CN111951897A

CN111951897A - 预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法

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Publication number: CN111951897A
Application number: CN202010414432.2A
Authority: CN
Inventors: 李佳萤; 曾如玉; 王鸿聆; 王信翰; 陈瑞麟
Original assignee: Micareo Taiwan Co ltd
Current assignee: Micareo Taiwan Co ltd
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-11-17
Also published as: EP3739338A3; US20200365249A1; TWI750660B; TW202043772A; EP3739338A2; AU2020203179A1; CA3080612C; JP2020187127A; CA3080612A1

Abstract

一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，包括以下步骤。在接受免疫疗法之前或之后，从癌症患者中获取周边血液样品。检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。比较免疫细胞数量与第一阈值/或第二阈值，以预测癌症患者是否会从免疫疗法中受益。第一阈值/或第二阈值由以下步骤进行测定：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后获得统计学上有意义的数值。数值用于定义相关性。

Description

预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法

技术领域

本发明是有关于一种预测癌症患者对癌症疗法的反应性的方法，且特别是关于预测癌症患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性。

背景技术

目前，利用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade)(例如PD-1/PD-L1抑制剂，但不限于此)的免疫疗法可藉由活化癌症患者的免疫***，进而透过免疫反应来达到杀死肿瘤细胞的效果。因此，相较于化疗(chemotherapy)，对免疫检查点抑制剂有治疗效果的癌症患者可具有较长的存活期以及较佳的生活质量。然而，使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法还是具有以下缺点：治疗费用昂贵、治疗后的反应性较慢且并非对于所有癌症患者都具有治疗效果。现在仍缺乏对免疫检查点抑制剂对于癌症患者的投药前的治疗效果预测或投药后治疗效果评估的方法。

发明内容

本发明提供一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，其可在第一次治疗前预测治疗效果，可以有效地帮助癌症患者决定是否接受免疫疗法。

本发明提供另一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，其可在下一次治疗前测定先前治疗后的治疗效果，可以有效地帮助癌症患者决定是否继续接受免疫疗法。

本发明的预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，包括以下步骤。在接受免疫疗法之前，从癌症患者中获取周边血液样品。检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。比较免疫细胞数量与第一阈值，以预测癌症患者是否会从免疫疗法中受益。第一阈值由以下步骤进行测定：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后获得统计学上有意义的数值。数值用于定义相关性。

在本发明的一实施例中，上述的免疫疗法可包括免疫检查点抑制剂或细胞免疫疗法。

在本发明的一实施例中，上述的免疫细胞表现以下至少一种标记：PD1、CD8、CD4、IFN-γ、TIM3、LAG3、CD25、TGF-β。

在本发明的一实施例中，上述的癌症为肝癌，且上述的免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

在本发明的一实施例中，上述的癌症为肾细胞癌，且上述的免疫细胞选自由PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞、PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞所组成的群组。

在本发明的一实施例中，上述的第一阈值依据风险比的图谱将癌症患者分为A组和B组。被分类为A组的癌症患者具有良好的预后，且被分类为B组的癌症患者具有较差的预后。

在本发明的一实施例中，上述的风险比是透过所述组的癌症患者的存活时间与所述组的癌症患者的存活机率的Cox回归模型来测量。

本发明提供另一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，包括以下步骤。在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间，从接受免疫疗法的癌症患者中获取周边血液样品。检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。比较免疫细胞数量和第二阈值，以获得免疫疗法对癌症患者的治疗效果。第二阈值由以下步骤进行测定：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后获得统计学上有意义的数值。数值用于定义相关性。

在本发明的一实施例中，上述的免疫疗法可包括免抗PD-1/PD-L1免疫疗法。

在本发明的一实施例中，上述的癌症为肝癌，且上述的免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

在本发明的一实施例中，上述的癌症为肾细胞癌，且上述的免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞所组成的群组。

在本发明的一实施例中，上述的癌症为泌尿道癌，且上述的免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

在本发明的一实施例中，上述的第二阈值依据风险比的图谱将癌症患者分为A组和B组。被分类为A组的癌症患者具有良好的预后，且被分类为B组的癌症患者具有较差的预后。

基于上述，本发明的实施例提供一种简单又能准确预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，借由检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量，并比较免疫细胞数量与第一阈值/第二阈值之后，即可在第一次治疗之前预测癌症患者是否会从免疫疗法中受益，也可在一次治疗后以及下一次治疗前即早得知免疫疗法对癌症患者的治疗效果。再者，相较于现有技术必须采取癌症患者的肿瘤细胞进行分析因而使癌症患者要承受较大的痛苦，本发明的实施例所提供的方法仅需以抽血的方式搜集特定的免疫细胞及计算其数量，可以大幅缩短检验时间，对于癌症患者更为方便。因此，本发明的实施例所提供的方法对于接受免疫疗法的癌症患者来说，具有可节省费用及时间的好处。

为了让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。

附图说明

图1A至图1G为肝癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与无恶化存活期(progression free survival，PFS)的风险比(hazard ratio)的散点图(scatter plot)。

图2A至图2G为肝癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之后的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型(Cox regression model)。

图3A至图3C为肾细胞癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。

图4A至图4C为肾细胞癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之后的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

图5A至图5I为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肝癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。

图6A至图6I为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肝癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

图7A至图7F为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肾细胞癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。

图8A至图8F为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肾细胞癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

图9A至图9E为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的泌尿道癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。

图10A至图10E为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的泌尿道癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

具体实施方式

[定义]

术语“免疫疗法”系指一种透过激活癌症病患本身的免疫***来治疗癌症的方法，例如：免疫检查点抑制剂及细胞免疫疗法。根据本发明的实施例，免疫疗法可以是指对癌症患者施予PD-1/PD-L1抑制剂，以活化癌症患者的免疫***，进而达到杀死癌细胞的目的。其中，PD-1/PD-L1抑制剂属于免疫检查点抑制剂，且PD-1/PD-L1抑制剂例如是PD-1/PD-L1抗体，但不以此为限。

术语“预后”系指对于疾病，特别是指癌症，其未来发展的病程和结局的预测。根据本发明的实施例，预后可以是指癌症患者的无恶化存活期，若无恶化存活期较长，代表癌症患者对于免疫疗法具有较佳的预后且对于免疫疗法的反应性较好。举例来说，在本实施例中，在被评估的癌症患者的免疫细胞数量与第一阈值相比之后，若所述被评估的癌症患者被分类为具有良好预后的A组，则代表所述被评估的癌症患者对于免疫疗法的反应性是良好的，适合进行免疫疗法。相反地，若所述被评估的癌症患者被分类为具有较差预后的B组，则代表该被评估的癌症患者对于免疫疗法的反应性是不佳的，不适合进行免疫疗法。此外，在本实施例中，在被评估的癌症患者的免疫细胞数量与第二阈值相比之后，若所述被评估的癌症患者被分类为具有良好预后的A组，则代表该被评估的癌症患者对于免疫疗法的反应性是良好的，治疗效果可被预期，可以继续进行免疫疗法。相反地，若所述被评估的癌症患者被分类为具有较差预后的B组，则代表该被评估的癌症患者对于免疫疗法的反应性是不佳的，不建议继续进行免疫疗法。

[实施例1]预测不曾接受过免疫疗法的癌症患者对免疫疗法的反应性的方法

在本实施例中，癌症可包括肝癌以及肾细胞癌，但不以此为限。免疫疗法可包括免疫检查点抑制剂或细胞免疫疗法，但不以此为限。其中，免疫检查点抑制剂可包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法，但不以此为限。以下以抗PD-1/PD-L1免疫疗法为例进行说明。

本实施例的预测癌症患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性的方法可包括以下步骤。首先，进行步骤一：在接受抗PD1/PD-L1免疫疗法之前，从癌症患者中获取周边血液样品。在本实施例中，例如是从不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的癌症患者的前臂静脉抽取周边血液样品，例如8毫升，但不以此为限。在一些实施例中，也可以从癌症患者的其他周边部位的静脉抽取周边血液样品。

接着，进行步骤二：检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。在本实施例中，在检测免疫细胞数量前，须先对周边血液样品进行前处理。所述前处理例如是包括以下步骤，但不以此为限：于室温下，以连接有PE荧光染剂的PD1抗体对4毫升的周边血液样品进行染色反应20分钟。接着，将染色后的周边血液样品分成四个2毫升的血液样品于四个50毫升的离心管中。接着，在将24毫升的ISOTON II Diluent(Beckman Coulter)加入至每个离心管中之后，以摆桶式转子(swinging bucket rotor)于室温下以800×g转速离心10分钟。离心后，移除每个离心管中的24毫升上清液并将四个离心管中的2毫升的血液样品均匀混合成8毫升的分析样品，即完成周边血液样品的前处理。

接着，从8毫升的分析样品中先取出4毫升的分析样品进行细胞分选(cellsorting)。在本实施例中，所述细胞分选例如是包括以下步骤，但不以此为限：利用含有SelectChip Dual的MiSelect R System(MiCareo Taiwan Co.,Ltd)进行细胞分选，以收集带有PD1标记的细胞(PD1⁺细胞)。接着，自动地将固定液以及抗体混合试剂A(例如是包括CD8-FITC抗体、IFN-γ-PerCP抗体、TIM3-APC抗体、LAG-3抗体，但不以此为限)加入至收集的PD1⁺细胞中，以进一步地鉴定出同时带有PD1以及CD8标记的细胞(PD1⁺CD8⁺细胞)，并鉴定出同时带有PD1、CD8标记以及其他标记(例如IFN-γ、TIM3、LAG3)的细胞并接着计算细胞数量。在本实施例中，PE、FITC、PerCP以及APC分别为可发出不同荧光颜色的荧光染剂。

另外，再对8毫升的分析样品中剩下的4毫升的分析样品进行细胞分选以收集PD1⁺细胞后，自动地将固定液以及抗体混合试剂B(例如是包括CD4-PerCP抗体、TGF-β-APC抗体、CD25-FITC抗体、LAG-3抗体，但不以此为限)加入至收集的PD1⁺细胞中，以进一步地鉴定出同时带有PD1以及CD4标记的细胞(PD1⁺CD4⁺细胞)，并鉴定出同时带有PD1、CD4标记以及其他标记(例如LAG3、CD25、TGF-β)的细胞并接着计算细胞数量。

因此，在本实施例中，免疫细胞可例如是表现有以下至少一种标记的细胞：PD1、CD8、CD4、IFN-γ、TIM3、LAG3、CD25、TGF-β。举例来说，免疫细胞可包括PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞、PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞，但不以此为限。

然后，进行步骤三：比较免疫细胞数量与第一阈值(cut-off value)，以预测癌症患者是否会从抗PD-1/PD-L1免疫疗法中受益。在本实施例中，第一阈值例如是由以下步骤进行测定，但不以此为限：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后可以获得统计学上有意义的值，其中所述统计学上有意义的值就可以视为是第一阈值。具体来说，所述统计学上有意义的值(即第一阈值)可例如是当统计学上的p值小于等于0.1时所对应的免疫细胞数量。因此，在本实施例中，可利用此对应的免疫细胞数量(即第一阈值)定义癌症患者中的免疫细胞数量与癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性。

一般而言，所述疾病发展的预期风险是无恶化存活期(progression freesurvival，PFS)的风险比(hazard ratio)，但不以此为限。因此，在本实施例中，可利用一组的癌症患者在接受抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图(scatter plot)(即风险比的图谱)来进行相关性的统计分析，以获得第一阈值。

接着，在比较所述组的癌症患者在接受抗PD-1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与第一阈值的大小之后，可将所述组的癌症患者分为A组和B组。其中，被分类为A组的癌症患者具有良好的预后，即A组的癌症患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性较佳；而被分类为B组的癌症患者则具有较差的预后，即B组的癌症患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性较差。

免疫细胞数量与第一阈值的大小关系与癌症种类有关。举例来说，在本实施例中，当不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者以及肾细胞癌患者的免疫细胞数量大于等于第一阈值时可具有良好的预后，但在患有其他种类的癌症的癌症患者中，也可能是当其免疫细胞数量小于第一阈值时才会具有良好的预后。

在本实施例中，风险比例如是透过一组的癌症患者的存活时间与一组的癌症患者的存活机率的Cox回归模型(Cox regression model)来进行测量。其中，所述存活时间可例如是无恶化存活期，但不以此为限。此外，在Cox回归模型中，当存活机率为50％时，可发现预后较佳的A组的无恶化存活期会显著地高于预后较差的B组的无恶化存活期，且此差异于统计学上的p值可小于等于0.1。

[实施例2]预测接受免疫疗法后的癌症患者对所述免疫疗法的反应性的方法

在本实施例中，癌症可包括肝癌、肾细胞癌以及泌尿道癌，但不以此为限。免疫疗法可包括免疫检查点抑制剂或细胞免疫疗法，但不以此为限。其中，免疫检查点抑制剂可包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法，但不以此为限。以下以抗PD-1/PD-L1免疫疗法为例进行说明。

首先，进行步骤一：在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间，从接受抗PD-1/PD-L1免疫疗法的癌症患者中获取周边血液样品。在本实施例中，可依据上述实施例1的步骤一中所示的步骤来进行，故于此不在赘述。而本实施例(实施例2)与上述实施例1的步骤一的不同之处在于：本实施例所获取的周边血液样品是来自接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的癌症患者的周边血液样品。此外，由于通常抗PD-1/PD-L1免疫疗法是每二～三周对癌症患者进行一次投药，因此，在本实施例中，在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间可例如是有将近二～三周的时间可作为测定抗PD-1/PD-L1免疫疗法对癌症患者的治疗效果的时机点，但不以此为限。

接着，进行步骤二：检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。在本实施例中，可依据上述实施例1的步骤二中所示的步骤来进行，故于此不在赘述。而本实施例(实施例2)与上述实施例1的步骤二的不同之处在于：本实施例是检测接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量。

然后，进行步骤三：比较免疫细胞数量和第二阈值，以获得抗PD-1/PD-L1免疫疗法对癌症患者的治疗效果。在本实施例中，可依据上述实施例1的步骤三中测定第一阈值所示的步骤来测定第二阈值，故于此不在赘述。

具体来说，在本实施例中，在比较癌症患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与第二阈值的大小之后，将癌症患者分为A’组和B’组。其中，被分类为A’组的癌症患者具有良好的预后，即抗PD-1/PD-L1免疫疗法对A’组的癌症患者具有较佳的治疗效果；而被分类为B’组的癌症患者具有较差的预后，即抗PD-1/PD-L1免疫疗法对B’组的癌症患者具有较差的治疗效果。

免疫细胞数量与第二阈值的大小关系与癌症种类有关。举例来说，在本发明的一个实施例中，已接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者的免疫细胞数量小于第二阈值时可具有良好的预后。在本发明的另一个实施例中，已接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肾细胞癌患者和泌尿道癌患者的免疫细胞数量大于等于第二阈值时可具有良好的预后。

[实验例]

实验例1：预测不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性

图1A至图1G为肝癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与无恶化存活期(progression free survival，PFS)的风险比(hazard ratio)的散点图(scatter plot)。图2A至图2G为肝癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之后的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型(Cox regression model)。

请同时参照图1A与图2A，在PD1⁺CD8⁺细胞的分析结果中，第一阈值为353。接着，由图2A的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，且具有小于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0227且风险比95％信赖区间(confidence interval，CI)为0.117～0.851。

请同时参照图1B与图2B，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的分析结果中，第一阈值为350。接着，由图2B的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，且具有小于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0343且风险比95％信赖区间为0.126～0.923。

请同时参照图1C与图2C，在PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为350。接着，由图2C的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，且具有小于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0343且风险比95％信赖区间为0.126～0.923。

请同时参照图1D与图2D，在PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为330。接着，由图2D的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于18个月，且具有小于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0429且风险比95％信赖区间为0.085～0.961。

请同时参照图1E与图2E，在PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为80。接着，由图2E的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，且具有小于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0925且风险比95％信赖区间为0.161～1.149。

请同时参照图1F与图2F，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为80。接着，由图2F的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，且具有小于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0911且风险比95％信赖区间为0.136～1.159。

请同时参照图1G与图2G，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为200。接着，由图2G的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为9～12个月，且具有小于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0353且风险比95％信赖区间为0.145～0.933。

基于上述，由图1A至图1G以及图2A至图2G的结果可知，对于不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者而言，当其在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量大于等于第一阈值时，可预测其对抗PD-1/PD-L1免疫疗法有较佳的反应性，且具有良好的预后；反之，当其在接受抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量小于第一阈值时，可预测其对抗PD-1/PD-L1免疫疗法有较差的反应性，且具有较差的预后。此处，上述的免疫细胞包括PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞、以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞，但不以此为限。

实验例2：预测不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肾细胞癌患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性

图3A至图3C为肾细胞癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。图4A至图4C为肾细胞癌患者在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之后的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

请同时参照图3A与图4A，在PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的分析结果中，第一阈值为50。接着，由图4A的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，且具有小于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0369且风险比95％信赖区间为0.064～0.917。

请同时参照图3B与图4B，在PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为40。接着，由图4B的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于40颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，且具有小于40颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0369且风险比95％信赖区间为0.064～0.917。

请同时参照图3C与图4C，在PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为10。接着，由图4C的结果可知，当存活机率为50％时，具有大于等于10颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，且具有小于10颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0534且风险比95％信赖区间为0.063～1.021。

基于上述，由图3A至图3C以及图4A至图4C的结果可知，对于不曾接受过抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肾细胞癌患者而言，当其在接受第一次抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量大于等于第一阈值时，可预测其对抗PD-1/PD-L1免疫疗法有较佳的反应性，且具有良好的预后；反之，当其在接受抗PD1/PD-L1免疫疗法之前的免疫细胞数量小于第一阈值时，可预测其对抗PD-1/PD-L1免疫疗法有较差的反应性，且具有较差的预后。此处，上述的免疫细胞包括PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞、PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞、以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞，但不以此为限。

实验例3：预测接受抗PD-1/PD-L1免疫疗法后的肝癌患者对所述抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性

图5A至图5I为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肝癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。图6A至图6I为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肝癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

请同时参照图5A与图6A，在PD1⁺CD8⁺细胞的分析结果中，第一阈值为353且第二阈值为353。接着，由图6A的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于353颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于14个月，未治疗前具有大于等于353颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于353颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于353颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于353颗PD1⁺CD8⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0480且风险比95％信赖区间为1.013～19.012。

请同时参照图5B与图6B，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的分析结果中，第一阈值为350且第二阈值为350。接着，由图6B的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于14个月，未治疗前具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0480且风险比95％信赖区间为1.013～19.012。

请同时参照图5C与图6C，在PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为350且第二阈值为350。接着，由图6C的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于14个月，未治疗前具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于350颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0480且风险比95％信赖区间为1.013～19.012。

请同时参照图5D与图6D，在PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为330且第二阈值为330。接着，由图6D的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于14个月，未治疗前具有大于等于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于330颗PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0602且风险比95％信赖区间为0.946～14.350。

请同时参照图5E与图6E，在PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为80且第二阈值为40。接着，由图6E的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0454且风险比95％信赖区间为1.019～6.342。

请同时参照图5F与图6F，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为80且第二阈值为40。接着，由图6F的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0930且风险比95％信赖区间为0.872～5.899。

请同时参照图5G与图6G，在PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为80且第二阈值为40。接着，由图6G的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0930且风险比95％信赖区间为0.872～5.899。

请同时参照图5H与图6H，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为80且第二阈值为40。接着，由图6H的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于12个月，未治疗前具有大于等于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于80颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0930且风险比95％信赖区间为0.872～5.899。

请同时参照图5I与图6I，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为200且第二阈值为320。接着，由图6I的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于320颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期大于14个月，未治疗前具有大于等于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于320颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于320颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于200颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于320颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肝癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0381且风险比95％信赖区间为1.093～23.386。

基于上述，由图5A至图5I以及图6A至图6I的结果可知，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时，其具有良好的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其具有较佳的治疗效果。然而，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肝癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量大于等于第二阈值时、当其在未治疗前的免疫细胞数量小于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时、或是当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时，其都具有较差的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其都具有较差的治疗效果。此处，上述的免疫细胞包括PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞、以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞，但不以此为限。

实验例4：预测接受抗PD-1/PD-L1免疫疗法后的肾细胞癌患者对所述抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性

图7A至图7F为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肾细胞癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。图8A至图8F为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的肾细胞癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

请同时参照图7A与图8A，在PD1⁺CD8⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为35。接着，由图8A的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为4～5个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0201且风险比95％信赖区间为0.034～0.760。

请同时参照图7B与图8B，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为35。接着，由图8B的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为5～6个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0123且风险比95％信赖区间为0.034～0.664。

请同时参照图7C与图8C，在PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为35。接着，由图8C的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为5～6个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0187且风险比95％信赖区间为0.038～0.743。

请同时参照图7D与图8D，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为35。接着，由图8D的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为5～6个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于35颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为3～4个月。此处，于统计学上的p值为0.0187且风险比95％信赖区间为0.038～0.743。

请同时参照图7E与图8E，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为70且第二阈值为20。接着，由图8E的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于70颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于20颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于70颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于20颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于70颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于20颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有小于70颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于20颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0381且风险比95％信赖区间为1.093～23.386。

请同时参照图7F与图8F，在PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的分析结果中，第一阈值为50且第二阈值为100。接着，由图8F的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有大于等于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞且治疗后具有大于等于100颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞且治疗后具有大于等于100颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有大于等于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞且治疗后具有小于100颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期大于16个月，未治疗前具有小于50颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞且治疗后具有小于100颗PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞的肾细胞癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0514且风险比95％信赖区间为0.030～1.011。

基于上述，由图7A至图7F以及图8A至图8F的结果可知，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肾细胞癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量大于等于第二阈值时、或是当其在未治疗前的免疫细胞数量小于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量大于等于第二阈值时，其都具有良好的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其具有较佳的治疗效果。然而，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的肾细胞癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时、或是当其在未治疗前的免疫细胞数量小于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时，其都具有较差的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其都具有较差的治疗效果。此处，上述的免疫细胞包括PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞、以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞，但不以此为限。

实验例5：预测接受抗PD-1/PD-L1免疫疗法后的泌尿道癌患者对所述抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性

图9A至图9E为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的泌尿道癌患者在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间的免疫细胞数量与无恶化存活期的风险比的散点图。图10A至图10E为接受抗PD1/PD-L1免疫疗法后的泌尿道癌患者的无恶化存活期与存活机率的Cox回归模型。

请同时参照图9A与图10A，在PD1⁺CD8⁺细胞的分析结果中，第一阈值为200且第二阈值为55。接着，由图10A的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有小于200颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有大于等于200颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为7～8个月，未治疗前具有小于200颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为2～3个月，未治疗前具有大于等于200颗PD1⁺CD8⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为1～2个月。此处，于统计学上的p值为0.0141且风险比95％信赖区间为0.046～0.707。

请同时参照图9B与图10B，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为55。接着，由图10B的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为6～7个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为3～4个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为1～2个月。此处，于统计学上的p值为0.0063且风险比95％信赖区间为0.039～0.585。

请同时参照图9C与图10C，在PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为55。接着，由图10C的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为6～7个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为2～3个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为1～2个月。此处，于统计学上的p值为0.0085且风险比95％信赖区间为0.033～0.608。

请同时参照图9D与图10D，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的分析结果中，第一阈值为150且第二阈值为55。接着，由图10D的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有大于等于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为6～7个月，未治疗前具有小于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为2～3个月，未治疗前具有大于等于150颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞且治疗后具有小于55颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为1～2个月。此处，于统计学上的p值为0.0085且风险比95％信赖区间为0.033～0.608。

请同时参照图9E与图10E，在PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的分析结果中，第一阈值为100且第二阈值为40。接着，由图10E的结果可知，当存活机率为50％时，未治疗前具有小于100颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有大于等于100颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有大于等于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期大于8个月，未治疗前具有小于100颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为2～3个月，未治疗前具有大于等于100颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞且治疗后具有小于40颗PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞的泌尿道癌患者的无恶化存活期为2～3个月。此处，于统计学上的p值为0.0274且风险比95％信赖区间为0.082～0.863。

基于上述，由图9A至图9E以及图10A至图10E的结果可知，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的泌尿道癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量小于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量大于等于第二阈值时、或是当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量大于等于第二阈值时，其都具有良好的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其都具有较佳的治疗效果。然而，对于接受有抗PD-1/PD-L1免疫疗法的泌尿道癌患者而言，当其在未治疗前的免疫细胞数量小于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时、或是当其在未治疗前的免疫细胞数量大于等于第一阈值且治疗后的免疫细胞数量小于第二阈值时，其都具有较差的预后且抗PD-1/PD-L1免疫疗法对其都具有较差的治疗效果。此处，上述的免疫细胞包括PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞、以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞，但不以此为限。

综上所述，在本发明的实施例的预测癌症患者对抗PD-1/PD-L1免疫疗法的反应性的方法中，借由检测癌症患者的周边血液样品中的免疫细胞数量，并比较免疫细胞数量与第一阈值或第二阈值之后，即可在第一次治疗之前预测癌症患者是否会从抗PD-1/PD-L1免疫疗法中受益，也可在一次治疗后以及下一次治疗前即早得知抗PD-1/PD-L1免疫疗法对癌症患者的治疗效果。再者，相较于现有技术必须采取癌症患者的肿瘤细胞进行分析因而使癌症患者要承受较大的痛苦，本发明的实施例所提供的方法仅需以抽血的方式搜集特定的免疫细胞及计算其数量，可以大幅缩短检验时间，对于癌症患者更为方便。因此，本发明的实施例所提供的方法对于接受免疫疗法的癌症患者来说，具有可节省费用及时间的好处。

虽然本发明已通过实施例的方式公开如上，但其并非用于限定本发明，任何所属技术领域中具有公知常识的人，在不脱离本发明的精神和范围内，应当可作出些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定的范围为准。

Claims

1.一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，包括：

在接受所述免疫疗法之前，从所述癌症患者中获取周边血液样品；

检测所述癌症患者的所述周边血液样品中的免疫细胞数量；以及

比较所述免疫细胞数量与第一阈值，以预测所述癌症患者是否会从所述免疫疗法中受益，

其中，所述第一阈值由以下步骤进行测定：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后获得统计学上有意义的数值，其中所述数值用于定义所述相关性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫疗法包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞表现以下至少一种标记：PD1、CD8、CD4、IFN-γ、TIM3、LAG3、CD25、TGF-β。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为肝癌，且所述免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为肾细胞癌，且所述免疫细胞选自由PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞、PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3^-细胞以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺LAG3⁺细胞所组成的群组。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一阈值依据风险比的图谱将所述癌症患者分为A组和B组，其中被分类为所述A组的所述癌症患者具有良好的预后，且被分类为所述B组的所述癌症患者具有较差的预后。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述风险比是透过所述组的癌症患者的存活时间与所述组的癌症患者的存活机率的Cox回归模型来测量。

8.一种预测癌症患者对免疫疗法的反应性的方法，包括：

在一轮治疗结束至下一轮治疗开始之间，从接受所述免疫疗法的所述癌症患者中获取周边血液样品；

比较所述免疫细胞数量和第二阈值，以获得所述免疫疗法对所述癌症患者的治疗效果，

其中，所述第二阈值由以下步骤进行测定：对一组的癌症患者中的免疫细胞数量与所述组的癌症患者中的疾病发展的预期风险之间的相关性进行统计分析，然后获得统计学上有意义的数值，其中所述数值用于定义所述相关性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫疗法包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞表现以下至少一种标记：PD1、CD8、CD4、IFN-γ、TIM3、LAG3、CD25、TGF-β。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症为肝癌，且所述免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺LAG3^-细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症为肾细胞癌，且所述免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞以及PD1⁺CD4⁺TGFβ⁺CD25⁺细胞所组成的群组。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症为泌尿道癌，且所述免疫细胞选自由PD1⁺CD8⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺细胞、PD1⁺CD8⁺TIM3⁺细胞、PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺细胞以及PD1⁺CD8⁺IFNγ⁺TIM3⁺LAG3^-细胞所组成的群组。

14.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二阈值依据风险比的图谱将所述癌症患者分为A组和B组，其中被分类为所述A组的所述癌症患者具有良好的预后，且被分类为所述B组的所述癌症患者具有较差的预后。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述风险比是透过其中一组的所述癌症患者的存活时间与所述其中一组的所述癌症患者的存活机率的Cox回归模型来测量。