.)注射的唯一药物,并且其在癌症患者中的用途仍有待确定。其也用于预防口腔黏膜炎。因此,这种药物仅适用于4%的高危群体。由于i.v.施用途径,其还需要医疗服务提供者。其他潜在的治疗包括表面清洗,例如黏性2%利多卡因(lidocaine)清洗剂,或小苏打和盐水溶液,或混合物溶液,例如BAX(利多卡因、苯海拉明(diphenhyramine)、山梨糖醇和)。其他研究性或黏膜保护性辅助治疗包括但不限于β胡萝卜素、生育酚、激光辐照、用硝酸银预防性冲刷口腔黏膜、米索前列醇、亚叶酸钙(leucovorin)、全身KGF、己酮可可碱、别嘌呤醇漱口剂、全身硫糖铝、葡萄糖酸氯己定以及冷冻治疗。
化学治疗诱导和辐射诱导的肠黏膜炎是炎性病症,其由于快速***的肠上皮细胞的急性死亡而产生。用于单独、以药物组合或与辐射一起治疗实体瘤的大多数化学治疗药物都将导致大量肠上皮细胞死亡。随后发生的黏膜炎的临床表现包括消化***症状,例如恶心和呕吐、严重腹泻、急性体重减轻和消瘦。这正快速成为许多癌症患者施用化学治疗的限制因素之一。Tat-Smad7保护肠上皮细胞免受化学治疗剂、辐射或二者组合的能力,将显著降低癌症治疗的不期望的副作用,并且能够以更积极的方式使用现有工具治疗该疾病。
骨髓衰竭综合征是当造血干细胞区室受损并无法产生正常细胞类型时发生出来的一系列病症。发生骨髓衰竭是遗传性遗传异常、暴露于有毒物质(例如毒素、化学物质或病毒)的结果。尽管仍未完全了解可导致获得性骨髓衰竭发生的环境因素的性质和特性,但一些因素已与军事人员中的获得性骨髓衰竭的发生相关,包括暴露于芥子气、电离辐射和感染剂,例如内脏利什曼病(visceral leishmaniasis)或非洲锥虫病(Africantrypanosomiasis)。用于管理骨髓衰竭综合征的最佳方法仍然是造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的移植,除非足够量的剩余驻留骨髓HSC可免受这些压力并鼓励再植造血区室。如此处所述,Smad 7的调节应能够对表现出与骨髓衰竭一致的临床体征的患者中的剩余驻留HSC提供有意保护。
5.癌症
已知TGF-β和NF-κB活化促进癌症侵袭和转移。目前,TGF-β抑制剂正在用于治疗转移性癌症的临床试验中并且NF-κB抑制剂用于癌症预防。已证明的Smad7对阻断TGF-β和NF-κB二者信号传导的作用表明,与仅抑制这两种途径之一的其他抑制剂相比Smad7可能甚至是更强的抗癌/抗转移剂。Smad7已表现出预防血管生成和纤维化生成,并且因此可在其中肿瘤需要发展血液供应和/或间质的情况下特别有用。
癌症可选自脑癌、肺癌、肝癌、脾癌、肾癌、***癌、小肠癌、胰腺癌、血细胞癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌、***癌、睾丸癌、子***、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌、食管癌、骨髓癌和血癌。癌症可以是转移性或原发性的、复发性或多重抗药性的。在一些实施方案中,所述癌症是实体瘤(器官肿瘤)。实体瘤是指在器官***中生长并可在身体任何地方出现的大量细胞。两种类型的实体瘤包括出现在器官内部或外部的上皮组织中的上皮肿瘤(癌)和出现在***中的肉瘤(***肿瘤),所述***例如但不限于肌肉、肌腱、脂肪、神经以及支撑、围绕或连接身体内结构和器官的其他***。在一些实施方案中,癌症是液体瘤或血癌、骨髓癌或***癌。这些肿瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在癌症治疗的背景下,本公开内容的Smad7构建体可用于治疗和预防癌症的继发作用,所述继发作用通常由癌症或癌症治疗诱导的炎性病症或伤口引起,例如肺癌患者中的肺纤维化。
6.瘢痕形成、纤维化和异常愈合
除加速再上皮化(例如,通过提高细胞增殖和/或提高细胞迁移)之外,PTD-Smad7(203至426)或Tat-Smad7(203至426)对伤口基质的作用还包括降低炎症、血管生成或胶原蛋白产生等中的一种或更多种等。尽管不希望受到理论的束缚,但可通过降低NF-κB信号传导(通过降低的p50证明)和阻断TGF-β信号传导(通过降低的pSmad2证明)来介导这些作用。作为结果,降低的炎症可显著有助于加速伤口愈合,任选地通过降低血管生成和胶原蛋白产生和/或降低白细胞浸润,导致降低通常由白细胞释放的细胞因子和趋化因子,其是促血管生成的和促纤维生成的。用PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))进行暂时治疗可允许伤口修复所需的早期血管生成和胶原蛋白产生,同时防止延长的血管生成和胶原蛋白产生。这些变化可潜在地加速伤口基质重塑并防止由于非消散性炎症或胶原蛋白过度产生引起的过度瘢痕形成。在用本公开内容的PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))蛋白构建体治疗之后降低的炎症也可有效治疗、预防和/或改善肺纤维化。
因此,本公开内容还提供了用于治疗患有肺纤维化的对象的方法,其包括向对象施用有效量的本文中公开的PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))蛋白质融合构建体,从而治疗肺纤维化。对象可患有间质性肺纤维化(ILF)。对象可患有导致肺纤维化的放射性肺炎。对象可患有药物诱导的肺纤维化。类似地,本公开内容的方法还提供了PTD-Smad7及其生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))蛋白质融合构建体或者编码其的核酸分子用于制造治疗肺纤维化的药物的用途。在一些实施方案中,肺纤维化是ILF。在一些实施方案中,肺纤维化是药物或辐射诱导的肺纤维化。
7.口炎
口炎是口中任何结构的黏膜内层的炎症,所述结构可涉及颊、齿龈、舌、唇、喉和口顶或口底。因此,口炎包括复发性口疮性口炎(“口疮”)。炎症可由口本身中的状况,例如口腔卫生不良、膳食蛋白质缺乏、义齿拟合不良引起,或者由于热食或热饮引起的口灼伤、有毒植物引起,或者由于影响全身的状况,例如药物、变应性反应、放射治疗或感染引起。重度缺铁性贫血可导致口炎。铁对细胞复制和修复的转录元件的上调是必需的。缺铁可导致这些元件的遗传性下调,导致上皮细胞的无效修复和再生,特别是在口和唇中。这种情况在缺乏维生素B2(核黄素)、B3(烟酸)、B6(吡哆醇)、B9(叶酸)或B12(钴胺素)的人中也很普遍。当其还涉及牙龈(齿龈)的炎症时,称为龈口炎。其也可能见于核黄素缺乏症(核黄素缺乏)或中性粒细胞减少症中。
唇角的刺激和裂纹被称为口角炎(angular stomatitis)或口角唇炎(angularcheilitis)。在儿童中,口角炎是反复舔唇的常见原因并且在成年人中,其可能是潜在的缺铁性贫血或维生素B缺乏(例如B2-核黄素、B9-叶酸或B12-钴胺素)的体征,这反过来可能是不良饮食或营养不良(例如乳糜泻(celiac disease))的迹象。同样,由于无牙颌或牙齿磨损,口角唇炎可由患者在静态时的颌“过度闭合”而导致,这导致颌比在存在完整/未受影响的牙列的情况下更紧密地靠在一起。这导致口角周围通过唾液保持湿润的皮肤皱褶,转而有利于感染;主要通过白色念珠菌(Candida albicans)或类似物种感染。治疗通常包括表面施用制霉菌素或类似的抗真菌剂。另一种治疗可以是用牙科治疗(例如,假牙或咬合调节)来矫正颌关系。
游走性口炎是其中口腔黏膜中的广泛区域受薄的白色边缘包围的环状萎缩性红色病变影响的病症。这是地图样舌病症的相对不常见的形式,与游走性口炎相反,其仅局限于舌黏膜的脊部和侧部方位。
8.直肠炎
直肠炎是通向***的大肠的下末端的直肠的内层的炎症。直肠炎,即直肠内层(称为直肠黏膜)的炎症,是不舒服的并且有时有疼痛。除其他症状之外,该病症可导致直肠出血或黏液排出。直肠炎的一些原因包括但不限于:性传播疾病(sexually transmitteddisease,STD),例如在***期间可能传播的那些(例如淋病、衣原体、梅毒和疱疹);来自例如食源性细菌(例如沙门菌(Salmonella)和志贺菌(Shigella))的非STD感染;来自例如***或将物体或物质***直肠(例如来自灌肠剂的化学物质)的***直肠创伤;溃疡性结肠炎和克罗恩病或其他炎性肠病,可在结肠和直肠内层中引起溃疡(例如疮);放射治疗,特别是骨盆区域(例如直肠癌、卵巢癌或***癌)的放射治疗,其可导致直肠出血;抗生素,其导致丧失共生细菌,从而允许有害细菌(例如艰难梭菌(Clostridium difficile))以引起疾病。
9.变应性皮炎、特应性皮炎和接触性皮炎
特应性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)是遗传决定的、反应素(IgE)相关的慢性皮肤疾病,在美国影响约800万成年人和儿童。在AD中,皮肤干燥、易受刺激、遭受速发型超敏反应类型的变应性响应,通常是鳞状的、经常加厚、通常红色、经常被感染,有时是渗出性的并且最重要的是发痒。反应素疾病(即特应性疾病)的特征在于在遗传基础上形成IgE抗体的能力,一旦暴露于许多特定的变应原,就立即引起超敏反应,所述变应原中最突出的可能是屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus),但也包括花粉、霉菌和皮屑。多种遗传因素有助于该表型的表达。特应性易感基因包括制造数种主要组织相容性复合体(histocompatibility complex,HLA)II类分子、IL-4受体蛋白和IgE高亲和力受体蛋白的那些。
变应性皮炎是由与物质接触引起的变应性响应的表现。尽管比接触性皮炎少见,但变应性皮炎是在人中发现的最普遍的免疫毒性形式。由于其变应性性质,这种形式的皮炎是在群体中不典型的超敏反应。变应性皮炎的症状与由接触性皮炎引起的症状非常类似。变应性接触性皮炎的第一体征是在暴露部位出现皮疹或皮肤病变。根据引起皮疹的变应原类型,皮疹可能渗出、排出或结痂,并且其可能变得粗糙、鳞状化或加厚。同样,皮肤病变可能不采用皮疹的形式,但是其可包含丘疹、水疱、囊泡或甚至单纯的红色区域。由变应性皮炎引起的皮疹与由接触性皮炎引起的皮疹的主要区别在于,后者倾向局限于其中诱因接触皮肤的区域,而在变应性接触性皮炎中,皮疹更可能在皮肤上更广泛分布。变应性皮炎皮疹的另一个特征是,其通常在暴露于变应原之后一两天之后出现,与接触诱因之后立即出现的接触性皮炎不同。其他症状可包括瘙痒、皮肤发红或发炎、局部肿胀以及该区域可变得更加疼痛(tender)或发热。如果不治疗,皮肤可变暗并变得粗糙和破裂。也可能出现疼痛。
变应性皮炎的症状可持续长达一个月,然后才完全消散。一旦个体对某种物质产生皮肤反应,很可能将在其余生中一直有这种反应,并且当与变应原接触时将再次出现该症状。
在美国,接触性皮炎每年导致超过560万的医生访视,而且占所有职业病的15%至20%。80%的接触性皮炎病例是由于刺激物,而在另外20%的病例中,化合物诱导了免疫级联并被归类为变应性的。通过以低分子量分子或金属离子的形式与细胞蛋白质复合,半抗原产生接触性皮炎和皮肤的许多超敏反应。随后,将这些加工成肽并呈递在抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)的表面上,通常是朗格汉斯细胞(Langerhans cell),其为皮肤的主要APC,驻留于表皮中。一旦朗格汉斯经历成熟,其就迁移到区域***,并在主要组织相容性I类和II类分子的背景下将半抗原修饰的肽分别呈递至半抗原特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞。T细胞的抗原特异性活化构成接触敏感性响应的致敏阶段。在随后暴露于攻击阶段的半抗原之后,效应记忆T细胞迁移至带有半抗原呈递APC的外周组织。在这里抗原识别诱导T细胞表达炎症和细胞毒性的多种介质,最终导致皮炎和组织损伤。
PTD-Smad7及其一种或更多种生物活性片段和衍生物(包括但不限于PTD-Smad7(203至426)、PTD-Smad7(259至426)和PTD-Smad7(203至217))在本文中所述的一个或更多个模型中表现出活性。
10.制剂和施用途径
在考虑临床应用的情况下,制备适合于预期应用的形式的药物组合物-蛋白质、表达载体、病毒储液、蛋白质和药物是必要的。通常,这将需要制备基本上不含致热原(pyrogen)以及可对人或动物有害的其他杂质的组合物。
PTD-Smad7(和截短的变体)在用于动物模型之前被广泛纯化。使用甘油和PBS的混合物制备PTD-Smad7(和截短变体)用于表面和跨黏膜应用。
人们将通常期望使用适当的盐和缓冲剂以使递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。当将重组细胞引入到患者中时也将使用缓冲剂。本技术的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的用于细胞的载体。这样的组合物也称为接种物(inocula)。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文中使用的,“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。除非到了任何常规介质或试剂与本技术的载体或细胞不相容的程度,否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入到组合物中。
本技术的活性组合物可包含经典的药物制剂。根据本技术这些组合物的施用将通过任何常见途径进行,只要靶组织通过该途径可及即可。这样的施用途径可包括:经口、肠胃外(包括静脉内、肌内、皮下、皮内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、皮下、眶内、囊内、脊髓内、骨内和经皮)、鼻腔、颊、尿道、直肠、***、黏膜、真皮或表面(包括真皮、颊和舌下)。或者,可通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射施用。这样的组合物通常将作为上述的可药用组合物施用。特别感兴趣的是直接瘤内施用、肿瘤输注或者局部或区域性地施用到肿瘤,例如在局部或区域性脉管***或淋巴***中,或者在切除的肿瘤床中。也可通过鼻喷雾、手术植入物、内用手术涂剂(internal surgical paint)、输注泵或者通过导管、支架、球囊或其他递送装置进行施用。最有用和/或有益的施用方式可以变化,特别是根据接受体的状况和所治疗的疾病。
作为游离碱或者药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下,形式必须是无菌的并且必须存在为达到易注射性之程度的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的,并且必须针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物,以及植物油的溶剂或分散介质。例如,可通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体情况下维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等实现防止微生物的作用。在许多情况下,将优选包含等张剂,例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的活性化合物与以上列举的多种其他成分(根据需要)并入到合适的溶剂中,然后通过过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常来说,通过将多种无菌活性成分并入到包含基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,其产生来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
本文中使用的“可药用载体”包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。除非到了任何常规介质或试剂与活性成分不相容的程度,否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可并入到组合物中。
本技术的组合物可以以中性或盐形式配制。可药用盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)并且与以下酸形成:无机酸,例如如盐酸或磷酸,或有机酸,例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱,例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁,以及有机碱,例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
制剂易于以多种剂型施用。根据所治疗对象的病症,将有必要对剂量进行一些改变。在任何情况下,负责施用的人将决定用于个体对象的合适剂量。此外,对于人施用,制剂应满足FDA生物制剂标准办公室(FDA Office of Biologics standards)所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
对于经口施用,本技术的多肽可与赋形剂合并并且以不可摄入的漱口剂和洁齿剂的形式使用。预期本领域技术人员已知几乎任何丸剂或胶囊剂类型,包括例如包衣、以及时间延迟、缓慢释放等,可与本技术一起使用。可将所需量的活性成分并入到适当的溶剂(例如硼酸钠溶液(Dobell’s溶液))中来制备漱口剂。或者,可将活性成分并入到包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的抗菌洗剂中。也可将活性成分分散在洁齿剂(包括:凝胶剂、糊剂、乳膏剂、粉末剂和浆液剂)中。可将活性成分以治疗有效量添加至糊状洁齿剂中,所述糊状洁齿剂可包含水、黏合剂、研磨剂、矫味剂、发泡剂和湿润剂。
适合于经口剂量的药物组合物可采取多种形式,例如片剂、胶囊剂、囊片剂和薄片剂(包含快速溶解或泡腾),每种均包含预定量的活性剂。组合物也可以以粉末剂或颗粒剂、在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂,以及作为液体乳剂(水包油和油包水)的形式。活性剂也可作为大丸剂(bolus)、栓剂或糊剂递送。一般认为,上述剂型的制备方法在本领域中是熟知的,并且任何这样的方法将均适合于制备用于递送组合物的相应剂型。
在一个实施方案中,活性剂化合物可与可药用载剂例如惰性稀释剂或可食用载体组合经口施用。经口组合物可包装在硬壳或软壳明胶胶囊中,可压制成片剂,或者可与患者饮食中的食物直接合并。组合物和制剂的百分比可以变化;然而,优选以这种治疗上有用的组合物的物质的量使得将获得有效剂量水平。
包含活性剂化合物的硬胶囊剂可使用生理学上可降解组合物(例如明胶)制成。这样的硬胶囊剂包含化合物,并且还可包含另外的成分,包含例如惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)。包含所述化合物的软明胶胶囊剂可使用生理学上可降解组合物(例如明胶)制成。这样的软胶囊剂包含可与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的化合物。
舌下片剂被设计为非常快速地溶解。这样的组合物的一些实例包括酒石酸麦角胺、二硝酸异山梨醇酯和盐酸异丙肾上腺素。除药物之外,这些片剂的组合物还包含多种可溶性赋形剂,例如乳糖、粉末状蔗糖、右旋糖酐和甘露醇。本技术的固体剂型可任选地被包衣,并且合适的包衣材料的一些实例包括但不限于纤维素聚合物(例如乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物以及甲基丙烯酸树脂(例如以商品名可商购的那些)、玉米醇溶蛋白(zein)、紫胶和多糖。
药物制剂的散剂和颗粒剂组合物可使用已知方法制备。这样的组合物可直接施用于患者或用于制备另一些剂型,例如形成片剂、填充胶囊剂或通过向其中添加水性或油性载剂来制备水性或油性混悬剂或溶液剂。这些组合物中的每一种还可包含一种或更多种添加剂,例如分散剂或润湿剂、助悬剂和防腐剂。这些组合物中还可包含另外的赋形剂(例如,填充剂、甜味剂、矫味剂或着色剂)。
适合于经口施用的药物组合物的液体组合物可以以液体形式或以旨在使用之前用水或另一种合适的载剂重构的干燥产品的形式制备、包装和销售。
包含本文中所述的一种或更多种活性剂化合物的片剂可通过本领域技术人员容易已知的任何标准方法,例如如通过压制或模塑(molding),任选地与一种或更多种佐剂或辅助成分一起制备。片剂可任选地被包衣或刻痕,并且可被配制以提供活性剂的缓慢或控制释放。
可配制固体剂型以提供活性剂的延迟释放,例如通过施加包衣。延迟释放包衣在本领域中是已知的,并且包含该包衣的剂型可通过任何已知的合适方法制备。这样的方法通常包括在制备固体剂型(例如片剂或囊片剂)之后,施加延迟释放包衣组合物。可通过例如无气喷涂、流化床包衣、使用包衣盘等的方法进行施加。用作延迟释放包衣的材料本质上可以是聚合的,例如纤维素材料(例如,邻苯二甲酸丁酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羧甲基乙基纤维素),以及丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的聚合物和共聚物。
根据本技术的固体剂型也可持续释放(即,在延长时间段内释放活性剂),并且可以或也可以不延迟释放。持续释放组合物在本领域中是已知的,并且通常通过将药物分散在逐渐可降解或可水解的材料(例如不溶性塑料、亲水性聚合物或脂肪化合物)的基质中来制备。或者,固体剂型可用这样的材料包衣。
用于肠胃外施用的组合物包含水性和非水性无菌注射溶液剂,其还可包含另外的试剂,例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质,其使组合物与预期接受体的血液等张。组合物可包含水性和非水性无菌混悬剂,其包含助悬剂和增稠剂。用于肠胃外施用的这样的组合物可存在于单位剂量或多剂量的容器(例如如密封的安瓿瓶和小瓶)中,并且可储存在仅需要在紧接着使用之前添加无菌液体载体(例如水(注射用))的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射溶液剂和混悬剂可由前述类型的无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备。
用于直肠递送的组合物包含直肠栓剂、乳膏剂、软膏剂和液体剂。栓剂可作为活性剂与本领域通常已知的载体例如聚乙二醇组合存在。可设计这样的剂型以快速或在延长时间段内崩解,并且完全崩解的时间可在短时间(例如约10分钟)至延长时间段(例如约6小时)的范围内。
表面组合物可以是本领域中合适和容易知道的用于将活性剂递送至身体表面的任何形式,包括经皮、经颊和舌下。表面组合物的一些典型实例包括软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂和溶液剂。用于在口中施用的组合物包含锭剂。
根据这些实施方案,经口(表面、黏膜和/或真皮)递送材料还可包含乳膏剂、油膏剂、软膏剂、贴剂、脂质体、纳米粒、微粒、定时释放制剂和本领域中已知的用于递送至对象的口腔、黏膜和/或皮肤用于治疗和/或预防本文中所公开的病症的其他材料。某些实施方案涉及使用可生物降解的经口(表面、黏膜和/或真皮)贴剂递送***或凝胶状材料。这些组合物可以是液体制剂或用这些组合物的制剂处理的可药用递送***,并且还可包含活化剂/诱导剂。
可配制本公开内容的Smad7蛋白融合构建体和编码其的核酸用于气溶胶施用,特别是对呼吸道,包括鼻内施用。为了确保在液体气溶胶中合适的颗粒尺寸,可将颗粒制备为可吸入尺寸并随后并入到胶体分散体中,所述胶体分散体包含作为定量吸入器(metereddose inhaler,MDI)的抛射剂(propellant)或空气,例如在干粉吸入器(dry powderinhaler,DPI)的情况下。活性成分可与合适的抛射剂例如氯氟烃(chlorofluorocarbon,CFC)例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体一起在加压包装中提供。药物剂量可通过定量阀控制。或者,可以以干燥粉末的形式提供活性成分,例如在合适的粉末基质例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物例如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidine,PVP)中的化合物的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂型存在,例如在例如明胶的胶囊或药筒中或者泡罩包装中,从中可通过吸入器方式施用粉末。或者,为了避免担心制剂中合适的颗粒尺寸,制剂可以以溶液剂的形式制备。然而,溶液剂制剂必须以产生可吸入尺寸的颗粒或液滴的方式分配。对于MDI应用,将气溶胶制剂填充至配备有定量阀的气溶胶罐中。在患者或对象的掌握下,制剂通过适于将剂量从阀引导至患者或对象的执行器(actuator)分配。
通常来说,用于气溶胶施用的制剂可通过组合以下来制备:(i)足以提供多种治疗有效剂量的量的所选择的一种或更多种药物;(ii)足以推进多种剂量(例如从气溶胶罐)的量的所述液体(例如抛射剂);(iii)任选地,以有效进一步稳定每种制剂的量添加的水;以及(iv)任何其他任选的组分,例如作为助溶剂的乙醇;并分散组分。可使用常规的混合器或均化器,通过摇动或通过超声能量以及通过使用珠磨机或微流化器来分散组分。通过使用阀到阀转移方法、压力填充或通过使用常规的冷填充方法,可将大体积(bulk)制剂转移至较小的单个气溶胶小瓶中。混悬气溶胶制剂中使用的组分不要求可溶于流体载体,例如抛射剂。不能充分溶解的组分可用适当量的聚合物溶解控制剂进行包衣或凝结,并随后可将包衣的颗粒并入到上述制剂中。适合用于本发明的聚合物溶解控制剂包括但不限于聚丙交酯乙交酯共聚物、丙烯酸酯、聚酰胺基胺、经取代或未经取代的纤维素衍生物,以及其他天然来源的碳水化合物和多糖产物,例如玉米醇溶蛋白和壳聚糖。
用于本技术方法的组合物也可经皮施用,其中将活性物质并入到适于与接受体的表皮保持延长时间段紧密接触的层状结构(通常称为“贴剂”)中。通常,这样的贴剂可作为单层“黏合剂中的药物”贴剂或作为其中活性剂包含在与黏合层分离的层中的多层贴剂使用。两种类型的贴剂通常还包含背层(backing layer)和衬里(liner),所述衬里在附着于接受体的皮肤之前被移除。经皮药物递送贴剂还可由位于背层下面的通过半透膜和黏合层与接受体的皮肤分开的储集层(reservoir)构成。经皮药物递送可通过被动扩散、电转运(electrotransport)或离子电渗治疗(iontophoresis)发生。
在某些实施方案中,本文中考虑的贴剂可以是缓慢溶解或定时释放的贴剂。根据这些实施方案,缓慢溶解贴剂可以是藻酸盐贴剂。在某些实例中,贴剂可包含可检测的指示剂染料或试剂,例如荧光剂。在另一些实施方案中,标签(例如,可检测标签,例如生物素或荧光标签试剂)可与治疗分子缔合以在递送至对象之后检测该分子。在某些实施方案中,根据由卫生专业人员评估的对象的需要,可每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每周等向对象施用本文中所考虑的一种或更多种经口递送贴剂或其他治疗。本文中考虑的贴剂可以是经口可生物降解贴剂或者可以降解或可以不降解的外用贴剂。根据需要,本文中考虑的贴剂的尺寸可以是1mm、2mm、3mm、4mm至5mm或更大。另外,本文中考虑使用皮肤贴剂用于例如患有银屑病的对象。在治疗银屑病和慢性伤口时,可使用载剂例如甘油、羧甲基纤维素表面递送Smad7。其也可使用经皮***(例如,从3M可商购)用于递送。也可使用皮下注射到病变中(在生理盐水或PBS中)。
在一些实施方案中,组合物可包含短期、快速起效、快速失效、控制释放、持续释放、延迟释放和脉冲释放组合物,只要该组合物实现如本文中所述化合物的施用即可。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed.;Mack Publishing Company,Eaton,Pennsylvania,1990),通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方案中,本文中公开的化合物和组合物可通过医疗装置递送。这样的递送通常可通过任何可***或可植入的医疗装置进行,包括但不限于支架、导管、球囊导管、分流器或线圈。在一个实施方案中,本技术提供了医疗装置,例如表面包衣有本文中所述的化合物或组合物的支架。可例如在用于治疗、预防或以其他方式影响疾病或病症(例如本文中公开的那些)的进程的任何应用中使用本技术的医疗装置。
考虑本领域中已知的任何分子生物学、细胞生物学或生物化学技术均可用于产生和/或测试本文中提供的治疗。另外,考虑了蛋白质化学技术来评估在本文中开发的模型***(例如,小鼠模型***)中治疗的效用。
11.组合治疗
在多种医学领域中,通常用多种治疗形式(通常称为“组合治疗”)来治疗疾病。本文中所述的许多疾病(例如炎性疾病和癌症)也不例外。在一些实施方案中,为了使用本技术的方法和组合物治疗炎性病症,将使靶细胞、器官或对象与Smad7蛋白、表达构建体或活化剂以及至少一种其他治疗接触。这些治疗将以有效实现一种或更多种疾病参数的降低的组合量提供。该过程可涉及使细胞/对象同时与药剂/治疗二者接触,例如使用包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂,或通过使细胞/对象同时与两种不同的组合物或制剂接触,其中一种组合物包含Smad7药剂且另一种包含其他药剂。
或者,Smad7药剂可以以数分钟至数周的间隔在其他治疗之前或之后。通常应保证每次递送时间之间不会中断一段显著的时间,使得治疗将仍能够对细胞/对象产生有利的组合作用。在这种情况下,考虑应在相隔约12至24小时内、相隔约6至12小时内或仅约12小时的延迟时间内使细胞与两种形式接触。在一些情况下,可期望显著延长治疗时间段;然而,在这种情况下在相应的施用之间推移数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还可想到Smad7药剂或另一种治疗的多于一次施用是期望的。可使用多种组合,其中Smad7药剂为“A”并且其他治疗为“B”,如下所示:
提供了其他组合。适用于针对炎性病症组合治疗的其他药剂包含类固醇、糖皮质激素、非固醇类抗炎药(non-steriodal anti-inflammatory drugs,NSAIDS;包含COX-1和COX-2抑制剂)、阿司匹林、布洛芬和萘普生。镇痛药通常与抗炎药相关,但其没有抗炎作用。一个实例是对乙酰氨基酚(paracetamol),在美国称为醋氨酚(acetaminophen)并以泰诺(Tylenol)品牌名出售。与通过抑制COX酶而降低疼痛和炎症的NSAIDS相反,对乙酰氨基酚最近被证明阻断了内源性***素的再摄入,这仅降低疼痛,可能解释了为什么其对炎症的影响最小。用于组合使用的特定药剂是抗TGF-β抗体。
技术人员受Remington’s Pharmaceutical Sciences,第15版,第33章,特别是第624至652页的指导。根据所治疗对象的病症,将有必要对剂量进行一些改变。在任何情况下,负责施用的人将确定用于个体对象的合适剂量。此外,对于人施用,制剂应满足FDA生物制剂标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
还应该指出的是,任何前述治疗可证明自身可用于治疗炎症中。
如上所讨论的,本技术与由某些抗癌治疗引起的DNA损伤和/或炎症的治疗特别相关,并且用于治疗癌症。因此,特别地,本技术可作为与癌症治疗的组合施用。该过程可能涉及使细胞、器官或患者与药剂/治疗同时接触,包括通过使细胞、器官或患者与包含两种药剂的单一组合物或药理制剂接触,或者与两种不同的组合物或制剂同时接触,其中一种组合物包含Smad7药剂,且另一种包含其他药剂。或者,类似于上述图表,组合物可在不同时间递送,包括一种或两种药剂的重复剂量。
适合于组合治疗的药剂或因素包含在向细胞施用时诱导DNA损伤的任何化学化合物或治疗方法。这样的药剂和因素包括诱导DNA损伤的辐射和波,例如辐照、微波、电子发射等。多种化学化合物(也称为“化学治疗剂”或“基因毒性剂”)旨在用于本文中公开的组合治疗方法中。在根据本技术治疗癌症时,除表达构建体之外,使肿瘤细胞与药剂接触。这可通过对局部肿瘤部位进行辐照来实现;或者,可通过向对象施用治疗有效量的药物组合物来使肿瘤细胞与药剂接触。
提供了用于与本技术的肽组合使用的多种种类的化学治疗剂。例如,选择性***受体拮抗剂(selective estrogen receptor antagonist,“SERM”),例如他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬(Afimoxfene)、氟维司群(Falsodex)、雷洛昔芬(Raloxifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、氯米芬(Clomifene)、Femarelle、拉索昔芬(Lasofoxifene)、奥美昔芬(Ormeloxifene)和托瑞米芬(Toremifene)。
预期有用的化学治疗剂包含,例如喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C。本技术还涵盖使用一种或更多种DNA损伤剂(无论是基于辐射还是实际的化合物)的组合,例如使用X射线与顺铂或使用顺铂与依托泊苷。如上所述,所述药剂可通过将其与MUC1肽组合来制备并用作组合的治疗性组合物或试剂盒。
热休克蛋白90是在许多真核细胞中发现的调节蛋白。已经显示出HSP90抑制剂可用于癌症的治疗。这样的抑制剂包含格尔德霉素(Geldanamycin)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀(Rifabutin)。
还设想了直接交联DNA或形成加合物的药剂。可使用例如顺铂的药剂和其他DNA烷化剂。顺铂已广泛用于治疗癌症,其中临床应用中使用的有效剂量为20mg/m2持续5天,每三周一次,总共三个疗程。顺铂经口不吸收并且因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。
损伤DNA的药剂还包含干扰DNA复制、有丝***和染色体分离的化合物。这样的化学治疗化合物包含阿霉素(也称为多柔比星)、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素(podophyllotoxin)等。在治疗赘生物(neoplasm)的临床环境中广泛使用的这些化合物通过以下施用:对于多柔比星,以21天为间隔,以25至75mg/m2的剂量静脉内推注注射(bolusinjection)施用;对于依托泊苷,以35至50mg/m2静脉内或以双倍静脉内剂量经口施用。还考虑了微管抑制剂,例如紫杉烷。这些分子是由红豆杉(Taxus)属植物产生的二萜,并且包含紫杉醇和多西他赛。
表皮生长因子受体抑制剂,例如易瑞沙(Iressa),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR,也称为FK506结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白1(FK506-binding protein 12-rapamycinassociated protein 1,FRAP1),是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成和转录。因此,根据本技术,提供了雷帕霉素及其类似物(“类雷帕霉素(rapalog)”)用于组合癌症治疗。
与本文中要求保护的肽一起的另一种可能的组合治疗是TNF-α(肿瘤坏死因子-α),其是参与全身炎症的细胞因子和刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡细胞死亡、诱导炎症以及抑制肿瘤发生和病毒复制。
破坏核酸前体和亚单位的合成和保真度的药剂也导致DNA损伤。因此,已经开发了许多核酸前体。特别有用的是经历广泛测试并且容易获得的药剂。因此,一些药剂,例如5-氟尿嘧啶(5-FU)优先被赘生性组织使用,使得该药剂特别可用于靶向赘生性细胞。尽管5-FU具有相当大的毒性,但可应用于多种载体,包括表面,然而通常使用以3至15mg/kg/天的剂量静脉内施用。
引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ-射线、x射线和/或向肿瘤细胞直接递送的放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素,例如微波和UV-辐照。最可能的是所有这些因素对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的损伤。x射线的剂量范围为50至200伦琴的日剂量持续延长时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大,并且取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄入。
技术人员受Remington’s Pharmaceutical Sciences,第15版,第33章,特别是第624至652页的指导。根据所治疗对象的病症,将有必要对剂量进行一些改变。在任何情况下,负责施用的人将确定用于个体对象的合适剂量。此外,对于人施用,制剂应满足FDA生物制剂标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
在另一些实施方案中,为了评估Smad7在口腔黏膜炎背景下的作用和机制,开发了“基因开关”转基因小鼠模型以允许控制特定地在口腔上皮中的Smad7转基因表达的水平和持续时间。根据这些实施方案,这些模型可用于测试其他基因或下游分子对口腔上皮和口腔黏膜的作用。因此,这些模型可用于但不限于对口腔伤口愈合生物学进行进一步分析和测试口腔伤口愈合的治疗方法。在这些研究中鉴定的分子Smad7靶标可为患有口腔黏膜炎的对象提供另外的治疗靶标。本文中开发的模型和资源可为分析研究提供独特的工具,以鉴定与Smad7过表达和控制相关的生物标志物和治疗靶标,例如,可将由Smad7开启或结合的下游分子鉴定为另外的治疗靶标,例如以治疗口腔黏膜炎、银屑病和由TGF-β活性和NF-κB活性而加剧的其他病症。
D.试剂盒
在某些实施方案中,本文中提供的试剂盒可包含以上讨论的用于治疗患有本文中提供的病症的对象的组合物,所述病症例如但不限于口腔黏膜炎、银屑病或伤口愈合。试剂盒可包含含有本技术的治疗性Smad7组合物的一个或更多个容器。任何试剂盒通常将包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器,组合物可优选地和/或适当地等分到其中。本文中的试剂盒还可包含用于评估有助于本文中提供的病症的生物学靶标的试剂盒。
E.预测或评价响应的方法
还提供了使用通过评估与暴露于Smad7相关的一种或更多种标志物的表达水平来预测和/或评价对用Smad7治疗的响应的方法。这样的标志物可包括但不限于对于细胞迁移的Rac1、对于炎症的NF-κB和对于生长阻滞和炎症的TGF-β。如在一些实施例中讨论的,在本领域中提供和/或已知与Smad7活性相关的一种或更多种标志物的水平的检测方法和/或改变。在一些实施方案中,可评估一种或更多种Smad7标志物在对象中的表达水平,并且基于所检测的水平,可做出决定用Smad7治疗(或继续或终止治疗)或者使用替代治疗。
如本文中使用的术语“检测”是指在一些可重复和受控水平下测量标志物的存在与否的能力。通常,检测是在背景值上进行的,所述背景值可包含测试***中固有的噪声(或检测极限)。因此,通常存在与测定相关检测的“下限”,并且为了被检测到,变化例如可能需要高于某个截止水平。确定这样的极限是本领域中公知的。
在一些实施方案中,与对照比较进行检测,其可包括但不限于与来自缺乏对象(或所测试的对象的特定组织)中所存在的疾病或病症的正常对象和/或可比的正常组织(在相同或不同对象中)的数据进行比较。在一些实施方案中,比较可以是在患者中在多个时间间隔(和/或位置)处检测到的水平之间的比较。在一些实施方案中,与背景或对照水平相比,检测需要在统计学上显著;评估显著性的能力在本领域中是公知的,并在实施例中例证。
如本文中使用的术语“水平的变化”是指从对照或背景水平和或先前检测到的水平的可检测变化。在一些实施方案中,与另一水平相比该变化是提高,并且在一些实施方案中,与另一水平相比该变化是降低。在一些实施方案中,可检测的变化(提高或降低)在统计学上显著。在一些实施方案中,可将这种变化定量地评估为至少约5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%或更大变化,和/或约5%至10%、10%至25%、10%至50%、25%至50%、50%至75%、50%至100%、100%至150%、100%至200%、200%至300%、300%至500%或500%至1000%变化。
F.筛选另外的生物活性片段的方法
在另一方面中,考虑了筛选Smad7的另外的生物活性片段(包括但不限于截短)的方法。在一些实施方案中,可使用本文中所述的方法之一(包括下文所述的那些)来评估生物活性。可评估的一些生物活性包括但不限于提高细胞增殖、降低或抑制细胞死亡、降低过度炎症、防止DNA损伤和/或提高细胞迁移,以及治疗或预防一种或更多种疾病或障碍的动物模型,其中如本文中进一步讨论的这样的治疗将是有帮助的。可使用一种或更多种测定来评估这样的活性,包括但不限于阻断Smad2磷酸化和/或NF-κBp50亚基核易位;提高细胞增殖;降低凋亡和/或辐射诱导的DNA损伤;降低炎症和/或血管生成;促进口腔黏膜炎、手术伤口、糖尿病伤口和/或小鼠和其他实验室模型中与慢性炎症相关的伤口愈合的能力。一些特定的实例包括但不限于免疫荧光(immunofluorescence,IF)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和用于凋亡的TUNEL测定。
在一些实施方案中,生物活性片段是被选择以包含本文中所述的一种或更多种或所有活性的那些。在一些实施方案中,选择生物活性片段以包含仅或主要1种、仅或主要2种、仅或主要3种、仅或主要4种、或者仅或主要5种的本文中所述的活性。在一些实施方案中,选择生物活性片段以排除仅或主要1种、仅或主要2种、仅或主要3种、仅或主要4种、或者仅或主要5种的本文中所述的活性。在一些实施方案中,选择生物活性片段以包含或排除本文中所述的活性的特定子集。例如,提高增殖和迁移可能足以治疗糖尿病伤口,而慢性炎症伤口中需要抗炎作用。治疗口腔黏膜炎需要降低细胞凋亡和DNA损伤活性,但治疗手术伤口不需要。
如本文中使用的术语“主要包含”是指这样的片段,其中尽管可能保留了一定水平的其他生物活性,但是与全长片段相比,该活性是降低的,而被认为是“主要”的活性以与在全长天然蛋白质中观察到的大致相同或提高的水平被保留。类似地,如本文中使用的术语“主要排除”是指这样的片段,其中尽管可能保留了一定水平的特定生物活性,但是与全长片段相比,该特定活性的水平是降低的(任选地显著降低和/或统计学上显著降低),而一种或更多种其他生物活性保留与在全长天然蛋白中观察到的大致相同或提高的水平。
在涉及选择生物活性片段的一些实施方案中,所述方法包括评估一种或更多种生物活性的表达水平的变化(包括在所选片段中一种或更多种活性的提高和降低),如参照在全长蛋白质中观察到的活性的变化来评估。在一些实施方案中,选择一种或更多种生物活性以保留与在全长片段中观察到的相同的生物活性,而其他活性可提高或降低或甚至消除(例如,这样的片段将缺少所讨论的一种或更多种活性)。在一些实施方案中,与另一水平相比该变化是提高,并且在一些实施方案中,与另一水平相比该变化是降低。在一些实施方案中,可检测的变化(提高或降低)在统计学上显著。在一些实施方案中,可将这样的变化定量地评估为至少约5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%或更大变化,和/或约5%至10%、10%至25%、10%至50%、25%至50%、50%至75%、50%至100%、100%至150%、100%至200%、200%至300%、300%至500%或500%至1000%变化。在一些实施方案中,仍然可观察到“保持相同”的活性相对于全长蛋白质的活性具有一些变化,但是这样的变化可被限制为例如约1%、2%、5%、10%或20%变化或更少。
在一个非限制性实例中,目的片段可包含主要介导Smad7的抗炎作用的那些。具有这种抗炎功能的Smad7肽对于治疗慢性炎症相关的病症,例如但不限于口腔黏膜炎、口炎和银屑病等可能是足够的,并且任选地是一种改善。在另一个非限制性实例中,目的片段可包含主要介导细胞迁移和/或阻断TGF-β诱导的生长阻滞和/或纤维化反应的那些。具有这种细胞迁移和增殖功能的Smad7肽对于增强与过度炎症无关的愈合可能是足够的,并且任选地是一种改善。可从这种治疗形式中受益的伤口类型包括但不限于手术伤口、纤维化瘢痕和糖尿病伤口、缺陷性愈合和/或瘢痕形成(包括瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成)等。
G.产生Smad7蛋白的方法
在另一方面中,考虑了产生Smad7蛋白,包括本文中所述的任何Smad7变体、片段、截短、融合蛋白(例如,PTD-Smad7)的方法。发明人发现了以足以用于研究、开发或商业化的水平和纯度产生Smad7蛋白的方法,包括核酸密码子优化。作为结果,明确考虑了用于产生Smad7的方法,其包括使用一种或更多种本文中所述的密码子优化的Smad7核酸分子(例如,在实施例中)。
实施例
包括以下实施例来举例说明多个实施方案。本领域技术人员应理解,在随后实施例中公开的技术表示发现在要求保护的方法、组合物和装置的实践中运行良好的技术。然而,根据本公开内容,本领域技术人员应理解,在不脱离本技术的精神和范围的情况下,可对所公开的一些具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或类似的结果。
发明人之前开发了包含与来自HIV-1 Tat蛋白的小肽融合的人Smad7的生物制品,其在接触之后快速渗透细胞(Han G,Bian L,Li F,Cotrim A,Wang D,Lu J,etal.Preventive and therapeutic effects of Smad7 on radiation-induced oralmucositis.Nat Med.2013;19(4):421-8;美国专利申请No.14/773,167,公开No.US 2016/0039894,以其整体并于本文)。此后,发明人制造了数个Tat-Smad7截短变体(美国专利申请No.15/208,424,美国公开No.2017/0000851),并表明其通常保留全长Tat-Smad7构建体的一些,但不是全部活性。另外,如可预期的活性通常低于全长Tat-Smad7构建体的活性,推测是由于三级结构的变化、降解特性或缺少与蛋白质的其他部分的相互作用,例如提供在细胞核和胞质之间运输的能力的序列。
图1B总结了Tat-PY-C-Smad7的多功能性质的潜在分子机制。
相反,发明人出乎意料地发现,包含人Smad7氨基酸203至426aa的Tat-PY-C-Smad7比US 2016/0039894中所述的Tat-Smad7片段构建体具有显著更高的生物活性。这种新的构建体Tat-PY-C-Smad7在多种医学适应证中也出乎意料地具有与全长Tat-Smad7类似或更好的活性。该发现是完全出乎意料的,因为发明人的先前数据均未提供任何迹象表明,与全长人Smad7-Tat融合构建体相比,在该融合构建体中连接的人Smad7的氨基酸203至426aa片段将具有显著更高或甚至显著不同的治疗活性。
实施例1:Tat-PY-C-Smad7融合蛋白在口腔黏膜炎中表现出活性
Tat-PY-C-Smad7融合蛋白的治疗潜力最初在辐射诱导的口腔黏膜炎中进行测试。在颅面辐射(18Gy)之后第6天开始,当经辐照的口腔黏膜开始发生口腔黏膜炎时,每天将Tat-PY-C-Smad7(1μg/小鼠)直接施加至小鼠口腔(Han G,et al.,Nat Med.2013;19(4):421-8,同上)。在第10天,取口腔组织用于病理性评价。组织学显示载剂组具有带有大量浸润炎性细胞的溃疡(图2A,左图)。Tat-PY-C-Smad7处理显著降低了溃疡尺寸和炎症(图2A,右图)。此外,在邻近溃疡的黏膜中Tat-PY-C-Smad7提高了增殖(BrdU+细胞)并降低了对磷酸-H2AX(pH2AX)+病灶(DNA损伤)呈阳性的细胞(图2B、2C)。Tat-PY-C-Smad7还降低了磷酸化的Smad2(pSmad2),pSmad2是TGF-β信号传导下游的受体活化的Smad,其被易位进入到细胞核内以调节促进口腔黏膜炎发生的靶基因的转录(图2D)。
实施例2:Tat-PY-C-Smad7融合蛋白在辐射诱导的皮炎中表现出活性
发明人还在小鼠中测试了在辐射诱导的皮炎中的Tat-PY-C-Smad7处理。用35Gy辐照小鼠腿。到第11天,当皮肤开始发生皮炎时,将Tat-PY-C-Smad7(1μg/小鼠)或PBS(载剂)每隔一天注射到病变皮肤中直至第27天。尽管辐射诱导的组织损伤机制在口腔黏膜炎与皮炎中类似,但是后者还具有由大量炎症诱导的表皮增生/增殖以及在来自载剂处理的对照小鼠的皮肤中证实的溃疡和明显纤维化(图3A,左图)。通过Tat-PY-C-Smad7处理减轻了这些病理性特征(图3B,右图)。
实施例3:Tat-PY-C-Smad7融合蛋白在银屑病、特应性皮炎和抑制纤维化中表现出活性
发明人先前在患有重度皮肤银屑病的C57BL/6或ICR背景中产生了K5.TGFβ1转基因小鼠。这些小鼠由于重度的瘙痒相关的消瘦综合征在六(6)个月内死亡(Li AG,Wang D,Feng XH,Wang XJ.Latent TGFbeta1 overexpression in keratinocytes results in asevere psoriasis-like skin disorder.EMBO J.2004;23(8):1770-81)。将Tat-PY-C-Smad7皮下注射(subcutaneously,s.c.)(2μg/小鼠,3次/周)至K5.TGFβ1病变皮肤中。在第10天,通过总体检查,Tat-PY-C-Smad7处理治愈了病变(图4A),而未处理的病变继续恶化。Tat-PY-C-Smad7最早在处理之后第6天就显著减轻了皮肤炎症,其中组织学表明处理最早在处理之后第13天就降低了表皮增生、炎症和纤维化响应(图4B)。未观察到明显的毒性作用。
Tat-Smad7(203至426)的治疗作用比最近的出版物(Li et al.,Journal ofInvestigative Dermatology,doi:10.1016/j.jid.2018.10.031.[Epub ahead of print]PMID:30423327)中示出的全长Tat-Smad7更快和更好。由发明人领导的这项研究表明,在该模型中全长Tat-Smad7花费18天来表现出在K5.TGFβ1皮肤中皮肤炎症的总体减轻并且花费28天来完全逆转皮肤炎症。
当这些K5.TGFβ1转基因小鼠表现出例如在伤口中存在肥大细胞浸润,如图4C(左图)中时,其还可作为用于接触性皮炎或特应性皮炎的模型。发现Tat-Smad7(203至426)在第13天降低了肥大细胞的数目(右图),表明了其在处理接触性皮炎或特应性皮炎中的效用。
发明人还研究了Tat-PY-C-Smad7融合蛋白在体外对成纤维细胞增殖的活性。将原代人皮肤成纤维细胞与2.5μg/ml、5.0μg/ml和7.5μg/ml的Tat-Smad7(203至426)或与单独的载剂(PBS)一起培养约9天。与载剂处理的对照相比,5μg/ml和7.5μg/ml的Tat-PY-C-Smad7显著降低了成纤维细胞扩增,这与Tat-PY-C-Smad7在体内的抗成纤维细胞活化和抗纤维化作用一致(图6)。
实施例4:Tat-PY-C-Smad7融合蛋白在糖尿病伤口中表现出活性
在糖尿病(db/db)伤口愈合的小鼠模型中评估了Tat-Smad7(203至426)活性。在紧接着穿刺活检以产生伤口(第0天)之后开始每隔一天表面施加Tat-Smad7(203至426),1μg/伤口。到第10天在PBS处理的伤口(对照)中未观察到愈合,但是相比之下,Tat-Smad7(203至426)处理的伤口从第8天开始就有明显的愈合,并且大多数伤口到第10天就已愈合(图7A)。H&E染色的皮肤切片的组织学支持该结果,其在PBS处理的伤口中显示出未愈合的伤口形态以及通过Tat-Smad7(203至426)处理的愈合伤口。出乎意料地,在如下表中总结的在12天的比较中,Tat-Smad7(203至426)也表现出比FDA批准的用于治疗糖尿病足伤口的药物RegranaxTM明显更好,下表总结了在用载剂对照(PBS)、RegranexTM(每隔一天表面施加)和Tat-Smad7(203至426)(每隔一天表面施加)所处理的糖尿病小鼠的伤口愈合率。处理和对照(P=0.03,第10天;P=0.02,第12天)以及Regranax组(P=0.014,第12天)中的愈合小鼠的数目之间的差异是显著的。
Tat-Smad7(203至426)也表现出比全长Tat-Smad7更好,后者的作用在处理10天之后明显并在第13天完全愈合(参见WIPO专利申请No.PCT/US2014/022052,公开为WO/2014/138670,2014年3月7日提交,其通过引用以其整体并入本文)。
实施例5:Tat-Smad7在辐射诱导的皮炎中表现出活性
在小鼠模型中评估了全长Tat-Smad7对辐射诱导的皮炎的治疗作用。如上所述,皮炎是由对小鼠腿进行35Gy辐射诱导的。在辐射之后第7天开始,3次/周皮下注射Tat-Smad7(1μg/小鼠)。每天使用由癌症治疗评价计划(Cancer Therapy Evaluation Program)建立的评分标准对皮炎的严重程度(皮炎评分)进行评估,表明到第18天经Tat-Smad7处理的小鼠具有显著较少的严重皮炎。*:p<0.05(图8A)。评估在第18天收获的皮肤活检物Tat-Smad7的存在(图8B)。使用对Tat-Smad7具有特异性的抗体的免疫荧光染色显示Tat-Smad7(浅灰色)渗透到真皮细胞和表皮细胞二者中。K14抗体染色(深灰色)突出了表皮。皮肤活检物也用H&E染色用于组织学,其表明经处理的皮肤的溃疡愈合,并且炎症和纤维化反应降低(图8C)。由于炎症,邻近溃疡的表皮增生也通过处理而降低。垂直线突出了PBS对照中未治愈的溃疡。虚线突出了经Tat-Smad7处理愈合的溃疡。
实施例6:Tat-Smad7在特应性皮炎模型中表现出活性
如上简要讨论的,在一些情况下,银屑病的小鼠模型K5.TGFβ1小鼠在存在外源病原体的情况下,也可作为接触性皮炎或特应性皮炎的模型。肥大细胞是这种疾病的标志,因为其是接触性/变应性皮炎的主要致病细胞。在该模型中,全长Tat-Smad7在完全逆转皮肤炎症之前降低了肥大细胞的数目。K5.TGFβ1皮肤经Tat-Smad7皮下(s.c.)处理,1μg/小鼠,3次/周。在处理之前(第0天)和在Tat-Smad7处理的第6天,在表皮增生和炎症逆转之前,采集皮肤活检物、将其切片并用吉姆萨(Giemsa)或甲苯胺蓝(Toluidine blue)对肥大细胞染色(图9)。经Tat-Smad7处理切片中肥大细胞数目的降低表明肥大细胞是Tat-Smad7的直接治疗靶标。
实施例7:Tat-Smad7(203至217)表现出治疗皮肤炎症和纤维化的活性
图10表明Tat-Smad7(203至217)减轻了TGFβ1诱导的皮肤炎症和纤维化。每天将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的15μg的Tat-Smad7(203至217)肽s.c.注射至K5.TGFβ1小鼠的皮肤中。未处理的K5.TGFβ1皮肤逐渐恶化,并且用单独的载剂(PBS)处理不能减轻表型。在处理之前(第0天)和处理之后(第18天)采集皮肤活检物。在处理之后2周开始,发炎的皮肤宏观上地逐渐改善,并且到第3周时总体上明显。类似的结果通过组织学观察到,其中肽处理的皮肤表现出白细胞浸润和表皮增生降低并且α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscleactin,α-SMA)(活化的成纤维细胞的标志物)降低。
实施例8:Tat-Smad7(203至217)在辐射诱导的皮炎中表现出活性
图11表明在实验小鼠模型中Tat-Smad7(203至217)促进了RT诱导的伤口溃疡的愈合。剃掉腿皮肤并使其接受30Gy辐射。RT之后第10天,受辐照的皮肤发炎并且伤口溃疡开始发生。每天将15μg Tat(对照肽)或30μg Tat-Smad7(203至217)肽皮下注射至辐照皮肤来处理皮肤伤口。具有核pH2AX(DNA损伤的标志物)的细胞在经处理皮肤中更少,并且与来自用对照肽处理的小鼠的切片相比,所述细胞在来自用Tat-Smad7(203至217)处理的小鼠的皮肤切片中更少。
实施例9:Tat-Smad7(203至217)在接触性皮炎中表现出活性
图12表明Tat-Smad7(203至217)减轻了当存在肥大细胞浸润时小鼠耳皮肤中咪喹莫特诱导的炎症,所述小鼠耳皮肤是银屑病和严重接触性皮炎的小鼠模型。每天将5%咪喹莫特乳膏施加至小鼠耳,并在一小时之后,用或不用30μg Tat-Smad7(203至217)表面处理耳。在第6天收集耳活检物。在咪喹莫特处理的耳(未处理对照)中存在大量肥大细胞,但在经Tat-Smad7(203至217)处理的耳中几乎没有肥大细胞。表皮增生在该阶段没有逆转,但是基于图10和11中所示的数据可在进一步处理之后看到。比例尺:100μm。
实施例10:Tat-Smad7(259至426)表现出治疗皮肤炎症和纤维化的活性
图13表明Tat-Smad7(259至426)减轻了TGFβ1诱导的皮肤炎症和纤维化。将在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg的Tat-Smad7(259至426)s.c.注射(3次/周)到K5.TGFβ1小鼠的皮肤中。未处理的K5.TGFβ1皮肤逐渐恶化。在处理之前(第0天)和处理之后(第19天)采集皮肤活检物。处理之后发炎的皮肤逐渐改善并且到3周时愈合总体上明显。通过组织学观察到类似的结果,因为经处理的皮肤表现出白细胞浸润和纤维化显著降低。
出于举例说明和描述的目的呈现了本技术的前述讨论。前述内容并不旨在将本技术限制为本文中公开的形式。尽管对本技术的描述已包括对一个或更多个实施方案的描述以及某些变化和修饰,但是其他变化和修饰也在本技术的范围内,例如,可在理解本公开内容之后,在本领域技术人员的技术和知识范围内。其旨在获得在允许的程度内包括替代实施方案的权利,所述权利包括对所要求保护的那些的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤,无论本文中是否公开了这样的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤,并且不旨在公开贡献任何可取得专利的主题。
Claims (100)
1.在对象中治疗或预防炎性疾病状态的方法,其包括:
向需要这样的治疗的对象施用融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸,其中所述融合蛋白包含PTD-Smad7融合蛋白。
2.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是伤口。
3.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是急性的。
4.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是慢性的。
5.权利要求2所述的方法,其中所述伤口包括瘢痕形成,瘢痕形成包括瘢痕疙瘩形成或肥厚性瘢痕形成。
6.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是糖尿病伤口。
7.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是溃疡。
8.权利要求7所述的方法,其中所述溃疡是静脉溃疡。
9.权利要求7所述的方法,其中所述溃疡是压力性溃疡。
10.权利要求7所述的方法,其中所述溃疡是口腔溃疡。
11.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是缺血的结果。
12.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗、手术或靶向治疗的结果。
13.权利要求2所述的方法,其中所述伤口是辐射毒性的结果,包括辐射诱导的皮炎或导致肺纤维化的放射性肺炎(例如由于治疗癌症的放射)。
14.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是口腔黏膜炎。
15.权利要求14所述的方法,其中所述口腔黏膜炎与通过上半身放射或重复的化学治疗周期治疗的癌症相关(“癌症治疗诱导的口腔黏膜炎”)。
16.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是自身免疫性疾病或障碍。
17.权利要求16所述的方法,其中所述自身免疫性疾病或障碍是银屑病。
18.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是皮肤炎症。
19.权利要求18所述的方法,其中所述皮肤炎症是变应性皮炎。
20.权利要求18所述的方法,其中所述皮肤炎症是特应性皮炎。
21.权利要求18所述的方法,其中所述皮肤炎症是接触性皮炎。
22.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是口炎,包括复发性口疮性口炎。
23.权利要求1所述的方法,其中所述炎性疾病状态是纤维化,包括特发性肺纤维化、间质性肺疾病、导致肺纤维化的放射性肺炎;以及纤维化肺疾病。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法,其中所述核酸是编码所述融合蛋白的表达载体。
25.权利要求24所述的方法,其中所述表达载体是病毒载体。
26.权利要求24所述的方法,其中所述表达载体是非病毒载体。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法,其中药物被配制在贴剂上、在胶状组合物中、在微球剂中、在微珠剂中、或其组合。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法,其中所述PTD是Tat。
29.权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白全身施用。
30.权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白表面施用。
31.权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白在定量吸入器内施用以用于向所述对象的肺进行气雾剂施用。
32.权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白在被配制成用于表面施用的药物组合物内施用。
33.权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、80、82、84、86、88、90、91、94、96和100的氨基酸序列。
34.包含融合蛋白的组合物,其中所述融合蛋白包含PTD-Smad7融合蛋白。
35.权利要求34所述的组合物,其中所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、80、82、84、86、88、90、91、94、96和100的氨基酸序列。
36.权利要求34所述的组合物,其中所述组合物与一种或更多种可药用赋形剂一起配制。
37.权利要求35所述的组合物,其中所述一种或更多种可药用赋形剂被选择用于表面或局部施用。
38.权利要求35所述的组合物,其中所述一种或更多种可药用赋形剂被选择用于全身施用。
39.权利要求35所述的组合物,其中所述一种或更多种可药用赋形剂被选择以施用于对象的肺。
40.权利要求35所述的组合物,其中所述一种或更多种可药用赋形剂是抛射剂。
41.权利要求35所述的组合物,其中所述一种或更多种可药用赋形剂包括用于气雾剂施用的定量吸入器,所述定量吸入器包含配备有定量阀的气雾剂筒,其中所述气雾剂筒填充有所述组合物。
42.权利要求34至40中任一项所述的组合物,其被配制成用于治疗或预防伤口,其中所述治疗包括加速上皮细胞增殖和/或迁移到所述伤口中。
43.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是急性的。
44.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是慢性的。
45.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是糖尿病伤口。
46.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是溃疡。
47.权利要求46所述的组合物,其中所述溃疡是静脉溃疡。
48.权利要求46所述的组合物,其中所述溃疡是压力性溃疡。
49.权利要求46所述的组合物,其中所述溃疡是口腔溃疡。
50.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是缺血的结果。
51.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗、手术或靶向治疗的结果。
52.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口是辐射毒性的结果。
53.权利要求42所述的组合物,其中所述伤口包括瘢痕形成。
54.权利要求30至36中任一项所述的组合物,其被配制成用于治疗或预防口腔黏膜炎。
55.权利要求54所述的组合物,其中所述组合物用于具有移植物的对象、患有癌症的对象或患有需要放射治疗的病症的对象。
56.权利要求54所述的组合物,其中所述组合物被配制成用于患有口腔癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌和用上半身放射或重复的化学治疗周期治疗的其他癌症中的一种或更多种的对象。
57.权利要求54所述的组合物,其中所述组合物被配制成用于已经历上半身放射的对象。
58.权利要求34至41中任一项所述的组合物,其被配制成用于治疗或预防自身免疫性疾病或障碍。
59.权利要求58所述的组合物,其中所述自身免疫性疾病或障碍是银屑病。
60.权利要求34至41中任一项所述的组合物,其被配制成用于治疗或预防皮肤炎症。
61.权利要求60所述的组合物,其中所述皮肤炎症是变应性皮炎。
62.权利要求60所述的组合物,其中所述皮肤炎症是特应性皮炎。
63.权利要求60所述的组合物,其中所述皮肤炎症是接触性皮炎。
64.权利要求63所述的组合物,其中所述组合物被配制成用于具有移植物的对象、患有癌症的对象或患有需要放射治疗的病症的对象。
65.权利要求63所述的组合物,其中所述组合物被配制成用于患有口腔癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌和用上半身放射或重复的化学治疗周期治疗的其他癌症中的一种或更多种的对象。
66.权利要求63所述的组合物,其中所述组合物被配制成用于已经历上半身放射的对象。
67.权利要求34至41中任一项所述的组合物,其被配制成用于治疗与一种或更多种治疗性治疗有关的炎性或组织损伤病症,其中所述治疗是化学治疗、放射治疗、细胞因子治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗或靶向治疗中的一种或更多种。
68.包含融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸的组合物在制备用于治疗或预防炎性疾病状态的药物中的用途,其中所述融合蛋白包含PTD-Smad7融合蛋白,并且其中所述融合蛋白易位至细胞核。
69.权利要求68所述的用途,其中所述炎性疾病状态是伤口。
70.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是急性的。
71.权利要求70所述的用途,其中所述伤口是慢性的。
72.权利要求69所述的用途,其中所述伤口包括瘢痕形成。
73.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是糖尿病伤口。
74.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是溃疡。
75.权利要求74所述的用途,其中所述溃疡是静脉溃疡。
76.权利要求74所述的用途,其中所述溃疡是压力性溃疡。
77.权利要求74所述的用途,其中所述溃疡是口腔溃疡。
78.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是缺血的结果。
79.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗、手术或靶向治疗的结果。
80.权利要求69所述的用途,其中所述伤口是辐射毒性的结果。
81.权利要求68所述的用途,其中所述炎性疾病状态是口腔黏膜炎。
82.权利要求81所述的用途,其中所述口腔黏膜炎与通过上半身放射或重复的化学治疗周期治疗的癌症相关。
83.权利要求68所述的用途,其中所述炎性疾病状态是自身免疫性疾病或障碍。
84.权利要求83所述的用途,其中所述自身免疫性疾病或障碍是银屑病。
85.权利要求68所述的用途,其中所述炎性疾病状态是皮肤炎症。
86.权利要求85所述的用途,其中所述皮肤炎症是变应性皮炎。
87.权利要求86所述的用途,其中所述皮肤炎症是特应性皮炎。
88.权利要求86所述的用途,其中所述皮肤炎症是接触性皮炎。
89.权利要求68所述的用途,其中所述炎性疾病状态是纤维化,包括特发性肺纤维化、间质性肺疾病、导致肺纤维化的放射性肺炎;以及纤维化肺。
90.权利要求68至89中任一项所述的用途,其中所述核酸是编码所述融合蛋白的表达载体。
91.权利要求90所述的用途,其中所述表达载体是病毒载体。
92.权利要求90所述的用途,其中所述表达载体是非病毒载体。
93.权利要求68至92中任一项所述的用途,其中所述药物被配制在贴剂上、在胶状组合物中、在微球剂中、在微珠剂中、或其组合。
94.权利要求68至93中任一项所述的用途,其中所述PTD是Tat。
95.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述药物被配制成用于全身施用。
96.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述药物包含所述融合蛋白并且被配制成用于表面施用。
97.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述药物被配制成用于局部施用至受影响区域。
98.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述药物被配制成用于表面施用。
99.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述药物在定量吸入器内施用,以用于向所述对象的肺进行气雾剂施用。
100.权利要求68至94中任一项所述的用途,其中所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、80、82、84、86、88、90、91、94、96和100的氨基酸序列。
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