CN111944866B - 连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，包括(1)牦牛皮前处理，(2)匀浆，(3)酶解，(4)离心分离，(5)脱色、脱腥、脱盐，(6)浓缩干燥步骤，其特征在于所述步骤(3)酶解包括：第一次酶解，超微细化处理，第二次酶解。本发明通过双酶解与连续旋蒸脱溶结合，可大幅缩短酶解时间，提高工艺效率，且制备的牦牛皮胶原蛋白肽纯度高，无色无味，分子量小，有利于人体直接吸收。

Description

连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法

技术领域

本发明属于胶原蛋白肽提取技术领域，具体涉及一种连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法。

背景技术

青海是全国最大的牦牛生产基地，占全国牦牛总数的三分之一以上，盛传为“世界牦牛之都”。独有的高原环境，使牦牛拥有极强的免疫力，强力的紫外线照射，使牦牛成为无菌资源的宝库，天然的放养方式，使牦牛具有独特的营养价值和可靠的安全性。因此，“世界屋脊”之称的牦牛是提取胶原蛋白肽的优良原料，进一步的加大牦牛皮的利用价值，减轻屠宰“废弃物”的问题。

现有的皮类提取原料中，仍是以深海鱼类为主，通过深海鱼皮所制备的胶原蛋白肽一直为市场上的主流，尤其是进口深海鳕鱼皮胶原蛋白肽深受大众欢迎。当前市场上的牛皮胶原蛋白肽，相比于鱼皮胶原蛋白肽，大多数产品色泽偏黄，有牛皮淡腥味，对食用口感有一定影响，作为添加原料同样影响终端产品的品质。由于本身陆地脊椎动物制备胶原蛋白肽产率低于海洋动物，同时酶解的过程中产生大量未水解碎屑增加过滤负担，生产有利于人体吸收的小分子肽成本颇高，以至于生产牛皮胶原蛋白肽的很多地方没有得到改善。因此，有必要开发一种更绿色环保，低成本，高品质的牛皮胶原蛋白肽的高效提取方法，增强我国青海牦牛皮的利用价值和牛皮肽的市场地位。

发明内容

为解决上述内容中的不足，本发明的目的在于提供一种连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，本发明通过双酶解与连续旋蒸脱溶结合，可大幅缩短酶解时间，提高工艺效率，且制备的牦牛皮胶原蛋白肽纯度高，无色无味，分子量小，有利于人体直接吸收。

本发明的技术方案如下。

连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，包括(1)牦牛皮前处理，(2)匀浆，(3)酶解，(4)离心分离，(5)脱色、脱腥、脱盐，(6)浓缩干燥步骤，其特征在于所述步骤(3)酶解包括：

第一次酶解：于步骤(2)匀浆得到的牦牛皮浆液中加入胃蛋白酶，之后于真空度0.85～0.98MPa、转速15～60r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解4～6h，得第一次酶解液；

超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500nm，得纳米化酶解液；

第二次酶解：调整纳米化酶解液的pH至合适范围，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液，之后于真空度0.85～0.98MPa、转速15～60r/min、温度45～55℃下进行旋蒸脱溶酶解2～3h；所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶中的任意一种；

上述步骤中，通过在酶解时进行旋转真空脱溶，可以维持酶解过程的底物浓度在较高水平，有利于提高整体的酶解速率，从而大幅缩短酶解时间；另外，将酶解液利用纳米对撞机进行处理，可以使含有胶原蛋白的酶解液的平均粒径达纳米级，可增加酶与底物的结合位点，提高酶解速率。

作为优选技术方案，所述步骤(3)中第一次酶解、第二次酶解进行旋蒸脱溶酶解时，同时施加超声波。

作为具体技术方案，所述步骤(1)牦牛皮前处理具体为：称取新鲜牦牛皮，脱毛后切碎，于室温下按料液质量比为1:3～7kg/kg加入质量浓度为3％～5％的纯碱浸泡6～8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:3～7kg/kg加入至质量浓度为3％～5％食盐中再次浸泡6～8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性。

作为具体技术方案，所述步骤(2)匀浆具体为：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:4～8kg/kg加入0.05M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液。

作为具体技术方案，所述步骤(4)离心分离具体为：将步骤(3)酶解结束后的酶解液高温煮沸进行灭酶和杀菌，之后于8000～12000rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液。

作为具体技术方案，所述步骤(5)脱色、脱腥、脱盐具体为：于步骤(4)离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入0.1％～0.3％m/v的活性炭，室温下40～80r/min搅拌2～3h，之后抽滤去除活性炭，再经离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥。

作为具体技术方案，所述步骤(1)的牦牛皮为青海柴达木盆地牦牛皮。

作为具体技术方案，所述的复合酶液为弹性蛋白酶与碱性蛋白酶，在第二次酶解中引入弹性蛋白酶进一步降解胶原纤维和胶原蛋白膨胀，在碱性蛋白酶的酶解过程中具有协同作用，极大促进第二次酶解，使牦牛皮得到充分的水解。

作为具体技术方案，所述步骤(3)中第一次酶解使用的胃蛋白酶为从动物粘膜提取的食品级蛋白酶，酶活力为10万；所述步骤(3)中第二次酶解使用的碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌中提取的食品级蛋白酶，酶活力为20万，弹性蛋白酶为胰脏中提取的食品级蛋白酶，酶活力为10万，优选的两种酶协同达到最佳酶解效果。

作为具体技术方案，所述的活性炭为200目的木质活性炭，所述离子交换树脂采用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂。

作为具体技术方案，所述方法制得的牦牛皮胶原蛋白肽中，分子量小于3000Da的胶原蛋白肽的含量大于95％，分子量小于2000Da的寡肽含量大于90％，分子量小于1000Da的寡肽含量大于70％。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用青海柴达木盆地新鲜牦牛皮为原料，具有天然的材料优势，采用纯碱和食盐的前处理，大大降低脂肪和杂蛋白对产品和后续工艺的影响。

2、本发明选用胶体磨进行牦牛皮匀浆处理，充分搅碎牛皮，并加上本发明的双酶解技术，此水解过程中仅包含维持酶解pH环境的醋酸和NaOH，无需特定缓冲体系，胃蛋白酶提取胶原蛋白后，在第二次酶解中引入弹性蛋白酶进一步降解胶原纤维和膨胀胶原蛋白，在碱性蛋白酶的酶解过程中具有协同作用，极大促进碱性蛋白酶酶解，使牦牛皮得到充分的水解，剩余残渣仅剩微量碎牛毛，大大减轻过滤负担。并且本发明将双酶解与连续旋蒸脱溶结合，可大幅缩短酶解时间，提高工艺效率。

3、本发明采用胃蛋白酶和复合酶液的双酶解，不经超滤分离，制得的牦牛皮胶原蛋白肽中，分子量小于3000Da的胶原蛋白肽的含量大于95％，分子量小于2000Da的寡肽含量大于90％，分子量小于1000Da的寡肽含量大于70％，使产品完全有利于人体直接吸收，且大大降低生产成本，简化了生产工艺。

4、本发明采用200目的木质活性炭和阴阳离子树脂结合达到最佳的脱色、脱盐、脱腥的效果，可增强牦牛皮胶原蛋白肽的品质，口感也更佳。

5、本发明获得的牦牛皮胶原白肽纯度高，无色无味，相较于市场上大多数牛皮胶原蛋白肽产品具有明显的优势，可广泛应用于食品、保健品和化妆品中，不影响终端产品的品质。

附图说明

图1为采用实施例3方法制备的牦牛皮胶原蛋白肽的12％SDS-PAGE凝胶电泳分析图，泳道1为第一次酶解中胃蛋白酶提取的胶原蛋白样品，泳道2为第二次酶解中复合酶液酶解后的牦牛皮胶原蛋白肽样品；

图2为采用实施例3方法制备的牦牛皮胶原蛋白肽的分子体积排阻色谱图及胶原蛋白肽分子量分布，色谱图中单峰为标准肽的保留时间；

图3为采用实施例3方法制备的牦牛皮胶原蛋白肽的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。

实施例1

连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其包括(1)牦牛皮前处理，(2)匀浆，(3)酶解，(4)离心分离，(5)脱色、脱腥、脱盐，(6)浓缩干燥步骤，具体步骤如下：

(1)前处理：称取50g新鲜牦牛皮，脱毛后切碎成1×1cm的块状，于室温下按料液质量比为1:5kg/kg加入质量浓度为5％的纯碱浸泡8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入至质量浓度为5％食盐中再次浸泡8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性，以达到脱脂除杂的目的；

(2)匀浆：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入0.05M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液；

(3)酶解：

第一次酶解：于步骤(2)匀浆得到的牦牛皮浆液中加入1.5g酶活力为10万的胃蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速20r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解6h，得第一次酶解液；

超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500nm，得纳米化酶解液；

第二次酶解：采用NaOH调整纳米化酶解液的pH至9，加入0.3g酶活力为20万的碱性蛋白酶和0.03g酶活力为10万的弹性蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速60r/min、温度50℃下进行旋蒸脱溶酶解3h；

(4)离心分离：将步骤(3)酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶和杀菌，之后于10000rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液。

(5)脱色、脱腥、脱盐：于步骤(4)离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入1.5g、200目的木质活性炭，室温下60r/min搅拌2～3h，之后抽滤去除活性炭，再经离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥。

(6)浓缩干燥：对上一步处理后的酶解液，通过降膜浓缩后，进行喷雾干燥，制得无色无味的牦牛皮胶原蛋白肽，最终牦牛皮胶原蛋白肽产率为15.6％。

实施例2

连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其包括(1)牦牛皮前处理，(2)匀浆，(3)酶解，(4)离心分离，(5)脱色、脱腥、脱盐，(6)浓缩干燥步骤，具体步骤如下：

(1)前处理：称取500g新鲜牦牛皮，脱毛后切碎成1×1cm的块状，于室温下按料液质量比为1:5kg/kg加入质量浓度为3％的纯碱浸泡8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入至质量浓度为3％食盐中再次浸泡8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性，以达到脱脂除杂的目的；

(2)匀浆：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入0.05M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液；

(3)酶解：

第一次酶解：于步骤(2)匀浆得到的牦牛皮浆液中加入15g酶活力为10万的胃蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速30r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解5h，得第一次酶解液；

超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500nm，得纳米化酶解液；

第二次酶解：采用NaOH调整纳米化酶解液的pH至9，加入3g酶活力为20万的碱性蛋白酶和0.3g酶活力为10万的弹性蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速40r/min、温度50℃下进行旋蒸脱溶酶解2.5h；

(4)离心分离：将步骤(3)酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶和杀菌，之后于10000rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液；

(5)脱色、脱腥、脱盐：于步骤(4)离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入1.5g、200目的木质活性炭，室温下60r/min搅拌2～3h，之后抽滤去除活性炭，再经预先装好的苯乙烯系阳离子交换树脂、大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥；

(6)浓缩干燥：对上一步处理后的酶解液，通过降膜浓缩后，进行喷雾干燥，制得无色无味的牦牛皮胶原蛋白肽，最终牦牛皮胶原蛋白肽产率为15.2％。

实施例3

连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其包括(1)牦牛皮前处理，(2)匀浆，(3)酶解，(4)离心分离，(5)脱色、脱腥、脱盐，(6)浓缩干燥步骤，具体步骤如下：

(1)前处理：称取20kg新鲜牦牛皮，脱毛后切碎成1×1cm的块状，于室温下按料液质量比为1:5kg/kg加入质量浓度为5％的纯碱浸泡8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入至质量浓度为5％食盐中再次浸泡8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性，以达到脱脂除杂的目的；

(2)匀浆：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入0.05M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液；

(3)酶解：

第一次酶解：于步骤(2)匀浆得到的牦牛皮浆液中加入0.6kg酶活力为10万的胃蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速20r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解4h，得第一次酶解液；

超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500nm，得纳米化酶解液；

第二次酶解：采用NaOH调整纳米化酶解液的pH至9，加入0.12kg酶活力为20万的碱性蛋白酶和0.012kg酶活力为10万的弹性蛋白酶，之后一并转移至旋转蒸发设备内，于真空度0.85～0.98MPa、转速15～60r/min、温度50℃下进行旋蒸脱溶酶解2h；

(4)离心分离：将步骤(3)酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶和杀菌，之后于10000rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液。

(5)脱色、脱腥、脱盐：于步骤(4)离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入加入0.1％～0.3％m/v的木质活性炭(200目)，室温下60r/min搅拌2～3h，之后抽滤去除活性炭，再经离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥。

(6)浓缩干燥：对上一步处理后的酶解液，通过降膜浓缩后，进行喷雾干燥，制得无色无味的牦牛皮胶原蛋白肽，最终牦牛皮胶原蛋白肽产率为13.2％。

实施例4

以本发明实施例3所述方法制备的牦牛皮胶原蛋白肽为样品进行胶原蛋白肽的特性分析。

1)由图1可知，泳道1中通过第一次酶解即胃蛋白酶酶解提取到的牦牛皮胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的胶原蛋白；泳道2中进一步通过第二次酶解即复合酶液酶解，胶原蛋白分解得到胶原蛋白肽。

2)由图2可知，根据食品安全国家标准GB/T 22729-2008中分子量分布的检测方法，结果显示实施例3中制备的牦牛皮胶原蛋白肽，相对分子质量小于10000Da的胶原蛋白肽所占比例完全超过90％，达到国家标准。并且，采用本发明制备方法制得的牦牛皮胶原蛋白肽中，分子量小于3000Da的胶原蛋白肽的含量大于95％，分子量小于2000Da的寡肽含量大于90％，分子量小于1000Da的寡肽含量大于70％，制得的产品有利于人体直接吸收。

3)由图3可知，MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果显示，实施例3制备的牦牛皮胶原蛋白肽分子量主要集中在3000Da以下。

Claims (9)

1.连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于包括（1）牦牛皮前处理，（2）匀浆，（3）酶解，（4）离心分离，（5）脱色、脱腥、脱盐，（6）浓缩干燥步骤，所述步骤（3）酶解包括：

第一次酶解：于步骤（2）匀浆得到的牦牛皮浆液中加入胃蛋白酶，之后于真空度0.85～0.98 MPa、转速15～60 r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解4 h，得第一次酶解液；

超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500 nm，得纳米化酶解液；

第二次酶解：调整纳米化酶解液的pH至9，加入碱性蛋白酶和弹性蛋白酶，之后于真空度0.85～0.98 MPa、转速15～60 r/min、温度50℃下进行旋蒸脱溶酶解2 h。

2.如权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤（1）牦牛皮前处理具体为：称取新鲜牦牛皮，脱毛后切碎，于室温下按料液质量比为1:3～7 kg/kg加入质量浓度为3%~5%的纯碱浸泡6~8 h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:3～7 kg/kg加入至质量浓度为3%~5%食盐中再次浸泡6~8 h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性。

3.如权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤（2）匀浆具体为：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:4～8 kg/kg加入0.05 M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液。

4.如权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤（4）离心分离具体为：将步骤（3）酶解结束后的酶解液高温煮沸进行灭酶和杀菌，之后于8000～12000 rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液。

5.如权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤（5）脱色、脱腥、脱盐具体为：于步骤（4）离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入0.1%~0.3% m/v的活性炭，室温下40～80 r/min搅拌2~3 h，之后抽滤去除活性炭，再经离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥。

6.根据权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述步骤（1）的牦牛皮为青海柴达木盆地牦牛皮。

7.根据权利要求1所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中第一次酶解使用的胃蛋白酶为从动物粘膜提取的食品级蛋白酶；所述步骤（3）中第二次酶解使用的碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌中提取的食品级蛋白酶，弹性蛋白酶为胰脏中提取的食品级蛋白酶。

8.根据权利要求5所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的活性炭为200目的木质活性炭，所述离子交换树脂采用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂。

9.根据权利要求1～8任一所述的连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述方法制得的牦牛皮小分子胶原蛋白肽中，分子量小于3000 Da的胶原蛋白肽的含量大于95%，分子量小于2000 Da的寡肽含量大于90%，分子量小于1000 Da的寡肽含量大于70%。

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