CN111944708B - 高产乙酸异戊酯的酵母及其应用 - Google Patents

高产乙酸异戊酯的酵母及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于非酿酒酵母的开发利用技术领域，具体涉及一种高产乙酸异戊酯的酵母及其应用。针对目前还没有采用Kazachstania turicensis属酵母纯培养菌株用于固态发酵的问题，本发明提供了一种固态发酵高产乙酸异戊酯的酵母，保藏编号为CGMCC 19812。该酵母对粮食固态发酵环境适应良好，代谢旺盛，其主要挥发性风味物质包括乙酸异戊酯700mg/kg糟醅，乙酸19.8mg/kg糟醅，β‑苯乙醇307mg/kg糟醅，正丙醇8mg/kg糟醅，异戊醇27mg/kg糟醅，正丁醇3mg/kg糟醅，甲醇仅2mg/kg糟醅。该酵母发酵后的粮食糟醅呈现明显的花果香风味特征。本发明为固态发酵生产风味更丰富的白酒提供了一种新的发酵酵母，拓宽了白酒风味调控手段，具有重要的现实意义。

Description

高产乙酸异戊酯的酵母及其应用
技术领域
本发明属于非酿酒酵母菌的开发技术领域，具体涉及一种高产乙酸异戊酯的酵母及其应用。
背景技术
浓香型白酒采用传统的混菌自然固态发酵工艺，数百年来经多轮次的续糟发酵，在糟醅中逐渐形成了相对稳定的功能微生物群体，这些功能微生物是我国重要的特色微生物资源，特别是其中的酵母资源，不仅承担了转化还原糖生成乙醇的任务，与其他发酵体系中的酵母相比，其更重要的价值在于通过产醇、酯、酸、酯等多种风味物质影响白酒品质，通过中间代谢产物参与微生物群体共代谢，通过产活性物质影响发酵体系内生态环境。并且，与现有产乙醇量通产超过11％的商业酵母相比，发酵结束后浓香型白酒糟醅中的乙醇含量通常不超过6-7％，糟醅中酵母除产乙醇外的其他功能才是使其区别于其他环境酵母的主要特征，与浓香型白酒品质关联也最为密切，通过选育功能酵母菌株来改善白酒品质一直是行业重点关注的研究领域。
酵母作为使用较为安全的一类微生物，在白酒酿造过程中有重要应用价值，目前已经选育了包括产酯酵母在内的可用于白酒酿造的多种功能酵母，但迄今为止尚未在生产中使用除酿酒酵母外的其他种属的纯培养酵母，且酿酒酵母也仅仅用于复糟酒的生产，这一方面由于产香酵母的固态发酵特性还不确切或不稳定；另一方面，则是考虑到添加外来酵母有可能影响到白酒自然发酵的微生物生态环境，因此，最好是在酿造环境中分离其中本来就有的酵母，并明确其固态发酵特性的基础上，用于白酒固态发酵。
研究表明，白酒糟醅或大曲中的Pichia anomala、P.kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii等多种属酵母与多种香型白酒中的风味物质生成有关，部分种属已经分离到具有特殊酿造功能的纯培养菌株。近两年来的研究发现，Kazachstania属酵母是浓香型白酒糟醅中的优势酵母菌，可能具有特殊酿造功能。
但目前，行业内对K.turicensis酵母的酿造功能的研究还不够深入，也未见该酵母纯培养菌株用于固态发酵或相关产业的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：目前尚无K.turicensis属酵母纯培养菌株用于固态发酵或相关产业的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种高产乙酸异戊酯的酵母，保藏编号为CGMCC 19812。保藏时间为2020年05月13日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1高产乙酸异戊酯的酵母的26S rDNA序列
gctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttgtagagggcgactttggggcggctccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttccgtgtaaagcgctctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgcgcccctcgctccttgtgggtgggggactctcgcagctcactgggccagcatcagttttggcggtcggataaaaccaggggaacgtagcttgcttcgggaagtgttatagcccttgggaatacggccagccgggactgaggaacgcgattcgtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母可产乙酸异戊酯的量达到700mg/kg糟醅。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母固态发酵后乙酸异戊酯产量为700mg/kg糟醅，乙酸为19.8mg/kg糟醅，β-苯乙醇为307mg/kg糟醅，正丙醇为8mg/kg糟醅，异戊醇为27mg/kg糟醅，正丁醇为3mg/kg糟醅，甲醇为2mg/kg糟醅。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母由五粮液发酵糟醅中分离得到。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母生长条件为温度24-32℃，pH 3.0-6.0。
优选的，上述高产乙酸异戊酯的酵母生长条件为温度28℃，pH 5.0。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母的乙醇耐受量为12％Vol。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母的生物学特征为：在WL培养基上28℃培养24小时后，形成圆形、黄绿色的平铺菌落，培养时间延长菌落绿色更深，容易挑取，带花果香气，细胞近圆形，出芽生殖。
进一步的，所述的WL培养基的组成包括：酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖5％，琼脂2％，磷酸二氢钾0.055％，氯化钾00425％，氯化钙0.0125％，氯化铁0.00025％，硫酸镁0.0125％，硫酸锰0.00025％，溴甲酚绿0.0022％，pH值为6.5，121℃灭菌20min。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母采用乳酸YPD培养基保藏，其组成包括：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，乳酸调节pH至5.0，121℃灭菌20min。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母保藏方法为斜面传代培养法或冻干法。
本发明还提供了一种上述高产乙酸异戊酯的酵母在浓香型、酱香型、清香型或米香型白酒酿造中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种高产乙酸异戊酯的酵母菌株，该酵母固态发酵粮食主要产15种挥发性风味物质，主要包括乙酸异戊酯、C6及以上的多种脂肪酸乙酯、β-苯乙醇、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等，尤其是乙酸异戊酯的产量高达700mg/kg糟醅，同时还高产其他风味物质，如：乙酸19.8mg/kg糟醅，β-苯乙醇307mg/kg糟醅，正丙醇8mg/kg糟醅，异戊醇27mg/kg糟醅，正丁醇3mg/kg糟醅，甲醇仅2mg/kg糟醅。
本发明的酵母对窖内生态环境有特殊意义：接种至粮食中固态发酵相同时间导致的失重量为酿酒酵母的145％，发酵后残糖仅1.7％，但乙醇产量仅为3.72mL/100g，表明其具有旺盛的呼吸代谢特征，且代谢产物更加丰富，发酵24d可使糟醅水分上升至64.70％，水分增幅为酿酒酵母的3.8倍，酸度增幅为酿酒酵母的2.3倍。
本发明的酵母高度适应白酒固态发酵环境，其最低生长pH为3.0，可正常生长的温度范围为24-32℃，接种到混菌自然发酵糟醅中1天内即可大量增殖，细胞数量在接种10-12天时达到最高值，可持续发酵24天。
本发明的高产乙酸异戊酯的酵母于2020年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 19812,保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为Kazachstania turicensis。
附图说明
图1所示为本发明的高产乙酸异戊酯的酵母在WL琼脂培养基上28℃培养48小时后的菌落形态。
图2所示为本发明的高产乙酸异戊酯的在WL琼脂培养基上28℃培养48小时后的细胞形态。
图3所示为本发明的高产乙酸异戊酯的发酵5种粮食所产的主要挥发性物质总离子图。
具体实施方式
本发明提供了一种高产乙酸异戊酯的酵母，保藏编号为CGMCC 19812。保藏时间为2020年05月13日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
其中，上述高产乙酸异戊酯的酵母的26S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
目前，还未见有采用K.turicensis酵母纯培养菌株用于固态发酵的研究。本发明发明人在五粮液发酵糟醅中分离得到了K.turicensis酵母，并发现K.turicensis酵母在混菌自然发酵糟醅中的数量达到106数量级，是浓香型白酒发酵旺盛期的主要优势酵母种。本发明分离培养了该纯种K.turicensis酵母，命名为WLY54。研究发现，采用该酵母进行固态发酵主要产15种挥发性风味物质，主要包括乙酸异戊酯、C6及以上的多种脂肪酸乙酯、β-苯乙醇、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等，尤其是乙酸异戊酯的产量高达700mg/kg糟醅，同时还高产其他风味物质，如：乙酸19.8mg/kg糟醅，β-苯乙醇307mg/kg糟醅，正丙醇8mg/kg糟醅，异戊醇27mg/kg糟醅，正丁醇3mg/kg糟醅，甲醇仅2mg/kg糟醅。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1高产乙酸异戊酯酵母菌株的分离鉴定
分离：取样窖池为宜宾五粮液股份有限公司生产车间中已连续发酵5年以上的窖池。在发酵12d时取样，以专用取样器(中空的双层不锈钢套管)***窖池，取从窖池表面开始0.5m-1.5m之间、中心及四周5个取样点的糟醅，装入无菌取样袋中，冰盒运回实验室，在取样后1小时内按如下方法分离酵母菌株：糟醅样品加无菌水分别稀释1000、10000、100000倍后，涂布于以木糖代替葡萄糖的、且用乳酸调节pH至5.0的YPD培养基(配方为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％木糖，2％琼脂，121℃下灭菌20min)。28℃培养36小时，挑取湿润、白色、表面及边缘呈细小绒毛状的菌落，并在相同培养基上纯化3次备用。
鉴定：按照E.Z.N.A Yeast DNA试剂盒(上海伟进生物科技有限公司)的步骤提取DNA，以NL1、NL4为引物(NL1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'(SEQ ID NO:2)；NL4引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'(SEQ ID NO:3))扩增酵母菌株26S rDNA序列。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送往上海美吉测序公司进行测序，获得的序列与GenBank中的模式菌株的序列进行BLASTN，将其序列相似性大于99％的序列鉴定为同种，并进一步对比分离酵母与文献记录中的该酵母种的形态特征及生理生化特征，完全吻合则鉴定为该种。
实施例2本发明固态发酵高产乙酸异戊酯酵母的生理生化特性
在L-YPD琼脂培养基上28℃培养2d，观察其菌落及细胞形态；以葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、赤藓糖、核酮糖、木糖、***糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、纤维二糖、乳糖、松三糖为YNB培养基中的唯一碳源培养酵母，观察其生长情况，评价其对糖的同化能力；将酵母菌接种到尿素培养基上，培养24h，根据培养基是否变红色评价酵母利用尿素的能力。5mL菌悬液接种乳酸YPD培养基(pH5.0)，分别在20、24、28、32、36、40℃下以100r/min振荡培养36h，检测其温度耐受性，5mL菌悬液接种至乙醇含量分别为1、2、3、4、5、6、7、8％的乳酸YPD培养基(pH5.0)中，28℃、100r/min振荡培养36h，检测其乙醇耐受性，5mL菌悬液接种至pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乳酸YPD培养基中，28℃、100r/min振荡培养36h，检测其pH适应性，以OD560增长超过50％视为生长。本发明编号为CGMCC 19812的菌株的生理生化特性如表1所示。
表1 Kazachstania turicensis CGMCC 19812主要生理特征
Figure BDA0002653711830000051
实施例3本发明酵母在浓香型白酒酿造中的应用
首先将斜面保存的酵母菌种利用接种针接种1环到乳酸YPD液体培养基中，28℃培养1天，再对得到的酵母菌悬液在25℃下，3000rpm离心5min，倒去上清液，添加无菌水后混匀再次在相同条件下离心，洗涤菌体，制成浓度为0.5OD左右的酵母菌悬液备用。
该酵母以0.1％接种量接种入窖粮糟发酵70d，与未接种酵母的自然发酵粮糟(对照)相比，该酵母所产主要风味物质如表2所示。其中，粮糟中的乙酸异戊含量从0.007g/kg增加至0.341g/kg，β-苯乙醇从0.014g/kg增加至0.207g/kg，C6以上脂肪酸乙酯总含量从1.014g/kg增加至3.516g/kg，感官品评发现，接种本发明酵母发酵后的糟醅芳香浓郁，显著优于对照，呈典型的花果香特征。
表2 Kazachstania turicensis CGMCC 19812菌株固态发酵粮食所产主要挥发性风味物质
Figure BDA0002653711830000052
Figure BDA0002653711830000061
实施例4利用本发明酵母生产浓香型白酒调味酒
酵母菌种的制备方法同实施实例2。
该酵母以0.5％的接种量接种入窖粮糟发酵70d，与未接种酵母的自然发酵粮糟(对照)相比，以乙酸正戊酯为内标，对所产风味物质进行半定量，考虑到该检测条件下β-苯乙醇的响应远高于内标，因此针对β-苯乙醇单独采用外标法定量，结果如表3所示。
表3 Kazachstania turicensis CGMCC 19812对糟醅风味物质生成的量g/kg
Figure BDA0002653711830000062
Figure BDA0002653711830000071
该酵母使粮糟中风味物质总量从7.48g/kg上升到18.07g/kg，上升了1.42倍，其中乙酸异戊酯含量达到0.980g/kg，β-苯乙醇含量达到0.312g/kg，乙醇产量下降0.7％Vol。
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 高产乙酸异戊酯的酵母及其应用
<130> A200687K（序）
<141> 2020-08-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcaaattt gaaatctggt accttcggtg cccgagttgt aatttgtaga gggcgacttt 60
ggggcggctc cttgtctatg ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg 120
tggcgaggag tgcggttccg tgtaaagcgc tctcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca 180
gctctaagtg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa 240
caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa 300
ttgttgaaag ggaagggcat ttgatcagac atggtgtttt gcgcccctcg ctccttgtgg 360
gtgggggact ctcgcagctc actgggccag catcagtttt ggcggtcgga taaaaccagg 420
ggaacgtagc ttgcttcggg aagtgttata gcccttggga atacggccag ccgggactga 480
ggaacgcgat tcgtcaagga tgctggcata atggttatat gccgcccgtc ttgaa 535
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (2)

1.一株产乙酸异戊酯的酵母，其特征在于：所述酵母的分类学名称为Kazachstania turicensis，保藏编号为CGMCC 19812。
2.权利要求1所述的产乙酸异戊酯的酵母在浓香型、酱香型、清香型或米香型白酒酿造中的用途。
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