CN111948319B

CN111948319B - 一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法

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Publication number: CN111948319B
Application number: CN202010831114.6A
Authority: CN
Inventors: 杨文鸽; 王宸; 张进杰; 李超; 徐大伦; 王岱杰
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111948319A

Abstract

本发明公开了一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化获得若干组分，对每个组分进行液质联用检测；高速逆流色谱采用的两相体系包括两种，第一种两相体系为叔丁基甲醚、乙腈、水按体积比为3.5～4.5:1:4.5～5.5，第二种两相体系为叔丁基甲醚、正丁醇、乙腈、水按体积比为2.5～3.5:0.9～1.1:1:4.5～5.5，使用时，第一种两项体系的下相作为固定相，第一种两项体系的上相和第二种两相体系的上相均作为流动相。本发明能够对浒苔中多酚类活性成分进行分离分析。

Description

一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法

技术领域

本发明涉及浒苔活性成分的高效分析方法，具体涉及一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

浒苔属(Enteromorpha)在分类学上属于绿藻门(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)，主要有条浒苔(Enteromorpha clathrata)、肠浒苔(E.intestinalis)、扁浒苔(E.compressa)、浒苔(E.prolifera)、缘管浒苔(E.linza)5种，生长在潮间带。浒苔是一种绿潮藻类，具有很高利用价值的藻类资源，研究表明浒苔含有丰富的营养成分。需要对浒苔的成分进行详细的挖掘、深入分析成分。

据发明人研究发现，目前海藻的研究主要集中于多糖的研究，对于多酚的研究比较少，对于多酚的分离纯化主要使用传统分离方法。传统分离纯化方法主要有：大孔树脂分离和制备液相分离。大孔树脂分离的缺点主要有：(1)有机残留物高，预处理难度大；(2)强度差，使用过程中破损严重，使用寿命短；(3)粒径分布广，分离效果差。制备液相分离的缺点主要有：效率低下，收率低，对于过于复杂的混合物，纯化效果不理想。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法，能够对浒苔中含多酚类活性成分的小分子化合物进行分离分析。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化获得若干组分，对每个组分进行液质联用检测；

高速逆流色谱采用的两相体系包括两种，第一种两相体系为叔丁基甲醚、乙腈、水按体积比为3.5～4.5:1:4.5～5.5，第二种两相体系为叔丁基甲醚、正丁醇、乙腈、水按体积比为2.5～3.5:0.9～1.1:1:4.5～5.5，使用时，第一种两项体系的下相作为固定相，第一种两项体系的上相和第二种两相体系的上相均作为流动相。

本发明经过试验发现，采用高速逆流色谱的两相体系影响对浒苔中活性成分的分离，采用本发明提供的两相体系能够实现对条浒苔中的活性成分初步分离，然后采用液质联用能够进一步对初步分离的活性成分进行进一步检测分离。

本发明的有益效果为：

本发明先采用高速逆流色谱对浒苔中多酚类活性成分进行初步分离，再采用液质联用对初步分离的每个组分进行检测，能够对浒苔的成分进行详细的挖掘、深入分析。

本发明采用特定的两相体系实现对浒苔中含多酚类活性成分的小分子化合物的初步分离，从而获得能够用于液质联用检测的多个组分。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1的条浒苔粗品分离的高速逆流色谱图；

图2为本发明实施例1的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例2的高速逆流色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于现有技术难以对浒苔中含多酚类活性成分的小分子化合物进行分离检测，本发明提出了一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化获得若干组分，对每个组分进行液质联用检测；

本发明经过试验发现，采用高速逆流色谱的两相体系影响对浒苔中活性成分的分离，采用本发明提供的两相体系能够实现对条浒苔中的含多酚类活性成分的小分子化合物初步分离，然后采用液质联用能够进一步对初步分离的活性成分进行进一步检测分离。

该实施方式的一些实施例中，条浒苔的醇提物采用体积分数为55～65％的乙醇进行提取。

在一种或多种实施例中，条浒苔的醇提物的提取过程为，将条浒苔粉末用55～65％的乙醇回流提取2～4次，每次2～4天，提取后过滤，再浓缩至无醇味获得条浒苔的醇提物。

该实施方式的一些实施例中，将两相体系的原料混合，静置分层后，上层为两相体系的上相，下层为两相体系的下相。

该实施方式的一些实施例中，高速逆流色谱进行分离纯化时，先以第一种两项体系的下相作为固定相，以第一种两项体系的上相作为流动相进行色谱分离，分离结束后，再以第二种两相体系的上相作为流动相继续进行色谱分离。

在一种或多种实施例中，以第一种两项体系的上相作为流动相进行色谱分离，分离出第5种组分后，再以第二种两相体系的上相作为流动相继续进行色谱分离。

该实施方式的一些实施例中，高速逆流色谱仪柱体积为250～350mL，上样量150～250mg，转速700～900转/min，流速1.5～2.5mL/min，检测波长254±2nm。

该实施方式的一些实施例中，液质联用的色谱条件为：色谱柱为C₁₈柱，紫外检测波长280±2nm，流速：0.5～1.5mL/min，进样量：5～15μL，流动相A相为乙腈，流动相B相为0.2％甲酸溶液。

在一种或多种实施例中，C₁₈柱的填料粒径为5±1μm，柱内径为4.6±0.1mm，柱长为245～255mm。

在一种或多种实施例中，液质联用的色谱的梯度洗脱程序为：0min，10％A；0–5min，10-25％A；5–15min，25-25％A；15–40min，25-45％A；40–45min，45-45％A；45–46min，45-10％A；46–51min，10-10％A。％为体积百分数。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

样品提取：

将干燥条浒苔(1kg)完全粉碎成粉末，用3L 60％乙醇回提取3次，每次3d，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液并浓缩至无醇味，然后使用等量的乙酸乙酯萃取浓缩物。乙酸乙酯部分在55℃下旋转蒸发至干，得到10g粗样品，将其储存在4℃的冰箱中进行进一步的HSCCC纯化。

应用梯度逆流色谱富集分段条浒苔中多酚类化合物：

将两相溶剂体系叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(4:0:1:5，v/v)和叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(3:1:1:5，v/v)分别按上述溶剂比例配制溶剂***，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为流动相，下相为固定相。200mg条浒苔乙酸乙酯提取物溶解于5mL的上相和5mL的下相待用。采用高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(4:0:1:5，v/v)的下相(固定相)用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱反转，转速达800转/min时，设置流动相流速为5.0mL/min，开始泵流动相叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(4:0:1:5，v/v)的上相泵入逆流色谱仪进行平衡，当达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为5.0mL/min，开始泵流动相叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(4:0:1:5，v/v)的上相，然后根据检测器紫外光谱图接收图1中组分a～e。接出e之后开始泵流动相叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(3:1:1:5，v/v)的上相进行梯度洗脱，然后根据检测器紫外光谱图接收图1中组分f～k。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：waters-RP C₁₈柱(4.6×250mm)，紫外检测波长280nm，柱温：25℃，流速：0.8mL/min，进样量：20μL，流动相采用甲醇(A)和0.2％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0min，10％A；0–5min，10–25％A；5–15min，25-25％A；15–40min，25–45％A；40–45min，45-45％A；45–46min，45–10％A；46–51min，10-10％A。

高效液相色谱的结果如图2所示，图2最上方的图为乙酸乙酯提取物的高效液相色谱图，从该图中仅由7个较为明显的色谱峰，而通过本实施例梯度逆流色谱分段收集组分a～k的高效液相色谱图，可以看出，能够分离检测出24种化合物，而乙酸乙酯提取物的高效液相色谱图只有经过放大才能显示其他15中化合物的色谱峰。表明本实施例能够检测出乙酸乙酯提取物中更多的化合物组分。

结构鉴定：对分离得到的多酚应用Agilent 5973N质谱仪分别进行一级质谱和二级质谱的测定。

一级质谱条件：全扫描模式(全MS)；氮气流量：8L/min；电压：3.5KV；干燥温度：200℃；扫描范围m/z 50～1500。

二级质谱条件：电离源为电喷雾负离子模式(ESI-)；监控模式：全扫描模式；氮气流量：8L/min；电压：3KV；干燥温度：200℃；扫描范围m/z 50～1500。

共检测出24个化合物，鉴定出其中14个化合物，分别为多酚类(7个)、黄酮类(6个)、生物碱类(1个)、香豆素类(1个)，如表1所示。

表1条浒苔粗品分离的质谱解析表

实施例2

与实施例1的区别在于，采用叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水(3:1:1:5，v/v)溶剂***的上相直接洗脱富集，其余步骤和实施例1一样，结果如图3所示。

由图3可以看出，若仅用一种两相溶剂体系，都会导致各有效组分之间不能分离。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化获得若干组分，对每个组分进行液质联用检测；

高速逆流色谱采用的两相体系包括两种，第一种两相体系为叔丁基甲醚、乙腈、水按体积比为3.5～4.5:1:4.5～5.5，第二种两相体系为叔丁基甲醚、正丁醇、乙腈、水按体积比为2.5～3.5:0.9～1.1:1:4.5～5.5，使用时，第一种两相体系的下相作为固定相，第一种两相体系的上相和第二种两相体系的上相均作为流动相；

以第一种两相体系的上相作为流动相进行色谱分离，分离出第5种组分后，再以第二种两相体系的上相作为流动相继续进行色谱分离；

高速逆流色谱仪柱体积为250～350mL，上样量150～250mg，转速700～900转/min，流速1.5～2.5mL/min，检测波长254±2nm；

液质联用的色谱条件为：色谱柱为C18柱，紫外检测波长280±2nm，流速：0.5～1.5mL/min，进样量：5～15μL，流动相A相为乙腈，流动相B相为0.2％甲酸溶液；

液质联用的色谱的梯度洗脱程序为：0min，10％A；0–5min，10-25％A；5–15min，25-25％A；15–40min，25-45％A；40–45min，45-45％A；45–46min，45-10％A；46–51min，10-10％A。

2.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，条浒苔的醇提物采用体积分数为55～65％的乙醇进行提取。

3.如权利要求2所述的浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，条浒苔的醇提物的提取过程为，将条浒苔粉末用55～65％的乙醇回流提取2～4次，每次2～4天，提取后过滤，再浓缩至无醇味获得条浒苔的醇提物。

4.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，将两相体系的原料混合，静置分层后，上层为两相体系的上相，下层为两相体系的下相。

5.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，高速逆流色谱进行分离纯化时，先以第一种两相体系的下相作为固定相，以第一种两相体系的上相作为流动相进行色谱分离，分离结束后，再以第二种两相体系的上相作为流动相继续进行色谱分离。

6.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的高效分离分析方法，其特征是，C18柱的填料粒径为5±1μm，柱内径为4.6±0.1mm，柱长为245～255mm。