CN111995669A - 一种人促卵泡激素及其体外重组装方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人促卵泡激素及其体外重组装方法，属于生物医药与基因工程技术领域。本发明提供的人促卵泡激素是将FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得，具有与Gonal‑F等同的生物学功能。制备方法包括构建人FSHα和FSHβ基因表达载体，将人FSHα和FSHβ亚基的表达在动物乳汁中，进行体外重组装获得具备生物学活性的人促卵泡激素，本发明可以避免有生物活性的内源FSH在动物体内的积聚，从而降低由于大量生物活性FSH的积累导致的动物患肿瘤的风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药与基因工程技术领域，特别是涉及一种人促卵泡激素及其体外重组装方法。
背景技术
人促卵泡生长激素(hFSH)是由下丘脑控制的垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白类***，它是一种由FSHα亚基与FSHβ亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白。其中FSHα亚基基因编码了92个氨基酸，包含10个半胱氨酸，形成5个二硫键；FSHβ亚基基因编码了111个氨基酸，其中包含12个半胱氨酸，形成6个二硫键。人促卵泡生长激素在女性体内的主要功能是促进子宫内膜的生长、卵泡的发育和***等，hFSH在临床上主要用于治疗女性***不育。
随着人类生活环境的日益恶化，hFSH的需求量越来越大。市面上主要有两种人促卵泡生长激素产品，一种是尿源的人促卵泡生长激素，另外一种是国外进口的基因工程重组人促卵泡生长激素(人促卵泡激素)蛋白，其中在国内市场的临床应用上进口重组人促卵泡生长激素占据主要市场。进口的重组促卵泡生长激素目前主要是利用基因工程技术和细胞培养工艺来制备重组促卵泡激素生物制品，如瑞士Serono公司的Gonal-F以及荷兰Organon公司的Puregon等进口的人促卵泡激素都是这类产品。然而细胞产生人促卵泡激素虽然生物活性好，纯度高，但是产量相对较低，使得这种方法制备的人促卵泡激素产品价格昂贵。
动物乳腺生物反应器被视为是一种更加优良的方法用于制备药物蛋白，具备产量高、价格低的优势。但是研究表明内源性的FSH在动物体内积聚过多，可能导致动物一系列的疾病，比如卵巢癌和乳腺癌，这是目前利用动物乳腺生物反应器制备人促卵泡激素最大的障碍。因此，探究一种避免在动物体内产生大量有生物活性的内源性FSH的方法是很有必要的，这能降低转基因动物因为内源性FSH的过多而患肿瘤的风险，同时又可以通过动物乳腺生物反应器制备大量人促卵泡激素。
发明内容
为了解决内源性FSH大量积累在动物体内的问题，本发明提供了一种人促卵泡激素，所述人促卵泡激素是FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得。
在本发明的一种实施方式中，FSHα、FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达是将Ad-FSHα、AdE-FSHβ腺病毒分别注入到动物乳腺内进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒是将FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体分别转染腺病毒包装细胞获得。
在本发明的一种实施方式中，所述FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体是将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组获得。
本发明还提供了一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，FSHα亚基与FSHβ亚基蛋白在体外重新组装，得到重组人促卵泡激素，包括以下步骤：
(1)构建人FSHα和FSHβ基因表达载体
以pAdTrack-CMV为穿梭载体，将人FSHα、FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组，获得重组腺病毒表达载体pAd-FSHα和pAd-FSHβ；
(2)人FSHα和FSHβ亚基的表达
将pAd-FSHα和pAd-FSHβ分别转染到腺病毒包装细胞中收获Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒，收获的所述Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒分别注入到非同一动物的乳腺中，获得含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁；
(3)体外组装人FSHα和FSHβ亚基蛋白
将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，使FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白在体外进行组装，组装后收集蛋白样品，得到体外重新组装的人促卵泡激素。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的动物乳汁中的FSHα亚基和FSHβ亚基蛋白不具备生物学活性。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述动物乳腺为活体牛的乳腺或者活体羊的乳腺。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，是以目的蛋白含量为1:1的浓度进行混合，体外重组装。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白体外组装是在2℃-8℃下经过24h-96h组装。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中获得的体外重新组装的人促卵泡激素具备生物活性。
在本发明的一种实施方式中，所述FSHβ基因中连接有6×His tag，便于后期体外重组装人促卵泡激素的纯化。
在本发明的一种实施方式中，所述将pAd-FSHα和pAd-FSHβ分别转染到腺病毒包装细胞，其转染方法包括阳离子脂质转染方法。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述收获的所述Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒分别注入到动物乳腺中，使用第三代腺病毒感染动物乳腺，第三代腺病毒具备更高的病毒滴度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中表达的人FSHα和FSHβ亚基蛋白为分别在不同的羊乳腺和/或牛乳腺中表达，单独的FSHα亚基蛋白和单独的FSHβ亚基蛋白都不具备生物学活性。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的FSHα和FSHβ亚基蛋白经过Westernblot检测其分子大小分别为18kD和22kD。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中组装是在2℃-8℃下组装24-96小时，FSHα亚基蛋白分子和FSHβ亚基蛋白分子自组装成完整的人促卵泡激素。
本发明有益效果在于：
(1)本发明的创新在于利用腺病毒在羊、牛乳腺中高效表达了没有生物活性的FSHα和FSHβ亚基蛋白，这让动物体内不会积累有生物活性的FSH，可以潜在降低因为内源活性FSH积累给动物带来的致病风险。
(2)无生物活性的FSHα亚基和FSHβ亚基在体外重新组装成有生物活性的人促卵泡激素，这种方法可以利用无活性的FSHα亚基和FSHβ亚基蛋白在体外制备出人促卵泡激素，可以利用转基因动物乳腺生物反应器制备大量人促卵泡激素。
(3)本发明的人促卵泡激素经过体内体外生物活性试验验证，具有与Gonal-F相当的生物学功能。
附图说明
图1 Western blot鉴定羊乳腺和牛乳腺表达的FSHα亚基蛋白
Anti-FSHα为检测羊乳腺和牛乳腺表达的FSHα亚基蛋白的单克隆抗体；
FSHα-G为羊乳腺表达的FSHα亚基蛋白，分子量大小约为18kD；
FSHα-B为牛乳腺表达的FSHα亚基蛋白，分子量大小约为18kD。
图2 Western blot鉴定羊乳腺和牛乳腺表达的FSHβ亚基蛋白
Anti-FSHβ为检测羊乳腺和牛乳腺表达的FSHβ亚基蛋白的单克隆抗体；
FSHβ-G为羊乳腺表达的FSHβ亚基蛋白，分子量大小约为22kD；
FSHβ-B为牛乳腺表达的FSHβ亚基蛋白，分子量大小约为22kD。
图3 Western blot鉴定羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重新组装
人促卵泡激素-G为羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过体外重新组装后的重组人促卵泡激素，分子量大小约为40kD；
FSHα-G为羊乳腺表达的FSHα亚基蛋白，分子量大小约为18kD；
FSHβ-G为羊乳腺表达的FSHβ亚基蛋白，分子量大小约为22kD；
Anti-FSHβ为检测FSHβ亚基蛋白的单克隆抗体。
图4 Western blot鉴定牛乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重新组装
人促卵泡激素-B为牛乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过体外重新组装后的重组人促卵泡激素，分子量大小约40kD；
FSHα-B为羊乳腺表达的FSHα亚基蛋白，分子量大小约为18kD；
FSHβ-B为羊乳腺表达的FSHβ亚基蛋白，分子量大小约为22kD；
Anti-FSHβ为检测FSHβ亚基蛋白的单克隆抗体。
具体实施方式
以下通过实施案例形式的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施案例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。
实施例1
羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重新组装成重组人促卵泡激素
(1)重组人促卵泡生长激素腺病毒载体的构建
在GenBank中检索得到人促卵泡生长激素的基因序列为中人FSHα(GenBenkaccession NO.：NP_000726.1)及FSHβ(GenBenk accession NO.：NP_000501.1)亚基基因序列，且在FSHβ基因下游增加6个组氨酸标签的基因序列便于后期纯化目的蛋白，目的基因由金斯瑞生物科技有限公司化学法合成，设计的酶切位点为BglII和HindIII，并连接到pAdTrack-CMV载体中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体，酶切及测序验证其正确性。用PmeI酶将穿梭载体线性化，切胶回收载体，将其转化到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183感受态，在含卡那霉素的LB平板上过夜生长。挑取平板上较小的菌落，扩大培养后，提取质粒，并用PacI酶切验证目的基因是否与骨架载体重组得到腺病毒载体pAd-FSHα和pAd-FSHβ/His，同时测序验证重组腺病毒载体的正确性。
(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增与滴度测定
将HEK-293A细胞复苏后传代培养，待细胞到较好状态的时候，将细胞传代到25cm2的细胞培养瓶中，确保24h后细胞汇合度为50％左右，将已经测序正确的线性化腺病毒表达载体pAdEasy-FSHα、pAdEasy-FSHβ分别和脂质体Lipofectamine 2000按照1:3(3μg质粒：9μL脂质体)的比例转染HEK-293A，转染4-6h后更换新鲜培养基。转染3天后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达，每2-3天添加少量新鲜培养基。到10-14天后，细胞几乎全部可以观察到荧光，并且细胞呈葡萄球状且大量漂起，此时可收集第一代病毒。用第一代病毒感染HEK-293A细胞，扩增后收集第二代病毒，如此反复，收集得到第三代腺病毒，用LaSRT法测定第三代腺病毒病毒滴度，并用氯化铯密度梯度法纯化腺病毒，准备用于感染羊乳腺。
(3)腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ感染羊乳腺
选择4只健康、乳腺发育良好，体重接近60kg的泌乳期奶山羊(西北农林科技大学萨能奶山羊育种基地提供)，重组腺病毒Ad-FSHα和Ad-FSHβ/His分别在两只奶山羊中乳腺内表达。用酒精和碘酒擦拭奶山羊的***以充分消毒，将***内的乳汁全部排空。用一次性输液器向奶山羊右***注入相同体积的灭菌的生理盐水作为空白对照组。48h后开始收集乳汁，之后每隔24h收集一次直至注射腺病毒第6天，收集的乳汁在4℃下12000×g离心20min去掉上层的脂肪，收集下层的乳清样品，准备用于体外重组装。
(4)Western blotting鉴定重组促卵泡生长激素在羊乳腺中的表达
制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，蛋白样品上样量为15μL，上样缓冲液为非还原上样缓冲液，电泳过程中浓缩胶用80V电压，分离胶用100V电压，待溴酚蓝距离凝胶底部约1cm处时停止电泳。将蛋白从凝胶转膜到PVDF膜上，4℃低温下用5％的脱脂奶粉过夜封闭。封闭结束后，将PVDF膜至于TBST缓冲液配置的抗FSH多克隆抗体中，在4℃条件下过夜孵育。孵育完一抗后用TBST洗膜4次，每次10min。将洗好的PVDF膜用羊抗兔HRP酶标二抗在4℃下孵育4h，然后用TBST洗膜缓冲液洗膜4次，每次10min。用ECL化学发光液显色后在化学发光成像仪中曝光，观察目的蛋白的表达情况。
(5)FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重新组装
羊乳腺表达的FSHα以及FSHβ用ELISA Kit(hCG alpha Human ELISA Kit,ThermoFisher,USA；Follicle-stimulating hormone beta subunit ELISA kit,CUSABIO,China)定量检测浓度，让FSHα和FSHβ以1:1的浓度混合在一起，置于在4℃中24-96h，让两个亚基蛋白自动组装成完整的人促卵泡激素。
(6)体外重新组装促卵泡激素蛋白的纯化
由于羊乳腺表达的蛋白含组氨酸标签，用镍柱纯化目的蛋白后用于进一步的生物活性检测。将含金属Ni的琼脂糖填料混匀后装入层析柱，静置10min后凝胶与溶液分层，缓慢排出柱中乙醇。装好柱子后向柱子中加入5倍体积的去离子水将残余乙醇冲洗干净，接着用10倍柱体积的上样缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl)平衡镍柱。平衡后准备上样，将细胞培养上清液及细胞裂解液作为样品上样，上样前需高速离心去除细胞碎片等杂质，以10倍柱体积每小时的流速过柱。样品过柱完成后，用洗杂缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.5M NaCl)冲洗柱子，洗去部分杂蛋白。根据上样蛋白量的多少用适量洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM咪唑，0.5M NaCl)将柱子上目的蛋白洗脱下来，并对洗脱的蛋白样品进行SDS Page鉴定。
(7)重组人促卵泡生长激素的体外生物学活性验证
复苏由实验室建立并且保存的HEK-293-FSHR细胞，该细胞为稳定表达人***受体(FSHR)基因的稳定细胞株。待细胞生长状态良好后，将HEK-293-FSHR细胞按照2×104个细胞/孔的密度种到96孔细胞培养板中，每个孔加入0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。细胞培养24h后，弃去孔中旧培养基，其中纯化的人促卵泡激素蛋白作为试验组、Gonal-F作为阳性对照组，分别用培养基稀释后加入到细胞中，空白组细胞只加等体积的完全培养基培养，每个组设三个复孔。细胞在培养箱培养1h后，弃去细胞上清液，裂解细胞后用cAMP试剂盒检测不同组中细胞cAMP的含量。
重组人促卵泡生长激素的体内生物学活性验证
8周龄体重接近25g的雌性昆明鼠分别注射2.5pmol、5pmol、10pmol经过纯化的体外重组装人促卵泡激素、阳性对照Gonal-F和空白对照生理盐水，每组6只昆明鼠，48h后给每只小鼠注射5IU的hCG进行促***。24h后处死小鼠，收集输卵管中***并统计分析。
对未成熟体重接近50g的雌性SD大鼠(21日龄)进行腹腔皮下注射给药。每组6只SD大鼠，SD大鼠每次注射0.5mL的1.5pmol、3pmol、6pmol的体外重组装人促卵泡激素、Gonal-F和生理盐水，每12小时注射一次，连续注射4天，同时给每只大鼠每天注射5IU的HCG(0h,24h,48h,72h)。4天后处死大鼠，解剖大鼠分离出卵巢组织称重。
本发明通过羊乳腺制备的体外重新组装人促卵泡激素蛋白大小为40kD左右，经体外和体外试验验证，体外重新组装的人促卵泡激素蛋白与商品化的重组人促卵泡生长激素Gonal-F具备等同的生物活性。
实施例2
牛乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重新组装成重组人促卵泡激素
试验所用奶为中国荷斯坦奶牛。在步骤(3)中，实施例2利用牛乳腺来表达FSHα、FSHβ亚基蛋白，实施例1使用羊乳腺，除了该点不同之处外，实施例2具体的实施步骤同实施例1步骤(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)。牛乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白蛋白大小与羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白大小一致，且在体外重新组装后的人促卵泡激素也大约为40kD，经过体外体内生物活性试验验证，其与商品化的重组人促卵泡生长激素Gonal-F相比具备相当的生物活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种人促卵泡激素，其特征在于，所述人促卵泡激素是FSHα和FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达后，在体外重组装获得。
2.根据权利要求1所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，FSHα、FSHβ亚基基因分别在动物乳汁中表达是将Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒分别注入到非同一动物的乳腺内进行表达。
3.根据权利要求2所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，所述Ad-FSHα、Ad-FSHβ腺病毒是将FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体分别转染腺病毒包装细胞获得。
4.根据权利要求3所述的一种人促卵泡激素，其特征在于，所述FSHα基因表达载体和FSHβ基因表达载体是将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组获得。
5.一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，FSHα亚基与FSHβ亚基蛋白在体外重新组装，得到重组人促卵泡激素，包括以下步骤：
(1)构建人FSHα和FSHβ基因表达载体
以pAdTrack-CMV为穿梭载体，将人FSHα、FSHβ亚基基因分别克隆到pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体，将pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ穿梭载体分别与骨架载体pAdEasy-1转化到非同一大肠杆菌体内重组，获得重组腺病毒表达载体pAd-FSHα和pAd-FSHβ；
(2)人FSHα和FSHβ亚基的表达
将pAd-FSHα和pAd-FSHβ分别转染到腺病毒包装细胞中收获Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒，收获的所述Ad-FSHα腺病毒和Ad-FSHβ腺病毒分别注入到动物乳腺中，获得含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁；
(3)体外组装人FSHα和FSHβ亚基蛋白
将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，使FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白在体外进行组装，组装后收集蛋白样品，得到体外重新组装的人促卵泡激素。
6.根据权利要求5所述的一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的动物乳汁中的FSHα亚基和FSHβ亚基蛋白不具备生物学活性。
7.根据权利要求5所述的一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，步骤(3)中将含有FSHα亚基蛋白的动物乳汁和含有FSHβ亚基蛋白的动物乳汁混合，是以目的蛋白含量为1:1的浓度进行混合，体外重组装。
8.根据权利要求5所述的一种体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白体外组装是在2℃-8℃下经过24h-96h组装。
9.根据权利要求5所述的一种通过体外重组装制备人促卵泡激素的方法，其特征在于，步骤(3)中获得的体外重新组装的人促卵泡激素具备生物活性。
10.根据权利要求5-9任一方法制备的人促卵泡激素在药物制备中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201127 |