CN111973608B - 一种唾液酸衍生物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种唾液酸衍生物的用途，属于生物医疗技术领域及药物制剂领域。本发明提供了所述唾液酸衍生物用于肿瘤免疫的组合物或试剂的用途。所述唾液酸衍生物可通过酶催化进而在肿瘤细胞表面表达，所表达的结构与B细胞亲和力高，能有效抑制体内肿瘤生长，延长患癌后残存期与寿命。本发明所述组合物具有靶向性强，安全性高，毒性弱，稳定性好，有效性高、应用广等优点。

Description

一种唾液酸衍生物的用途

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域及药物制剂领域，尤其涉及一种唾液酸衍生物的用途。

背景技术

唾液酸(sialic acid，Sia)是一类9-碳单糖衍生物，一般位于细胞表面糖萼末端。肿瘤细胞糖萼中会过表达唾液酸的现象，这表明肿瘤细胞因自身的新陈代谢需要大量唾液酸。以往研究中，N-乙酰基甘露糖胺作为外源的唾液酸前体可以通过细胞内代谢途径表达在细胞表面的糖萼上。然而其缺点是N-乙酰基甘露糖胺没有细胞及组织的特异性，其可以表达在动物的各种组织的细胞表面。

传统治疗癌症的方式包括手术、放疗和化疗，但这些方式均无法有效消灭癌症。进入21世纪以后，随着肿瘤学和免疫学的深入发展，肿瘤免疫疗法作为最新最先进的疗法应运而生。

肿瘤免疫治疗是指应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫***杀伤肿瘤、抑制肿瘤细胞的生长。肿瘤免疫治疗近来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点。

B细胞是一类重要的免疫细胞，其功能包括产生分泌抗体，抗原呈递，分泌细胞因子等。另外，B细胞可激活多种其它免疫细胞，如DC细胞与NK细胞。肿瘤组织还含有大量肿瘤相关B细胞。然而，到目前为止，少有基于B细胞的小分子肿瘤免疫调控方法。

Wenjie Peng和James C.Paulson在文献“CD22 Ligands on a Natural N-GlycanScaffold Efficiently Deliver Toxins to B-Lymphoma Cells”中公开了一种利用药物携带抗体，与B细胞淋巴瘤和白血病上的CD22蛋白结合，从而杀灭癌细胞的方法。但该方法的弊端是只适用于B细胞淋巴瘤和白血病，以及容易杀伤正常B细胞，因为正常B细胞表面也携带有CD22蛋白。

因此，仍需要研发或筛选一种能在肿瘤细胞上特异性表达，并引发免疫调控，特别是基于B细胞的小分子肿瘤免疫调控方法的安全性高、靶向性好、应用广的药物。

发明内容

发明概述

为解决上述药物不能特异性表达、缺少基于B细胞的肿瘤免疫调控方法、靶向性差、应用少等问题，本发明提出以下技术方案。

第一方面，本发明提供一种式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药的用途，所述用途为用于制备用于治疗或抑制肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长的组合物或试剂。所述组合物或试剂可在肿瘤细胞表面生成与B细胞CD22蛋白具有高亲和力的结构，进而通过B细胞产生肿瘤免疫治疗效果。

第二方面，本发明提供了一种在肿瘤细胞表面表达与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构的方法。所述方法靶向性强，安全性高，有效性高，所述结构与B细胞CD22蛋白结合亲和力高。

第三方面，本发明提供一种包含式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药的组合物。所述组合物靶向性强，安全性高，毒性弱，稳定性好，有效性高。

相比采用其他肿瘤免疫机制，例如吞噬细胞的肿瘤抑制机制，本发明通过在肿瘤细胞表面表达与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构，起到促进肿瘤细胞与B细胞的结合，干扰B细胞的生物功能，以及促进B细胞对含前述与B细胞CD22蛋白有结合亲和力结构的肿瘤细胞的抗原呈递等功效，从而起到靶向性更高、起效更快、有效性更强的抑制肿瘤效果。

发明详述

第一方面，本发明提供一种式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药的用途。

一种式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药在用于制备用于治疗或抑制肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长的组合物或试剂上的用途，

在一些实施例中，所述式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药用于制备组合物，所述组合物用于包括选自以下的一种或多种应用：

(1)在肿瘤细胞表面生成与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构；

(2)促进B细胞对肿瘤细胞的抗原呈递；

(3)抑制肿瘤细胞的生长；

(4)预防或***。

在一些实施例中，所述式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药以治疗有效量给予，所述治疗有效量可以为2mg/kg-1000mg/kg。在一些优选的实施方式中，所述治疗有效量为5mg/kg-100mg/kg。在一些更优选的实施方式中，所述治疗有效量为10mg/kg-50mg/kg。

在一些实施例中，所述给予可以包括注射给予或肠胃道给予。在一些优选的实施例中，所述给予为经注射给予。在一些更优选的实施例中，所述给予为静脉注射给予。

在一些实施例中，所述给予的有效浓度可以为0.1mg/m1-100.0mg/ml。在一些优选的实施方式中，所述给予的有效浓度为1.0mg/ml-50.0mg/ml。在一些更优选的实施方式中，所述给予的有效浓度为2.0mg/ml-10.0mg/ml。

在一些实施例中，所述给予的次数可以为1-5天/次。在一些优选的实施方式中，所述给予的次数为1-3天/次。在一些更优选的实施方式中，所述给予的次数为1-2天/次。

在一些实施例中，所述给予可以持续10-100天。在一些优选的实施方式中，所述给予持续50-70天。在一些更优选的实施方式中，所述给予持续80-100天。

第二方面，本发明提供一种在肿瘤细胞表面表达前述与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构的方法。

一种在肿瘤细胞表面表达前述与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构的方法，包括将式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药与肿瘤细胞接触，从而在肿瘤细胞表面表达。

在一些实施方式中，所述式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药与肿瘤细胞接触并被肿瘤细胞摄取，经酶催化或修饰，与肿瘤细胞中新生成的生物分子的糖链末端的糖发生N-连接或O-连接，经肿瘤细胞内源的运输与分选，被分选到肿瘤细胞表面，从而在肿瘤细胞表面表达。

所述糖链末端的糖可以包括包括选自乳糖、D-半乳糖和N-乙酰-D-半乳糖胺中的至少一种。在一些实施方式中，所述糖链末端的糖为乳糖；在一些实施方式中，所述糖链末端的糖为半乳糖；在一些实施方式中，所述糖链末端的糖为N-乙酰-D-半乳糖胺。

在本发明的一些实施方式中，一种在肿瘤细胞表面表达前述与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构的方法，包括将式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药与肿瘤细胞接触并被肿瘤细胞摄取，经CMP唾液酸合成酶和/或唾液酸转移酶催化或修饰，与肿瘤细胞中新生成的生物分子的糖链末端的糖发生N-连接或O-连接，经肿瘤细胞内源的运输与分选等途径，被分选到肿瘤细胞表面，从而在肿瘤细胞表面表达。

所述结构与B细胞CD22蛋白结合亲和力高，能诱导肿瘤细胞与B细胞结合，进而起到抑制肿瘤细胞的作用。

第三方面，本发明提供一种包含前述式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药的组合物。

一种组合物，其包括前述的式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药和药学上可接受的赋形剂或载体。

在一些实施例中，所述组合物可以为注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或混悬剂。在一些实施方式中，所述组合物为注射剂。

本发明前述肿瘤包括：黑色素瘤，***、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、***癌、胰腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌或卵巢癌等。

相比现有技术，本发明具有包括以下有益技术效果：

(1)本发明所述组合物或试剂可在肿瘤细胞表面生成与B细胞CD22蛋白具有高亲和力的结构，进而通过B细胞产生肿瘤免疫治疗。

(2)本发明所述在肿瘤细胞表面表达与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构的方法的靶向性强，安全性高，有效性高，所述结构与B细胞CD22蛋白结合亲和力高。

(3)本发明采用B细胞免疫机制，所述包含式(A)化合物或其药学上可接受的盐或前药的组合物的靶向性强，安全性高，毒性弱，稳定性好，有效性高。

术语定义：

g表示克；μL表示微升；％表示百分比；NaCl表示氯化钠；ml表示毫升；cm表示厘米；mol/L表示摩尔每升；PBS表示磷酸缓冲盐溶液；PBA-Sia表示式(A)化合物；lactose表示乳糖；Gal表示半乳糖；CD22蛋白是主要在成熟B淋巴细胞表达的I型跨膜蛋白；CMP表示05′-单磷酸胞苷；B16F10细胞表示小鼠黑色素瘤细胞；A549细胞表示腺癌人类肺泡基底上皮细胞；H22细胞表示小鼠肝肿瘤细胞；DMEM培养基表示达尔伯克改良伊格尔培养基。存活期表示小鼠有效存活时间，或肿瘤体积≤2.5cm³的天数。

本发明中“室温”指的是温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另一些实施例中，“室温”指的是温度由大约25℃到大约30℃；在又一些实施例中，“室温”指的是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等等。

附图说明

图1示式(A)化合物对小鼠体内肿瘤细胞表面结构改造与免疫调控示意图；

图2示式(A)化合物对B16F10细胞的细胞增值的影响及对细胞的毒性；

图3示式(A)化合物对H22细胞的细胞增值的影响及对细胞的毒性；

图4示接种B16F10细胞的小鼠在给予不同浓度式(A)化合物后的存活期；

图5示接种A549细胞的小鼠在给予不同浓度式(A)化合物后的存活期。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

实施例1：式(A)化合物的制备

将3.8克的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，2.5克的N-羟基丁二酰亚胺，与2克3-苯氧基苯甲酸加入至100毫升干燥的二甲基甲酰胺，室温搅拌5小时后，除去二甲基甲酰胺，将残存物用二氯甲烷溶解，并用1mol/1的盐酸溶液洗涤，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，过滤，再通过旋转蒸发除去滤液中的二氯甲烷，得到产物a。将产物a与C-9氨基唾液酸加入到二氧六环与水的混合溶剂(二氧六环与水的体积比为2∶1)中，然后用饱和碳酸钠水溶液将混合溶剂调节pH至8，室温下搅拌除去溶剂。采用硅胶柱分离法分离得到约1.5克式(A)化合物粗品，产率约45％。所得式(A)化合物粗品用C-18sep-pak固相萃取柱进一步纯化，得到纯度＞95％的式(A)化合物。

实施例2：式(A)化合物的细胞毒性研究

将H22与B16F10细胞分别在含有不同剂量式(A)化合物(0，0.2mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL)的DMEM培养基中培养12-24小时。使用商业化CCK-8细胞计数试剂盒分析式(A)化合物对细胞增值的影响及对细胞的毒性。结果如图2-图3所示。

结论：结果显示在0.2mg/mL-1.0mg/mL剂量条件下，式(A)化合物的细胞毒性仍极低，说明式(A)化合物的安全性高。

实施例3：式(A)化合物在肿瘤细胞表面的表达

小鼠黑色素瘤B16F10细胞在含式(A)化合物的DMEM中孵育24h，随后将细胞用PBS洗涤3次，再将细胞置于4℃与α2-3，6，8唾液酸水解酶孵育60min，水解切除细胞表面的式(A)化合物与天然唾液酸，将溶液收集后，与DMB(1，2二氨基-4，5-亚甲基二氧苯，盐酸盐)进行衍生化，测量DMB衍生化式(A)化合物的含量。通过质谱法定量检测细胞表面被酶水解释放的式(A)化合物的含量。

结果：结果发现每个B16F10细胞含有数量约为6x10⁶个式(A)化合物分子。

结论：实验结果表明加入到培养基中的式(A)化合物能有效被肿瘤细胞吸收，随后通过细胞代谢导入到细胞表面。

实施例4：式(A)化合物抑制小鼠黑色素瘤的效果

分别将三组C57BL/6小鼠在右侧腹壁皮下接种B16F10细胞(细胞数1×10⁷，注射体积100μL)。接种后从第三天开始，通过静脉注射方式分别在每只小鼠注射生理盐水(100μL，空白对照组)、低剂量式(A)化合物(2mg/ml，100μL，低剂量组)、或高剂量式(A)化合物(4mg/ml，100μL，高剂量组)。给药频率是每2天注射1次。然后记录小鼠存活期与化合物剂量的关联，并对小鼠肿瘤尺寸及小鼠体重进行记录。实验结果见图4。

结果分析：结果发现没有注射式(A)化合物的对照组小鼠，平均存活期为16天，在肿瘤接种后22天内全部死亡。注射低剂量式(A)化合物的小鼠组平均存活期为22天，在肿瘤种植后第20-22天期间陆续死亡。而注射高剂量式(A)化合物的小鼠组小鼠组平均存活期为24天，在肿瘤种植后第22-26天期间陆续死亡。另外，三组小鼠的体重在实验开始时测得为18.6-21.2克，小鼠死亡或实验结束时三组小鼠的体重测得为20.0-25.4克，均没有明显变化。

结论：结果表明式(A)化合物能够有效延长小鼠的存活率以及患癌症后的存活期，说明式(A)化合物能有效抑制肿瘤细胞。另外，由于三组小鼠的体重均没有明显差别，同时表明式(A)化合物的低细胞毒性及式(A)化合物延长存活期的原因在于免疫识别方式的改变。

实施例5：式(A)化合物抑制小鼠肺肿瘤细胞的效果

分别将三组BALB/C裸鼠在右侧腹壁皮下接种A549细胞(细胞数1×10⁷，注射体积100μL)。接种后从第三天开始，通过静脉注射方式分别在每只小鼠(体重测得为19.1-21.4克)注射生理盐水(100μL，对照组)、低剂量式(A)化合物(2mg/ml，100μL，低剂量组)、或高剂量式(A)化合物(4mg/ml，100μL，高剂量组)。给药频率是每2天注射1次。然后记录小鼠存活期与化合物剂量的关联，并对小鼠肿瘤尺寸及小鼠体重进行记录。实验结果见图5。

结果分析：结果发现没有注射式(A)化合物的对照组小鼠，平均存活期为28天，在肿瘤接种后15天陆续死亡，到49天是全部死亡。注射低剂量式(A)化合物的小鼠组平均存活期高于35天。而注射高剂量式(A)化合物的小鼠组平均存活期高于39天，在肿瘤种植后31天期间开始死亡，到第47天仍有50％的小鼠存活。另外，三组小鼠的体重在实验开始时测得为19.1-21.4克，小鼠死亡或实验结束时三组小鼠的体重测得为20.6-25.9克，均没有明显变化。

结论：结果表明式(A)化合物能够有效延长小鼠的存活率以及患癌症后的存活期，说明式(A)化合物能有效抑制肿瘤细胞。另外，由于三组小鼠的体重均没有明显差别，同时表明式(A)化合物的低细胞毒性及式(A)化合物延长存活期的原因在于免疫识别方式的改变。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (6)

1.一种式（A）化合物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备用于治 疗或抑制肿瘤，和/或，用于抑制肿瘤细胞生长的组合物或试剂，所述肿瘤包括黑色素瘤，***、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、***癌、胰腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌或卵巢癌；所述组合物为注射剂；所述式（A）化合物或其药学上可接受的盐或前药以治疗有效量给予，所述治疗有效量为2mg /kg-1000mg /kg；所述给予为注射给予；

，

所述组合物或试剂用于包括选自以下的一种或多种应用：

（1）在肿瘤细胞表面生成与B细胞CD22蛋白有结合亲和力的结构；或

（2）促进B细胞对肿瘤细胞的抗原呈递；或

（3）抑制肿瘤细胞的生长；或

（4）预防或***。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，权利要求1所述结构在肿瘤细胞表面表达的方法，包括：所述式（A）化合物或其药学上可接受的盐被肿瘤细胞摄取，从而在肿瘤细胞表面表达。

3.根据权利要求2所述的用途，还包括：所述式（A）化合物或其药学上可接受的盐被肿瘤细胞摄取，经酶催化或修饰，与肿瘤细胞中新生成的生物分子的糖链末端的糖发生N-连接或O-连接，经肿瘤细胞内源的运输与分选，被分选到肿瘤细胞表面，从而在肿瘤细胞表面表达。

4.根据权利要求3所述的用途，所述酶为CMP 唾液酸合成酶和/或唾液酸转移酶。

5.根据权利要求3或4任一项所述的用途，所述糖链末端的糖选自乳糖、D-半乳糖和N-乙酰-D-半乳糖胺中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的用途，所述注射给予为注射静脉给予。

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