CN111989114A - 肺炎链球菌的荚膜多糖以及其免疫原性缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含肺炎链球菌多糖‑蛋白质缀合物的免疫原性组合物及其制备方法，该缀合物包含：源自选自由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组中的任一个以上的荚膜多糖；及缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。通过本发明的一实施例，可提供用于预防或治疗肺炎球菌感染的免疫原性组合物。

Description

肺炎链球菌的荚膜多糖以及其免疫原性缀合物
技术领域
本申请请求于2018年4月18日提交的韩国专利申请第10-2018-0045245号、2018年4月18日提交的韩国专利申请第10-2018-0045246号、2018年4月18日提交的韩国专利申请第10-2018-0045247号、及2018年4月18日提交的韩国专利申请第10-2018-0045248号的优先权，并且申请的说明书及附图中揭示的全部内容以引用方式并入本文。
本发明是关于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫原性组合物及疫苗，并且更具体而言，本发明是关于包含肺炎链球菌的荚膜多糖-载体蛋白缀合物的免疫原性组合物及疫苗。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是肺炎的主要致病细菌。另外，肺炎链球菌引起侵袭性疾病诸如败血症、菌血症、脑膜炎等。根据***[2014年死亡原因统计]，2014年肺炎死亡率为每10万人中有23.7人，并且此死亡率比2013年增加11％，比2015年增加2.8倍，可以看出由肺炎引起的死亡率一直在不断增加。此外，根据2012年WHO，在2008年，全球476,000名HIV阴性的5岁以下婴儿死于肺炎链球菌感染，占5岁以下婴儿死亡原因的5％。取决于荚膜多糖的结构及免疫学特征，肺炎球菌被分类为超过约90种血清型(serotype)，荚膜多糖是围绕肺炎球菌外部(细胞膜)的主要毒力因子(virulencefactor)。
为了预防肺炎链球菌引起的疾病，Robert Austrian博士于1977年开发了一种14-价多糖疫苗，之后，该疫苗被开发成一种23-价多糖疫苗。已经证明，多价肺炎球菌多糖疫苗可用于在老年人及高危患者中预防肺炎链球菌疾病。然而，婴儿及儿童对大多数肺炎链球菌多糖没有免疫反应，这归因于与T细胞非依赖性免疫反应。因此，已经开发了肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白的缀合疫苗，该疫苗可以引起T细胞依赖性反应。
7-价肺炎链球菌结合疫苗
Figure BDA0002726669040000011
包含源自7种最常见血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的荚膜多糖。自从该疫苗最初在2000年在美国获得批准以来，已经证明该疫苗具有高度免疫原性，可有效抵抗婴儿及儿童的侵袭性肺炎球菌疾病及中耳炎。之后，依序开发了13-价缀合疫苗
Figure BDA0002726669040000021
其中添加了6种血清型1、3、5、6A、7F、19A，以及10-价缀合疫苗Synflorix，其中添加了3种血清型1、5、7F，进一步减少了肺炎链球菌引起的侵袭性疾病数量。然而，在由于引入Prevnar、Prevnar13及Synflorix而导致出现血清型改变，并且由疫苗中包含的血清型引起的疾病的数量总体上减少，重要性相对较低的非疫苗血清型的重要性却受到重视。
尤其，在北美及巴西发生由肺炎链球菌血清型20引起的侵袭性肺炎球菌疾病的发病率的增加(例如，参见[Kendall B.等人,Vaccine.34:474-478,2016]、[Yildirim I.等人,Pediatr Infect Dis J.31(10):1016-1021,2012]或[Caierγo J.等人,PLoS ONE 9(10):e111129,2014])。此外，在加拿大进行的CASPER研究中，观察到除血清型19A外的血清型8及12F的发病率增加(incidence)(Sα-Leγo A.等人,J Clin Microbiol.,49(4):1369-75,2011)。最近发表的一项研究报告称，在挪威及以色列引入Prevnar 13后，非疫苗血清型引起的疾病增加，并且例举23A、23B、12F、15A/15B/15C、31、33F、7C及8为此类非疫苗血清型(Martin J.,Pediatr Infect Dis J.,33(11):e286-90,2014)。
尽管由肺炎链球菌血清型2、9N、17F和/或20引起的肺炎球菌疾病的发病率稳步增加，但缺乏能够有效预防或治疗血清型感染的研究。
因此，越来越需要针对非疫苗血清型的免疫原性缀合物及免疫原性组合物以提供更广泛的保护范围，该血清型具有在多价多糖疫苗中包含但在缀合疫苗中不包含的血清型。
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明要解决的问题是提供一种能够提供广泛保护范围的多价疫苗。
此外，还提供包含先前未包含在缀合疫苗中的新血清型的免疫原性组合物。
另外，本发明要解决的问题是提供具有优异抗体效价的肺炎球菌缀合疫苗。
用于解决问题的手段
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；及缀合至所述荚膜多糖中每个的载体蛋白。
一个实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述多糖经活化并且以100至400kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述多糖经活化并且以400至900kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述多糖经活化并且以400至800kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，包含所述源自血清型2的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至16,000kDa的分子量，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，包含所述源自血清型17F的多糖的免疫原性缀合物具有300至4,500kDa的分子量，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，包含所述源自血清型20的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至4,000kDa的分子量。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述载体蛋白为破伤风类毒素(Tetanus toxoid，TT)或CRM197，并且优选地，仅包含一种血清型的免疫原性组合物可包含CRM197作为载体蛋白。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至2.0，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型17F荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至18，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型20荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为1至5。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，就包含所述源自血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的20至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或就包含所述源自血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的15至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或就包含所述源自血清型20的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的70至90％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，就包含所述源自血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为2至18，或就包含所述源自血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为1至22，或就包含所述源自血清型20的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为4至16。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的15种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、及23F，并且所述血清型缀合至CRM197。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的23种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并且在所述血清型之中，源自血清型3及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT并且源自血清型1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖缀合至载体蛋白CRM197。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的24种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并且源自所述血清型1及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT并且源自血清型2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖缀合至载体蛋白CRM197。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含生理学上可接受的媒剂。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物为疫苗。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生源自选自由肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组中的任一种以上的血清型的荚膜多糖；(b)对所述溶解的细胞中的源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使经过所述纯化的多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；以及(d)将经过所述活化多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的步骤。
在本发明的一实施例中，在源自血清型2及17F的荚膜多糖的情况下，所述制备方法可在(c)步骤之前进一步包括将经过所述纯化肺炎链球菌荚膜多糖水解以调整其大小的步骤。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，所述(d)步骤的组合载体蛋白通过与选自由氰基硼氢化物、硼烷-吡啶及硼氢化物交换树脂构成的组的任一种以上的还原剂反应而与经所述活化多糖形成缀合物。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，所述(c)步骤是在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.22μg高碘酸盐反应15至20小时的步骤。
本发明的一实施例提供通过所述方法获得的用于预防或治疗肺炎链球菌感染的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物。
本发明的一实施例提供预防或治疗受试者中的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F感染的方法，该方法通过给受试者给药有效剂量的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物来进行，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及分别缀合至所述荚膜多糖的一种或两种以上的载体蛋白。所述和/或表示“和”或“或”。
所述方法可针对选自由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组的任一种的血清型预防或治疗感染，或也可以针对选自所述组中的一种以上血清型预防或治疗感染，可预防针对15种血清型的感染，或可预防针对23种血清型的感染，或可预防针对24种血清型的感染。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物用于预防或治疗肺炎球菌感染的用途，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及分别缀合至所述荚膜多糖的一种或两种以上的载体蛋白。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型2的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型2的多糖可经活化并且以100至400kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有1,000至16,000kDa的分子量，例如，载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为0.5至2.0。
所述血清型2的免疫原性缀合物的20至60％可以以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一个实施例提供具有2至18的氧化度的肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型2的多糖通过在每1μg糖含量添加0.02至0.12μg高碘酸盐来氧化并且缀合至蛋白质时，缀合物的分子量可为1,000～16,000kDa，并且分子量的分布可为20～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质的比率可为0.5至2.0。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型2荚膜多糖；(b)对所述溶解细胞中的肺炎链球菌血清型2荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)将经所述纯化肺炎链球菌血清型2荚膜多糖水解以调整多糖大小的步骤；(d)使所述(c)步骤的经调整大小的多糖与氧化剂反应以对多糖进行活化的步骤；以及(e)将经所述活化多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型2荚膜多糖的缀合物的步骤。
所述(e)步骤的组合载体蛋白可通过使其与还原剂反应而与经所述活化多糖形成缀合物。
所述(d)步骤可包括在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.02～0.12μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(e)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有100至400kDa的分子量。
可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，其中，所述载体蛋白为CRM197。
所述免疫原性缀合物可具有1,000至16,000kDa的分子量。
在一个实施例中，经活化血清型2荚膜多糖相比于所述载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为0.5至2:1。
另一实施例可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，其中，免疫原性缀合物的至少20至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。
本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型9N的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
在本发明的一实施例中，所述血清型9N的多糖可经活化并且以200至700kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
所述免疫原性缀合物可具有500至4,000kDa的分子量并且所述载体蛋白可为CRM197。
所述免疫原性缀合物中的血清型9N荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)为0.1至5，优选为0.5～2.5。
在一个实施例中，所述免疫原性缀合物的15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
在一个实施例中，所述缀合物可具有2至19的氧化度。
在本发明的一实施例中，当肺炎链球菌血清型9N的多糖通过在每1μg糖含量添加0.02～0.19μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为500～4,000kDa，并且分子量的分布可为15～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为0.5～2.5。
本发明的一实施例可提供包含免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使所述多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；以及(d)将经所述活化的多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖的缀合物的步骤。
可提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物的制备方法，其中，通过与还原剂反应所述(d)步骤的组合载体蛋白与经活化的所述多糖形成缀合物。
所述(c)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.02～0.19μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(c)步骤的氧化剂反应的多糖可具有400至900kDa的分子量。
与所述(d)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有200-700kDa的分子量。
所述免疫原性缀合物可具有500至4,000kDa的分子量。
经活化血清型9N荚膜多糖相比于载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为0.5至2.5:1。
在一个实施例中，免疫原性缀合物的至少15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型17F的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型17F的多糖可经活化并且以400至900kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有300至4,500kDa的分子量，例如，载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型17F荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为0.5至18。
所述血清型17F的免疫原性缀合物的15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一实施例提供具有1至22的氧化度的肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型17F的多糖通过在每1μg糖含量添加0.01至0.22μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为300～4,500kDa，并且分子量的分布可为15～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为0.5至18。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型17N的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型17F被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)将经纯化肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖水解以调整多糖大小的步骤；(d)使所述(c)步骤的经调整大小的多糖反应以对所述多糖进行活化的步骤；以及(e)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖的缀合物的步骤。
可提供肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物的制备方法，其中，所述(e)步骤的组合载体蛋白可通过使其与还原剂反应而与活化的所述多糖形成缀合物。
所述(d)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.22μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(e)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有400至900kDa的分子量。
所述免疫原性缀合物可具有300至4,500kDa的分子量。
经活化血清型17F荚膜多糖相比于所述载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为1:1。
在一个实施例中，免疫原性缀合物分子量的至少15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。其他实施例可提供包含免疫原性组合物的疫苗。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型20的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型20的多糖可经活化并且以400至800kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有1,000至4,000kDa的分子量，例如，所述载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型20荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为1至5。
所述血清型20的免疫原性缀合物的70至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一实施例提供具有4至16的氧化度的肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型20的多糖通过在每1μg糖含量添加0.01至0.04μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为1,000～4,000kDa，并且分子量的分布可为70～90％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为1至5。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型20被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型20荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使所述多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；及(d)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型20荚膜多糖的缀合物的步骤。
所述(d)步骤的组合载体蛋白可与还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
所述(c)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.04μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
在一实施例中，与所述(d)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有400至800kDa的分子量。
在本发明的一实施例中，通过所述方法的本发明的免疫原性缀合物可具有1,000至4,000kDa的分子量。
在一实施例中，经活化血清型20荚膜多糖相比于载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为1:1。
在一实施例中，免疫原性缀合物分子量的至少70至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。
本发明的一实施例可提供包含通过上述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；及分别缀合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
一个实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述多糖经活化并且以100至400kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述多糖经活化并且以400至900kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述多糖经活化并且以400至800kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至16,000kDa的分子量，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物具有300至4,500kDa的分子量，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，包含源自所述血清型20的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至4,000kDa的分子量。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述载体蛋白为破伤风类毒素(Tetanus toxoid，TT)或CRM197，优选地，仅包含一种血清型的免疫原性组合物可包含CRM197作为载体蛋白。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至2.0，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型17F荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至18，或当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型20荚膜多糖与载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为1至5。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，就包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的20至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或就包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的15至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或就包含源自所述血清型20的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的70至90％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，就包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为2至18，或就包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为1至22，或就包含源自血清型20的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为4至16。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的15种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、及23F，并且所述血清型与CRM197缀合。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的23种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并且在所述血清型之中，源自血清型3及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT，并且源自血清型1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖缀合至载体蛋白CRM197。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是源自彼此不同的24种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，并且所述血清型为2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，源自所述血清型1及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT并且源自血清型2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖缀合至载体蛋白CRM197。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物为生理学上可接受的媒剂。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物为疫苗。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生源自选自由肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组的任一种以上的血清型的荚膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使经所述纯化的多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；及(d)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的步骤。
在本发明的一实施例中，在源自血清型2及17F的荚膜多糖的情况下，所述制备方法可在(c)步骤之前进一步包含将肺炎链球菌的经纯化的所述荚膜多糖水解以调整多糖大小的步骤。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，所述(d)步骤的组合载体蛋白通过使其与选自由氰基硼氢化物、硼烷-吡啶及硼氢化物交换树脂构成的组的任一种以上的还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
本发明的一实施例提供包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，所述(c)步骤是在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.22μg高碘酸盐反应15至20小时的步骤。
本发明的一实施例提供通过所述方法获得的用于预防或治疗肺炎链球菌感染的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物。
一实施例可提供预防或治疗受试者中的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F感染的方法，该方法通过给受试者给药有效剂量的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物来进行，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。和/或表示“和”或“或”。
所述方法可针对选自由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组的任一种的血清型预防或治疗感染，或也可以针对选自所述组中的一种以上血清型预防或治疗感染，可预防针对15种血清型的感染，或可预防针对23种血清型的感染，或可预防针对24种血清型的感染。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物用于预防或治疗肺炎球菌感染的用途，该缀合物包含：源自选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型2的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型2的多糖可经活化并且以100至400kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有1,000至16,000kDa的分子量，例如，所述载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为0.5至2.0。
所述血清型2的免疫原性缀合物的20至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一实施例提供具有2至18的氧化度的肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型2的多糖通过在每1μg糖含量添加0.02至0.12μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为1,000～16,000kDa，并且分子量的分布可为20～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质的比率可为0.5至2.0。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型2被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型2荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)将经所述纯化肺炎链球菌血清型2荚膜多糖水解以调整多糖大小的步骤；(d)使所述(c)步骤的经调整大小的多糖反应以对多糖进行活化的步骤；以及(e)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型2荚膜多糖的缀合物的步骤。
所述(e)步骤的组合载体蛋白可通过使其与还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
所述(d)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.02～0.12μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(e)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有100至400kDa的分子量。
可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，其中载体蛋白为CRM197。
所述免疫原性缀合物可具有1,000至16,000kDa的分子量。
在一个实施例中，活化血清型2荚膜多糖相比于所述载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为0.5至2:1。
另一实施例可提供肺炎链球菌血清型2的免疫原性缀合物的制备方法，其中，免疫原性缀合物的至少20至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。
本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型9N的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
在本发明的一实施例中，所述血清型9N的多糖可经活化并且以200至700kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
所述免疫原性缀合物可具有500至4,000kDa的分子量，并且所述载体蛋白可为CRM197。
所述免疫原性缀合物中的血清型9N荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为0.1至5，优选为为0.5～2.5。
在一个实施例中，所述免疫原性缀合物的15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
在一个实施例中，所述缀合物可具有2至19的氧化度。
当肺炎链球菌血清型9N的多糖通过在每1μg糖含量添加0.02～0.19μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为500～4,000kDa，并且分子量的分布可为15～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为0.5～2.5。
本发明的一实施例可提供包含免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型9N被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使所述多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；以及(d)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖的缀合物的步骤。
可提供肺炎链球菌血清型9N的免疫原性缀合物的制备方法，其中，所述(d)步骤的组合载体蛋白与还原剂反应以与经活化多糖形成缀合物。
所述(c)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.02～0.19μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(c)步骤的氧化剂反应的多糖可具有400至900kDa的分子量。
与所述(d)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有200-700kDa的分子量。
所述免疫原性缀合物可具有500至4,000kDa的分子量。
经活化的血清型9N荚膜多糖相比于载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为0.5至2.5:1。
在一个实施例中，免疫原性缀合物的至少15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型17F的荚膜多糖；及结合至所述荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型17F的多糖可经活化并且以400至900kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有300至4,500kDa的分子量，例如，载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型17F荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为0.5至18。
所述血清型17F的免疫原性缀合物的15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一实施例提供具有1至22的氧化度的肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型17F的多糖通过在每1μg糖含量添加0.01至0.22μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为300～4,500kDa，并且分子量的分布可为15～60％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为0.5至18。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型17F被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)将经纯化肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖水解以调整多糖大小的步骤；(d)使所述(c)步骤的经调整大小的多糖反应以对多糖进行活化的步骤；以及(e)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖的缀合物的步骤。
可提供肺炎链球菌血清型17F的免疫原性缀合物的制备方法，其中，所述(e)步骤的组合载体蛋白可通过使其与还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
所述(d)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.22μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
与所述(e)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有400至900kDa的分子量。
所述免疫原性缀合物可具有300至4,500kDa的分子量。
经活化的血清型17F荚膜多糖相比于所述载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为1:1。
在一个实施例中，免疫原性缀合物分子量的至少15至60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。本发明的一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的一实施例提供肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物，该缀合物包含：源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型20的荚膜多糖；及结合至(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖的载体蛋白。
所述血清型20的多糖可经活化并且以400至800kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物可具有1,000至4,000kDa的分子量，例如，载体蛋白可为CRM197。
在本发明的一实施例中，所述免疫原性缀合物中的血清型20荚膜多糖与载体蛋白的比率(W/W)可为1至5。
所述血清型20的免疫原性缀合物的70至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。另一实施例提供具有4至16的氧化度的肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物。
当肺炎链球菌血清型20的多糖通过在每1μg糖含量添加0.01至0.04μg高碘酸盐来氧化并且与蛋白质缀合时，缀合物的分子量可为1,000～4,000kDa，并且分子量的分布可为70～90％(0.3kd以下)，并且多糖/蛋白质比率可为1至5。
本发明的一实施例可提供包含所述免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
本发明的另一实施例可提供包含所述免疫原性组合物的疫苗。
本发明的另一实施例可提供肺炎链球菌血清型20的免疫原性缀合物的制备方法，包括：(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，该细菌细胞产生肺炎链球菌血清型20被膜多糖；(b)对溶解的所述细胞中的肺炎链球菌血清型20荚膜多糖进行纯化的步骤；(c)使所述多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；以及(d)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型20荚膜多糖的缀合物的步骤。
所述(d)步骤的组合载体蛋白可与还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
所述(c)步骤可包含在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.04μg高碘酸盐反应15至20小时的过程。
在一实施例中，与所述(d)步骤的载体蛋白组合的经活化多糖可具有400至800kDa的分子量。
在本发明的一实施例中，通过所述方法的本发明的免疫原性缀合物可具有1,000至4,000kDa的分子量。
在一实施例中，经活化血清型20荚膜多糖相比于载体蛋白的最初输入比率(载体蛋白:多糖)可为1:1。
在一实施例中，免疫原性缀合物分子量的至少70至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
本发明的一实施例可提供通过所述方法获得的免疫原性缀合物。
一实施例可提供包含通过所述方法获得的免疫原性缀合物及生理学上可接受的媒剂的免疫原性组合物。
另一实施例可提供包含免疫原性组合物的疫苗。
血清型20多糖-载体蛋白缀合物的特征
在一实施方式中，缀合物可具有1,300至4,300kDa的分子量，也可具有1,250至4,250kDa的分子量，还可具有1,200至4,200kDa的分子量，还可具有1,150至4,150kDa的分子量，还可具有1,100至4,100kDa的分子量，还可具有1,000至4,000kDa的分子量。上述范围中的任何范围内的所有整数被视为实施方式。
在所述分子量范围中，缀合物的产率优异，并能够稳定地形成缀合物。另外，可减少游离糖的比率。此外，其可有助于所述分子量范围中的优异免疫原性。
本发明的免疫原性组合物通过在纯化相应多糖-蛋白质缀合物之后将其组合来配制。
本发明的血清型的多糖-蛋白质缀合物可通过糖与载体蛋白的比率(多糖的量/蛋白质的量)(重量/重量)来表征。
在一些实施方式中，所述多糖-蛋白质缀合物之中的各血清型的糖与载体蛋白的比率(w/w)可为0.1至7、0.2至7.5、0.3至7、0.4至6.5、0.5至6、0.6至6.5、0.7至6、0.8至5.8、0.9至5.6、0.95至5.3、或1至5。例如，其可为约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5。
在另一实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)可为1至5、1.2至4.5、或1.3至4。
优选地，所述载体蛋白可为CRM197。
当糖与载体蛋白的比率与上述相同时，缀合物的产率优异，且能够稳定地形成缀合物。另外，可减少游离糖的比率。此外，在上述范围的情况下，不仅免疫原性是优异的，而且可稳定地保持缀合物而没有其他血清型的干扰。
本发明的缀合物及免疫原性组合物可包含不共价地缀合至所述载体蛋白但存在于多糖-蛋白质缀合物组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与所述多糖-蛋白质缀合物缔合(即，其可非共价结合或吸附至所述多糖-蛋白质缀合物，或囊封在所述多糖-蛋白质缀合物中或通过所述多糖-蛋白质缀合物来囊封)。
在优选实施方式中，所述多糖-蛋白质缀合物包含少于各血清型的多糖总量的约70％、约60％、约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、或10％的各游离血清型的多糖。
各血清型的多糖-蛋白质缀合物还可通过其分子尺寸分布(Kd)来表征。使用尺寸排阻层析介质(CL-4B，交联琼脂糖珠粒(Cross-linked Agarose beads)，4％)，可量测所述缀合物的相对分子尺寸分布。缀合物的分子尺寸分布在重力供给管柱中使用尺寸排阻层析(SEC)来侧描。从所述介质中的孔中排除的大分子比小分子更快地溶离。通过使用溶离份收集器，收集所述管柱溶离液。所述溶离份通过比色法以糖分析来测试。对于Kd的量测，将管柱定标以设定其中分子得以完全排除的溶离份(VO)，(Kd＝0)以及展示最大保持的溶离份(Vi)，(Kd＝1)。其中达到指定样品特征的溶离份(Ve)通过式Kd＝(Ve-V0)/(Vi-V0)来与Kd关联。
在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的至少30％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
在优选实施方式中，所述血清型的多糖-蛋白质缀合物的至少95％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的至少60％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的50至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的65至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。在优选实施方式中，各血清型的多糖-蛋白质缀合物的70至90％可以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
1.4荚膜糖-载体蛋白缀合物的组合
在一实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含选自由肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20构成的组的任一种以上的多糖与蛋白质的缀合物。在一实施方式中，所述免疫原性组成物中的任一种可包含缀合物，其中源自选自由1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F构成的组的任一个以上的多糖进一步缀合至载体蛋白。
在一实施方式中，所述免疫原性组合物中的任一个多糖-蛋白质缀合物分别缀合至CRM197和/或TT。优选地，23-价或24-价免疫原性组合物可同时包含CRM197和TT作为载体蛋白，并且在此情况下，优选地，血清型5包含TT作为载体蛋白。在一实施例中，在23-价免疫原性组合物中，源自血清型3和5的多糖缀合至TT，并且源自血清型1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的多糖缀合至CRM197。在一实施例中，在24-价免疫原性组合物中，源自血清型1和5的多糖缀合至TT，并且源自血清型2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的多糖缀合至CRM197。
在一实施方式中，所述免疫原性组合物可包含源自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24种不同血清型的多糖-蛋白质缀合物。
2.免疫原性组合物的剂量
各剂量之中的荚膜糖-载体蛋白缀合物的量选择为诱导免疫保护反应而没有典型疫苗之中的显著副作用的量。如上述的量可取决于如何使用特异性免疫原及如何提供该免疫原来变化。
2.1荚膜多糖-载体蛋白缀合物的量
免疫原性组合物中的特定荚膜多糖-载体蛋白的量可基于相对于所述缀合物的总多糖(缀合及未缀合)来计算。例如，具有20％游离多糖的荚膜多糖-载体蛋白缀合物表示在100μg多糖剂量中具有约80μg缀合多糖及约20μg未缀合多糖。所述多糖-蛋白质缀合物的量可取决于所述肺炎球菌血清型而变化。所述多糖浓度可通过蒽酮或糖醛酸分析来量测。
所述免疫原性组合物中的不同多糖组分的“免疫原性量”可存在多种情况，并且其可分别包含约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、或约100μg的任一特定多糖抗原。
通常，相对于给定血清型，各剂量可包含0.1μg至100μg，具体而言，0.5μg至20μg，更具体而言，1.0μg至10μg，并且更具体而言2.0μg至5.0μg的多糖。所述范围中任一范围内的所有整数被视为实施方式。
在一实施方式中，相对于各特定荚膜糖-载体蛋白缀合物，各剂量可包含约1.0μg、约1.2μg、约1.4μg、约1.6μg、约1.8μg、约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0μg、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg或约6.0μg的多糖。
在一实施方式中，相对于源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F的多糖-蛋白质缀合物，各剂量可包含1至3μg的多糖。例如，其可包含约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、或约3.0μg的多糖。
在一实施方式中，在进一步包含源自血清型6B的多糖-蛋白质缀合物的情况下，可包含2至6μg的多糖。
2.2载体蛋白的量
在一实施方式中，所述载体蛋白可为CRM197和/或TT。
在一实施方式中，当所述载体蛋白为CRM197时，包含在免疫原性组合物中的载体蛋白的各剂量可包含10μg至150μg、20μg至100μg、25μg至95μg的载体蛋白。例如，根据本发明的一实施方式的24-价免疫原性组合物可包含70至90μg的载体蛋白。
在一实施方式中，当所述载体蛋白为TT时，包含在免疫原性组合物中的载体蛋白的各剂量可包含5μg至15μg、8μg至10μg的载体蛋白。
3.佐剂
在一些实施例中，在本发明中揭示的免疫原性组合物可进一步包含任一种以上的佐剂。术语“佐剂(Adjuvant)”是指增加针对抗原的免疫反应的化合物或混合物。在不诱导或诱导弱的抗体效价或细胞介导的免疫反应的单次给药的情况下，佐剂可以增强针对表现出弱免疫原性的抗原的免疫反应且/或可以增加针对抗原的抗体效价且/或可以减少用于在受试者中达成免疫反应的抗原的有效剂量。因此，佐剂主要发挥增加免疫反应的作用，并且此为本领域技术人员已知的。增强组合物的功效的合适佐剂包括以下，但是其不限于此：
在一个实施例中，佐剂可包括铝盐(明矾)，例如，氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。
在一个具体实施例中，佐剂为铝盐。铝盐佐剂可为明矾沉淀疫苗或明矾吸附疫苗。铝盐佐剂在本技术领域已知的。铝盐包括水合氧化铝、氧化铝水合物、氧化铝三水合物(alumina trihydrate，ATH)、铝水合物、铝三水合物、氢氧化铝(Alhydrogel)、Superfos、Amphogel、氢氧化铝(III)、羟基磷酸硫酸铝(磷酸铝佐剂(aluminum phosphate adjuvant，APA))、非晶形氧化铝、三水合氧化铝、或三羟基铝，但是不限于此。
APA为羟基磷酸铝的水性悬浮液。通过将氯化铝及磷酸钠以1:1的体积比混合并使羟基磷酸铝沉淀来制备APA。在混合过程之后，通过使用高剪切混合器减小材料的尺寸，获得尺寸在2-8μm范围内的目标聚集体颗粒。随后，将产物用盐水溶液渗滤并蒸汽灭菌。
在一个具体实施例中，使用市售的Al(OH)3(例如，Denmark/Accurate Chemicaland Scientific Co.(美国纽约韦斯特伯里)的氢氧化铝(Alhydrogel)或Superfos)以50-200g蛋白质/每毫克氢氧化铝的比率吸附蛋白质。在另一实施方式中，蛋白质的吸附取决于蛋白质的pI(等电点pH)及介质的pH而不同。具有较低pI的蛋白质比具有较高pI的蛋白质更强地吸附至带正电荷的铝离子。铝盐可以建立在2-3周内缓慢释放的Ag储集层，且/或可以涉及巨噬细胞的非特异性活化及补体活化，且/或可以刺激先天性免疫机制(可能通过尿酸刺激)。
在优选实施方式中，佐剂是选自由磷酸铝、硫酸铝及氢氧化铝构成的组的铝基佐剂。在一实施方式中，本文揭示的免疫原性组合物包含磷酸铝佐剂。
4.剂型
本发明的免疫原性组合物可以配制成液体形式(即溶液或悬浮液)或冻干形式。有利地，液体制剂可以以其包装形式直接给药，因此所述剂型对于注射为理想的，无需如本发明的冻干组合物所需在水性介质中进行重构。
可以使用在本领域中认可的方法进行本发明的免疫原性组合物的配制。例如，可以通过将单独的肺炎球菌缀合物与生理学上可接受的媒剂一起配制来制备所述组合物。如上所述的媒剂的实施例无限制地包括水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及葡萄糖溶液。
本发明提供免疫原性组合物，该组合物包含所揭示的多糖-蛋白质缀合物的组合中的任一个和医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
在一实施方式中，本发明的免疫原性组合物为液体形式，优选为水性液体形式。
本发明的免疫原性组合物可包含缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子型清洁剂、低温保护剂，例如糖及抗氧化剂，例如自由基清除剂及螯合剂，以及它们中任一各种组合中的一种以上。
在一实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含缓冲剂。在一实施方式中，所述缓冲剂具有约3.5至约7.5的pKa。在一些实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐、琥珀酸盐、组胺酸或柠檬酸盐。在若干实施方式中，所述缓冲剂是1mM至10mM的终浓度的琥珀酸盐。在一个具体实施方式中，所述琥珀酸盐的终浓度为约5mM。
在一实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方式中，所述盐选自由氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合构成的组。在优选实施方式中，所述盐为氯化钠。在一个具体实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含150mM的氯化钠。
在一实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含界面活性剂。所述界面活性剂选自由以下构成的组：聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(吐温80)、聚山梨醇酯-60(吐温60)、聚山梨醇酯-40(吐温40)及聚山梨醇酯-20(吐温20)、聚氧乙烯烷基醚(包括Brij 58、Brij 35，但不限于此)，以及其他材料，例如，任一种以上的非离子界面活性剂，包括Triton X-100；Triton X-114、NP40、Span 85及普朗尼克系列非离子界面活性剂(例如普朗尼克121)，但不限于此。在优选实施方式中，免疫原性组合物包含聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20，优选包含聚山梨醇酯-20。在优选实施方式中，免疫原性组合物包含浓度为约0.001％至约2％(优选为约0.005％以下)的聚山梨醇酯-20。
在一实施方式中，本发明的容器由玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和/或聚合物(例如，热塑性材料、弹性体、热塑性弹性体)制备。在一实施方式中，本发明的容器通过玻璃制备。
在一实施方式中，本发明提供了填充有本发明揭示的任何一种免疫原性组合物的注射剂。在一个具体实施方式中，所述注射剂用硅处理且/或通过玻璃制备。
5.用途
在一实施方式中，本发明中揭示的免疫原性组合物用作药物。组合物中缀合物的量被选择为诱导免疫保护反应而没有显著副作用的量。此量可以取决于肺炎球菌的血清型而变化。
本发明中揭示的免疫原性组合物可以通过各种治疗或预防方法用于预防、治疗或改善受试者中的细菌感染、疾病或病状。尤其，本发明中揭示的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善受试者中的肺炎链球菌感染、疾病或病状。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请案均以引用方式并入本文中。
本发明通过所附实施例来说明。除非另外具体描述，否则通过使用本领域技术人员已知的常用标准技术进行以下实施例。此等实施例是说明性的，并不限制本发明。
本发明中揭示的免疫原性组合物可以通过各种治疗或预防方法用于预防、治疗或改善受试者中的细菌感染、疾病或病状。具体而言，本发明中揭示的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善受试者中的肺炎链球菌感染、疾病或病状。
在一实施方式中，本发明提供用于预防、治疗或改善受试者中的肺炎链球菌感染、疾病或病状的方法，包括向受试者给药免疫有效剂量的本发明的免疫原性组合物。
在如上所述的实施方式中，所述感染、疾病或病状选自由肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、细菌性血症、败血症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染及脑脓肿构成的组。
在一实施方式中，本发明提供了在受试者中诱导针对肺炎链球菌的免疫反应的方法，包括向受试者给药免疫有效剂量的本发明的免疫原性组合物的步骤。
在一实施方式中，本发明中揭示的免疫原性组合物用作疫苗。在如上所述的实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物可用于预防受试者中肺炎链球菌感染。因此，在一实施方式中，本发明提供了用于预防所述受试者中肺炎链球菌感染的方法，包括将免疫有效剂量的本发明的免疫原性组合物给药受试者的步骤。
在如上所述的实施方式中，所述感染选自由肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、细菌性血症、败血症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染及脑脓肿构成的组。在一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是哺乳动物，例如人、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。
在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物用于预防、治疗或改善受试者中与肺炎链球菌有关的感染、疾病或病状的方法。在如上所述的一些实施方式中，所述感染、疾病或病状选自由肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、细菌性血症、败血症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染及脑脓肿构成的组。
在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物用作疫苗。在如上所述的实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物可用于预防受试者的肺炎链球菌感染。因此，在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物用于受试者中肺炎链球菌感染的预防方法。在如上所述的一些实施方式中，所述感染选自由肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、细菌性血症、败血症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝组织炎、软组织感染及脑脓肿构成的组。在一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是哺乳动物，例如人、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。
本发明的免疫原性组合物可用于通过全身或黏膜途径给药所述免疫原性组合物来保护或治疗对肺炎球菌感染敏感的人。在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径给药。在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射给药。在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物通过肌肉内或皮下注射给药。
在所述ELISA(酶联免疫吸附分析)方法中，将来自接种疫苗的受试者的血清的抗体与吸附在固体支持物上的多糖一起培养。通过使用酶缀合的二级检测抗体来检测结合的所述抗体。
所述ELISA量测人血清中存在的特定类型的IgG抗肺炎链球菌荚膜多糖(PS)抗体。当将人血清稀释液加入到特定类型的荚膜PS包被的微量滴定板中时，对所述荚膜PS特异的抗体与微量滴定板结合。通过使用山羊抗人IgG碱性磷酸酶标记的抗体，随后使用对硝基苯基磷酸酯受质来检测与所述板结合的抗体。
所述有色终产物的光密度与所述血清中存在的抗荚膜PS抗体的量成比例。
在一实施方式中，包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20中的任一种以上的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，可以诱导能够至少以0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4或0.5μg/ml的浓度结合至肺炎链球菌血清型15B多糖的IgG抗体，如通过人中的ELISA分析来量测的。
在一实施方式中，包含选自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20中的任一种以上的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，可以诱导形成能够在如本发明所揭示的由调理素引发的吞噬作用分析中吞噬选自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20的任一种以上的血清型的肺炎链球菌的抗体。
在一实施方式中，在OPA分析中，与针对在测试期间未缀合的天然肺炎链球菌荚膜多糖获得的OPA效价相比，包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20的任一种以上的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物具有更大的OPA效价。
量测在功能性抗体及补体存在下通过具有吞噬作用的细胞来杀死肺炎链球菌细胞的肺炎球菌调理素引发的吞噬作用分析(OPA)，被视为在评估肺炎球菌疫苗功效中的重要替代物。
调理素引发的吞噬作用分析(OPA)可以通过将肺炎链球菌细胞、待测试的热灭活人血清、分化的HL-6细胞(吞噬细胞)及外源补体供应源(例如，幼兔补体)的混合物在一起培养来进行。在培养期间，调理素引发的吞噬作用进行，并且在调理素引发的吞噬作用期间杀死包被有抗体及补体的细菌细胞。通过涂抹所述分析混合物来量测从调理素引发的吞噬作用中逃逸的存活细菌的菌落形成单位(cfu)。所述OPA效价定义为在没有测试血清的对照孔中产生50％的细菌数目减少的相互稀释。所述OPA效价由包括所述50％杀灭截止值的2种稀释剂内插。
1:8以上的终末效价被视为所述杀灭型OPA中的阳性的结果。
在一实施方式中，包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20的任一种以上的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物可针对选自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20的任一种以上的血清型诱导至少1:8的效价，如通过调理素引发的吞噬作用杀伤分析(OPA)所量测的。在一实施方式中，包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20的任一种以上的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物可以在至少60％、70％、80％、90％或至少93％的受试者中针对肺炎链球菌血清型2、9N、17F及20诱导至少1:8的效价，如通过调理素引发的吞噬作用杀伤分析(OPA)所量测的。
6.待用本发明的免疫原性组合物治疗的受试者
如本发明所揭示的，本发明中揭示的免疫原性组合物可以用于预防、治疗或改善受试者中的细菌感染、疾病或病状的各种治疗或预防方法。
在优选实施方式中，所述受试者为人类。在最佳的实施方式中，所述受试者是新生婴儿(即3个月以下)、婴儿(即3个月至1岁)或幼儿(即1岁至4岁)。
在一实施方式中，本发明揭示的免疫原性组合物用作疫苗。在如上所述的实施方式中，待接种疫苗的所述受试者可能小于1岁。例如，待接种疫苗的所述受试者可具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个月的年龄。在一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是约2个月、约4个月或约6个月。在另一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者小于2岁。例如，待接种疫苗的所述受试者具有约12个月至约15个月的年龄。在一些情况下，可能需要一剂量的根据本发明的免疫原性组合物，但在一些情形下，可以提供第二、第三或第四剂量。
在本发明的一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是50岁以上的成年人，优选为55岁以上的成年人。
在一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是65岁以上、70岁、75岁或80岁的成年人。
在一实施方式中，待接种疫苗的所述受试者是免疫缺陷个体，尤其是人。免疫缺陷个体通常被定义为具有减少或降低的针对病原体攻击来启动正常体液或细胞防御的能力的人。
在本发明的一实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者患有损害免疫***的疾病或病状，并产生不足以防止肺炎球菌疾病或治疗所述疾病的抗体反应。
在一实施方式中，所述疾病是原发性免疫缺陷疾病。优选地，所述原发性免疫缺陷疾病选自由复合T细胞及B细胞免疫缺陷、抗体缺乏、明确的症候群、免疫调节障碍疾病、吞噬细胞疾病、先天性免疫缺陷、自身炎症疾病及补体缺乏构成的组。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可患有选自以下构成的组的疾病：HIV感染、后天性免疫缺陷症候群(AIDS)、癌症、慢性心脏病或肺病、淤血性心力衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障碍(例如，镰状细胞病)、脾功能缺陷(无脾)、血液***恶性肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、淋巴瘤、肾功能不全、肾病症候群及哮喘。
在本发明的一实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可能患有营养不良。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可能在接受降低身体对感染的抵抗力的药物或治疗。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可以为吸烟者。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可具有5×109细胞/升以下、或4×109细胞/升以下、或3×109细胞/升以下、或2×109细胞/升以下、或1×109细胞/升以下、或0.5×109细胞/升以下、或0.3×109细胞/升以下、或0.1×109细胞/升以下的白细胞数(白血球数)。
白细胞数(白血球数)：血液中的白细胞(WBC)数。所述WBC大致作为CBC(全血细胞数)的一部分进行量测。白血球细胞是感染抗击性细胞，并且不同于作为红血球的红(氧气输送)血球细胞。
有不同类型的白血球，例如，嗜中性球(多形核白血球，PMN)、杆状核细胞(一些未成熟的嗜中性球)、T型淋巴球(T细胞)、B型淋巴球(B细胞)、单核球、嗜酸球及嗜碱球。所述类型的白血球均反映为白血球的数量。所述白血球细胞的正常范围大多为4,300至10,800细胞/血液立方毫升。此也称为白血球数，并且它可以由国际单位表示为4.3至10.8×109/升。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者患有嗜中性球减少症。在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可以具有2×109细胞/升以下、或1×109细胞/升以下、或0.5×109细胞/升以下、或0.1×109细胞/升以下、或0.05×109细胞/升以下的嗜中性球数。
白血球细胞数量少或“嗜中性球减少症”是以循环血液中异常低水平的嗜中性球为特征的病状。嗜中性球是一种独特的白血球细胞，其有助于预防感染并且抗击感染。癌症患者患嗜中性球减少症的最常见原因是化疗的副作用。化疗引起的嗜中性球减少症会增加患者的感染风险并停止癌症治疗。
在本发明的一具体实施方式中，待接种疫苗的免疫缺陷的所述受试者可以具有500/mm3以下的CD4+细胞数、或300/mm3以下的CD4+细胞数、或200/mm3以下的CD4+细胞数、或100/mm3以下的CD4+细胞数、或75/mm3以下的CD4+细胞数、或50/mm3以下的CD4+细胞数。
通常将CD4细胞测试报告为mm3的细胞数。正常CD4数量为500到1,600，并且CD8数量为375到1,100。CD4数量在HIV感染者中显著下降。
在本发明的一实施方式中，本发明揭示的免疫缺陷受试者的任何受试者可以为男人或女人。
7.规定的服用法
在一些情况下，可能需要一剂量的根据本发明的免疫原性组合物，但在一些情形下，例如，在更严重的免疫缺陷的条件下，可以提供第二、第三或第四剂量。在初次接种疫苗后，受试者可以以适当的间隔接受一或多次的附加免疫接种。
在一实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物的疫苗接种方案是单剂量。在一具体实施方式中，所述单剂量方案是针对至少2岁的健康人。
在一实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物的疫苗接种方案是多剂量方案。在一具体实施方式中，所述多剂量方案由以约一个月至约两个月的间隔分开的一系列的2次量组成。在一具体实施方式中，所述多剂量方案由以约1个月的间隔分开的一系列的2次量组成，或由以约2个月的间隔分开的一系列的2次量组成。
在另一实施方式中，所述多剂量方案由以约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的3次量组成。在另一实施例中，多剂量方案由以约1个月的间隔分开的一系列的3次量组成，或由以约2个月的间隔分开的一系列的3次量组成。
在另一实施例中，所述多剂量方案由以约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的3次量及在所述第一剂量后约10个月至约13个月的第四次量组成。在另一实施例中，所述多剂量方案由以约1个月的间隔分开的一系列的3次量及在所述第一剂量后约10个月至约13个月的第四次量组成，或由以约2个月的间隔分开的一系列的3个次量及在所述第一剂量后约10个月至约13个月的第四次量组成。
在一实施方式中，所述多剂量方案由1岁时的至少1次量(例如，1、2或3次量)及后续至少1个剂量的幼儿剂量组成。
在一实施方式中，所述多剂量方案由在2个月龄开始后以约1个月至约2个月的间隔(例如，剂量之间的28至56天)分开的一系列的2或3次量，以及12至18个月的后续幼儿剂量组成。在一实施方式中，多剂量方案由在2个月开始后以约1个月至约2个月的间隔(例如，剂量之间的28至56天)分开的一系列3个剂量，以及12至15个月的后续幼儿剂量组成。在另一实施例中，所述多剂量方案由在2个月开始后以约2个月的间隔分开的一系列的2次量，以及12至18个月的后续幼儿剂量组成。
在一实施方式中，所述多剂量方案由在2、4、6及12至15个月龄的一系列4次疫苗剂量组成。
在一实施方式中，初始剂量在第0天提供，并且一次以上的附加剂量以约2至约24周的间隔提供，优选地，以4至8周的给药间隔提供。
在一实施方式中，初始剂量在第0天提供，附加剂量在约3个月后提供。
发明效果
本发明可以提供用于先前未提供保护范围的血清型17F等新血清型的免疫原性缀合物。
本发明可通过包含先前未提供保护范围的新血清型缀合物而提供能够提供广泛保护范围的多价肺炎球菌疫苗。
另外，能够形成针对各种肺炎球菌血清型的抗体而没有任何特殊的干扰现象，从而提供广谱的免疫性。
本发明能够提供优异的抗体效价。
本发明的多价肺炎球菌疫苗表现出较少的副作用。
本发明的疫苗可以接种给婴儿及幼儿，并可以接种给老年人。
具体实施方式
在下文中，将参考以下实施例等来描述本发明以更具体地描述本发明。然而，根据本发明的实施例可以变形为各种其他形式，并且本发明的范围不应该被解释为限于下面描述的实施例。提供本发明的实施例来说明本发明，以便于具体理解本发明。
实施例1.制备源自血清型2、9N、17F或20的多糖-蛋白质缀合物疫苗
[1.源自肺炎链球菌血清型2的多糖-蛋白质缀合物]
从肺炎链球菌血清型2制备多糖-蛋白质缀合物
制作主细胞库和制备用细胞库
肺炎链球菌血清型2获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)(菌株ATCC 6302)。为了增强菌株并去除动物来源的成分，将种子储备物(seed stock)培养数代。使用作为冷冻保存剂的合成甘油将种子小瓶冷冻(<-70℃)。为了制作细胞库，所有培养物都在基于大豆的培养基中增殖。在冷冻之前，通过离心浓缩细胞并去除用过的培养基，随后将细胞沉淀重悬于含有冷冻保存剂(例：合成甘油)的新培养基中。
发酵
使用来自制备用细胞库的培养物，将其接种到含有基于大豆的培养基的种子瓶(seed bottle)中。在满足生长要求之前，将其在一定温度下培养而不进行搅拌。使用种子瓶，将其接种到含有基于大豆的培养基的能够控制温度、pH及搅拌速度的种子发酵罐中。在生长中断后，或在达到发酵罐的工作容量时，终止发酵。添加灭活剂来终止发酵过程后，使用连续流动离心及过滤的组合去除细胞残余物。
纯化
肺炎球菌多糖的纯化由多层过滤、数次浓缩/渗滤工作及沉淀/溶离步骤组成。
活化
通过依次加入计算量的0.1N盐酸溶液及WFI，调节多糖浓度，使最终浓度在0.01N盐酸溶液中为约2.0g/L。使多糖的水解，水解反应在60℃下进行60分钟。将反应溶液的温度降至室温后，通过加入0.1M磷酸一氢钠溶液将反应pH调节至约6.0。调节pH后，将温度调节至23℃。通过向每1mg多糖加入约0.023～0.114mg的高碘酸钠而引发氧化。氧化反应在23℃下进行18小时。
使用100kDa MWCO超滤膜进行经活化多糖的浓缩及渗滤。在10倍渗滤体积的WFI上进行渗滤。随后，将经纯化的活化多糖在2～8℃下储存。经纯化的活化多糖尤其通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定的醛浓度、(iii)氧化度及(iv)通过SEC-MALLS的分子量。
SEC-MALLS用于测定多糖及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于按照流体动力学体积来分离多糖。折射率(RI)及多角度雷射光散射检测器(MALLS)用于分子量测定。当光与物质相互作用时，光会散射，并且经散射光的量与浓度、dn/dc的平方(特异折射率增加)及物质的摩尔质量有关。基于来自MALLS检测器的经散射光信号及来自RI检测器的浓度信号的读数值计算分子量量测值。
经活化的多糖的氧化度(DO)通过“糖重复单元的摩尔数÷醛的摩尔数”来测定。通过各种比色法，例如，使用蒽酮(Anthrone)法，测定糖重复单元的摩尔数。另外，同时，使用Park-Johnson比色法测定醛的摩尔数。
优选地，通过所述方法获得的经活化的肺炎链球菌血清型2荚膜多糖具有2至18的氧化度及约100kDa至400kDa的分子量。
缀合工序
以每克经活化的所述多糖对2至8g的蔗糖的比率，将经活化的多糖与蔗糖组合。随后，将组合混合物的瓶子冻干。冻干后，将含有经冻干活化多糖的瓶子在-20至-30℃下储存。将计算量的CRM197蛋白分别冻干。将冻干的CRM197储存在-20至-30℃。
将冻干的经活化多糖在无水二甲基亚砜溶液(DMSO)中重构。当完成多糖的溶解时，为了重构，将无水DMSO加入到冻干的CRM197中。在反应容器中将重构的经活化的多糖与重构的CRM197(输入比率0.5至2:1)组合，随后将其充分混合。通过向反应混合物中加入1.0摩尔当量的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)来引发缀合反应。将WFI以1％(v/v)的目标浓度加入到反应混合物中，并使其在23℃下反应22至26小时。通过向反应混合物中加入2.0摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)并以5％(v/v)的目标浓度添加WFI来将未反应的醛封端，从而终止缀合反应。所述封端反应在23℃下进行4.5小时。
在制备过程中，用0.9％氯化钠溶液稀释所述缀合物溶液，以便通过使用100kDaMWCO膜的浓缩及渗滤来进行纯化。使稀释的所述缀合物溶液穿过0.8μm过滤器，并使用15倍至40倍的渗滤体积的0.9％氯化钠以进行渗滤。完成所述渗滤后，将残余溶液借助0.2μm过滤器过滤。将缀合物溶液用0.9％氯化钠溶液稀释至小于约0.55mg/mL浓度，并灭菌过滤后在2至8℃下储存。
经纯化的血清型2缀合物通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定(Lowry)的蛋白质浓度、(iii)多糖与蛋白质的比率、(iv)通过尺寸排阻层析(CL-4B)的分子尺寸分布、(iv)游离糖的含量及(v)通过SEC-MALLS的分子量。
基于所述制备方法调节氧化度(DO)来观察血清型2缀合物的特征变化。结果概述于表1中。
[表1]
Figure BDA0002726669040000391
通过在所述制备方法的基础上调节冻干过程中经活化多糖与CRM197的混合比，观察血清型2缀合物的特征变化。结果概述于表2中。
[表2]
Figure BDA0002726669040000392
血清型2多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
配制包含均与CRM197单独缀合的来自肺炎链球菌血清型2的多糖-蛋白质缀合物的单价缀合物组合物。
使用ELISA在兔中分析所述表1及表2的单价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中的血清型特异性IgG浓度。
5只2.5kg至3.5kg的雌性新西兰白兔组在第0周通过肌肉内途径用所建议的人临床剂量(缀合物2.2μg，+作为AlPO4的铝0.25mg/ml)来免疫接种。在第2周用相同剂量的缀合物疫苗进一步对所述兔子免疫接种，随后在第4周进行血液采集。在第0及第4血清样品中进行血清型特异性ELISA。
分析结果如表3所示。用单价缀合物组合物(缀合物编号1-6)免疫接种的兔表现出针对血清型2的总IgG效价的显著增加。在用其他缀合物免疫接种的兔中，也显示出总IgG效价的显著增加。
下表3的值是显示用所述表1的缀合物编号1-6免疫接种后量测的IgG浓度的结果。
[表3]
Figure BDA0002726669040000401
[2.源自肺炎链球菌血清型9N多糖-蛋白质缀合物]
源自肺炎链球菌血清型9N的多糖-蛋白质缀合物的制备
制作主细胞库和制备用细胞库
肺炎链球菌血清型9N获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)(菌株ATCC 6309)。以与血清型2相同的方式进行。
发酵
以与血清型2相同的方式进行。
纯化
以与血清型2相同的方式进行。
活化
通过依次添加计算量的WFI来提供约2.0g/L的最终多糖浓度。若需要，则将反应pH调节至约6.0。调节pH后，将反应温度调节至23℃。通过在约每1mg糖中加入0.024～0.189mg的高碘酸钠来引发氧化。氧化反应在23℃下进行18小时。
使用100kDa MWCO超滤膜进行经活化多糖的浓缩及渗滤。在10倍渗滤体积的WFI上进行渗滤。随后，将经纯化的活化多糖在2～8℃下储存。经纯化的活化多糖尤其通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定的醛浓度、(iii)氧化度及(iv)通过SEC-MALLS的分子量。
SEC-MALLS用于测定多糖及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于按照流体动力学体积来分离多糖。折射率(RI)及多角度雷射光散射检测器(MALLS)用于分子量测定。当光与物质相互作用时，光会散射，并且散射光的量与浓度、dn/dc的平方(特异折射率增加)及物质的摩尔质量有关。基于来自MALLS检测器的散射光信号及来自RI检测器的浓度信号的读数值计算分子量量测值。
经活化多糖的氧化度(DO)通过“糖重复单元的摩尔数÷醛的摩尔数”来测定。通过各种比色法，例如，使用蒽酮(Anthrone)法，测定糖重复单元的摩尔数。另外，同时，使用Park-Johnson比色法测定醛的摩尔数。
优选地，通过所述方法获得的经活化的肺炎链球菌血清型9N荚膜多糖具有2至19的氧化度及约200kDa至700kDa的分子量。
缀合工序
以每克经活化的的所述多糖对0.5至2克的CRM197的比率，将经活化的多糖与载体蛋白CRM197组合。随后，将组合的混合物冻干。冻干后，将经活化多糖及CRM197的冻干混合物在-20℃下储存。
将经活化的多糖及CRM197的冻干混合物在0.1M磷酸钠溶液中重构，随后充分混合。反应溶液中的最终多糖浓度为约10至20g/L。通过向混合物中加入1.2摩尔当量的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)来引发缀合，并使其在37℃下反应48小时。通过加入与缀合反应溶液相同体积的0.9％氯化钠溶液，随后加入2.0摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)来将未反应的醛封端，从而终止缀合反应。所述封端反应在23℃下进行4.5小时。
在制备过程中，用0.9％氯化钠溶液稀释所述缀合物溶液，以便通过使用100kDaMWCO膜的浓缩及渗滤来进行纯化。使稀释的所述缀合物溶液穿过0.45μm过滤器，并通过浓缩及渗滤来进行纯化。使用100kDa MWCO膜的渗滤使用15倍至40倍的渗滤体积的0.9％氯化钠溶液进行。完成所述渗滤后，将残余溶液借助0.2μm过滤器过滤。将缀合物溶液稀释至小于约0.55mg/mL浓度，并灭菌过滤后在2至8℃下储存。
经纯化的血清型9N缀合物通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定(Lowry)的蛋白质浓度、(iii)多糖与蛋白质的比率、(iv)通过尺寸排阻层析(CL-4B)的分子尺寸分布、(iv)游离糖的含量及(v)通过SEC-MALLS的分子量。
基于所述制备方法调节氧化度(DO)来观察血清型9N缀合物的特征变化。结果概述于表4中。
[表4]
Figure BDA0002726669040000421
通过在所述制备方法的基础上调节冻干过程中经活化多糖与CRM197的混合比，观察血清型9N缀合物的特征变化。结果概述于表5中。
[表5]
Figure BDA0002726669040000422
通过在所述制备方法的基础上调节缀合反应溶液中的多糖浓度，观察血清型9N缀合物的特征变化。结果概述于表6中。
[表6]
Figure BDA0002726669040000423
血清型9N多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
配制包含均与CRM197单独缀合的来自肺炎链球菌血清型9N的多糖-蛋白质缀合物的单价缀合物组合物。
使用ELISA在兔中分析所述表4至表6的单价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中的血清型特异性IgG浓度。
以与血清型2相同的方式，向雌性新西兰白兔组通过肌肉内途径来免疫接种。
分析结果如表7所示。用单价缀合物组合物(缀合物编号2-8)免疫接种的兔表现出针对血清型9N的总IgG效价的显著增加。在用其他缀合物免疫接种的兔中，也显示出总IgG效价的显著增加。
下表7的值是显示用所述表5的缀合物编号2-8免疫接种后量测的IgG浓度的结果。
[表7]
Figure BDA0002726669040000431
[3.源自肺炎链球菌血清型17F多糖-蛋白质缀合物]
源自肺炎链球菌血清型17F的多糖-蛋白质缀合物的制备
制作主细胞库和制备用细胞库
肺炎链球菌血清型17F获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)(菌株ATCC 6317)。为了增强菌株并去除动物来源的成分，将种子储备物(seed stock)培养数代。以与血清型2相同的方式进行。
发酵
以与血清型2相同的方式进行。
纯化
以与血清型2相同的方式进行。
活化
通过依次加入计算量的0.1N盐酸溶液及WFI，调节多糖浓度，使最终浓度在0.01N盐酸溶液中为约2.0g/L。对多糖进行水解，水解反应在约60℃下进行60分钟。将反应溶液的温度降至室温后，通过加入0.1M磷酸一氢钠溶液将反应pH调节至约6.0。调节pH后，将温度调节至23℃。通过在每1mg糖加入约0.008～0.219mg的高碘酸钠来引发氧化。氧化反应在23℃下进行18小时。
使用100kDa MWCO超滤膜进行经活化多糖的浓缩及渗滤。在10倍渗滤体积的WFI上进行渗滤。随后，将经纯化的活化多糖在2～8℃下储存。经纯化的活化多糖尤其通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定的醛浓度、(iii)氧化度及(iv)通过SEC-MALLS的分子量。
SEC-MALLS用于测定多糖及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于按照流体动力学体积来分离多糖。折射率(RI)及多角度雷射光散射检测器(MALLS)用于分子量测定。当光与物质相互作用时，光会散射，并且散射光的量与浓度、dn/dc的平方(特异折射率增加)及物质的摩尔质量有关。基于来自MALLS检测器的散射光信号及来自RI检测器的浓度信号的读数值计算分子量量测值。
经活化的多糖的氧化度(DO)通过“糖重复单元的摩尔数÷醛的摩尔数”来测定。通过各种比色法，例如，使用蒽酮(Anthrone)法，测定糖重复单元的摩尔数。另外，同时，使用Park-Johnson比色法测定醛的摩尔数。
优选地，通过所述方法获得的经活化的肺炎链球菌血清型17F荚膜多糖具有1至22的氧化度及约400kDa至900kDa的分子量。
缀合工序
以每克经活化的多糖对1.0克的CRM197的比率，将经活化的多糖与载体蛋白CRM197组合。随后，将组合的混合物冻干。冻干后，将经冻干活化多糖及CRM197的冻干混合物在-20℃下储存。
将冻干的经活化的多糖及CRM197的冻干混合物在0.1M磷酸钠溶液(pH 7.2±0.1)中重构。反应溶液中的最终多糖浓度为15.0至25.0g/L。通过向反应混合物中加入1.2摩尔当量的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)来引发缀合，并使其在37℃下反应48小时。通过加入与缀合反应溶液相同体积的0.9％氯化钠溶液和2.0摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)来将未反应的醛封端，从而终止缀合反应。所述封端反应在23℃下进行4.5小时。
在制备过程中，用0.9％氯化钠溶液稀释所述缀合物溶液，以便通过使用100kDaMWCO膜的浓缩及渗滤来进行纯化。使稀释的所述缀合物溶液穿过0.45μm过滤器，通过第二阶段浓缩及渗滤来进行纯化。使用20倍渗滤体积的0.9％氯化钠溶液以进行使用100kDaMWCO膜的渗滤。完成初步渗滤后，将残余溶液借助0.2μm过滤器过滤，并在2至8℃下储存。将缀合物溶液稀释至小于约0.55mg/mL浓度，并灭菌过滤后在2至8℃下储存。
纯化的血清型17F缀合物通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定(Lowry)的蛋白质浓度、(iii)多糖与蛋白质的比率、(iv)通过尺寸排阻层析(CL-4B)的分子尺寸分布、(iv)游离糖的含量及(v)通过SEC-MALLS的分子量。
基于制备方法调节氧化度(DO)及反应溶液中的多糖浓度，观察血清型17F缀合物的特征变化。结果概述于表8中。
[表8]
Figure BDA0002726669040000451
血清型17F多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
配制包含均与CRM197单独缀合的来自肺炎链球菌血清型17F的多糖-蛋白质缀合物的单价缀合物组合物。
使用ELISA在兔中分析所述表8的单价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中的血清型特异性IgG浓度。
以与血清型2相同的方式，向雌性新西兰白兔组通过肌肉内途径来免疫接种。
分析结果如表9所示。用单价缀合物组合物(缀合物编号3-8)免疫接种的兔表现出针对血清型17F的总IgG效价的显著增加。在用其他缀合物免疫接种的兔中，也显示出总IgG效价的显著增加。
下表9的值是显示用所述表8的缀合物编号3-8免疫接种后量测的IgG浓度的结果。
[表9]
Figure BDA0002726669040000461
[4.源自肺炎链球菌血清型20多糖-蛋白质缀合物]
源自肺炎链球菌血清型20的多糖-蛋白质缀合物的制备
制作主细胞库和制备用细胞库
肺炎链球菌血清型20获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)(菌株ATCC 6320)。以与血清型2相同的方式进行。
发酵
以与血清型2相同的方式进行。
纯化
以与血清型2相同的方式进行。
活化
通过依次加入计算量的0.1N盐酸溶液及WFI，调节多糖浓度，使最终浓度在0.01N盐酸溶液中为约2.0g/L。通过在每1mg糖添加约0.010～0.038mg的高碘酸钠来引发氧化。氧化反应在23℃下进行18小时。
使用100kDa MWCO超滤膜进行经活化多糖的浓缩及渗滤。在10倍渗滤体积的WFI上进行渗滤。随后，将经纯化的活化多糖在2～8℃下储存。经纯化的活化多糖尤其通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定的醛浓度、(iii)氧化度及(iv)通过SEC-MALLS的分子量。
SEC-MALLS用于测定多糖及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于按照流体动力学体积来分离多糖。折射率(RI)及多角度雷射光散射检测器(MALLS)用于分子量测定。当光与物质相互作用时，光会散射，并且散射光的量与浓度、dn/dc的平方(特异折射率增加)及物质的摩尔质量有关。基于来自MALLS检测器的散射光信号及来自RI检测器的浓度信号的读数值计算分子量量测值。
经活化的多糖的氧化度(DO)通过“糖重复单元的摩尔数÷醛的摩尔数”来测定。通过各种比色法，例如，使用蒽酮(Anthrone)法，测定糖重复单元的摩尔数。另外，同时，使用Park-Johnson比色法测定醛的摩尔数。
优选地，通过所述方法获得的经活化的肺炎链球菌血清型20荚膜多糖具有4至16的氧化度及约400kDa至800kDa的分子量。
缀合工序
以每克经活化的多糖对1.0克的CRM197的比率，将经活化的多糖与载体蛋白CRM197组合。随后，将组合的混合物冻干。冻干后，将冻干的经活化多糖及CRM197的冻干混合物在-20℃下储存。
将冻干的经活化的多糖及CRM197的冻干混合物在0.1M磷酸钠溶液(pH 7.2±0.1)中重构。反应溶液中的最终多糖浓度为约15.0g/L。通过向反应混合物中加入1.2摩尔当量的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)来引发缀合，并使其在37℃下反应48小时。通过加入与缀合反应溶液相同体积的0.9％氯化钠溶液和2.0摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)来将未反应的醛封端，从而终止缀合反应。所述封端反应在23℃下进行4.5小时。
在制备过程中，用0.9％氯化钠溶液稀释所述缀合物溶液，以便通过使用100kDaMWCO膜的浓缩及渗滤来进行纯化。使稀释的所述缀合物溶液穿过0.45μm过滤器，通过第二阶段浓缩及渗滤来进行纯化。使用20倍渗滤体积的0.9％氯化钠溶液以进行使用100kDaMWCO膜的渗滤。完成初步渗滤后，将残余溶液借助0.2μm过滤器过滤，并在2至8℃下储存。将缀合物溶液稀释至小于约0.55mg/mL浓度，并灭菌过滤后在2至8℃下储存。
纯化的血清型20缀合物通过以下来表征：(i)通过比色测定的多糖浓度、(ii)通过比色测定(Lowry)的蛋白质浓度、(iii)多糖与蛋白质的比率、(iv)通过尺寸排阻层析(CL-4B)的分子尺寸分布、(iv)游离糖的含量及(v)通过SEC-MALLS的分子量。
基于制备方法调节氧化度(DO)来观察血清型20缀合物的特征变化。结果概述于表10中。
[表10]
Figure BDA0002726669040000481
肺炎链球菌血清型20多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
配制包含均与CRM197单独缀合的来自肺炎链球菌血清型20的多糖-蛋白质缀合物的单价缀合物组合物。
使用ELISA在兔中分析所述表10的单价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中的血清型特异性IgG浓度。
以与血清型2相同的方式，向雌性新西兰白兔组通过肌肉内途径来免疫接种。
分析结果如表11所示。用单价缀合物组合物(缀合物编号4-7)免疫接种的兔表现出针对血清型20的总IgG效价的显著增加。在用其他缀合物免疫接种的兔中，也显示出总IgG效价的显著增加。
下表11的值是显示用所述表10的缀合物编号4-7免疫接种后量测的IgG浓度的结果。
[表11]
Figure BDA0002726669040000482
实施例2.多价肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的制备
[5.肺炎链球菌15价多糖-蛋白质缀合物]
肺炎链球菌15价多糖-蛋白质缀合物的制备
配制包含均与CRM197单独缀合的源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F及23F的多糖-蛋白质缀合物的15价缀合物组合物(15vPnC)。
对于血清型2及9N，通过上述方法制备缀合物，并且对于其他血清型，根据韩国专利申请2012-0065893中揭示的方法制备缀合物。
基于批料体积及本体糖浓度来计算最终本体浓缩物的所需体积。将所需量的0.85％氯化钠、聚山梨醇酯80及琥珀酸盐缓冲剂添加至预先标记的制剂化容器中，随后添加本体浓缩物。将其充分混合并且借助0.22μm过滤器过滤。在添加本体磷酸铝期间及之后，将制剂化的本体溶液缓慢混合。检查pH并在必要时进行调节。制剂化的本体产物在2至8℃下储存。得到的疫苗组合物在总量0.5mL中含有2.2μg的各糖类、除6B为4.4μg、约32μg的CRM197载体蛋白、0.125mg的铝元素(0.5mg磷酸铝)佐剂、约4.25mg的氯化钠、约295μg的琥珀酸盐缓冲剂及约100μg的聚山梨醇酯80。
肺炎链球菌15价多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
IgG浓度量测
使用ELISA在兔中分析所述15价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中血清型特异性IgG浓度。
6只2.5kg至3.5kg的雌性新西兰白兔组在第0周通过肌肉内途径用所建议的人临床剂量(缀合物2.2μg，除血清型6b测定为4.4μg以外；+作为AlPO4的铝0.25mg/ml)来免疫接种。在第3周用相同剂量的缀合物疫苗进一步对所述兔子免疫接种，随后以3周的间隔进行血液采集。在每周的血清样品中进行血清型特异性ELISA。
通过IgG ELISA评估根据本发明的疫苗制剂及比例实施例的疫苗制剂的血清型特异性免疫反应。分析结果概述于表12中。该表显示接种后随时间推移的IgG浓度(U/mL)。结果表明，用所述15vPnC免疫接种的兔产生出不能通过Prevnar13获得的针对血清型2及9N的抗体，尤其，与Prevnar13相比，可诱导同等或优异的血清IgG效价，尽管添加血清型使价数增加。
[表12]
Figure BDA0002726669040000491
Figure BDA0002726669040000501
OPA分析结果
为了确认15价多糖-蛋白质缀合物是否诱导功能性抗体反应，进行多重调理吞噬杀伤测定(Multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA)。
通过按照每个受试者收集相同量的血清，在相同的组之间将血清汇集(pooling)。按照每个血清，将肺炎链球菌在THY培养基中培养，并稀释至1000CFU/10uL。将调理作用缓冲剂(Opsonization buffer)200μL、稀释的血清10μL及稀释的肺炎链球菌10μL混合，并使其在室温下反应1小时。添加预分化的HL-60细胞及补体的混合溶液，并且使其在CO2培养箱(37℃)中反应1小时。通过降低温度来中断吞噬作用，并将反应溶液5uL在预先干燥30至60分钟的琼脂培养基中涂上。将其在CO2培养箱(37℃)中培养12至18小时，并计数菌落数。OPA效价由观察到50％死亡的稀释率表示。作为比较例，使用13价疫苗(Prevnar13，Pfizer)以相同方式评价，并且结果概述在表13中。
[表13]
Figure BDA0002726669040000502
Figure BDA0002726669040000511
[6.肺炎链球菌23-价多糖-蛋白质缀合物]
肺炎链球菌23-价多糖-蛋白质缀合物的制备
配制23价缀合物组合物(23vPnC)，该组合物包含：源自肺炎链球菌血清型1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的多糖与CRM197缀合的多糖-蛋白质缀合物，以及肺炎链球菌血清型3及5与TT(Tenus toxoid)缀合的多糖-蛋白质缀合物。
对于血清型2、9N、17F及20，通过上述方法制备缀合物，并且对于其他血清型，根据韩国专利申请2012-0065893、美国专利申请62/371,529、62/371,553及62/626,482中揭示的方法制备缀合至CRM197或TT的缀合物。
基于批料体积及本体糖浓度来计算最终本体浓缩物的所需体积。将所需量的0.85％氯化钠、聚山梨醇酯80及琥珀酸盐缓冲剂添加至预先标记的制剂化容器中，随后添加本体浓缩物。将其充分混合并且借助0.22μm过滤器过滤。在添加本体磷酸铝期间及之后，将制剂化的本体溶液缓慢混合。检查pH并在必要时进行调节。制剂化的本体产物在2至8℃下储存。得到的疫苗组合物在总量0.5mL中含有2.2μg的各糖类、除4.4μg的6B以外、约50至85μg的CRM197载体蛋白、实验量的铝佐剂(例如，在表14中的第4组的情况下，0.125mg的铝元素，即0.5mg磷酸铝)、约4.25mg的氯化钠、约295μg的琥珀酸盐缓冲剂及约100μg的聚山梨醇酯80。
肺炎链球菌23价多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
IgG浓度量测
使用ELISA在兔中分析所述23价免疫原性组合物的免疫原性，从而量测血清中血清型特异性IgG浓度。研究了含有佐剂的23vPnC疫苗的诱导血清型特异性免疫反应的能力。
5只2.5kg至3.5kg的雌性新西兰白兔组在第0周通过肌肉内途径用所建议的人临床剂量(缀合物2.2μg，除血清型6b测定为4.4μg以外)(其中分别包含0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml及1mg/ml作为AlPO4的铝)来免疫接种。在第2周用相同剂量的缀合物疫苗进一步对所述兔子免疫接种，随后在第4周进行血液采集。在第0及第4血清样品中进行血清型特异性ELISA。
作为比较实施例，使用13价疫苗(Prevnar13，Pfizer)以相同方式评价，并且分析结果概述在表14中。该表显示接种后第4周的IgG浓度(U/mL)。
提出了在给药23vPnV疫苗及Prevnar13两次后，在汇集(pooled)的血清样品中量测的几何平均效价(Geometric Mean Titer，GMT)。此等数据表明，当佐剂包含在23vPnV制剂中时，与不含佐剂的相同疫苗相比，诱导了更高水平的IgG抗体。尤其，证实可以获得包含所有血清型2、9N、17F及20的23价免疫原性疫苗。如在以下结果中可以发现，尤其，可以产生不能通过Prevnar13获得的针对血清型2及其类似血清型的抗体。此外，证实它可以诱导针对所有包含的血清型的免疫反应，而不会极大地影响针对其他血清型的抗原的抗体的产生，尽管价数大大增加。
[表14]
Figure BDA0002726669040000521
Figure BDA0002726669040000531
[7.肺炎链球菌24-价多糖-蛋白质缀合物]
肺炎链球菌24-价多糖蛋白质缀合物的制备
配制24价缀合物组合物(24vPnC)，该组合物包含：源自肺炎链球菌血清型2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的多糖与CRM197缀合的多糖-蛋白质缀合物，以及肺炎链球菌血清型1及5与TT(Tenus toxoid)缀合的多糖-蛋白质缀合物。对于血清型2、9N、17F及20，通过前述方法制备缀合物，并且对于其他血清型，根据韩国专利申请2012-0065893、美国专利申请62/371,529、62/371,553及62/626,482中揭示的方法制备缀合至CRM197或TT的缀合物。
基于批料体积及本体糖浓度来计算最终本体浓缩物的所需体积。将所需量的0.85％氯化钠、聚山梨醇酯80及琥珀酸盐缓冲剂添加至预先标记的制剂化容器中，随后添加本体浓缩物。将其充分混合并且借助0.22μm过滤器过滤。在添加本体磷酸铝期间及之后，将制剂化的本体溶液缓慢混合。检查pH并在必要时进行调节。制剂化的本体产物在2至8℃下储存。得到的疫苗组合物在总量0.5mL中含有2.2μg的各糖类、除6B为4.4μg、约50至90μg的CRM197载体蛋白、0.125mg的铝元素佐剂(0.5mg磷酸铝)、约4.25mg的氯化钠、约295μg的琥珀酸盐缓冲剂、及约100μg的聚山梨醇酯80。
肺炎链球菌24-价多糖-蛋白质缀合物的免疫原性研究
OPA分析结果
为了确认24价多糖-蛋白质缀合物是否诱导功能性抗体反应，以与所述15价疫苗相同的方式在三只兔子中进行调理吞噬杀伤测定(Opsonophagocytic killing assay，OPA)。
[表15]
血清型 PCV24 Prevnar 13
1 309 54
2 490 -
3 407 393
4 1290 2072
5 1516 306
6A 1817 2355
6B 2888 1614
7F 1277 952
8 279 -
9N 653 52
9V 178 324
10A 658 -
11A 675 -
12F 471 -
14 959 539
15B 371 -
17F 348 -
18C 1357 1996
19A 642 1870
19F 1521 1516
20 306 -
22F 1703 -
23F 1531 928
33F 428 -
通过该结果，证实可以获得包含所有血清型2、9N、17F及20的24价疫苗。从所述结果中可以发现，尤其，可以产生不能通过Prevnar13获得的针对血清型2、17F及其类似血清型的抗体。此外，证实了可以诱导针对所有包含的血清型的免疫反应而不会极大地影响针对其他血清型的抗原的抗体的产生，尽管将11种血清型添加到Prevnar13。
工业适用性
本发明一个实施例的免疫原性组合物可用作药物。
本发明一个实施例的免疫原性组合物可用作用于预防、治疗或改善细菌感染、疾病或病状的各种治疗或预防方法。尤其，本发明揭示的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善受试者中的肺炎链球菌感染、疾病或病状。
在一实施方式中，可提供用于在受试者中诱导针对肺炎链球菌的免疫反应的方法，其包括向受试者给药有效剂量的本发明的免疫原性组合物的步骤。

Claims (19)

1.一种包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
该缀合物包含：
源自选自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及
缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。
2.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述多糖经活化并且以100至400kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述多糖经活化并且以400至900kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述多糖经活化并且以400至800kDa的分子量结合至所述载体蛋白以形成缀合物。
3.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至16,000kDa的分子量，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物具有300至4,500kDa的分子量，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，包含源自所述之血清型20的多糖的免疫原性缀合物具有1,000至4,000kDa的分子量。
4.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述载体蛋白为TT或CRM197。
5.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
当所述免疫原性组合物包含源自血清型2的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与该载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至2.0，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型17F的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型2荚膜多糖与该载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为0.5至18，或
当所述免疫原性组合物包含源自血清型20的多糖时，所述免疫原性缀合物中的血清型20荚膜多糖与该载体蛋白的比率(多糖/蛋白质，W/W)为1至5。
6.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物，
就包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的20至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或
就包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，总分子量的15至60％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在，或
就包含源自血清型20的多糖的免疫原性缀合物所述，总分子量的70至90％以CL-4B管柱中0.3Kd以内存在。
7.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物，
就包含源自所述血清型2的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为2至18，或
就包含源自所述血清型17F的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为1至22，或
就包含源自所述血清型20的多糖的免疫原性缀合物而言，缀合至所述缀合物的多糖的氧化度为4至16。
8.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物是源自彼此不同的15种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，
所述血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、及23F，并且
所述血清型分别缀合至CRM197。
9.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物是源自彼此不同的23种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，
所述血清型为1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，
在所述血清型之中，源自血清型3及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT，源自血清型1、2、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖分别缀合至载体蛋白CRM197。
10.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物是源自彼此不同的24种血清型的多糖缀合至相应载体蛋白的免疫原性组合物，
所述血清型为2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，
源自血清型1及5的荚膜多糖缀合至载体蛋白TT，源自血清型2、3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖分别缀合至载体蛋白CRM197。
11.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物包含生理学上可接受的媒剂。
12.根据权利要求1所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中，
所述免疫原性组合物是疫苗。
13.一种包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，
包括：
(a)发酵并溶解细菌细胞的步骤，所述细菌细胞产生源自选自由肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F构成的组的任一种以上的血清型的荚膜多糖；
(b)对溶解的所述细胞中的源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖进行纯化的步骤；
(c)使经纯化的所述多糖与氧化剂反应以将其活化的步骤；以及
(d)将经活化的所述多糖与载体蛋白组合，以形成结合至载体蛋白的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的步骤。
14.根据权利要求13所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，
在源自血清型2及17F的荚膜多糖的情况下，所述制备方法在(c)步骤之前进一步包括将经纯化肺炎链球菌荚膜多糖水解以调整其大小的步骤。
15.根据权利要求13所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，
所述(d)步骤的组合载体蛋白通过与选自由氰基硼氢化物、硼烷-吡啶及硼氢化物交换树脂构成的组的任一种以上的还原剂反应而与经活化的所述多糖形成缀合物。
16.根据权利要求13所述的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的制备方法，其中，
所述(c)步骤是在20至25℃的温度下使每1μg多糖与0.01～0.22μg高碘酸盐反应15至20小时。
17.一种用于预防或治疗肺炎链球菌感染的肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物，其中，
所述肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物通过根据权利要求13至16中任一项所述的方法获得。
18.一种用于预防或治疗受试者中的肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F感染的方法，其中，
所述方法通过向受试者给药有效量的包含肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物来进行，
所述缀合物包含：
源自选自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及
缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。
19.一种肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物用于预防或治疗肺炎球菌感染的用途，其中，
所述缀合物包含：
源自选自肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一个以上的荚膜多糖；以及
缀合至所述荚膜多糖中每个的一种或两种以上的载体蛋白。
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