CN111948389A - 一种检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

一种检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时检测咽拭子中甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。在PVC底板上依次相互交错约2mm粘贴上样品垫、甲型、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗体标记的时间分辨荧光微球结合垫、反应膜、吸水垫，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条组装成测试卡。反应膜上预包被有甲型流感病毒捕获抗体（T1检测线）、乙型流感病毒捕获抗体（T2检测线）、新型冠状病毒捕获抗体（T3检测线）和羊抗鼠多抗抗体（C对照线）。本发明将时间分辨荧光免疫层析技术引入到咽拭子甲型、乙型流感病毒和新型冠状病毒的检测中，不仅大大节约了检测时间，提升了检测的稳定性和灵敏度，而且操作简便，可用于现场检测；同时也具有成本低、性价比高的优点。

Description

一种检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨 荧光免疫层析试纸条及制备方法
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体地说，本发明涉及一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法。
背景技术
流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：高热、全身酸痛、全身乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起，可分为甲、乙、丙三型，其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重，乙型常引起爆发，丙型则多引起小儿散发病型。甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8，其中H1、H5、H7、H9为高致病性。乙型型流感病毒是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显着乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，可引起局部爆发流行，但不会引起世界性流感大流行。
新型冠状病毒于2019年12月被首次发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名“2019-nCoV”。新型冠状病毒（2019-nCoV）是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体。2019-nCoV的临床表现：基于目前的流行病学调查，2019-nCoV潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。2019-nCoV的临床表现为：发热，乏力，呼吸道症状以干咳为主，并逐渐出现呼吸困难；严重者表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍；部分患者起病症状轻微，可无发热；多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。2019-nCoV病情可以表现为单纯性感染、轻症肺炎重症肺炎、ARDS、脓毒症和脓毒性休克。根据临床综合征严重程度分为轻、中、重度，后者包括重症肺炎、ARDS、脓毒症和脓毒性休克。现存的实验室检验方法检测时间长、操作较复杂、费用较高，临床使用存在一定局限性。
传统的甲型流感病毒和（或）乙型流感病毒和（或）新型冠状病毒的检测方法主要有。
a、荧光PCR法--该方法对模板RNA质量要求高，但需要专门实验室，检测仪器昂贵，检测时间较长，检测灵敏度高。
b、金标法---该法具有快速简便，易观察的特点，但是灵敏度不高。
c、病毒分离法---该方法准确，周期长，操作需要专门实验室。
d、酶联免疫法---该方法准确，灵敏度高，但是操作复杂，周期长。
荧光免疫层析检测技术具有安全、费用低、操作简便、可实现床旁快速检测等优点，其中，时间分辨荧光免疫层析无放射性污染、无背景荧光干扰，其原理为：利用时间分辨荧光微球的荧光强度实现对待测物的定量检测。该方法作为POCT发展的新方向之一，其具备的检测结果准确度高、灵敏性好特点，能够满足临床床旁快速检测和基层社区医院的需要。成为目前的研究热点，在临床检测中具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、同时检测时间短的甲型和乙型流感病毒时间分辨荧光试纸条，使其能够满足临床快速检验的需要及国内市场的需求。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：本发明所提供了一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原时间分辨荧光试纸条如图1所示，该试纸条包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫和底板。反应膜位于中间，样品垫与吸水垫分别位于反应膜左右两端。其中，试纸条结合垫上载有时间分辨荧光微球标记的甲型流感病毒单克隆抗体、乙型流感病毒单克隆抗体和新型冠状病毒单克隆抗体。反应膜上设有T1检测线、T2检测线、T3检测线和C对照线。T1检测线包被甲型流感病毒单克隆抗体；T2检测线包被乙型流感病毒单克隆抗体；T3检测线包被新型冠状病毒单克隆抗体；C线包被兔抗鼠抗体。按照常规免疫层析法的原理进行样本的检测，结合简便易行的干式荧光免疫分析仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的种种弊端，测量结果准确，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。
在本发明的实施方案中，所述样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫在底板按顺序排列，其中，所述样品垫与结合部分重合，重合部分长度约1-2mm；所述结合垫与反应膜有部分重合，重合部分长度约1-2mm；所述反应膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度约1-2mm；所述检测线和对照线的长度约0.5-1.5mm；所述T1、T2和T3检测线之间的间距离约1-3mm；所述T3检测线和对照线之间的间距离约3-5mm。
在本发明的一个具体实施例中，样本垫的长度为20mm，结合垫的长度为6mm，反应膜的长度为25mm，吸水垫的长度为20mm。
在其中一些实施例中，所述识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体的包被浓度为1-1.5mg/ml；羊抗鼠多抗抗体的包被浓度为0.5-1.0mg/ml，在所述包被膜上的包被量均为1-1 .5ul/cm。
在本发明的一个实施例中，所述荧光微球的直径为100～300nm。在本发明的一个更优选实施例中，所述荧光微球的直径为200nm。
在本发明的一个实施例中，所述反应膜为硝酸纤维素膜。硝酸纤维素又称硝化纤维素、纤维素硝酸酯，为纤维素与硝酸酯化反应的产物。以棉纤维为原料的硝酸纤维素称为硝化棉。硝酸纤维素是一种白色纤维状聚合物，耐水、耐稀酸、耐弱碱和各种油类。尤其适于作为本发明抗体承载膜的基底膜材质。
在其中一些实施例中，所述结合垫为玻璃纤维，其能够载有足量的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，且遇样品后又能迅速释放微球。
在本发明的一个实施例中，所述时间分辨荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。微球表面带有活性基团，可以连接蛋白、糖类等生物物质，内含荧光素。在本发明的一个更优选实施例中，所述镧系元素为Eu3+元素。
本发明还提供了上述检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤。
1、结合物垫的制备：选用直径为200nm的荧光微球，使用碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）共价偶联的方式将甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗体标记到荧光微球上；将制备好的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体按照1：1：1比例混合使用定量喷液装置以1-4μL/cm的量喷涂于处理过的结合物垫上。
2、结合物垫的处理：用定量喷液装置将结合物垫处理液以1-4μL/cm的量喷涂于结合物垫上后50℃烘干2小时。
3、反应膜的制备：使用包被缓冲液分别将甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒捕获抗体分别稀释到1.5mg/mL；羊抗鼠多抗抗体稀释到1.0mg/mL。使用定量喷液装置分别将四者以检测线之间2mm、检测线和对照线4mm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于42℃烘干12小时，加入干燥剂封存备用。
4、试纸条的组装：在白色PVC底板上依次相互交错2mm地贴上样品垫、结合物垫、反应膜、吸水垫，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条。所述试纸条还包括外壳，所述外壳包括上壳和下壳，上壳将样品垫、反应膜和吸水垫压紧在PVC底板上，且上壳在对应样品垫垫和反应膜的部分分别设有加样孔和观察窗。
在其中一些实施例中，上述步骤1中所述荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体的制备方法包括如下步骤。
(1)使用0.01-0.05mol/L的pH6.0的MES活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使EDC、NHS和微球终浓度分别为100mg/mL和1.0-1.5mg/mL，室温反应15-30分钟，充分洗涤微球，用0.02-0.05mol/L的pH7.8-8.0的硼酸缓冲液复溶。
(2)按甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体与微球的质量比为1:5-10的比例，分别在复溶后的微球中加入甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，室温反应1-2小时，加入含有3%BSA0.02mol/L的pH7 .8-8.0的硼酸缓冲液，室温反应1-2小时，洗涤，再用含有0 .3％BSA，0.05％Tween-20的0.02mol/L的pH7.4-7.6的硼酸缓冲液复溶至原体积，将制备好的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体按照1：1：1比例混合，使用定量喷膜仪以1-4ul/cm的量喷涂于玻璃纤维膜上，避光，烘干即得。
本发明还提供了一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括塑料卡壳、上述的试纸条、以及样本缓冲液。
在其中一些实施例中，所述样本缓冲液为含有0.5％BSA、0.05％Tween-20、pH7.4的PBS缓冲液。
本发明的同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试剂盒在使用时，将待测咽拭子样品加到样本缓冲液中，在样品垫上分别滴加60-80µL样本稀释液，通过毛细管作用将样本输送到结合垫。当咽拭子样本中含有甲型和（或）乙型流感病毒和（或）者新型冠状病毒抗原时，则会与荧光微球上的单克隆抗体形成抗原-抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达包被识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体的T1、T2和T3检测区，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，聚集在检测区处。未结合甲型和（或）乙型流感病毒和（或）新型冠状病毒单克隆抗体的标记微球（Eu3+镧系元素）继续前行，到达对照区C时，与对照区上的羊抗鼠多抗结合，在C线处出现标记微球的聚集。整个反应在10-15分钟内完成，并进行上机读卡。在激发光源下产生的荧光强度与试纸条上的结合物含量成正比，当光源照射到试纸条的检测区和对照区时，激发附着的荧光物质，发射光收集并转化为电信号，电信号的强弱和荧光分子数量相关，检测仪计算样品中待测物的含量。
与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点。
1）将时间分辨荧光免疫层析技术引入甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的检测中，结合干式荧光免疫分析仪，实现了同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原，为临床使用提供了极大的便利。
2）实现在一张检测卡上检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原，大大方便了临床诊断。
本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、农村和基层诊所等。
附图说明
图1显示了本发明时间分辨荧光免疫层析法检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的试纸条结构示意图。
图2是检测卡壳结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1 同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒的时间分辨免疫层析试纸条。
本实施例的一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，包括底板以及依次设在所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫。所述结合垫上包被有等同数量荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体；所述反应膜包括平行设置、且相互间隔2mm及4mm的T1、T2、T3检测区和对照区；所述T1检测区靠近所述结合垫，所述对照区靠近所述吸水垫，所述T2和T3检测区位于T1检测区和对照区中间，所述T2检测区靠近T1检测区，所述T3检测区靠近对照区。所述T1、T2和T3检测区分别包被有识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体，所述对照区包被有羊抗鼠多抗抗体。
本实施例中，所述反应膜为化学交联聚碳酸酯与聚苯乙烯丙烯腈(聚合物)的硝酸纤维膜，所述聚碳酸酯与聚苯乙烯丙烯腈聚合物在小于450nm波长具有10％以下透光率，在500nm波长以上具有95％以上的透光率。这种材料可以允许绝大多数的可见光透过，光检测器能够捕捉多层多孔膜表面和内部的荧光信号，使检测结果更准确。
本实施例中，所述结合垫为玻璃纤维膜，其能够载有足量的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，且遇样品后又能迅速释放微球。
本实施例中，所述荧光微球选用本领域公知的用于标记抗体的Eu3+镧系元素荧光微球，微球表面带有活性基团，可以连接蛋白、糖类等生物物质，内含荧光素。所述荧光微球的直径为200nm。
本实施例的同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤。
(1)、在反应膜上分别固定识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒、新型冠状病毒单克隆捕获抗体和羊抗鼠多抗抗体，形成T1、T2、T3检测区和C对照区。具体方法为：使用含有0.05%Tween-20、0.02mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别将识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体稀释到1.5mg/ml，羊抗鼠多抗抗体稀释到1.0mg/ml，使用定量喷膜仪以1ul/cm的量将甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体以2mm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，将羊抗鼠多抗抗体喷于硝酸纤维素膜上（与新型冠状病毒单克隆捕获抗体间隔4mm）42℃烘干12h，加入干燥剂封存备用。
(2)、制备好的荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，按照1：1：1比例混合并喷涂在结合垫上，具体方法为。
(a)、使用0.02mol/L的pH6.0的MES活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使EDC/NHS和微球终浓度分别为100mg/mL和1.0mg/mL，室温反应15分钟，充分洗涤微球，用0.02mol/L、pH8.0的硼酸缓冲液复溶；(b)、按甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体与微球的质量比为1:10的比例，分别在复溶后的微球中加入甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，室温反应2小时，加入含有3％BSA、0.02mol/L、pH7.4的硼酸缓冲液，室温反应1小时，洗涤，再用含有0 .3％BSA、0.05％Tween-20、0.02mol/L、pH7.4的硼酸缓冲液复溶至原体积，将制备好的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体按照1：1：1比例混合，使用定量喷膜仪以4ul/cm的量喷涂于玻璃纤维膜上，避光，在42℃烘干12小时，加入干燥剂封存备用。
(3)、在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，切割成宽度为3.5mm大小，即得试纸条。
一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设有加样孔和观察窗，加样孔对应于甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原检测试纸条的样品垫，结果观察窗对应于甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原检测试纸条的T1、T2、T3检测线和C对照线。
实施例2 同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试剂盒。
本实施例的同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括：实施例1所述的试纸条、塑料卡壳、样本缓冲液。
在本实施例中，所述样本缓冲液为含0.5％BSA和0.05％Tween-20、pH7.4、0.02mol/L的PBS缓冲液。
本发明的同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试剂盒在使用时将待测将咽拭子样品加到样本缓冲中，在样品垫上滴加60µL样本稀释液，通过毛细管作用将样本输送到结合垫。当咽拭子样本中含有甲型和（或）乙型流感病毒和（或）新型冠状病毒抗原时，则会与荧光微球上的单克隆抗体形成抗原-抗体复合物。随着层析作用，复合物向前移动，到达包被识别单一抗原表位的甲型和（或）乙型流感病毒和（或）新型冠状病毒单克隆捕获抗体的T1、T2或T3检测区，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，聚集在检测区处。未结合甲型和（或）乙型流感病毒和（或）新型冠状病毒单克隆抗体的标记微球(Eu3+镧系元素)继续前行，到达对照区C时，与羊抗鼠多抗结合，在C线处出现标记微球的聚集。整个反应在15分钟内完成，并进行上机读卡。在激发光源下产生的荧光强度与试纸条上的结合物含量成正比，当光源照射到试纸条的检测区和对照区时，激发附着的荧光物质，发射光收集并转化为电信号，电信号的强弱和荧光分子数量相关，检测仪计算样品中待测物的含量。
实施例3的试剂盒的性能测定。
对试剂盒进行了性能方面的测定，包括最低检测限、精密度、灵敏度、特异性等。
1、最低检测限。
其检测结果表1所示，从表中可以看出甲型H1N1、甲型H5N1、甲型H3N2、甲型H7N9的最低检测限0.5ng/mL；B/Victoria和B/Yamagata的最低检测限为1.0ng/mL；新型冠状病毒最低检测限为0.5ng/mL。
2、批内精密度：随机抽取同一批号的时间分辨免疫层析试剂盒10份，分别对同一浓度的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原参考品进行检测，其变异系数CV(％)值≤10％。
3、批间精密度：随机抽取连续三个批号的时间分辨免疫层析试剂盒，每个批号取3份分别对同一浓度的甲、乙型流感和新型冠状病毒参考品进行检测，其变异系数CV(％)值≤10％。
4、准确性和特异性：利用合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、巨细胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒参考品为待测干扰物，待测样品滴入实施例1得到的检测试剂盒的加样端，15分钟后用荧光检测仪进行测试。
其结果表明本发明的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原时间分辨免疫层析试剂盒与对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒具有很强的特异性，与其他病原体间无交叉反应。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
表1。
Figure 932561DEST_PATH_IMAGE001
表2。
Figure 996945DEST_PATH_IMAGE002

Claims (11)

1.一种检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括PVC底板、以及依次设在所述底衬上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，所述反应膜包括平行设置、且相互间隔的检测区和对照区，所述T1检测区、T2检测区和T3检测区分别包被有识别单一抗原表位的甲型流感病毒单克隆捕获抗体、乙型流感病毒单克隆捕获抗体和新型冠状病毒单克隆捕获抗体，对照区包被羊抗鼠多抗抗体，所述反应膜为结合聚合物的硝酸纤维膜，所述聚合物为在小于450nm波长具有10％以下透光率，在500nm波长以上具有95％以上的透光率的材料。
2.根据权利要求1所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。
3.根据权利要求1或2所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗体--时间分辨荧光微球的终浓度为1.0-1.5mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体和羊抗鼠多抗抗体的终浓度分别为1-1.5mg/ml和0.5-1.0mg/ml，在所述反应膜上的包被量均为1-1 .5ul/cm。
5.根据权利要求1或2所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合垫为玻璃纤维。
6.根据权利要求1或2所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的直径为100nm-300nm。
7.根据权利要求1或2所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，所述T1检测区靠近所述结合垫，所述对照区靠近所述吸水垫，所述T2和T3检测区位于T1检测区和对照区中间，所述T2检测区靠近所述T1检测区，所述T3检测区靠近所述对照区，T1 、T2、T3检测区和对照区的间隔为2~4mm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤：
(1) 在反应膜上分别固定识别单一抗原表位的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆捕获抗体和羊抗鼠多抗抗体，形成T1、T2、T3检测区和对照区C；
(2) 制备时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，将制备好的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体按照1：1：1体积比例混合并喷涂在结合垫上；
(3) 在底板上依次粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条，所述试纸条还包括外壳，所述外壳包括上壳和下壳，上壳将样品垫、反应膜和吸水垫压紧在PVC底板上，且上壳在对应样品垫垫和反应膜的部分分别设有加样孔和观察窗。
9.根据权利要求8所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述荧光标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体的制备方法包括如下步骤：
(1) 使用0.01-0.05mol/L的pH5.0-6 .0的MES活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），使EDC/NHS和微球终浓度分别为80-120mg/mL和0.5-1.0mg/mL，室温反应15-30分钟，充分洗涤微球，用0.02- 0 .05mol/L的pH8.0-8.5的硼酸缓冲液复溶；
(2) 按甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体与微球的质量比为1:5-10的比例，在复溶后的微球中分别加入甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体，室温反应1-2小时，加入含有5％BSA的0 .02mol/L的pH8.0-8.5的硼酸缓冲液，37℃反应1小时，洗涤，再用含有0.3％BSA，0 .05％Tween-20的0 .02mol/L的pH7.4-7.6的硼酸缓冲液复溶至原体积，于4℃避光保存，将制备好的时间分辨荧光微球标记的甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒单克隆检测抗体按照1：1：1比例混合，使用时，用定量喷膜仪以1-4ul/cm的量喷涂于玻璃纤维膜上，放入烘箱，40～60℃避光烘干，加入干燥剂封存备用。
10.一种同时检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒抗原的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括塑料卡壳、权利要求1～7任一项所述的试纸条、以及样本反应液。
11.根据权利要求10所述的检测甲、乙型流感病毒和新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述样本反应液为含有0.5％的BSA、0.05％的Tween-20、pH7.4的PBS缓冲液。
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