CN111991414A - 一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途,其特征在于:(1)0.05~1%的β‑壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与SARS‑CoV‑2S‑RBD结合;(2)0.05~1%的β‑壳糖胺具有类似抗体的功能,能够中和SARS‑CoV‑2S‑RBD;(3)0.05~1%的β‑壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能;(4)0.05~1%的β‑壳糖胺能够阻止ACE2与SARS‑CoV‑2S‑RBD结合内化降解,同时抑制因SARS‑CoV‑2S‑RBD引发的炎症信号。本发明有效预防和治疗新冠肺炎。
Description
技术领域
本发明属于天然活性多糖抗病毒应用领域,涉及一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途。
背景技术
研究一种有效预防和治疗新冠肺炎产品成为全球最为紧迫工作。
目前对于新冠肺炎治疗的研究主要集中于疫苗、抗体以及便捷的新冠肺炎病毒检测方法等,但仍没有特别有效便捷的治疗药物。多项研究表明,SARS-CoV-2与SARS-CoV 使用相同受体——血管紧张素转换酶2(ACE2)进入宿主细胞,二者有相似的发病机制,即病毒与ACE2结合后诱导细胞内吞,导致ACE2降解耗竭,AngⅡ水平显著升高,最终出现炎症因子风暴和多脏器损害。很快,表达ACE2的组织器官引发关注和研究,揭示了肺、心脏、肾、食道、回肠、结肠、膀胱、睾丸均有高表达ACE2,从而推测SARS-CoV-2 很可能通过与这些ACE2阳性细胞结合,入侵并损伤患者的相关组织。周强等研究证明 SARS-CoV-2S刺突蛋白受体结合区域(SARS-CoV-2S-RBD)可通过极性氨基酸残基与ACE2 的胞外肽酶结构域(peptidasedomain)锚定在一起。Daniel Wrapp等研究表明 SARS-CoV-2S结合细胞上的ACE2受体的亲和力比SARS-CoV S高10-20倍,进一步揭示新冠病毒传染性和致病率高于SARS病毒的原因。由此可见,探寻SARS-CoV-2S与ACE2 结合的阻断药物成为防控COVID-19最为重要的策略。
人体中的ACE2与ACE(血管紧张素转换酶)有着密切的关联,研究发现二者基因源于同一祖先。有研究发现壳糖胺通过与ACE活性中心结合从而抑制ACE活性实现降压效果。壳糖胺具有很好的生物降解性,生物兼容性,生物活性,能与阴离子聚合电解质形成聚电解质复合物,因其对人体没有毒副作用,目前已成为抗高血压功能食品和辅助药物研究热点之一。通过计算机模拟对比ACE和ACE2结构(PDB ID分别为1o8a和1r42) 发现,二者活性结构基本相同,均为一个氨基酸序列为HEMGH的锌结合区,暗示壳糖胺具有结合ACE2的可能,倘若该结合又能阻止SARS-CoV-2结合且保持抗高血压作用,结果将具有重大的科学意义!
壳糖胺(Chitosan)是甲壳素脱乙酰产物,其化学名称为β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡聚糖,因其分子结构的不同,分为α、β、γ三种类型。正常情况下壳糖胺酸性溶解,pH>7即沉淀,因此很大程度限制其在生理环境下细胞和动物的应用。β- 壳糖胺比α-壳糖胺具有较弱的分子内和分子间氢键作用力,以及更高的溶解度和生物活性,因此,本发明针对SARS-CoV-2S-RBD与ACE2的结构特异性,利用β-壳糖胺阻断 SARS-CoV-2S-RBD与ACE2的结合,开发一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的方法,可为新冠病毒防控提供新策略。
发明内容
本发明提供一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途,其目的在于,有效预防和治疗新冠肺炎。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途,其特征在于:
(1)0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与 SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合;
(2)0.05~1%的β-壳糖胺具有类似抗体的功能,能够中和SARS-CoV-2S-RBD,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合;
(3)SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能;
(4)0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化AngII 降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
本发明证明了0.05~1%的β-壳糖胺对阻断SARS-CoV-2S-RBD/ACE2结合和抑制炎症具有显著的预防和治疗效果,说明β-壳糖胺对人类抗SARS-CoV-2具有重大研究价值与应用前景。
0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与 SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
0.05~1%的β-壳糖胺具有中和SARS-CoV-2S-RBD的功效,并且结合物不再与ACE2结合,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的炎症。
0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活金属蛋白酶ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化Ang II降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与 SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
0.05~1%的β-壳糖胺用于预防和治疗下列感染:
1)上呼吸道感染;
2)下呼吸道感染;
3)眼部感染。
0.05~1%的β-壳糖胺用作一种溶液,以喷剂的产品形式向鼻腔、口腔、咽喉或眼睛给药,也可以口服液形式口服使用。
本发明针对SARS-CoV-2S-RBD与ACE2的结构特异性,利用β-壳糖胺阻断 SARS-CoV-2S与ACE2的结合,开发一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的方法,可为新冠病毒防控提供新策略。
本发明的有益之处在于:
本发明结合分子作用模型,细胞模型和动物模型,证明0.05~1%的β-壳糖胺(以下提及的β-壳糖胺均为此浓度范围)能结合易感染细胞受体ACE2,阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合;β-壳糖胺能够中和SARS-CoV-2S-RBD,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合;SARS-CoV-2S-RBD能激活炎症信号通路,引发炎症,而β-壳糖胺具备抑制炎症信号通路激活功能;β-壳糖胺能通过激活ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化Ang II降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2 与SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。说明β-壳糖胺对阻断SARS-CoV-2S-RBD/hACE2结合和抑制炎症具有显著的预防和治疗效果,提示了β-壳糖胺对人类抗SARS-CoV-2具有重大研究价值与应用前景。
附图说明
图1是β-chitosan抗SARS-CoV-2-S-RBD/ACE结合的体外分子作用模型的 Native-PAGE和HPLC分析图谱;
图中:A、为验证β-chitosan与ACE2结合物是否还能与SARS-CoV-2S-RBD结合,在ACE2相对β-chitosan过量情况下,分别取1μg ACE2与2μg、4μg和8μg β-chitosan混匀,37℃孵育20min,再分别加入1μg SARS-CoV-2S-RBD再次共孵育。 B、Native-PAGE分析结:(1).β-chitosan;(2).ACE2;(3).ACE2+β-chitosan; (4).SARS-CoV-2S-RBD;(5).SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan;(6). ACE2+SARS-CoV-2S-RBD;(7).(ACE2+SARS-CoV-2S-RBD)+β-chitosan;(8).(ACE2 +2μgβ-chitosan)+SARS-CoV-2S-RBD;(9).(ACE2+4μgβ-chitosan)+SARS-CoV-2S-RBD;(10).(ACE2+8μgβ-chitosan)+SARS-CoV-2S-RBD。C:灰度分析。D、HPLC分析:(1).ACE2;(2).SARS-CoV-2S-RBD;(3).β-chitosan;(4) ACE2+SARS-CoV-2S-RBD;(5).ACE2+β-chitosan;(6).SARS-CoV-2S-RBD+ β-chitosan;(7).(ACE2+SARS-CoV-2S-RBD)+β-chitosan;(8). (ACE2+β-chitosan)+SARS-CoV-2S-RBD;
图2是β-chitosan抗SARS-CoV-2-S-RBD/ACE结合的Vero E6细胞模型结果;
图中:A、细胞免疫荧光检测,其中SARS-CoV-2S-RBD、ACE2和DAPI分别显示绿色、红色和蓝色荧光。B、流式细胞仪分析。C、Western Blot分析。各实验组:(a).control; (b).SARS-CoV-2S-RBD;(c).SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan;(d).β-chitosan; (e).β-chitosan+SARS-CoV-2S-RBD;(f).(SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan);
图3是β-chitosan抗SARS-CoV-2-S-RBD/ACE结合的小鼠细胞模型结果;
图中:A、FITC标记β-chitosan在小鼠肺组织的代谢分布。B、小鼠肺组织器官的形态学病变观察。C、免疫荧光检测小鼠ACE2表达及其与SARS-CoV-2-S-RBD共定位情况,其中SARS-CoV-2S-RBD、ACE2和DAPI分别显示绿色、红色和蓝色荧光。D、Western Blot分析ACE2和炎症相关蛋白;
各实验组:(a).control;(b).SARS-CoV-2S-RBD;(c). β-chitosan+SARS-CoV-2S-RBD;(c1).β-chitosan(L)+SARS-CoV-2S-RBD;(c2). β-chitosan(M)+SARS-CoV-2S-RBD;(d).SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan;(e). β-chitosan;
图4是β-chitosan通过激活ADAM17活性调节ACE2表达效果图;
图中:A、细胞免疫荧光分析ADAM17抑制剂TAPI对ACE2表达的影响,该荧光为ACE2(红色)和DAPI(蓝色)的Merge形式。B、Western Blot分析ACE2和炎症相关蛋白。
各实验组:(a).control;(b).SARS-CoV-2S-RBD;(c). SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan;(d).β-chitosan;(e). β-chitosan+SARS-CoV-2S-RBD;(f).(SARS-CoV-2S-RBD+β-chitosan)。
具体实施方式
本发明提供了一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途,其特征在于:
(1)0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与 SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合;
(2)0.05~1%的β-壳糖胺具有类似抗体的功能,能够中和SARS-CoV-2S-RBD,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合;
(3)SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能;
(4)0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化AngII 降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
本发明证明了0.05~1%的β-壳糖胺对阻断SARS-CoV-2S-RBD/ACE2结合和抑制炎症具有显著的预防和治疗效果,说明β-壳糖胺对人类抗SARS-CoV-2具有重大研究价值与应用前景。
0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与 SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
0.05~1%的β-壳糖胺具有中和SARS-CoV-2S-RBD的功效,并且结合物不再与ACE2结合,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的炎症。
0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活金属蛋白酶ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化Ang II降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与 SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
本发明使用0.05~1%的β-壳糖胺用于预防和治疗下列感染:
1)上呼吸道感染;
2)下呼吸道感染;
3)眼部感染。
将0.05~1%的β-壳糖胺用作一种溶液,以喷剂的产品形式向鼻腔、口腔、咽喉或眼睛给药,也可以口服液形式口服使用。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述:
实施例1β-chitosan抗SARS-CoV-2S-RBD/ACE2结合的体外分子作用模型:
将蛋白质(SARS-CoV-2S-RBD和ACE2)和β-chitosan分别溶解于0.02M的Tris-HCl缓冲液中。按表1顺序添加样品,将样品混合均匀,37℃孵育20min,特别的,7号样品加入10μgβ-chitosan进行二次孵育,最后收集的混合物样品用Native-PAGE分析。
表1样品添加顺序
结果如附图1所示,ACE2或SARS-CoV-2S-RBD与β-chitosan作用后,电泳条带灰度值分别下降95.8%和94.8%,说明β-chitosan在体外模拟正常生理条件下对ACE2 和SARS-CoV-2S-RBD均具很强的结合作用。ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合后,电泳带灰度值同比于ACE2、SARS-CoV-2S-RBD显著减弱,说明ACE2与SARS-CoV-2S-RBD具强结合;加入β-chitosan后,灰度值同比明显减弱,说明β-chitosan对SARS-CoV-2S-RBD 与ACE2的结合物有明显的影响。
此外,在ACE2相对于β-chitosan过量的前提下,分别加入1μg ACE2与2μg,4μg 和8μgβ-chitosan混合均匀,37℃孵育20min,最后再分别加入1μg SARS-CoV-2S-RBD,再次孵育20min。结果显示,各泳道SARS-CoV-2S-RBD电泳带灰度值递增(见附图1中的泳道8、9、10),说明ACE2与β-chitosan结合后的结合物不能与 SARS-CoV-2S-RBD再次结合。
HPLC样品处理方式参考表1,结果如图1所示,在高压条件下,β-chitosan与 SARS-CoV-2S-RBD的结合物不分离且不再与ACE2结合,而β-chitosan与ACE2的结合物则在高压下分离,说明β-chitosan对SARS-CoV-2S-RBD的结合力远超过ACE2。
体外分子作用模型表明,β-chitosan与ACE2或SARS-CoV-2S-RBD均可结合,且结合其中之一的结合物不再与另一物质发生结合;β-chitosan具有中和SARS-CoV-2S-RBD 从而阻断ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合的功能。
实施例2基于Vero E6细胞模型检测β-chitosan抗SARS-CoV-2S-RBD结合效果:
用含有10%FBS的DMEM培养液,于37℃,5%二氧化碳的培养箱中培养Vero-E6细胞。取生长状态良好的Vero-E6细胞接种至直径为10cm的培养皿中,待细胞长至80%时按表2进行加药处理。采用细胞免疫荧光检测分析ACE2(红色)和SARS-CoV-2S-RBD(绿色)免疫荧光及共定位情况,并结合Werstern Blot检测与炎症相关信号通路蛋白。
表2加药方式
结果如附图2所示,从细胞水平证明:(1)β-chitosan具有保护ACE2免于被 SARS-CoV-2S-RBD“感染”的功效;(2)β-chitosan具有类似抗体的功能,能够中和 SARS-CoV-2S-RBD;(3)SARS-CoV-2S-RBD的介入能促进细胞炎症的发生,β-chitosan 的介入则可明显抑制与炎症相关信号通路的激活,具有消炎作用。
实施例3基于动物模型检测β-chitosan抗SARS-CoV-2S-RBD结合效果:
实验动物,无特异性病原体,8周龄,雄性hACE2小鼠和WT(ICR)小鼠。采用FITC 标记对β-chitosan进行标记,鼻腔给药β-chitosan,给药量为10mg/kg体重,结合 CFW染色法,观察β-chitosan在肺组织代谢分布情况。本实验分别用SARS-CoV-2S-RBD 和β-chitosan滴鼻接种hACE2小鼠和WT(ICR)小鼠,以等量PBS滴鼻作为模拟感染对照。解剖小鼠,收集不同组织,观察组织病理学变化。免疫荧光检测各实验组ACE2 表达以及其与SARS-CoV-2S-RBD共定位情况。Werstern Blot分析比较WT小鼠和hACE2 小鼠ACE2的表达水平以及与炎症相关的蛋白表达。
表3加药方式
注:图3实验组c1和c2的加药方式与c组类似,区别在于二者给药量分别为5mg/kg和10mg/kg。
结果如附图3所示,说明β-chitosan对hACE2鼠无毒性表现,“感染”SARS-CoV-2S-RBD的hACE2鼠出现肺损伤、水肿(炎症),与SARS-CoV-2S-RBD组比,β-chitosan对已“感染”SARS-CoV-2S-RBD的hACE2鼠肺炎症具有治疗效果,同时也能预防hACE2鼠被SARS-CoV-2S-RBD感染引发肺炎。
实施例4β-chitosan影响ACE2表达机制:
按实施例2培养Vero-E6细胞,在细胞开始给药前30min,加入8μM TAPI。采用细胞免疫荧光检测分析ACE2(红色)和SARS-CoV-2S-RBD(绿色)免疫荧光及共定位情况,并结合Werstern Blot检测与炎症相关信号通路蛋白。结果如图4所示,β-chitosan 可显著下调Vero E6细胞ACE2表达水平;当预先加入ADAM17抑制剂TAPI,Vero E6细胞的ACE2表达水平同比显著上升。表明β-chitosan下调Vero E6细胞ACE2表达水平是通过激活ADAM17提升切割ACE2的能力,使细胞上的ACE2膜外区域脱落并释放至胞外,从而减少细胞与SARS-CoV-2S-RBD的结合并呈现ACE2表达下调的假象。
Claims (7)
1.一种β-壳糖胺预防和治疗新冠肺炎病毒感染的用途,其特征在于:
(1)0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合;
(2)0.05~1%的β-壳糖胺具有类似抗体的功能,能够中和SARS-CoV-2S-RBD,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合;
(3)SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能;
(4)0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化AngII降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于:0.05~1%的β-壳糖胺能结合易感染细胞受体ACE2,并且结合物不再与SARS-CoV-2S-RBD结合,从而阻断SARS-CoV-2S-RBD对ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于:0.05~1%的β-壳糖胺具有中和SARS-CoV-2S-RBD的功效,并且结合物不再与ACE2结合,从而有效阻断SARS-CoV-2S与ACE2的结合,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的感染。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于:SARS-CoV-2S-RBD能激活相关的炎症信号通路,进而引发炎症,但0.05~1%的β-壳糖胺却具备抑制炎症信号通路激活功能,可用于预防和治疗新冠肺炎病毒引起的炎症。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于:0.05~1%的β-壳糖胺通过能够激活金属蛋白酶ADAM17活性,增强切割ACE2具有催化Ang II降解活性的胞外域,并释放到细胞外环境中,从而阻止ACE2与SARS-CoV-2S-RBD结合内化降解,同时抑制因SARS-CoV-2S-RBD引发的炎症信号。
6.如权利要求1至5所述的用途,其特征在于:0.05~1%的β-壳糖胺用于预防和治疗下列感染:
1)上呼吸道感染;
2)下呼吸道感染;
3)眼部感染。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于:0.05~1%的β-壳糖胺用作一种溶液,以喷剂的产品形式向鼻腔、口腔、咽喉或眼睛给药,也可以口服液形式口服使用。
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