CN111991392A - 一种抗疱疹病毒感染的生物碱及其组合物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种抗疱疹病毒感染的生物碱，包含以下一种或者多种生物碱：苯甲酰乌头原碱(C₃₂H₄₅NO₁₀)、苯甲酰次乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₉)、苯甲酰新乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₁₀)、乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)、次乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₀)以及新乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₁)，及包含所述生物碱的组合物，所述生物碱及其组合物具备良好的抗疱疹病毒感染，所述生物碱及其组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染的药物中的应用。

Description

一种抗疱疹病毒感染的生物碱及其组合物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。

背景技术

单纯疱疹病毒为线状双链DNA病毒，虽然能引起实验性动物感染，但人类是其唯一的天然宿主。根据病毒的理化性状、生物学特性和DNA限制性内切酶图谱及对温度敏感性的差异将单纯疱疹病毒(HSV)分为两个血清型：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，两型间有共同抗原和特异性抗原。两型之间的核昔酸序列同源性达47％-50％，基因组结构基本相同。HSV DNA分子长约150kb，约有70余个编码基因，推测可编码至少70余种不同的病毒蛋白。HSV-1主要引起周围性面瘫、颜面疱疹、疱疹性角膜炎和单纯疱疹病毒性脑炎等多种疾病，严重者可引起死亡；HSV-2主要引起生殖器疤疹，并且可通过母亲传染给胎儿，导致流产及胎儿畸形。免疫功能低下或缺陷患者更易发生严重的HSV感染。同时，HSV易在宿主体内建立潜伏感染，一定条件下可重新激活引起临床症状，严重影响了患者的生活及身体健康。临床治疗HSV感染的首选药物是阿昔洛韦(ACV)，其属于无环核苷类药物。由于无环核苷类抗疱疹病毒药物的长期使用，导致病毒胸苷激酶突变而产生耐药株。HSV耐ACV毒株在20世纪80年代已出现，近年来关于HSV耐药株的报道越来越多，因此探寻新的具有抗HSV活性的药物具有重要意义。

HSV-1感染细胞后，可依次表达立即早期基因(α)、早期基因(β)、晚期基因(γ)。α基因表达的立即早期蛋白是感染过程中产生的第一个病毒多肽，不仅可激活β和γ基因的表达，还可拮抗宿主免疫成分。ICP27是α基因UL54表达的调节蛋白，先抑制mRNA剪接，再招募RNA聚合酶II到复制位点，促使RNA从细胞核转入细胞质。UL12基因编码的碱性核酸酶是HSV-1复制的关键酶，其核酸外切酶活性强于核酸内切酶活性，具有3个磷酸化位点(Tyr-371、Thr-474、Ser-604)，可促进病毒的复制及其在细胞间的传播。UL42是HSV-1复制的早期(Early，E)基因，可编码磷酸化的UL42蛋白，存在于病毒颗粒皮层，是HSV-1 DNA聚合酶的辅助因子，可与DNA直接结合，促进病毒基因的表达。此外，已知糖蛋白gD与病毒吸附有关，易感细胞表面特异性受体HVEM直接与gD特异结合介导HSV-1进入宿主细胞。

水痘带状疱疹病毒(VZV)属于人类疱疹病毒α亚科，是一种双链DNA病毒，为人类传播中最小的疱疹病毒。人是VZV传播的唯一宿主，其主要的靶器官是皮肤。VZV全基因组由71个开放读码框组成，全长约125kb，由两个共价键相互联接的长片段(L)和短片段(S)DNA构成，不同毒株间的遗传变异主要表现为单核苷酸多态性，任何两个VZV病毒株的基因组之间存在着30～200个不同的多态性位点。VZV感染过程中病毒颗粒(CFVs)借助其包膜与受感染细胞膜融合而黏附细胞，进而通过内吞作用穿透细胞。病毒核衣壳进入细胞核启动病毒DNA转录和复制，新复制DNA与新合成衣壳包装成核衣壳后运出细胞核，与粗面内质网合成的病毒糖蛋白及游离核糖体合成的病毒衣壳蛋白装配成带包膜的感染性子代病毒，后者释放出受感染细胞再感染邻近细胞。带细胞病毒(CAVs)感染过程中因病毒感染细胞与未感染细胞间紧密相邻，无需细胞间的膜融合作用启动感染，因而更容易进入邻近细胞。VZV感染除导致受染组织破坏外还会激活NF-κB信号通路诱发受染宿主的免疫炎症反应。

理想的抗病毒药物，不仅在感染早期或后期对病毒有杀灭、抑制作用，还要抑制病毒复制过程中转录因子NF-κB的激活以减轻受染宿主的免疫炎症反应。

VZV可经飞沫和(或)接触传播，原发感染主要引起水痘，主要见于儿童。残余的VZV可沿感觉神经轴突逆行，或经感染的T细胞与神经元细胞的融合，转移到脊髓后根神经节或颅神经节内并潜伏，当机体抵抗力降低时，VZV特异性细胞免疫下降，潜伏的病毒被激活，大量复制，通过感觉神经轴突转移到皮肤，穿透表皮，引起带状疱疹。全球普通人群带状疱疹的发病率为(3-5)/1000人年，亚太地区为(3-10)/1000人年，并逐年递增2.5％-5.0％。带状疱疹的住院率(2-25)/10万人年，死亡率(0.017-0.465)/10万人年，复发率1％-6％。50岁后随年龄增长，VZV特异性细胞免疫功能逐渐降低，带状疱疹的发病率、住院率和病死率均逐渐升高。目前核苷类抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)和非核苷类抗病毒药物膦甲酸(RFA)是治疗VZV感染的主要药物。但近年来有关VZV对ACV和/或PFA耐药以及耐药株感染者预后差的报告逐渐增多，临床多采用阿昔洛韦抗病毒联合镇痛药物治疗带状疱疹，不良反应发生率高且有导致急性肾损伤的风险。阿昔洛韦仅具有抗VZV活性，但无法减轻病毒引起的免疫炎性反应及神经性疼痛。

因此，探索一种临床应用安全性高且同时具有抗VZV、抗炎、镇痛活性的药物，将极大缓解当前带状疱疹患者的治疗困境。

发明内容

本发明提出一种抗疱疹病毒感染的生物碱，还提出一种包含所述生物碱的抗疱疹病毒感染组合物以及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗疱疹病毒感染的生物碱，包含以下一种或者多种生物碱：苯甲酰乌头原碱(C₃₂H₄₅NO₁₀)、苯甲酰次乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₉)、苯甲酰新乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₁₀)、乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)、次乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₀)以及新乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₁)。

优选的，苯甲酰乌头原碱的分子式为C₃₂H₄₅NO₁₀、苯甲酰次乌头原碱的分子式为C₃₁H₄₃NO₉、苯甲酰新乌头原碱的分子式为C₃₁H₄₃NO₁₀、乌头碱的分子式为C₃₄H₄₇NO₁₁、次乌头碱的分子式为C₃₃H₄₅NO₁₀以及新乌头碱的分子式为C₃₃H₄₅NO₁₁；苯甲酰乌头原碱的结构式为

苯甲酰次乌头原碱的结构式为

苯甲酰新乌头原碱的结构式为

乌头碱的结构式为

次乌头碱的结构式为

以及新乌头碱的结构式为

一种包含上述一种或者多种生物碱的抗疱疹病毒感染组合物，还包含载体。

进一步，所述载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂、增效剂。

进一步，所述生物碱与所述载体的质量比为7∶3-8∶2。

进一步，所述的生物碱在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染的药物中的应用。

进一步，所述的组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染的药物中的应用。

进一步，所述的生物碱在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染中的新用途。

进一步，所述的组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染中的新用途。

进一步，上述生物碱或抗疱疹病毒感染组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型感染所致周围性面瘫的药物中的应用。

进一步，上述生物碱或抗疱疹病毒感染组合物在制备预防或治疗水痘带状疱疹病毒感染所致带状疱疹后遗神经痛的药物中的应用。

本发明的有益效果为：在本发明的具体实施例中，在体外细胞试验采用CPE法研究了苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对单纯疱疹病毒1型HSV-1、单纯疱疹病毒2型HSV-2致Vero细胞病变的抑制作用，证明了苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对HSV-1、HSV-2都有良好的抑制效果。本发明在实施例2采用RT-qPCR检测了苯甲酰乌头原碱对HSV-1基因UL12、UL42、UL54表达的影响，证明其通过抑制UL12、UL42、UL54表达发挥抗病毒活性。本发明在实施例3采用核酸分子杂交检测了苯甲酰乌头原碱对HSV-1糖蛋白gD的基因表达的影响，发现其可抑制gD的基因表达从而阻止HSV-1进入宿主细胞。本发明在实施例4、5建立了HSV-1感染致周围性面瘫小鼠模型，进一步说明了苯甲酰乌头原碱可通过抑制NF-κB的表达以调节免疫炎症反应从而发挥抗病毒作用，并能有效治疗HSV-1感染导致的周围性面瘫。本发明的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱良好的抗HSV-1、HSV-2活性，并揭示UL12、UL42、UL54、糖蛋白gD、NF-κB信号通路可作为HSV-1、HSV-2的治疗靶点，并作为一种HSV-1感染导致的周围性面瘫的有效治疗药物。

本发明能够提供一种高效预防或治疗单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型感染的药物，为HSV-1、HSV-2感染以及HSV-1感染导致的周围性面瘫的治疗提供了新的途径和方法。

苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱具有良好的抗炎、镇痛活性。其中苯甲酰乌头原碱的抗炎作用强于苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱，能减轻佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性足肿胀。通过小鼠耳肿胀试验、大鼠足肿胀试验、小鼠热板试验和小鼠扭体试验发现，苯甲酰乌头原碱可显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，并显著升高小鼠热刺激疼痛的痛阈值与冰醋酸刺激疼痛的痛阈值，显著减少冰醋酸刺激引起的小鼠扭体次数，苯甲酰乌头原碱表现出良好的抗炎镇痛作用。

苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱具有良好的抗VZV活性，结合其确切的抗炎、镇痛作用，可在有效抗VZV感染的同时(抗病毒活性)，减轻病毒感染的炎性反应(抗炎活性)，减轻患者神经疼痛(镇痛活性)，有助于全方位、多靶点治疗VZV感染导致的带状疱疹，有望开发成为治疗此病的特效药物。在本发明的具体实施例中，通过体外细胞试验采用荧光分析GFP表达情况及luciferase的表达定量检测分析，证明了苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对水痘带状疱疹病毒都有良好的抑制效果。

本发明在一个具体的实施例中还建立了水痘带状疱疹病毒接种感染致带状疱疹后神经痛大鼠模型，通过免疫组化检测大鼠NF-κB p65蛋白表达，进一步说明了苯甲酰乌头原碱通过抑制NF-κB的表达以调节免疫炎症反应从而发挥抗水痘带状疱疹病毒作用。同时，苯甲酰乌头原碱可显著提高带状疱疹后神经痛大鼠的机械缩足反射阈值(PWT)，表现出良好的镇痛作用。苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱通过抗病毒、抑制免疫炎症反应、镇痛而全方位治疗水痘带状疱疹病毒感染及带状疱疹后神经痛的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1苯甲酰乌头原碱对HSV-1致Vero细胞病变数量比较图；

图2苯甲酰乌头原碱对HSV-1影响基因UL12、UL42、UL54表达的琼脂糖电泳图对照图；

图3苯甲酰乌头原碱对HSV-1影响糖蛋白gD的mRNA表达的结果图；

图4苯甲酰乌头原碱对影响NF-κB蛋白表达的对照图；

图5为苯甲酰乌头原碱抗VZV活性结果图；

图6为苯甲酰乌头原碱(μM)对影响GFP表达的结果图；

图7为免疫组化染色结果(400×)对照图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验材料：非洲绿猴肾细胞(Vero)由山东中医药大学提供，HSV-1、HSV-2由武汉病毒研究所提供。苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱购自上海源叶生物科技有限公司，将干粉状药物溶于二甲基亚砜，配制成1mmol/L的药液，4℃保存备用。成年SD大鼠30只，雄性，体重约200-250g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，兔抗NF-κB p65多克隆抗体(Abcam)。Trizol和6×Loading Buffer购于Takara公司；反转录试剂盒购于Takara公司；2×SYBR Green PCR Kit购于德国Qiagen公司。通过Genbank收录的HSV-1全基因序列查找出HSV-1 UL12、UL42、UL54的基因序列。UL12、UL42、UL54基因引物由上海生工生物工程公司合成。

实施例1：苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱体外具有良好的抗单纯疱疹病毒活性。

CPE法检测药物对HSV-1、HSV-2的抑制作用：将生长状态良好的Vero细胞培养至单层，用100TCID₅₀ HSV-1、HSV-2病毒液进行2h吸附接毒后弃上清，每孔加入7个浓度(10-1000μM)的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，每个浓度5个复孔，设细胞对照、病毒对照和阳性药物(ACV)对照，于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，每日观察细胞CPE情况。当病毒对照组细胞CPE达90％以上时，记录各孔细胞CPE情况，抑制浓度(IC₅₀)。

试验结果：计算得到苯甲酰乌头原碱对Vero细胞的TC₅₀为967μM，HSV-1感染Vero细胞后，病变细胞圆缩聚集，呈串珠样排列，细胞间隙增大，镜下可见多核巨细胞。而细胞对照组的Vero细胞生长状态良好，排列紧密，边界清晰。ACV阳性对照组中，细胞形态规则，未见明显的病毒病变。苯甲酰乌头原碱组CPE较病毒对照组弱，且随着苯甲酰乌头原碱浓度的提高，细胞病变减少，结果见图1。苯甲酰乌头原碱浓度为30μM时，病变细胞融合成为多核巨细胞，细胞核数量可多达几十个，致使细胞间距明显增大。当浓度升高到90-270μM时，细胞病变明显减少。采用CPE法记录的结果表明组间病变程度的差异具有统计学意义(P＜0.01)。用Reed-Muench方法计算苯甲酰乌头原碱对病毒的IC₅₀为83.02μM。治疗指数TI＝11.65。计算苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱治疗指数分别为：9.7、8.5、13.2、12.0、11.9。在HSV-2研究组中，苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱治疗指数分别为：10.2、8.1、7.4、11.5、9.7、8.9。

实施例2：苯甲酰乌头原碱抑制HSV-1基因UL12、UL42、UL54表达RT-qPCR检测HSV-1相关基因表达：100TCID₅₀ HSV-1感染单层Vero细胞2h，弃上清，培养孔中加入40、80、160μM的苯甲酰乌头原碱，同时设病毒对照，37℃、5％CO₂培养箱中培养16h后提取细胞总RNA。以提取的总RNA为模板，逆转录成cDNA后进行RT-qPCR实验。RT-qPCR反应体系为2×SYBRGreen PCR MasterMix 5μL，上下游引物各0.5μL，稀释10倍的cDNA模版4μL。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火/延伸10s，共45个循环。采用CFX Manager 96软件分析结果。

试验结果：HSV-1复制相关基因扩增结果以总RNA反转录的cDNA为模板，加入上、下游引物经RT-qPCR扩增后，用1.5％琼脂糖电泳检测目的片段的大小，结果见图2，内参18SrRNA扩增后的电泳图符合研究条件。UL12、UL42、UL54扩增后的琼脂糖电泳图显示，病毒对照组的目的条带较亮，而苯甲酰乌头原碱组的目的条带不明显，提示该基因含量较少。以病毒对照组各mRNA的表达量为“1”，各药物浓度处理后病毒mRNA的表达量与之相比，结果如下：40μM组UL12∶0.097±0.031、UL42∶0.088±0.013、UL54∶0.095±0.009；80μM组UL12∶0.051±0.002、UL42∶0.036±0.004、UL54∶0.086±0.010；160μM组UL12∶0.038±0.003、UL42∶0.023±0.003、UL54∶0.020±0.003。病毒组UL12∶1.000±0.106、UL42∶1.000±0.091、UL54∶1.000±0.186组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。通过检测HSV-1基因UL12、UL42、UL54表达的情况，发现苯甲酰乌头原碱可抑制HSV-1基因的表达，随着苯甲酰乌头原碱药浓度的增加，3个目标基因的表达水平呈下降趋势，均低于病毒对照组。

实施例3：苯甲酰乌头原碱抑制HSV-1糖蛋白gD的mRNA表达核酸分子杂交检测HSV-1糖蛋白gD的基因表达：根据GenBank中HSV-1全基因序列，设计对应于HSV-1糖蛋白gD基因序列的寡核苷酸探针，探针序列由上海生工生物技术公司合成。Vero细胞制成2×10⁵/ml细胞悬液，接种在放有盖玻片的培养瓶中培养，每孔加入1.8ml细胞，于5％CO₂孵箱中37℃培养24h-48h，弃生长液，加约100TCID₅₀病毒液100μl，37℃吸附2h，吸出病毒液，加用维持液稀释的PSP 200μl，，置5％CO₂孵箱中37℃培养。24h后，取出细胞飞片经梯度乙醇脱水，PBS漂洗2次，37℃1μg/ml蛋白酶K消化30min，PBS漂洗2次，4％多聚甲醛室温下固定10min，2×SSC冲洗2次，70％，95％，100％乙醇系列脱水，空气干燥。每张飞片滴加500μl杂交液，预杂交2h；加入含探针1-2ng/μl杂交液，置于密闭湿盒中，60℃过夜。杂交结束后，飞片在室温下依次经2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗各2次，将飞片于buffer I洗液中10min，封闭液bufferII中37℃孵育30min，抗体液37℃孵育30-60min，buffer I洗液中10min，置bufferIII平衡10min，新鲜配制的显色液中避光孵育10min至数小时，终止反应。中性树胶封片。实验同时设3个阴性对照：(1)杂交前用RnaseA 100μg/ml预处理细胞飞片，37℃，1h；(2)加未标记的探针进行反应；(3)正常的Vero细胞。阳性对照为未加苯甲酰乌头原碱作用的HSV-1感染Vero细胞组。所有操作步骤与其他样本相同。结果判定：400×光镜下随机选择视野，观察200个细胞，计数杂交阳性的细胞数。见图3。

试验结果：不同剂量苯甲酰乌头原碱作用的HSV-1感染组，其糖蛋白gG mRNA的表达为：40μM组42.67±1.37(％)，80μM组30.55±0.79(％)，160μM组22.14±1.27(％)，显著低于阳性对照组76.68±1.40(％)(P＜0.01)，且随药物浓度的增加其抑制率明显增高。

实施例4：苯甲酰乌头原碱抑制HSV-1感染致周围性面瘫小鼠的NF-κB表达Western印迹检测NF-κB表达情况：选取4周龄的Balb/c小鼠，雌雄各半，体重17.5-21.5g，共选取120只，随机分为：空白组、生理盐水组、药物组、模型组，每组各30只，各组又分为3天、7天、14天三个时间点，每个时间点各10只。造模方法：腹腔内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，取右侧耳后纵切口，于腮腺后上缘暴露面神经主干和耳后支，解剖、切除约2mm耳后支，于神经断端放置2mm*3mm大小明胶海绵，滴加25μL病毒液，生理盐水组滴加25μL生理盐水作为对照，缝合切口。小鼠眨眼反射消失、触须运动减弱和鼻尖位置偏移即造模成功。药物组小鼠每日腹腔注射苯甲酰乌头原碱0.2mg/kg/d。在3天、7天、14天分批处死动物，提取面神经核组织做Western Blot分析。

试验结果：正常组和生理盐水组小鼠面神经细胞核内中仅见有微量NF-κB的表达；模型组核内NF-κB的表达量从第3天就开始显著增加，随时间变化逐渐增加，14天时有所恢复，但值仍显著的高于正常组和生理盐水组；药物组，应用苯甲酰乌头原碱治疗后能明显的抑制单纯疱疹病毒引起的核内NF-κB的表达。和模型组相比，药物组在3、7、14天三个时间点核内NF-κB的表达量都显著低于模型组(P＜0.05)。结果见图4。

实施例5：苯甲酰乌头原碱促进HSV-1感染致周围性面瘫小鼠的症状恢复行为学评分法评价HSV-1感染致周围性面瘫小鼠症状恢复情况：造模成功后，药物组小鼠每日腹腔注射苯甲酰乌头原碱0.2mg/kg/d，每天对实验小鼠的触须运动、眨眼反射、鼻尖位置进行仔细观察并评分(总和为0-5分)，观察眨眼射时，用18G针头配5ml注射器，在距小鼠的眼睛2cm处，瞬时对其眼内吹注空气并观察小鼠眼睑的活动以及闭合的情况，0分∶双眼没有明显差异；1分：患侧相对另侧闭合有延迟；2分：患侧的眼睑不能够闭合。计算30秒内动物两侧胡须的运动，0分：两侧胡须无明显的差异；1分：患侧的胡须运动相对对侧减弱；2分：患侧的胡须运动消失。观察小鼠鼻尖的位置，0分：动物的鼻尖位置居中；1分：鼻尖的位置偏向了对侧。

试验结果：药物组评分5分(1d)，5分(3d)，4.5分(5d)，2.8分(7d)，1.2分(9d)，0分(11d)。模型组评分5分(1d)，5分(3d)，4.2分(5d)，4.0分(7d)，3.5分(9d)，2.1分(11d)，1.4分(13d)，0分(15d)。较模型组，苯甲酰乌头原碱治疗组的小鼠触须运动、眨眼反射、鼻尖位置症状完全恢复时间显著缩短(P＜0.01)。

苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱具有良好的抗HSV-1、HSV-2作用。

试验材料：检测所用病毒株为含有GFP和luciferase报告基因的感染性VZV Oka型病毒株，检测所用细胞系为VZV易感细胞系人视网膜上皮细胞ARPE-19，由本实验室传代保存。细胞培养条件：培养于添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃和5％CO₂培养箱中培养。成年SD大鼠30只，雄性，体重约200-250g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，兔抗NF-κB p65多克隆抗体(Abcam)，Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒(Promega)、CellTiter-Glo试剂盒(Promeg)。苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱购自上海源叶生物科技有限公司，分别称取4.2mg各溶于69.6μl DMSO中，配成100mM的贮存液。对照化合物阿昔洛韦(Acyclovir，ACV)购自麦克林公司。实验仪器主要有：CO₂培养箱、生物安全柜、多功能酶标仪、荧光显微镜。

实施例1：苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱体外具有良好的抗水痘带状疱疹病毒活性。

荧光分析GFP表达情况及luciferase的表达定量检测分析：CellTiter-Glo(Promega)试剂盒检测样品对细胞的毒性作用，药物对细胞的毒性大小与细胞的活性呈反比，并以细胞活性来反映。计算公式：细胞活性(％)＝(药物组数值-空白对照平均值)/(细胞对照组数值平均值-空白对照平均值)*100。VZV报告病毒携带GFP和luciferase报告基因，报告基因的表达能反映病毒复制的水平。ARPE-19细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养过夜后备用。药物用DMEM培养基从合适的浓度起连续倍比梯度稀释6个梯度。药物及病毒贮存液加入到细胞。置于37℃细胞培养箱培养。3d后，通过荧光显微镜观测GFP表达情况并对luciferase的表达量进行定量检测分析。抑制率(％)＝100-(样品孔数值-细胞对照组平均值)/(病毒对照组平均值-细胞对照组平均值)×100。

试验结果：苯甲酰乌头原碱在1000μM、333.33μM、111.11μM、37.04μM、12.35μM、4.12μM浓度下，感染病毒的细胞中GFP和luciferase表达的水平逐渐升高，表明药物对病毒抑制作用逐渐减小，结果见图6。结合细胞毒性实验结果，采用Graphpad Prisim 6作图5，红色曲线为药物浓度-细胞活性曲线，蓝色曲线为药物浓度-病毒抑制率曲线，计算出EC₅₀和CC₅₀值。苯甲酰乌头原碱细胞毒性与药物活性起始检测浓度为1000μM，稀释倍数为3，CC₅₀＞1000μM，EC₅₀为346.5μM，SI＞2.9。(SI选择指数，为CC₅₀/EC₅₀的值，是表征一个样品抗病毒活性的基本参数，数值越大活性越好)。苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的S1分别为2.7、2.5、3.2、3.0、2.9。六种生物碱对VZV病毒都有良好的抑制效果。

实施例2：苯甲酰乌头原碱抑制带状疱疹后遗神经痛大鼠炎症信号通路NF-κB表达免疫组化检测检测带状疱疹后遗神经痛大鼠脊髓NF-κB p65蛋白表达：大鼠随机分为空白组(不造模)、模型组(水痘带状疱疹病毒接种大鼠造模)、外用治疗组(苯甲酰乌头原碱外用治疗，1mg/kg)，灌胃治疗组(苯甲酰乌头原碱灌胃治疗，1mg/kg)，每组10只。造模时大鼠将左后肢和背部皮肤用化学脱毛剂脱毛，脱毛后观察3d，选取脱毛区光滑无损伤大鼠接种。用4％水合氯醛麻醉大鼠，注射50μl(内含6×10⁶)VZV接种到大鼠右后肢胫部皮下，接种后1d、4d、7d后观察起带状疱疹样皮疹和疼痛相关反应(触痛异常和机械性痛觉过敏)。造模成功一周后开始给药，外用组患处均匀涂抹苯甲酰乌头原碱1mg/kg/d，灌胃组灌胃苯甲酰乌头原碱1mg/kg/d。在特定时间点取模型大鼠L4-L5段脊髓腰膨大部位置石蜡包埋，进行免疫组织化学染色，在Confocal激光共聚焦显微镜下观察采图，测定脊髓细胞中NF-κB p65阳性表达产物的平均光密度值(OD)。

试验结果：模型组阳性细胞数明显多于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。药物治疗后，阳性细胞数明显减少，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。空白对照组平均光密度0.49±0.043，模型组0.90±0.06，外用治疗组0.18±0.027，灌胃治疗组0.17±0.029。免疫组织化学染色结果：阳性细胞的细胞核呈棕褐色。模型组大鼠脊髓组织中NF-κB p65核反应阳性细胞表达较正常组明显增加，治疗组大鼠脊髓组织中NF-κB p65核反应阳性细胞较模型组的表达明显减少。结果见图7。

实施例3：苯甲酰乌头原碱提高带状疱疹后遗神经痛大鼠疼痛阙值，缓解带状疱疹感染造成的神经痛。

机械缩足反射阈值(PWT)的测定：采用von Frey filaments(Stoeling公司，美国)测定右侧后肢触诱发痛阈。即将大鼠置于金属笼中适应环境适应20min后，用不同压力的纤维丝(从小到大)刺激其足底2、3跖趾间皮肤敏感处，观察是否出现缩足反应。大鼠有抬足、躲避或***动作视为阳性反应，无抬足反应，视为阴性。每根重复5次，每次测试间隔约10min，去掉最大及最小值后取3次的平均值代表PWT。于接种前1d，接种后1d、4d、7d、14d和21d分别进行PWT测定。

试验结果：空白对照组：26.48±0.95(造模前)，26.29±0.82(造模后1d)，26.39±0.64(造模后4d)，26.62±0.70(造模后7d)，26.30±0.48(造模后14d)，26.29±0.49(造模后21d)。模型组：26.39±0.59(造模前)，26.27±0.71(造模后1d)，26.03±0.77(造模后4d)，11.98±0.89(造模后7d)，9.18±1.07(造模后14d)，8.93±0.87(造模后21d)。外用治疗组：26.34±0.86(造模前)，25.60±1.76(造模后1d)，26.79±1.37(造模后4d)，17.01±1.20(造模后7d)，22.50±1.24(造模后14d)，22.44±1.39(造模后21d)。灌胃治疗组：26.25±0.77(造模前)，26.51±1.73(造模后1d)，26.70±1.39(造模后4d)，17.11±1.18(造模后7d)，22.41±1.26(造模后14d)，22.35±1.27(造模后21d)。与空白对照组比较，治疗组可明显减轻PHN大鼠的疼痛反应，差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组从造模后7d开始出PWT值下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。治疗组第7天治疗后开始出现PWT值上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗疱疹病毒感染的生物碱，其特征在于，包含以下一种或者多种生物碱：苯甲酰乌头原碱(C₃₂H₄₅NO₁₀)、苯甲酰次乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₉)、苯甲酰新乌头原碱(C₃₁H₄₃NO₁₀)、乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)、次乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₀)以及新乌头碱(C₃₃H₄₅NO₁₁)。

2.如权利要求1所述的抗疱疹病毒感染的生物碱，其特征在于：苯甲酰乌头原碱的分子式为C₃₂H₄₅NO₁₀、苯甲酰次乌头原碱的分子式为C₃₁H₄₃NO₉、苯甲酰新乌头原碱的分子式为C₃₁H₄₃NO₁₀、乌头碱的分子式为C₃₄H₄₇NO₁₁、次乌头碱的分子式为C₃₃H₄₅NO₁₀以及新乌头碱的分子式为C₃₃H₄₅NO₁₁；苯甲酰乌头原碱的结构式为

苯甲酰次乌头原碱的结构式为

苯甲酰新乌头原碱的结构式为

乌头碱的结构式为

次乌头碱的结构式为

以及新乌头碱的结构式为

3.一种包含权利要求1所述的生物碱的抗疱疹病毒感染组合物，其特征在于：还包含载体。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂、增效剂。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述生物碱与所述载体的质量比为7：3-8：2。

6.权利要求1或2所述的生物碱在制备预防或治疗水痘带状疱疹病毒感染所致带状疱疹后遗神经痛的药物中的应用。

7.权利要求3或4所述的组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染的药物中的应用。

8.权利要求1或2所述的生物碱在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染中的新用途。

9.如权利要求3或4所述的组合物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染或水痘带状疱疹病毒感染中的新用途。

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