CN111961711A - 用于靶向测序的通用杂交增强剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于靶向测序的通用杂交增强剂及方法。本发明的杂交增强剂能够高效封闭接头序列，且不受接头序列中Index的影响，操作简便，封闭效率高，能够有效降低背景信号，提升有效数据量，减少测序成本。

Description

用于靶向测序的通用杂交增强剂及方法

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体地涉及用于靶向测序的通用杂交增强剂及靶向测序方法。

背景技术

在高通量测序领域，杂交捕获技术是利用核酸分子之间互补配对原理，通过带有生物素修饰的探针分子高效富集感兴趣的目标区域，从而减少非目标区域数据占比，提高数据有效率，是一种实用性高、成本较低的靶向测序技术。目前，杂交捕获技术已经广泛应用于临床诊断，例如肿瘤用药的伴随诊断，遗传病辅助诊断等。

对于人类基因相关的杂交捕获，探针与文库(也称为预文库)的杂交反应包括以下组分，探针、文库、Human Cot1 DNA和杂交增强剂。其中，探针是与文库中的目标序列结合，靶向富集含有目标序列的文库；Human Cot1DNA用于封闭文库序列中重复序列，减少背景信号；由于文库中含有相同的接头序列，文库与文库之间会通过接头序列的互补配对发生串联反应，导致背景信号增加，目标序列占比降低。因此，杂交增强剂的作用在于封闭文库中的接头序列，阻断文库之间的串联反应发生，提高数据利用率。

杂交捕获技术可以一次完成对几百万碱基的基因组区间的检测，通量非常高，结合高通量测序仪，可以一次完成多个样本的检测。但是为了区分不同的样本，每个样本的文库都具有特定的标签(Index)，以便高通量测序仪进行识别。在杂交反应时，需要加入与Index对应的杂交增强剂。例如，对带有12种Index的12个文库进行杂交捕获就需要12种杂交增强剂，操作较为繁琐，流程不流畅，也不利于自动化平台的建立。因此，迫切需要一种通用杂交增强剂，该杂交增强剂能够兼容不同的Index，在杂交反应时，无论Index的多与少，都只需要一种通用杂交增强剂。

发明内容

针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明开发了一种用于杂交捕获的通用杂交增强剂，该杂交增强剂能够高效封闭接头序列，且不受接头序列中Index的影响，操作简便，封闭效率高，能够有效降低背景信号，提升有效数据量，减少测序成本。

本发明的第一方面，提供一种用于靶向测序的通用杂交增强剂，其中，所述通用杂交增强剂能够与文库中至少一个核酸片段的两个末端结合，从而形成环状结构，所述通用杂交增强剂包括第一结合部或其互补序列、第二结合部或其互补序列和第三结合部或其互补序列，当文库中核酸片段的正链沿5’端至3’方向依次包括第一接头、***片段和第二接头，且第一接头沿5’端至3’方向依次包括序列A和序列B，第二接头沿5’端至3’方向依次包括序列C和序列D时，所述第一结合部能够同时与序列A或其部分连续序列和序列D或其部分连续序列互补结合，所述第二结合部能够与序列B或其部分连续序列互补结合，所述第三结合部能够与序列C或其部分连续序列互补结合。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述第一结合部、所述第二结合部和所述第三结合部中的至少之一包含核苷酸类似物。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述核苷酸类似物选自LNA、BNA和MGB组成的组中的至少一种。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述第一结合部与所述第二结合部之间或所述第一结合部与所述第三结合部之间通过共价键或连接子连接；或者所述第一结合部与所述第二结合部之间和所述第一结合部与所述第三结合部之间各自通过共价键或连接子连接。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述共价键包括磷酸二酯键，所述连接子包括C3间隔臂。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述通用杂交增强剂的Tm值在70-90℃。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，所述通用杂交增强剂的3’末端含有封闭修饰。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，在序列A和序列B之间进一步包含第一索引序列，和/或在序列C和序列D之间进一步包含第二索引序列。

根据本发明所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，优选地，在序列A和序列B之间和/或在序列C和序列D之间进一步包括单分子标签。

本发明的第二方面，提供一种靶向测序方法，其包括使所述通用杂交增强剂与文库反应的步骤。

本发明的通用杂交增强剂阻断效果优异，并且与基于线性阻断的方案相比，本发明不受Index长度影响。

附图说明

图1为示例性通用杂交增强剂(UB)基本结构的示意图。

图2为一种示例性通用杂交增强剂(UB)的工作原理图。

图3为示例性三类通用杂交增强剂的工作原理图。其中，1-UB中，第一结合部与第二结合部以及第一结合部与第三结合部之间分别通过共价键或连接子连接；2-UB中，第一结合部与第三结合部之间通过共价键或连接子连接，而第一结合部与第二结合部分别以独立的方式存在。3-UB中，第一结合部、第二结合部和第三结合部分别以独立的方式存在。

图4为本发明的通用杂交增强剂用于阻断不同类型的文库的示意图。其中，文库的接头中可以只有一侧的接头含有索引序列(Index)，可以两侧的接头同时都含有索引序列(Index)，还可以在接头的序列中进一步包含单分子标签(UMI)序列。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明的第一方面，提供用于靶向测序的通用杂交增强剂。本发明的通用杂交增强剂能够兼容不同的Index，在杂交反应时，无论Index的多与少，都只需要一种通用杂交增强剂即可。另外，本发明的通用杂交增强剂既包括单链核酸分子的情形，也包括由互补的双链形成的核酸分子的情形。为方便说明起见，下文以单链核酸分子的情况进行说明。

本发明的通用杂交增强剂能够与文库中至少一个核酸片段的两个末端结合，从而形成环状结构。其中，核酸片段是指文库中包含待测序列及其两端接头序列的核酸片段。本发明中，核酸片段的两个末端通常是指两端的接头或各接头中由连续序列组成的一部分小的片段，或由多个连续序列组成的多个小的片段，如两个小的片段。

本发明的通用杂交增强剂一般包括第一结合部、第二结合部和第三结合部三个部分。每个结合部分别由连续的多个核苷酸或核苷酸类似物组成。在某些实施方案中，本发明的各结合部分别由连续的多个核苷酸(A、T、C、G)组成。在某些实施方案中，本发明的至少一个结合部中除了核苷酸外，还进一步包含1个以上，优选2个以上，更优选4个以上，还优选5个以上，例如6、8、10个核苷酸类似物。通常情况下，在各结合部中引入核苷酸类似物以使结合部的Tm值升高，例如，升高1℃以上、优选2℃以上、更优选3℃以上，还优选4℃以上，例如5℃。本发明通过引入核苷酸类似物等来控制整个通用杂交增强剂的Tm在70-90℃之间。例如70-80℃，75-85℃，80-90℃，85-90℃。本发明中，核苷酸类似物在本领是已知的，其实例包括但不限于LNA、BNA和MGB。

为方便说明，假定文库中至少一个核酸片段的单链(例如，正链或负链)沿5’端至3’方向依次包括第一接头、***片段和第二接头，且第一接头沿5’端至3’方向依次包括序列A和序列B，第二接头沿5’端至3’方向依次包括序列C和序列D。序列A和序列B分别对应于测序接头中两侧的序列，一般而言，序列A和序列B被索引序列(index序列)所间隔。在某些情况下，序列A和序列B之间可以没有索引序列，即序列A和序列B直接相连。在另外的情况下，序列A和序列B之间除了索引序列之外还进一步包含其他序列，例如单分子标签序列等。类似地，序列C和序列D分别对应于待测片段另一测序接头的两侧序列。并且在序列C和序列D之间通常被index序列所间隔，但有些情况下，序列C和序列D直接连接而没有其他间隔序列。在另外的情况下，序列C和序列D之间除了索引序列之外还进一步包含其他序列，例如单分子标签序列等。

本发明的第一结合部能够同时与序列A或其部分连续序列和序列D或其部分连续序列互补结合，由此使该核酸片段形成环状结构。此时，序列A的部分连续序列是指从5’端向3’端延伸的连续序列。序列D的部分连续序列是指从3’端向5’端延伸的连续序列。优选地，第一结合部的5’端能够与序列A互补结合，而3’端能够与序列B互补结合。序列A的部分连续序列的长度和序列D的部分连续序列的序列长度不特别限定，其中，A的部分连续序列至少1nt，优选至少5nt，更优选至少10nt，其长度可以是20-35nt，优选29nt，D的部分连续序列至少1nt，优选至少5nt，更优选至少10nt，其长度可以是20-35nt，例如24nt。在使用illumina Truseq接头的情况下，A序列为10-29nt，D序列为24nt。另外，序列A的部分连续序列的长度和序列D的部分连续序列的序列长度可以相同，也可以不同。

本发明的第二结合部是指能够与序列B或其部分连续序列互补结合的部分。序列B的部分连续序列的长度不特别限定，与序列B相比，一般至少1nt，优选至少5nt，更优选至少10nt，其长度可以是30-40nt，优选30-35nt，例如33nt。序列B的部分连续序列可以由从序列B的5’端第一个核苷酸开始向3’延伸的连续多个核苷酸组成，也可以由从序列B的5’端起第n个核苷酸开始向3’延伸的连续多个核苷酸组成，其中n可以2-20的自然数，优选n为5-15，更优选n为6-10。

本发明的第三结合部是指能够与序列C或其部分连续序列互补结合的部分。序列C的部分连续序列的长度不特别限定，与序列C相比，一般少至少1nt，优选至少5nt，更优选至少10nt，其长度可以是30-40nt，优选30-35nt，例如34nt。序列C的部分连续序列可以由从序列C的3’端第一个核苷酸开始向5’延伸的连续多个核苷酸组成，也可以由从序列C的3’端起第n个核苷酸开始向5’延伸的连续多个核苷酸组成，其中n可以2-20的自然数，优选n为5-15，更优选n为6-10。

本发明的某些实施方案中，构成通用杂交增强剂的第一结合部、第二结合部和第三结合部三者之间可以独立的方式存在。此时第一结合部、第二结合部和第三结合部各自可以单独存放。使用时可以将第一结合部、第二结合部和第三结合部以所需的比例混合，从而构成通用杂交增强剂，三者之间的摩尔比不特别限定，例如第一结合部、第二结合部和第三结合部可以(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)摩尔比使用，优选三者之间的摩尔比为(1-10):(1-10):(1-10)，更优选三者之间的摩尔比为(1-5):(1-5):(1-5)。在某些实施方案中，三者以等摩尔比使用。

本发明的某些实施方案中，构成通用杂交增强剂的第一结合部、第二结合部和第三结合部三者中至少两个部分之间通过共价键或连接子连接。例如，第一结合部和第二结合部之间连接。优选地，第二结合部的3’与第一结合部的5’通过共价键或连接子连接。再例如，第一结合部和第三结合部之间连接。优选地，第一结合部的3’端与第三结合部的5’通过共价健或连接子连接。在某一实施方案中，第二结合部的3’端通过共价键或连接子与第一结合部的5’端连接，同时第一结合部的3’端通过共价健或连接子与第三结合部的5’端连接。

本发明中，用于连接不同结合部的共价键为已知的，其实例包括但不限于磷酸二酯键、肽键。本发明中，连接子的实例包括但不限于C3间隔臂、烷基、聚醚基团、胺基、酰胺基或其他化学基团。优选地，连接子由多个通过化学键连接的重复单元构成。连接子的长度不特别限定，一般而言，连接子的长度与两个不同结合部的结合区域之间的距离相当。例如，连接子的长度与接头内的index序列的长度相当。

本发明的通用杂交增强剂中，在其自由末端，例如5’端或3’端可进一步包括封闭基团，从而阻止其扩增反应。封闭基团在本领域内是已知的，其实例包括但不限于醚、多元醇、烯烃或其他不可杂交基团。在一些方面，通用杂交增强剂的3’末端含有封闭修饰，例如C3 Spacer，NH2，ddC，Inverted dT等。在一些方面，所述通用杂交增强剂含有通配碱基，例如I。

基于上面的说明，本领域技术人员完全理解，本发明的通用杂交增强剂还可以是完全互补的双链结构的核酸分子。此时，通用杂交增强剂包含第一结合部、第二结合部、第三结合部、与第一结合部互补的结合部、与第二结合部互补的结合部、与第三结合部互补的结合部。其中，第一结合部以及与第一结合部互补的结合部的摩尔比不特别限定，可以是0.5:1-2:1，优选1:1。此类地，第二结合部以及与第二结合部互补的结合部的摩尔比不特别限定，可以是0.5:1-2:1，优选1:1。第三结合部以及与第三结合部互补的结合部的摩尔比不特别限定，可以是0.5:1-2:1，优选1:1。

基于上面的说明，本领域技术人员还可以理解，本发明的通用杂交增强剂可包含部分互补的双链结构和部分单链结构。在某些实施方案中，本发明的通用杂交增强剂包括第一结合部、与第一结合部互补的结合部、第二结合部、与第二结合部互补的结合部和第三结合部。在某些实施方案中，本发明的通用杂交增强剂包括第一结合部、第二结合部、与第二结合部互补的结合部、第三结合部、与第三结合部互补的结合。在某些实施方案中，本发明的通用杂交增强剂包括第一结合部、第二结合部、第三结合部、与第三结合部互补的结合部。基于上述的说明，本领域技术人员完全可以预料包含部分互补的双链结构和部分单链结构的其他情形，这些其他情形也在本发明的范围内。

实施例

一、预文库构建

采用DNA建库试剂盒(Rapid DNA Lib Prep Kit，ABclonal)以及Illumina TruseqDual-index接头(图4)，对NA12878 gDNA(Coriell)构建本实施例所用的预文库(***片段大小：～200bp；PCR循环数：7)。

二、杂交捕获

针对B、A-D和C区域，设计并合成含有LNA的寡核苷酸，作为构成通用杂交增强剂的组分，其中寡核苷酸3-UB 24LNA-B、3-UB 24LNA-AD、3-UB 24LNA-C分别与B、A-D和C区域互补，即封闭上述区域。随后，使用与Index序列一一对应的特异杂交增强剂作为对照，对通用封闭剂组分的组合进行杂交捕获，测试其封闭效果。按照步骤如A-J所示进行4小时杂交捕获(N＝2)。寡核苷酸序列信息见表1。各通用封闭剂的封闭效果如表2所示。

表1

注：+A、+C、+T或+G分别表示对应的LNA碱基；A、C、T或G表示DNA碱基。

表2

杂交捕获步骤如下：

A.文库预封闭

将下表3试剂加入到0.2mL低吸附离心管(Eppendorf)中，使用真空浓缩仪(Eppendorf)将离心管中溶液蒸干备用。

表3

B.探针与文库杂交

将13μL杂交缓冲液(0.33M Sodium phosphate buffer pH7.0、0.65％SDS(w/v)、1.31mM EDTA、1.31X SSC、2.62X Denhardt’s Solution、20％(v/v)甲酰胺)加入到上述步骤的离心管中，涡旋混匀，室温孵育5分钟。

95℃变性10分钟，随后加入4μL(3pmol)探针池，Panel尺寸为116Kb，涡旋混匀，65℃孵育4小时。

C.清洗液准备

按照表4所示准备清洗缓冲液，其中，1X Wash Buffer S和部分1X Wash Buffer I在65℃条件下预热30分钟后使用。

表4

1X Beads Wash Buffer：1M NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA、0.1％(v/v)Tween-20

1X Wash Buffer S:1X SSC、0.1％(v/v)Tween-20，pH7.0

1X Wash Buffer I：1X SSC、0.1％(w/v)SDS，pH7.0

1X Wash Buffer II：0.5X SSC，pH7.0

1X Wash Buffer III：0.2X SSC，pH7.0

D.链霉亲和素磁珠准备

将链霉亲和素磁珠(Dyna Beads M270，Invitrogen)从冰箱中(4℃)取出恢复到室温(约30分钟)。涡旋混匀15秒。取100μL链霉亲和素磁珠加入到新的1.5mL低吸附离心管中。将离心管放到磁力架上，直到溶液澄清。吸弃上清，切勿扰动磁珠。按以下步骤对链霉亲和素磁珠进行清洗：

(1)将离心管从磁力架上取下，加入200μL 1X Beads Wash Buffer，涡旋振荡10秒。

(2)将离心管瞬时离心，放到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清，切勿扰动磁珠。

重复步骤(1)和(2)。

将离心管从磁力架上取下，加入100μL 1X Beads Wash Buffer。将离心管中的100μL磁珠重悬液转移到新的0.2mL低吸附离心管(Eppendorf)中待用。将离心管放到磁力架上，直到溶液澄清。吸弃上清，切勿扰动磁珠，立即进行后续实验步骤。

E.链霉亲和素磁珠捕获

将杂交混合物加入到含链霉亲和素磁珠的0.2mL低吸附离心管中。使用移液器轻柔吹吸10次混匀。使用PCR仪(热盖温度设置为75℃)65℃孵育45分钟。每12分钟涡旋混匀3秒，确保磁珠处于悬浮状态。

F.捕获后清洗

1.65℃清洗步骤：

将100μL预热的1X Wash Buffer I加入到含有杂交混合物的0.2mL低吸附离心管中。吹吸混匀后，将含有链霉亲和素磁珠的反应液转移到新的1.5mL低吸附离心管中。将离心管放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。

继续按以下步骤进行清洗：

(1)加入200μL预热的1X Wash Buffer S，吹吸或涡旋混匀后，在65℃条件下孵育5分钟。

(2)瞬时离心，将离心管放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。

重复步骤(1)和(2)。

2.室温清洗

加入200μL1X Wash Buffer I，涡旋混匀2分钟。将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。加入200μL1X Wash Buffer II，涡旋混匀1分钟。将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。加入200μL1X Wash Buffer III，涡旋混匀30秒。将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。

3.磁珠重悬

立即加入20μL无酶无菌水。使用移液器吹吸10次，重悬磁珠，进入后续实验步骤。

G.PCR扩增

按照表5配置PCR反应体系。

表5

吹吸或低速涡旋混匀使磁珠保持悬浮状态，立即进入PCR步骤。使用PCR仪按表6程序运行，热盖温度105℃。

表6

H.PCR产物纯化

每个PCR管中加入75μL AMPure XP纯化磁珠(Beckman)。按照AMPure XP操作手册纯化PCR产物。使用22μL Tris-HCl(10mM，pH 8.5)进行洗脱。转移20μL包含捕获文库的洗脱液到新的1.5mL低吸附离心管(Eppendorf)中。

I.文库质控

使用Qubit荧光计3.0(ThermoFisher)测量文库浓度。使用Agilent 2100测量文库片段长度，产物集中在320bp，无接头二聚。

J.高通量测序

采用Illumina Novaseq测序仪进行PE150模式测序。

三、数据分析

使用Trimmomatic去除接头以及低质量序列得到Clean data，然后使用Samtools提取目标区域的reads，统计目标区域reads与总reads数的比例，得到On-target ratio。

如表7所示，对于B、A-D和C三个区域，单独封闭B或C区域的On-Target ratio为25-32％，均与不加入杂交增强剂实验组类似，无明显封闭效果。单独封闭A-D区域的On-Targetratio有明显提升，达到38％左右。在封闭A-D区域的基础上，进一步封闭B或C区域，On-Target ratio提升10％左右。在将B、A-D和C三个区域全部封闭后，其On-Target ratio为69％，与采用特异杂交增强剂封闭实验组水平一致。上述结果表明，本发明设计的通用杂交增强剂方案能够有效阻断文库接头串联，达到与特异杂交增强剂一致的封闭效果。

表7各通用杂交增强剂的封闭效果

实施例2

本实施例用于探究通用杂交增强剂的Tm值。采用实施例1的方法构建NA12878gDNA(Coriell)的Illumina Truseq Dual-index接头预文库。

如表8分别使用特异杂交增强剂和含有不同数量LNA的通用杂交增强剂(1nmoleEach)对预文库进行杂交捕获、测序及分析(方法同实施例1)(N＝2)。杂交增强剂序列信息见表1。

表8

如表9所示，随着Tm值的增加，文库的On-Target ratio逐渐增加。当通用杂交增强剂的Tm值达到80℃时(3-UB 12LNA)，其On-Target ratio较不加入杂交增强剂样本的On-Target ratio有明显提升；当通用杂交增强剂的Tm值达到83℃及以上时(3-UB 24LNA/3-UB27LNA)，其On-Target ratio与特异杂交增强剂相当或更优。

表9

实施例3

本实施例用于研究通用杂交增强剂对不同Index的阻断效果。

采用实施例1的文库构建方法，对NA12878 gDNA(Coriell)构建本实施例所用的预文库。构建12例接头为illumina Truseq Dual-index，并含有不同Index的预文库(***片段大小：～200bp；PCR循环数：7)。使用3-UB 24LNA杂交增强剂(1nmole each)对上述12例预文库进行杂交捕获、测序及分析(方法同实施例1)。

如表10所示，对于Adapter-1的8种和Adapter-2的12种Index,3-UB 24LNA杂交增强剂均能获得稳定且高效的封闭效果。

表10

实施例4

本实施例用于研究通用杂交增强剂对不同接头的阻断效果。

采用实施例1的文库构建方法，对NA12878 gDNA(Coriell)构建本实施例所用的预文库。如图4所示，分别构建三种illumina Truseq接头的预文库，其分别为Single-Index、Dual-Index和Dual-Index UMI Adapter(***片段大小：～200bp；PCR循环数：7)。使用3-UB24LNA杂交增强剂(1nmole each)对上述预文库进行杂交捕获、测序及分析(N＝2，方法同实施例1)。

如表11所示，对于illumina Truseq的三种接头，3-UB 24LNA杂交增强剂均能获得稳定且高效的封闭效果。

表11

实施例5

本实施例用于研究通用杂交增强剂与接头的比例对阻断效果的影响。

采用实施例1的文库构建方法，对NA12878 gDNA(Coriell)构建本实施例所用的预文库(illumina Truseq Dual-Index Adapter，***片段大小：～200bp；PCR循环数：7)。采用3-UB 24LNA杂交增强剂与接头摩尔量比例分别为500:1、100:1、25:1、5:1对上述预文库进行杂交捕获、测序及分析(N＝2，方法同实施例1)。

如表12所示，当3-UB 24LNA杂交增强剂与接头摩尔量比例在25:1以上时，捕获数据仍然保持与500:1相近的水平，当二者的摩尔量比例低至5:1时，On-Target ratio出现下降的趋势，当二者的摩尔量比例为2:1时，On-Target ratio下降为40％左右，表明3-UB24LNA杂交增强剂与接头摩尔量比例在5:1以上时，均能高效工作。

表12

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述通用杂交增强剂能够与文库中至少一个核酸片段的两个末端结合，从而形成环状结构，所述通用杂交增强剂包括第一结合部或其互补序列、第二结合部或其互补序列和第三结合部或其互补序列，当文库中核酸片段的正链沿5’端至3’方向依次包括第一接头、***片段和第二接头，且第一接头沿5’端至3’方向依次包括序列A和序列B，第二接头沿5’端至3’方向依次包括序列C和序列D时，所述第一结合部能够同时与序列A或其部分连续序列和序列D或其部分连续序列互补结合，所述第二结合部能够与序列B或其部分连续序列互补结合，所述第三结合部能够与序列C或其部分连续序列互补结合。

2.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述第一结合部、所述第二结合部和所述第三结合部中的至少之一包含核苷酸类似物。

3.根据权利要求2所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述核苷酸类似物选自LNA、BNA和MGB组成的组中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述第一结合部与所述第二结合部之间或所述第一结合部与所述第三结合部之间通过共价键或连接子连接；或者所述第一结合部与所述第二结合部之间和所述第一结合部与所述第三结合部之间各自通过共价键或连接子连接。

5.根据权利要求4所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述共价键包括磷酸二酯键，所述连接子包括C3间隔臂。

6.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述通用杂交增强剂的Tm值在70-90℃。

7.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，所述通用杂交增强剂的3’末端含有封闭修饰。

8.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，在序列A和序列B之间进一步包含第一索引序列，和/或在序列C和序列D之间进一步包含第二索引序列。

9.根据权利要求1所述的用于靶向测序的通用杂交增强剂，其特征在于，在序列A和序列B之间和/或在序列C和序列D之间进一步包括单分子标签。

10.一种靶向测序方法，其特征在于，包括使根据权利要求1-9任一项所述的通用杂交增强剂与文库反应的步骤。

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