CN111936180B - 浮力激活细胞分选(bacs)兼容的激活/转导***和方法 - Google Patents

浮力激活细胞分选(bacs)兼容的激活/转导***和方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种在密闭容器中使包含靶细胞与包含脂质壳气核微泡的微泡试剂的宿主液体，以及一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体进行接触的方法，其中所述一种或多种抗体或其他配体结合到靶细胞或微泡上，其中接触是在产生通过一种或多种抗体或其他配体连接到微泡的靶细胞的条件下进行，以及激活靶细胞以生成活化的靶细胞。

Description

浮力激活细胞分选(BACS)兼容的激活/转导***和方法
交叉引用
本发明享有2018年3月14日提交的申请号为No.62/643081的美国临时专利申请的优先权，其以全部引用的方式包含于本文中。
背景技术
人类淋巴细胞的基因修饰在治疗性活细胞疗法(如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞)的开发和制造中是一个日益重要的步骤。CAR-T细胞，比如FDA批准的首个用于治疗急性淋巴细胞白血病的KYMRIAH(Tisagenlecleucel)，是患者自己的(自体的)T淋巴细胞经过复杂、昂贵和费时的实验室过程后制备成的可杀死癌症的细胞。
如今，CAR-T细胞的制造过程通常包括以下连续步骤：(1)对患者血液实施白细胞去除术，以浓缩大量自体白细胞，然后将“白细胞分离产品(leukapheresis product)”从门诊运输到制造实验室；(ii)对白细胞分离产品进行初步细胞分级，以制备更接近纯的单核细胞悬浮液(MCs)，即具有更少量污染的非单核细胞(通常通过使用FicollTM或类似的可溶性聚合物作为密度剂的密度梯度离心来实现)，产生所谓的外周血单核细胞制剂(PBMCs)；(iii)再进行一轮纯化以从PBMCs中分离出更接近纯净的CD3+淋巴细胞(这是制备CAR-T细胞的起始材料的特定细胞类型)，如今通常使用将磁性纳米颗粒与抗CD3抗体偶联的磁性激活细胞分选技术(MACS)获得；随后(iv)“激活”分离出的CD3+细胞，使其易于将外源DNA整合至其染色体中(激活通常是将细胞暴露于与抗CD3/抗CD28抗体偶联的微珠中在培养基中培养1-3天来完成的)；随后(v)进行被称为“转导”的过程，其中所述活化的CD3+细胞与基因工程腺病毒载体接触，所述载体含有编码嵌合(两部分)跨膜融合蛋白的人工基因构建体，所述融合蛋白包括细胞外抗CD19单链抗体片段和细胞内T细胞信号传导蛋白(CD3-ζ)和共刺激(4-1BB)结构域(所谓的嵌合抗原受体，或CAR)。最后，将患者转导的、表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)在培养基中扩增(允许繁殖)，以产生治疗剂量(在Tisagenlecleucel中0.2×106-2.5×108个可行的CAR-T细胞)的表达CAR的T细胞，用于在淋巴衰竭化疗后通过静脉输注返回患者体内。
此处概述的KYMRIAH制造工艺与当今仅有的FDA批准的其他CAR-T细胞治疗剂Yescarta(axicabtagene ciloleucel，用于弥漫性大B细胞淋巴瘤)大体相似，因为其与世界上目前正在临床前开发或临床试验中的越来越多的其他转基因淋巴细胞治疗候选药物也类似。从商业化的角度来看，这些制造过程的一个显著特征是其复杂、劳动密集型和低效的特性，导致了这些救命的治疗剂成本极高(Yescarta或KYMRIAH单的剂量疗程费用分别为$373,000或$475,000)。按照当今的惯例，所述制造范例通常涉及数十个连续的液体处理步骤，并将过程中的材料转移至新容器中(伴随着相关细胞的损失)，并且，由于细胞分离和细胞洗涤步骤会产生额外的细胞损失，导致相对的效率低下(靶细胞的回收率低)，从而又必须通过额外的用于细胞扩增的时间(消耗昂贵的细胞培养基并施加额外的液体处理步骤，以及对体内潜在的细胞增殖能力产生负面影响)进行补偿，以获得治疗剂量。这种复合的生产效率低下和冗长的制造过程不仅对产品的成本产生了负面影响，更重要的是，对重症患者的预后产生了负面影响，因为如果有治疗剂的话其会影响及时制造有效治疗剂量的可能性。
发明内容
本发明的第一方面公开了一种方法，包括在密闭容器中使包含靶细胞以及包含脂质壳气核微泡的微泡试剂的宿主液体与一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体进行接触，其中所述一种或多种抗体或其他配体结合到靶细胞或微泡上，其中所述接触发生的时间和条件足以使靶细胞通过所述一种或多种抗体或其他配体与微泡连接；和
激活靶细胞以生成活化的靶细胞。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括在密闭容器中浓缩与微泡相连的靶细胞。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括在产生与微泡相连的靶细胞后，使微泡塌陷和/或破裂。在进一步的实施方式中，在密闭容器中浓缩与微泡相连的靶细胞后，发生微泡的塌陷和/或破裂。在多个实施方式中，所述微泡的塌陷和/或破裂发生在开始接触后约180min内，开始接触后约1min-约180min内，开始接触后约2min-约60min内，和/或开始接触后约5min-约30min内。在另一个实施方式中，所述活化无需将靶细胞从微泡或微泡残余物中分离出来即可实现。
在一个实施方式中，所述接触包括在密闭容器中接触宿主液体，所述宿主液体包括(i)与一种或多种抗体或其他配体结合的靶细胞，和(ii)能够通过接头直接或间接与一种或多种抗体或其他配体结合的微泡。在另一个实施方式中，所述接触包括在密闭容器中接触宿主液体，所述宿主液体包括(i)靶细胞，和(ii)显示一种或多种抗体或其他配体的微泡试剂，所述抗体或其他配体与靶细胞上的细胞表面分子结合。在进一步的实施方式中，所述一种或多种抗体或其他配体包括一种或多种抗体。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括用包括转基因的载体(如病毒载体)转导活化的靶细胞，以生成转导的靶细胞，其中所述转导包括在适于转导活化的靶细胞的条件下，将活化的靶细胞与包括转基因载体的基因转导试剂接触。在另一个实施方式中，所述转导在密闭容器中进行。在进一步的实施方式中，所述转导包括将活化的CD3+靶细胞与基因工程病毒载体接触，所述载体包括编码嵌合(两部分)跨膜融合蛋白的人工基因构建体，所述融合蛋白包括细胞外抗CD19单链抗体片段和细胞内T细胞信号传导蛋白(CD3-ζ)和共刺激(4-1BB)结构域(所谓的嵌合抗原受体，或CAR)，并且其中所得的转导靶细胞是CAR-T细胞。在另一个实施方式中，所述开始接触的时间点和通过将活化的CD3+靶细胞与基因工程病毒载体接触而开始转导的时间点之间的时间间隔为约12h至约36h。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括扩增活化的靶细胞或转导的靶细胞，其中扩增包括在适于促进活化的靶细胞或转导的靶细胞增殖的条件下培养活化的靶细胞或转导的靶细胞。在另一个实施方式中，所述扩增在密闭容器中进行。
在一个实施方式中，所述靶细胞包括CD3+T细胞，并且其中一种或多种抗体包括抗CD3和抗CD28抗体。在另一个实施方式中，所述宿主液体包括血液、白细胞分离产品，或其稀释液或加工处理液。在进一步的实施方式中，所述宿主液体包括外周血单核细胞(PBMC)制剂。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括收获扩增的活化靶细胞或转导的靶细胞，以生成收获的活化细胞群体或收获的转导细胞群体；其中所述收获(harvesting)任选在密闭容器中进行。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括洗涤收获的活化细胞群或收获的转导细胞群；其中所述洗涤任选在封闭的容器中进行。在进一步的实施方式中，所述方法进一步包括将收获的活化细胞群或收获的转导细胞群转移到适于输注的培养基中，或转移到冷冻保存培养基中；其中所述转移任选在密闭容器中进行。在另一个实施方式中，在活化步骤之前，宿主液体中的非靶细胞被部分耗尽。
在一个实施方式中，所述功能性密闭容器包括：
(a)套筒，包括
(i)包括至少一个输入口、第一出口和第二出口的处理容器；
(ii)包括输入口的第二容器；
(iii)包括输入口和第一出口的第三容器；
(iv)连接处理容器的第一出口和第二容器的输入口的第一导管，其中第一导管包括第一可逆关闭装置，其中第二容器与处理容器瞬时流体地连接，可使得当第一可逆关闭装置打开时，流体仅从处理容器流向第二容器；
(v)连接处理容器的第二出口和第三容器的输入口的第二导管，其中第二导管包括第二可逆关闭装置，其中第三容器与处理容器瞬时流体地连接，使得当第二可逆关闭装置打开时，流体仅可从处理容器流向第三容器；
(b)包括至少一个端口的转移容器；
(c)至少第三导管，其
(i)将第三容器的第一出口连接至转移容器的至少一个端口，和
(ii)将转移容器的至少一个端口连接至处理容器的至少一个输入口；
其中所述至少第三导管包括至少第三可逆关闭装置，使得(A)第三容器与转移容器瞬时流体地连接，和(B)转移容器与处理容器瞬时流体地连接；其中所述至少第三导管被配置成使得以下仅一项成立：
(I)当所述至少第三可逆关闭装置打开时，仅可发生从第三容器向转移容器的流体流动；或
(II)当所述至少第三可逆关闭装置打开时，仅可发生从转移容器向处理容器的流体流动；和
(d)控制模块，其被配置成控制至少在所述套筒以及第一和第二导管中的活动。
在一个实施方式中，所述转移容器在套筒的内部。在进一步的实施方式中，所述至少第三导管包括单个导管。在另一个实施方式中，所述至少第三导管包括设置在第三容器和转移容器之间以及转移容器和处理容器之间的T型或Y型连接器。在另一个实施方式中，转移容器的所述至少一个端口包括第一输入口和出口。
在一个实施方式中，所述至少第三导管包括：
(i)连接第三容器的出口和转移容器的输入口的第三导管，其中第三导管包括第三可逆关闭装置，使得第三容器与转移容器瞬时流体地连接，使得当第三可逆关闭装置打开时，仅可发生从第三容器向转移容器的流体流动；和
(ii)连接转移容器的出口和处理容器的所述至少一个输入口的第四导管，其中第四导管包括第四可逆关闭装置，使得转移容器与处理容器瞬时流体地连接，使得当第四可逆关闭装置打开时，仅可发生从转移容器向处理容器的流体流动。
在另一个实施方式中，处理容器的所述至少一个输入口包括第一输入口和第二输入口，其中所述至少第三导管或第四导管(当存在时)将转移容器的出口与处理容器的第一输入口连接。在进一步的实施方式中，所述第一介质输入导管将处理容器的第二输入口与至少一个介质储存器连接，其中所述第一介质输入导管包括至少第五可逆关闭装置，其中所述至少一个介质储存器与处理容器瞬时流体地连接，使得当所述至少第五可逆关闭装置打开时，可以仅发生从至少一个介质储存器向处理容器的流体流动。在另一个实施方式中，转移容器的所述至少一个端口进一步包括第二输入口。在进一步的实施方式中，第二介质输入导管将转移容器的第二输入口与至少一个介质储存器连接，其中所述第二介质输入导管包括至少第六可逆关闭装置，其中所述至少一个介质储存器与处理容器瞬时流体地连接，使得当所述至少第六可逆关闭装置打开时，可以仅发生从至少一个介质储存器向转移容器的流体流动。
在另一个实施方式中，所述细胞分离***进一步包括混合器。在多个实施方式中，所述混合器可以包括静态混合器，所述混合器可以包括设置在套筒顶部内表面上的叶轮，还可以包括与套筒顶部内表面隔开的叶轮，还可以包括蠕动泵，所述蠕动泵包括具有第一端和第二端的泵导管，其中泵导管的第一端位于处理室中，并且其中泵导管的第二端位于处理室的外部并与处理室的至少一个输入口连接；所述混合器可以包括混合模块，所述混合模块包括底部部分和顶部部分，其中套筒设置在模块底部，并且其中顶部被配置为可拆卸的与底部连接。
所述混合模块可以包括连接至底部的可旋转部件，并且其中可旋转部件被配置成可以使得套筒在其垂直轴上旋转180°或360°；和/或当套筒位于混合模块的底部时混合模块可以被配置成用以提高套筒的温度。
在一个实施方式中，所述第一介质输入导管和/或第二介质输入导管进一步包括过滤器。在另一个实施方式中，所述第二容器包括连接至第一废弃物(waste)导管的出口。在进一步的实施方式中，所述处理容器进一步包括与第二废弃物导管连接的无菌通气口。
在一个实施方式中，所述转导的细胞是CAR-T细胞。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括给有此需要的受试者施用可有效治疗受试者疾病剂量的获得的活化细胞群或获得的转导细胞群。
本发明的另一方面公开了分离的细胞悬浮液，其包括通过本文公开的任何实施方式或其组合的方法生成的获得的活化细胞群体或获得的转导细胞群体。在一个实施方式中，所述分离的细胞悬液包括CAR-T细胞。
本发明的另一方面提供的是用于治疗有此需要的受试者的方法，包括给受试者施用可有效治疗受试者疾病剂量的本文公开的获得的活化细胞群体或获得的转导细胞群体。在一个实施方式中，所述受试者患有癌症。
本发明的另一方面公开了试剂盒，其包括下述的任意组合：
(a)用于靶细胞类型的激活和转导的微泡，其中所述试剂盒包括下述中的一种：
(i)人造试剂，其中提供的微泡和抗体已经彼此附着，任选的通过中间接头，或
(ii)分别将微泡和抗体与互补接头包装，当其添加至宿主液体中时，其自发组装成有抗体结合的微泡；
(b)美国第‘394号专利中公开的类型的一个或多个套筒；
(c)适合与所提供的试剂和套筒一起使用以激活和转导靶细胞的缓冲液；
(d)适用于在所提供的套筒内激活的靶细胞的病毒转导的缓冲液；和
(e)适合在所提供的套筒内转导活化的靶细胞的病毒载体。
附图说明
图1是根据示例实施方式的密闭***的分解图。
图2是根据示例实施方式的密闭***的套筒剖面图。
图3是根据示例实施方式的密闭***的侧视图。
图4A是根据示例实施方式的套筒顶部的示例性静态混合器的透视图。
图4B是根据示例实施方式的图4A的示例性静态混合器的仰视图。
图5A是根据示例实施方式的套筒顶部的另一个示例性静态混合器的透视图。
图5B是根据示例实施方式的图5A的示例性静态混合器的仰视图。
图6是根据示例实施方式的在套筒的漏斗中的示例性混合器的剖面图。
图7是根据示例实施方式的套筒的示例性蠕动泵的剖面图。
图8是根据示例实施方式的示例性混合模块的分解图。
图9：用CD3/CD28 BACS微泡或CD3/CD28 BACS DynabeadsTM激活的CD3+T细胞的生长曲线。
图10：用CD3/CD28 BACS微泡或CD4/CD8 BACS气泡分离和激活的T细胞的生长曲线。
图11：对于被CD3/CD28 BACS微泡或CD3/CD28 DynabeadsTM激活的细胞，激活和转导后活化标记CD69和CD25的CD3+T细胞表达情况。
具体实施方式
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。除非另有明确说明，否则本文所用的“和(and)”可与“或(or)”互换使用。
如本文所用，术语“大约”是指所述参数的+/-5％。
除非上下文另有明确规定，否则本发明公开的任意方面的所有实施方式都可以组合使用。
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括(comprise)”、“包含(comprising)”等应理解为包含性的含义，而不是排他性的或穷尽性的含义；也就是说，“包括但不限于”的意思。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。此外，本申请中使用的术语“在此”、“上述”、“下述”和类似含义的词语应当指的是本发明的整体，而非本发明的任何特定部分。
本发明对实施方式的描述并不旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。尽管本发明的实施方式和实施例在此是出于解释说明目的的描述，但是正如相关技术领域人员能理解的，在本发明的范围内，任何等价修改都是可能的。
本发明的一个方面提供了一种方法，包括在密闭容器中使包含靶细胞与包含脂质壳气核微泡的微泡试剂的宿主液体以及一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体进行接触，其中所述一种或多种抗体或其他配体结合到靶细胞或微泡上，其中所述接触发生的时间和条件足以使靶细胞通过所述一种或多种抗体或其他配体与微泡连接；和
激活靶细胞以生成活化的靶细胞。
本发明的方法从两个相互关联的令人惊讶的发现开始：(i)美国专利No.9,821,111(以下简称‘111专利)中的***和方法中的浮力激活细胞分选(BACS)微泡试剂可以配制成一种组合物，所述组合物实现了‘111专利中先前记载的高效靶细胞回收率和纯度，同时，在靶细胞与所述BACS试剂的相同单次接触中，实现了靶淋巴细胞的高效激活，这是其有效转导的既定先决条件；和(ii)所述BACS分离和活化的靶细胞(包括但不限于CD3+T细胞)随后可以被转基因载体(包括但不限于逆转录病毒载体)有效地转导，从而使得用于生产转基因靶细胞(如淋巴细胞)的“一锅法”制造过程显著简化，所述“一锅法”从起始产品(如白细胞分离产品或外周血)到转基因表达靶细胞，具有较高的整体效率(靶细胞回收和转导)，且投资成本低。
本发明提供了组合的BACS/细胞活化试剂、***和方法，其可以与“一锅法”的工作流程(从血液或白细胞分离产品的预处理到T细胞的病毒转导)兼容，其避免了固体微珠的使用和由此产生的需要在临床使用前从制造的细胞中将微珠去除的情况，并且其与浮力激活的细胞分选方法和试剂兼容，同时在功能上封闭的无菌容器中保持细胞的活力和制造适应性。这些方法在一定体积的起始材料上的实践，所述起始材料例如血液细胞，骨髓细胞或包含临床上或商业上相关数量的干细胞的白细胞分离产品，祖细胞、免疫细胞或其他细胞，可以提供靶细胞的组合物，所述组合物在回收率、纯度、活化程度和随后的转导方面明显高于通过其他已知方法一贯获得的组合物。此外，本发明通过可以在“一锅法”(从血液或细胞分离产品的初始预处理过程到T细胞活化和转导)工艺(例如，采用‘394专利的套筒)中执行的扩展制造步骤的数量简化了CAR-T细胞的制作流程，因此具有提升工作流程效率和降低制造成本的潜力。
如本文所用，“靶细胞”是在本发明的方法中被激活和转导的细胞。本发明的方法和***可用于任何合适的待激活和转导的靶细胞，包括但不限于T细胞(包括但不限于CD3+、CD4+和Treg细胞)。
在一个具体实施方式中，所述靶细胞包括CD3+T细胞，并且所述一种或多种抗体包括抗CD3和抗CD28抗体，或者所述一种或多种配体包括CD3和CD28结合配体。在进一步的实施方式中，所述CD3+细胞可以是静态幼稚T细胞。在另一个实施方式中，所述接触可以包括在白细胞介素-2(IL-2)的存在下接触总接触时间的一部分(即，IL-2在抗体与靶细胞的结合中是不需要的，但其可以用于促进活化过程)。在一个实施方式中，含有CD3+细胞的所述宿主液体可以是血液、白细胞分离产品或其稀释液或加工处理液。在另一个实施方式中，所述宿主液体可以包括外周血单核细胞(PBMC)制剂。
如本文所用，“密闭***”是一种工艺***，其设备的设计和操作使得产品不会暴露在室内环境中。可将材料引入密闭***，但添加必须以避免产品暴露于室内环境的方式(例如，通过0.2μm孔径过滤)进行。
所述接触包括使包含靶细胞的宿主液体，与包含脂质壳气核微泡的微泡试剂，以及一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体进行接触，其中所述一种或多种抗体或其他配体结合到靶细胞或微泡上。因此，在一个实施方式中，所述接触包括在密闭容器中接触宿主液体，所述宿主液体包括(i)与一种或多种抗体或其他配体结合的靶细胞，和(ii)能够通过接头直接或间接的与一种或多种抗体或其他配体结合的微泡。在另一个实施方式中，接触包括在密闭容器中接触宿主液体，所述宿主液体包括(i)靶细胞，和(ii)显示一种或多种结合至靶细胞上的细胞表面分子的抗体或其他配体的微泡试剂。
接触发生的时间和条件足以使靶细胞通过一种或多种抗体或其他配体与微泡连接。用于促进靶细胞与一种或多种与微泡结合的抗体或一种或多种与微泡结合的配体结合以生成与微泡结合的靶细胞，或用于促进微泡与一种或多种靶细胞结合的抗体或一种或多种靶细胞结合的配体以生成微泡结合的靶细胞的任意合适条件都可以使用，例如本文和‘111专利中公开的那些条件。基于本文的教导来确定合适的条件完全在本领域技术人员的水平之内。在一个实施方式中，所述接触包括靶细胞与微泡的单次接触(即：在初始接触步骤之后，没有另外的微泡被添加到宿主液体中)。这一实施方式相对于使用的现有方法有着显著的改进，在某些情况下，现有方法在激活期间必须对/>进行补充。
如本文所用，术语“激活(activating)”或“活化(activation)”是指先前静止的细胞过程或过程序列的启动和发展，其活性是满足特定技术、医学或商业目标所必需的。举例来说，但不限于：
(a)在基因工程幼稚T细胞的特定情况下，“激活”是指一系列细胞生物过程和生化过程的触发和发展，所述过程使20％或更多的细胞具有转导能力(即，能够被足够有效地转导并表达转基因)，其中所述过程可以包括但不限于CD69、CD71、CD25、HLA-DR和CTLA-4的细胞表面表达的变化，细胞表面糖基化分布的变化，从细胞质到转录因子(包括NFAT，RelA和p50)的核易位，多效基因集(包括编码细胞因子IL-2的基因)的转录激活，离开G0期进入细胞周期的G1期，最终进入细胞增殖阶段。在一个非限制性实施方式中，可以通过上调T细胞中的CD69和CD25来证明T细胞的“活化”。
(b)在凝血酶激活的血小板分泌的特定情况下，“激活”是指(但不限于)信号通路的触发和发展，从刺激PAR1和PAR4受体开始以刺激Gq，进而与磷脂酶C-β相互作用并刺激其使得磷脂酰肌醇二磷酸水解并释放肌醇三磷酸和双酰甘油(DAG)，进而刺激钙动员和蛋白激酶C介导的蛋白磷酸化和CalDAG-GEF1活性以及额外活性，最终导致血小板分泌。
在生理环境中，T细胞活化是T细胞与抗原呈递细胞(APC)接触的复杂的和协调的细胞反应序列，由T细胞的T细胞受体(TCR)表面蛋白结合到APC表面上的负载抗原的主要组织相容性复合体II(MHC-II)蛋白触发，结合T细胞表面蛋白CD28到APC上两个共刺激表面分子中的一个(CD80或CD86)的结合物。这些触发事件引发了一系列复杂的T细胞反应，称为激活，从接触后几乎立即发生的早期反应开始，但持续数小时甚至数天后才持续发展为后期反应，包括CD69、CD71、CD25、HLA-DR和CTLA-4等蛋白质的细胞表面表达的变化，细胞表面糖基化分布的变化，从细胞质到转录因子(包括NFAT，RelA和p50)的核易位，多效基因集(包括编码细胞因子IL-2的基因)的转录激活，离开G0期退出进入细胞周期的G1期，最终进入细胞增殖阶段。
在实验室(与生理环境相反)环境中，这种最终导致基因表达改变和T细胞增殖的级联反应可以在培养基中可溶性白细胞介素-2存在的情况下，通过将静态幼稚T细胞与抗CD3和抗CD28抗体接触来人工触发。当这些抗体附着在固体表面上时，比游离存在于溶液中(例如，当其被结合在培养皿的壁和底部或结合在培养皿相对大(4.5μm直径，即细胞大小)的表面上，固体聚合物微珠，比如ThermoFisher Scientific’s)时更能持久的触发和完全活化。
有效的T细胞活化是实现高效的T细胞病毒转导的必要前提，以便对这些细胞进行基因工程改造，使其能够稳定表达转基因。此外，需要细胞增殖(细胞活化的结果)扩增基因工程细胞，从而为临床应用制造有效剂量的细胞，如KYMRIAHTM或YescartaTM等细胞免疫疗法(通常需要数千倍或更高水平的细胞扩增)。
本方法的一个令人惊讶的方面是，我们发现抗CD3/CD28抗体在结合到脂质壳微泡上时，在诱导活化方面至少与抗体结合到固体塑料珠上的常规活化试剂一样有效。如实施例所示，与携带相同抗体的塑料珠相比，携带抗体的微泡可以诱导T细胞产生实质上更强的活化(通过生长曲线评估)。这是令人惊讶的，因为在本领域中公认的是，固体珠激活试剂如应与细胞保持长时间接触，以诱导足以支持有效病毒转导的活化水平(根据制造商的说法，1-3天)，而脂质壳气核微泡不同于塑料珠，在培养中是不稳定的，并且仅在几小时后在细胞上是不可观察的。因此，在该时间段之后，微泡塌陷和/或破碎，而微泡残余物(即脂质壳残余物)保留。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括在密闭容器中浓缩与微泡相连的靶细胞。所述浓缩步骤可以通过容器内任何合适的方式进行，包括但不限于本文所述的浓缩方法。
在另一个实施方式中，所述方法可以进一步包括在产生与微泡相连的靶细胞后，使微泡塌陷和/或以其他方式破裂。正如以下示例中令人惊讶地展示的那样，微泡可以在靶细胞结合后非常短的时间内塌陷或以其他方式破裂，而不影响使用本文公开的方法最终观察到的活化或转导效率。可以使用任何合适的方法来塌陷和/或破坏微泡；在一个非限制性实施方式中，所述方法可以包括在结合到靶细胞后施加正压以主动且不可逆地破坏充气微泡。
在一个实施方式中，在浓缩密闭容器中与微泡相连的靶细胞后，发生微泡的塌陷和/或破裂。在另一个实施方式中，所述微泡的塌陷和/或破裂发生在开始接触后约180min内。在多个进一步的实施方式中，在开始接触后约170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1min内发生微泡的塌陷和/或破裂。在另一个实施方式中，所述微泡的塌陷和/或破裂发生在开始接触后约1min-约180min。在多个进一步的实施方式中，所述微泡塌陷和/或破裂发生在约2min-约180min、约3min-约180min、约4min-约180min、约5min-约180min、约6min-约180min、约7min-约180min、约8min-约180min、约9min-约180min、约10min-约180min，约11min-约180min，约12min-约180min，约13min-约180min，约14min-约180min，约15min-约180min，约16min-约180min，约17min-约180min，约18min-约180min，约19min-约180min，约20min-约180min，约21min-约180min，约22min-约180min，约23min-约180min，约24min-约180min，约25min-约180min，约26min-约180min，约27min-约180min，约28min-约180min，约29min-约180min，或约30min-约180min。
在多个进一步的实施方式中，所述微泡塌陷和/或破裂发生在约1min-约120min、约2min-约120min、约3min-约120min、约4min-约120min、约5min-约120min、约6min-约120min、约7min-约120min、约8min-约120min、约9min-约120min、约10min-约120min，约11min-约120min，约12min-约120min，约13min-约120min，约14min-约120min，约16min-约120min，约17min-约120min，约18min-约120min，约19min-约120min，约20min-约120min，约21min-约120min，约22min-约120min，约23min-约120min，约24min-约120min，约25min-约120min，约26min-约120min，约27min-约120min，约28min-约120min，约29min-约120min，或约30min-约120min。
在其他实施方式中，所述微泡塌陷和/或破裂发生在约1min-约60min、约2min-约60min、约3min-约60min、约4min-约60min、约6min-约60min、约7min-约60min、约8min-约60min、约9min-约60min、约10min-约60min之间，约11min-约60min，约12min-约60min，约13min-约60min，约14min-约60min，约15min-约60min，约16min-约60min，约17min-约60min，约18min-约60min，约19min-约60min，约20min-约60min，约21min-约60min，约22min-约60min，约23min-约60min，约24min-约60min，约25min-约60min，约26min-约60min，约27min-约60min，约28min-约60min，约29min-约60min，或约30min-约60min。
在进一步的实施方式中，在多个进一步的实施方式中，所述微泡塌陷和/或破裂发生在约1min-约30min、约2min-约30min、约3min-约30min、约4min-约30min、约5min-约30min、约6min-约30min、约7min-约30min、约8min-约30min、约9min-约30min，约10min-约30min，约11min-约30min，约12min-约30min，约13min-约30min，约14min-约30min，约16min-约30min，约17min-约30min，约18min-约30min，约19min-约30min，约20min-约30min，约21min-约30min，约22min-约30min，约23min-约30min，约24min-约30min，约25min-约30min，约26min-约30min，约27min-约30min，约28min-约30min，或约29min-约30min。
在进一步的实施方式中，所述活化是在不将靶细胞从微泡或微泡残余物中分离的情况下实现的。在该实施方式中，没有采取从靶细胞中分离微泡或微泡残余物的步骤。在该实施方式中，例如，所述方法可以包括在产生与微泡相连的靶细胞之后，使微泡塌陷和/或以其他方式破裂，而不采取任何步骤来将微泡残余物与靶细胞分离。
在一个实施方式中，从开始接触到通过将活化的CD3+靶细胞与基因工程病毒载体接触而开始转导之间的间隔为约12h-约36h。在该实施方式中，充气微泡在约3h内基本上或完全耗尽自身，或者可能已经主动塌陷或甚至更早的破裂，留下微泡残余物。对于本领域技术人员来说，在基本上或完全没有充气微泡的情况下产生的激活是非常出乎意料的。
在当今广泛关注的细胞类型中，T淋巴细胞(包括幼稚CD3+或CD4+T淋巴细胞和Treg细胞)相对独特，因为它们在转导病毒之前需要激活，因此是基因修饰细胞疗法的候选者。相比之下，其他候选治疗细胞如单核细胞源性巨噬细胞、初级自然杀伤细胞、神经元、皮肤成纤维细胞、上皮细胞、角质细胞、初级肝细胞、间充质干细胞和脂肪来源的干细胞都已被证明能够在没有预先激活的情况下可被有效转导。然而，可以提供细胞同时分离和活化在商业上可能有利的其他示例。一个这样的示例(不直接涉及治疗性细胞)将是作为细胞培养添加剂的自体血清或血浆的产生，用于扩增自体干细胞，祖细胞或免疫细胞。众所周知，富含血小板的血浆是一种有效的细胞培养添加剂，这可能是由于活化的血小板释放出细胞因子和其他生长促进因子的复杂混合物，并且在自体细胞疗法的制造中使用自体血清消除了在细胞培养中更普遍使用胎牛血清可能造成的病原体传播的威胁。不幸的是，活化的血小板粘性(sticky)较大，容易与其他细胞类型结合并聚集，这可能使细胞分析和制造过程复杂化。将美国专利No.9,695,394(以下称为‘394专利)的套筒与本发明中的BACS/活化微泡(在这种情况下，浮标附着在可溶性胶原蛋白片段上，血小板与之结合并有效激活血小板)用于血小板阴性的选择和同时活化，可以促进自体血清或血浆的产生，所述自体血清或血浆用血小板衍生的细胞因子和其他生长促进因子强化，但基本上不含血小板本身。
本文所用的“宿主液体”是包含与非靶细胞混合的靶细胞的流体(包括但不限于全血、胎盘/脐带血、骨髓、白细胞分离术等。)。宿主液体可以是稀释的或未稀释的(例如，用缓冲液或任何其他用于分离所需细胞的液体稀释，如盐水、磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基、蛋白酶溶液等)。在一个实施方式中，所述宿主液体是外周血、脐带血或白细胞分离术产物，或其稀释液。在另一个实施方式中，所述宿主液体可以包含已经在体外培养的收获细胞(包括但不限于T细胞(所述T细胞包括但不限于CD3+、CD4+和Treg细胞))的悬浮液。
在一个实施方式中，所述宿主液体可以是“未耗尽的”宿主液体，因为通常存在于相关宿主液体或其稀释液中的所有细胞仍然存在。在另一个实施方式中，宿主液体可以包括耗尽的宿主液体。“耗尽的”宿主液体是宿主液体或其稀释物，其一种或多种类型的非靶细胞的主要部分(例如，至少50％；在其他实施方式中，至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)已经耗尽。通过非限制性实例，耗尽的宿主液体可以包括在通过密度离心、差速离心或裂解从全血中耗尽红细胞后悬浮的靶细胞，或者已经耗尽红细胞和粒细胞的靶细胞，或者已经耗尽血小板的靶细胞。在耗尽的宿主液体的所有实施方式中，所述靶细胞可以悬浮在任何合适的液体中，包括但不限于盐水、磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基、稀释或未稀释的原始宿主液体(即：全血等)。
微泡的脂质壳可以包含脂质或磷脂。在一个实施方式中，所述充气气泡包括由磷脂壳包围的全氟化碳气体核。在这些实施方式中的任何一个中，充气气泡可以具有任何合适的直径；在一个非限制性实施方式中，所述充气气泡的直径在约1μm和约6.5μm之间。
气核脂质壳微泡或靶细胞显示一种或多种与靶细胞上的细胞表面分子结合的抗体或配体。因此，一种或多种抗体或配体的选择将取决于目的靶细胞。抗体或配体可直接结合至微泡或可通过任何合适的接头连接。如本文所用，“接头”(或单独的“接头”)包括一对化学部分(第一接头和第二接头)，一个共价或非共价的连接到抗体或接头上，另一个连接到微泡上，它们能够在合适的介质中在合适的条件下以足够高的亲和力自发的相互连接(共价或非共价)，以通过接头的方式实现抗体与微泡的间接连接。在某些实施方式中，至少一个第一接头部分是功能性暴露的抗生物素蛋白或链霉亲和素，第二接头部分是生物素或生物素衍生物。在其他实施方式中，所述第一接头是第一寡核苷酸，第二接头是第二寡核苷酸，在其长度的至少一部分上与第一寡核苷酸互补(例如完全互补)，并且能够通过碱基配对与第一寡核苷酸结合。
抗体可以在引入密闭***之前结合到微泡或靶细胞，或者可以在促进抗体结合到密闭***内的细胞和微泡的条件下，与微泡和/或细胞一起或在微泡和/或细胞之前引入密闭***。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括用包含转基因的载体如病毒载体转导活化的靶细胞以产生转导的靶细胞，其中所述转导包括在适合转导活化的靶细胞的条件下，将活化的靶细胞与包含载体的基因转导试剂接触。在一个这样的实施方式中，转导是在密闭***中进行的。转导方法在本领域是公知的；因此，任何合适的转基因(包括但不限于嵌合抗原受体)可以被转导至被认为合适的靶细胞中。可以使用任何合适的携带转基因的载体，包括但不限于病毒载体(如逆转录病毒载体)。根据特定的细胞群体和其他相关因素，可以使用任何被认为合适的培养条件。在该实施方式中，所述方法允许用携带转基因的载体(包括但不限于逆转录病毒载体)进行有效的转导，从而使得用于生产转基因靶细胞(如淋巴细胞)的“一锅法”制造过程显著简化，所述“一锅法”从起始产品(如白细胞分离产品或外周血)到转基因表达靶细胞，具有较高的整体效率(靶细胞回收和转导)，且投资成本低。在下面的实施例中提供了转导的非限制性实施方式。
在一个实施方式中，所述转导包括将活化的CD3+细胞与含有人工基因构建体的基因工程腺病毒或慢病毒载体接触，所述人工基因构建体编码嵌合(两部分)跨膜融合蛋白，所述融合蛋白包含细胞外抗CD19单链抗体片段和细胞内T细胞信号传导蛋白(CD3-ζ)和共刺激(4-1BB)结构域(所谓的嵌合抗原受体或CAR)，所得的转导细胞是CAR-T细胞。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括扩增活化的靶细胞或转导的靶细胞，其中所述扩增包括在适于促进活化的靶细胞或转导的靶细胞增殖的条件下培养活化的靶细胞或转导的靶细胞。在一个这样的实施方式中，扩增在密闭***中进行。根据特定的细胞群体和其他相关因素，可以使用任何被认为合适的培养条件。本领域技术人员将认识到，通过本发明的方法产生的转导细胞可以随后转移到单独的细胞培养***(例如生物反应器、培养瓶或摇床反应器)中，用于最终的细胞扩增。在一个实施方式中，已经在单个容器如‘394专利中的套筒中分离、活化和转导的细胞随后在相同的单个容器中扩增，而不是在外部培养***中扩增，从而提供了从血液预处理到细胞扩增的完整的一锅法生产***。在本发明这一方面的一个实施方式中，在细胞扩增过程开始时，单个容器中培养基上方的气体顶部空间充入一次空气中的5％CO2，并且顶部空间的体积足以支持细胞扩增，在不进一步的顶部空间冲洗的情况下，将细胞***成需要将细胞***成一个或多个额外的密闭容器的程度。在另一个实施方式中，在细胞***之前，单个容器的顶部空间被充电不止一次。在另一个实施方式中，用空气中加湿的5％CO2连续冲洗顶部空间。在一个优选的实施方式中，所述扩增的细胞通过无菌连接被无菌的分成‘394专利的另外的套筒，因此使得“一锅法(类型的)”制造过程能够通过细胞收获、洗涤和悬浮在培养基中继续进行，在培养基中它们将被运回给医生。在另一个实施方式中，在单个容器如‘394专利的套筒侧面进行培养过程，或者在其倒置时培养，以最大化气体交换发生的空气/流体界面面积。在另一个实施方式中，用于培养的单个容器被轻轻摇动、滚动或以其他方式搅动以促进气体交换。
在进一步的实施方式中，所述方法还包括收获扩增的活化靶细胞或转导的靶细胞，以产生收获的活化细胞群体或收获的转导细胞群体，其中收获任选在密闭容器中进行。任何收获步骤和条件都可适用于活化细胞群或收获的转导细胞群的预期用途。在一个实施方式中，所述方法可进一步包括洗涤收获的活化细胞群或收获的转导细胞群，其中洗涤任选在密闭容器中进行。在另一个实施方式中，所述方法可以进一步包括将收获的活化细胞群或收获的转导细胞群转移到适于输注的培养基(立即使用)或冷冻保存的培养基(以后使用)，其中转移任选在密闭的容器中进行。如果医务人员根据所有相关因素认为合适，可以使用任何合适的输注介质。类似地，根据特定细胞群、最终预期用途和其他相关因素，任何冷冻保存介质都可以被认为是合适的。
在本发明中方法的一个具体实施方式中：
(a)所述靶细胞是人CD3+T淋巴细胞；
(b)所述宿主液体包括与浮力激活细胞分选兼容的液体，例如(但不限于)磷酸盐缓冲盐水；
(c)所述宿主液体含有PBMCs的悬浮液，
(d)所述宿主液体的PBMCs由以下任一物质制备
(i)稀释或未稀释的血液，
(ii)稀释或未稀释的白细胞分离产品，或
(iii)稀释或未稀释的骨髓；
(e)所述一种或多种抗体包含：
(i)抗CD3抗体，和
(ii)抗CD28抗体；
(f)所述抗体以每抗CD3抗体分子对一个或多个抗CD28抗体分子的比例存在于微泡表面；
(g)仅需通过微泡(其中一个与抗体结合)与靶细胞进行单次接触，即可达到靶细胞活化程度，该靶细胞活化程度足以支持用编码嵌合抗原受体的合成基因对靶细胞进行的有效病毒转导，和
(h)随后将分离的细胞与包含转基因的病毒载体接触，实现了分离细胞的有效转导，而无需预先去除微泡或其残余物。
在进一步的具体实施方式中，所述白细胞分离术或血液预处理、通过BACS的靶细胞分离、细胞活化、细胞转导的步骤和所有需要的细胞洗涤步骤全都在单个容器中进行，例如美国专利No.9,695,394的单个套筒，因此包括一锅法制造过程。
在本文公开的方法的所有实施方式中，所述密闭***可以是任何合适的密闭***。在一个实施方式中，密闭***如美国专利No.9,695,394所公开的那样。图1示出了示例性的密闭***100。如图1所示，密闭***100可以包括套筒102、控制模块104和对接站(docking station)106。如本文所用，“套筒”是封闭的外壳(具有顶部)，其允许细胞在封闭外壳内的容器之间无菌转移，以及细胞、抗体或配体和微泡的混合以实现连接，包括三个或更多个通过瞬时流体地连接的机械连接容器。套筒102可以容纳高达250ml的液体，可以是圆柱形的，可以是一次性的，并且可以优选的由硬塑料制成，更优选的由光学透明的聚碳酸酯制成。在某些其他实施方式中，套筒102是可重复使用的。控制模块104可拆卸地耦合到套筒102。控制模块104是具有光学和重力传感的机电设备。具体而言，控制模块104提供套筒102底部中的细胞界面的光学传感，并且可以被配置成控制一个或多个可逆关闭装置，以控制套筒102的各种容器之间的活动，如下文另外详述的。对接站106可拆卸地耦合到控制模块104，并且可以用于对控制模块104再充电。此外，对接站106可以无线地或通过有线连接接收一个或多个协议，并且可以进一步被配置成下载和处理由控制模块104接收的数据。对接站106优选使用可充电电池***来给控制模块104供电，所述控制模块104监控和控制重力和光学传感设备并引导在套筒102中的活动。用于确定重力的装置可以是本领域公知的任何装置，例如通过测量离心机转速或通过直接测量加速度或力来计算所述重力。
当套筒102可拆卸地附接到控制模块104时，可使用控制模块104的一个或多个检测器例如光学传感器或其它传感器来检测流过套筒102的细胞的类型。进一步的，控制模块104还可以包括至少一个但优选两个或更多个光学或其他发射器。在示例性实施方式中，四个红外发射器/检测器对被垂直布置在控制模块104中。在第一优选实施方式中，所述红外传感器位于成对红外发射器的正对面。在第二优选实施方式中，提供优先被红细胞吸收的波长的发射器位于对该频率敏感的成对传感器的正对面。在第三优选实施方式中，利用传感器来识别已经吸收荧光染料的细胞。在第一优选实施方式中，细胞的存在会干扰发射的红外光，而红外光检测器会量化穿透流体的信号幅度。在一个优选实施方式中，传感器可以给传输级别分配一个0-1000的值。纯净的血浆类似于水，不阻挡任何红外光，其值大约为1000。当压实的RBCs(红细胞)在传感器/发射器对之间通过时，基本上所有的红外光都被阻挡，探测器记录的值为0。
图2示出了套筒102的剖视图。如图2所示，套筒102包括处理容器108，处理容器108包括至少一个输入口110、第一出口112和第二出口114。套筒102还包括包含输入口118的第二容器116和包含输入口122和第一出口124的第三容器120。如以下过程所述，包括细胞的生物流体，例如正常血液、脐带血或骨髓，通过至少一个输入口110被输送到处理容器108。套筒102的第二容器116包括大的第一刚性储存室或红细胞耗尽室，第三容器120包括较小的第二刚性储存室或干细胞(SC)室，白细胞(WBC)和基本上所有的SPCs被转移到其中。第二容器116明显大于第三容器120，因为从血液样本中耗尽的红细胞体积总是远大于收集的白细胞体积。套筒102内的所有隔室彼此不同，但是相对于气流而言是相邻的。第二隔室116和第三隔室120可以通过小型过滤或足够窄的通气孔与处理容器108连接，以允许当细胞溶液从处理室108移至第二和第三容器116、120中时空气的置换，但是不允许容器之间的流体转移。在一个实施方式中，所述处理容器108是近似圆锥形的中心容器，而第二和第三容器116、120是较小的、位于周边的容器。为了给定的目的，所述容器可以是任何合适的体积。在一个实施方式中，第二和第三容器116、120各自进一步可以包括额外的常闭口，该口提供与套筒102外部的任何合适的接收容器的任选连接点，用于重力排放或通过空气过滤器192增加气压而排放。在进一步的实施方式中，处理容器108中的流体可以通过空气过滤器192施加空气压力而通过内部输入管110移除，当容器中的流体水平下降到内部刚性输入管110上的最低点以下时停止。
如图2所示，套筒102还包括连接处理容器108的第一出口112和第二容器116的输入口118的第一导管126。第一导管126包括第一可逆关闭装置128。第二容器116与处理容器108瞬时流体地连接，使得当第一可逆关闭装置128打开时，仅发生从处理容器108到第二容器116的流体流动。套筒102还包括连接处理容器108的第二出口114和第三容器120的输入口122的第二导管130。第二导管130包括第二可逆关闭装置132。第三容器120与处理容器108瞬时流体地连接，使得当第二可逆关闭装置132打开时，仅发生从处理容器108到第三容器120的流体流动。
如本文所使用的，“可逆关闭装置”是能够被关闭(例如通过控制器)以阻止流体流动的任何装置。示例性的这种装置包括但不限于阀、夹具和旋塞阀。如本文所用，“瞬时流体地连接”是指所述容器是流体不连续的(即，每个功能关闭)，除了当通过打开装置的常闭阀瞬时连接以实现流体或细胞悬浮液从一个容器到另一个容器的无菌转移时。“导管”可以是允许容器之间流体转移的任何合适的装置，包括但不限于管道。所有的导管都变成“常闭”的，使得一旦操作者移除在套筒组装过程中安装的防止导管关闭的销，容器就不会流体地连接。导管可以通过任何合适的可逆关闭装置关闭，例如阀门、夹具或旋塞阀。在一个实施方式中，筒内的导管可以在任何时候都由弹簧加载的管夹紧机构关闭，除非流体应该通过时，此时夹紧机构可以旋转(例如，通过控制模块自动控制导管的可逆打开)以允许流体通过，然后可以再次旋转以允许弹簧加载的管夹紧机构通过重新夹紧导管来关闭该通道。在这样的示例中，可逆关闭装置包括两个相对的夹具，夹具具有大约0.088英寸宽的夹紧表面，并且当管中的液压压力为325PSI时，需要大约1.6磅的夹紧力来阻挡通过内径为0.062英寸、外径为0.088英寸的聚氨酯管的所有流体通道。在较大的压力下，可能需要超过1.6磅的挤压力，而在较低的压力下，较小的挤压力可能就足够了。在这样的示例中，可以使用悬臂***来实现这些所需的夹紧压力。悬臂***可以根据需要打开和关闭导管(夹紧和释放管道)。弹簧可以设置在每个悬臂上，并且优选位于悬臂的最末端。促动器克服弹簧的阻力来移动杠杆。一旦促动器停止施加力，弹簧的偏压将杠杆推回其第一位置。
如上所述，处理容器108或其他容器可以任选的由至少一个检测器来查询，以检测细胞的存在或不存在。在这样的实施方式中，控制模块104基于从至少一个检测器传递的信息来控制第一可逆关闭装置128和/或第二可逆关闭装置132的打开和关闭。可以使用任何合适的检测器，包括但不限于光学检测器，如上述关于图1所讨论的。
如下文将详细描述的，在操作中，红细胞最初向处理容器108的底部迁移，远离离心机的旋转轴径向向外移动，直到到达处理容器108的底部，第一可逆关闭装置128和第二可逆关闭装置132位于该底部。在此，处理容器108底部上方的流体压头促使流体进入两个隔室中的一个：第二容器116或第三容器120。流体被导入哪个隔室取决于第一可逆关闭装置128和第二可逆关闭装置132的状态(打开、关闭)。在任一种情况下，在通过第一可逆关闭装置128和/或第二可逆关闭装置132之后，流体在来自处理容器108中剩余的流体(大部分是血浆)的压力的推动下通常流向旋转轴。已经通过第一可逆关闭装置128和/或第二可逆关闭装置132的流体然后被保留在第二容器116或第三容器120中。通过第一可逆关闭装置128和/或第二可逆关闭装置132的微小调节，可以耗尽不需要的细胞溶液，并且可以收获所需要的细胞溶液。
如图3所示，密闭***100可以进一步包括转移容器134，其包括至少一个口136。转移容器134可以机械地耦合到套筒102，或者可以仅通过相关导管将转移容器134连接到套筒102内的容器的物理连接将***保持为密闭***。同样的，在一个实施方式中，转移容器134在套筒102的内部；在另一个实施方式中，转移容器134在套筒102的外部。多种容器可以包括任何合适的材料，例如刚性结构、袋子、瓶子或任何其他合适的结构。在一个实施方式中，每个容器是刚性容器，例如硬塑料容器(包括但不限于聚碳酸酯)。在另一个实施方式中，转移容器134是柔性容器，包括但不限于袋子。转移容器134可以是刚性容器，因为在开始转移溶液中收获的靶细胞时，容器中的空气可以沿着连接至处理容器的相关导管排出。转移容器134也可以是柔性容器，其具有可折叠成小形状的优点，以使其更容易储存，例如在离心过程中储存在离心机的转子室中。
进一步的，如图3所示，所述密闭***100进一步包括至少第三导管138，其将第三容器120的第一出口124与转移容器134的至少一个口136连接，并将转移容器134的至少一个口136与处理容器108的至少一个输入口110连接。所述至少第三导管138包括至少第三可逆关闭装置140，使得第三容器120与转移容器134瞬时流体连接，以及转移容器134与处理容器108瞬时流体连接。所述至少第三导管138配置成使得以下只有一项能够成立：(i)当所述至少第三可逆关闭装置140打开时，仅可能发生从第三容器120到转移容器134的流体流动，或者(ii)当所述至少第三可逆关闭装置140打开时，仅可能发生从转移容器134到处理容器108的流体流动。
在第三容器120的第一出口124到转移容器134之间以及从转移容器134到处理容器108的至少一个入口110之间的第三导管138通常也由任何合适的可逆关闭装置关闭。在一个实施方式中，第三导管138可以通过第三可逆关闭装置140(正好邻近第三容器120的第一出口124)被夹紧在套筒102的外部，并且可以在隔离的附着细胞从第三容器120转移到转移容器134时被松开(例如，通过重力将隔离的附着细胞从第三容器120排出到转移容器134)。在转移到转移容器134中之后，邻近第三容器端口124的第三导管138上的第三可逆关闭装置140可以被重新夹紧。此时，例如，隔离的附着细胞可以经由第三导管138转移到处理容器108(例如，通过重力将隔离的附着细胞排回到处理室108中，用于进一步处理，例如分离/富集隔离的附着细胞的亚群，包括但不限于单核细胞，以从宿主液体中加入无细胞和乏血小板血浆)。因为套筒102可以重复使用，因此，转移容器134具有经济优势。另外，转移容器134允许改善靶细胞悬浮液和BACS试剂的混合。
密闭***100可以进一步包括控制模块104，如上述关于图1的论述。控制模块104可以被配置成控制至少在套筒102以及第一和第二导管126、130中的活动。在一些实施方式中，控制模块104还可以控制转移容器134内和/或第三导管138内的活动。例如，在转移容器134存在于套筒102内的实施方式中，控制模块104可以控制转移容器134内和/或第三导管138内的活动。控制模块104可以控制引导筒形容器108、116、120之间的流体流动可逆关闭装置128、132、140，例如当放置在离心机中时。在一个非限制性实施方式中，包含靶细胞/微泡混合物的套筒102被离心，使得结合到微泡的靶细胞与未结合到微泡的细胞分离。控制模块104可以被编程为经由第一可逆关闭装置128将未结合微泡的沉淀细胞输送到套筒102的第二容器116，将大部分上清液和基本上所有结合微泡的靶细胞留在套筒102的处理容器108中。
在一个实施方式中，至少第三导管138包括单个导管。在该实施方式中，仅有单个导管与转移容器134流体连接，并且所述导管可以流体分离，使得从第三容器120流向转移容器134的流体与从转移容器134流向处理容器108的流体分离。在该实施方式中可以使用任何合适的可逆关闭装置。图3中示出了一个非限制性示例，其中所述至少第三导管138包括设置在第三容器120和转移容器134之间以及转移容器134和处理容器108之间的T型或Y型连接器144，其具有适当的可逆关闭装置140、146以调节期望的流体流量。
在进一步的实施方式中，转移容器的至少一个端口包括第一输入口148和出口150。在该实施方式中，所述至少第三导管138可以包括(i)将第三容器120的出口124与转移容器134的输入口136的第三导管138连接，其中第三导管138包括第三可逆关闭装置140，使得第三容器120与转移容器134瞬时流体地连接，使得当第三可逆关闭装置140打开时，仅发生从第三容器120到转移容器134的流体流动；以及(ii)将转移容器134的出口136与处理容器108的至少一个输入口110的第四导管152连接，其中第四导管152包括第四可逆关闭装置146，使得转移容器134与处理容器108瞬时流体地连接，使得当第四可逆关闭装置146打开时，可能仅发生从转移容器134到处理容器108的流体流动。在该实施方式中，通过使用完全分离的导管138、152，使得从第三容器120流向转移容器134的流体与从转移容器134流向处理容器108的流体分离成为可能。
在更进一步的实施方式中，处理容器108的至少一个输入口110包括第一输入口154和第二输入口156，其中所述至少第三导管138或第四导管152(当存在时)将转移容器134的出口136与处理容器108的第一输入口154连接。在这样的示例中，密闭***100可以进一步包括将处理容器108的第二输入口156与至少一个介质储存器160的第一介质输入导管158连接，其中第一介质输入导管158包括至少第五可逆关闭装置162，其中至少一个介质储存器160与处理容器108瞬时流体连接，使得当至少第五可逆关闭装置162打开时，只可发生从至少一个介质储存器160向处理容器108的流体流动。
介质储存器160可用于通过第二输入口156向处理容器108提供宿主液体、靶细胞、抗体或配体和/或微泡。
在另一个实施方式中，处理容器108的所述至少一个输入口110包括第三输入口157。第三输入口157可以耦合到第五导管159。在这样的示例中，通过在过滤器186处提供正压，可以从处理室108中移除液体。
在一个实施方式中，转移容器134的至少一个端口还包括第二输入口161。例如，密闭***100可以进一步包括将转移容器134的第二输入口161与至少一个介质储存器(未示出)的第二介质输入导管163连接，其中第二介质输入导管163包括至少第六可逆关闭装置165，其中至少一个介质储存器与处理容器108瞬时流体地连接，使得当至少第六可逆关闭装置165打开时，可以仅发生从至少一个介质储存器到转移容器134的流体流动。
介质储存器可用于通过第二输入端口161向转移容器134供应宿主液体、靶细胞、抗体或配体和/或微泡。在至少一个介质储存器与处理容器108和转移容器134瞬时流体地连接的实施方式中，所述介质储存器可以是相同的储存器，或者每个容器可以具有其自己的专用储存器。
在进一步的实施方式中，所述封闭***100进一步包括混合器。所述混合器可以用于例如促进/改善(a)微泡和宿主液体，和/或(b)靶、抗体或配体和接头(当存在时)的混合。在一个实施方式中，所述混合器是静态混合器。所述静态混合器包括具有入口和出口的容器，所述入口和出口保持静止，同时提供两种同时通过容器的流体的连续混合，其构造例如但不限于包含混合元件的圆柱形管，所述混合元件在圆柱管的整个内部长度上定向。
图4A-5B示出了本发明的装置中适用于混合(例如混合靶细胞悬浮液(主要成分)和BACS试剂(添加剂))的示例性静态混合器。上述介质储存器可以通过第五和第六可逆关闭装置与静态混合器瞬时流体地连接。在一个非限制性实施方式中，如图4A和4B所示，静态混合器164通过包括固定在套筒顶部170的内表面168上的叶轮166来使套筒102绕其轴线旋转，从而使例如处理容器内溶液中的BACS试剂和靶细胞混合。图4A-4B中的设计的优点在于，套筒内部的混合附加件被胶合在适当的位置，因此仅通过将装载的套筒放置在辊道装置上一段可编程的时间即可发生溶液中的细胞和BACS试剂的混合。
在另一个非限制性实施方式中，如图5A和5B所示，静态混合器164通过包括与套筒顶部170的内表面168间隔开的叶轮166来使套筒102绕其轴线旋转，从而使例如处理容器内溶液中的BACS试剂和靶细胞混合。图5A-5B中的设计的优点在于，添加到套筒内部的混合附加件在电动机装置的驱动下绕其轴线旋转，使得套筒保持直立，并且不必从离心机中取出。
在另一个非限制性实施方式中，如图6所示，当套筒102保持不动时，混合器用于向套筒102的处理容器108内的溶液中的BACS试剂和靶细胞的混合物施加循环运动。这样的实施方式可以包括位于圆柱形管174内的叶轮172，电动机176被配置成驱动叶轮172，从而引起处理容器108中的混合。
在另一个非限制性实施方式中，如图7所示，所述混合器包括蠕动泵178，所述蠕动泵包括具有第一端182和第二端184的泵导管180，其中泵导管180的第一端182位于处理室108中，并且其中泵导管180的第二端184位于处理室108的外部，并且与处理室108的至少一个输入口110连接。
在又一个非限制性实施方式中，如图8所示，所述混合器包括混合模块194。混合模块可以包括底部部分195和顶部部分196。如图8所示，套筒102可以被配置成定位在底部部分195中，并且顶部部分196可以被配置成可拆卸地与底部部分195连接。这样，套筒102可以定位在由底部部分195和顶部部分196形成的腔室中。在一个非限制性实施方式中，所述混合模块194可以包括耦合到底部部分195的可旋转部件197。可旋转部件197可以被配置成使套筒102在其垂直轴上旋转。可旋转部件197可以耦合到电动机，电动机进而引起混合模块194的底部部分195旋转。在一个特定的示例中，所述可旋转部件197被配置成使套筒102在其垂直轴上旋转180度，因此套筒102的底部处于垂直位置，然后可旋转部件197使套筒102旋转180度回到原始的直立位置。在另一个示例中，所述可旋转部件197被配置成在一段时间内以不同的旋转速率将套筒102端对端(end over end)的连续旋转360度。在另一个非限制性实施方式中，可以配置所述混合模块194的底部部分195来振动以帮助混合。在另一个非限制性实施方式中，所述混合模块194可以被配置成当套筒102被定位在混合模块194的底部部分195中时增加套筒102的温度。这种温度升高可以通过混合模块194的底部部分195中的传导、对流或辐射加热来发生。
如图8所示，所述混合模块194可以包括混合控制模块198，所述混合控制模块198可以包括控制面板199和显示器200。所述控制面板199可用于选择混合的时间段以及一个或多个混合参数。例如，用户可以选择180度混合一段时间，360度混合一段时间，在特定温度下加热一段时间，和/或振动一段时间。其他示例也是可能的。
在多种实施方式中，第一介质输入导管158和/或第二介质输入导管还包括过滤器186。任何合适的过滤器(包括但不限于0.2μm的过滤器，或其它适当尺寸的过滤器以去除大颗粒)都可与介质输入导管结合使用，以促进介质无菌的引入处理容器和/或目标容器。例如，所述过滤器的示例性位置可在图3中看到。
在另一个实施方式中，第二容器116包括与第一废物导管190连接的出口188。该实施方式允许从第二容器116中移除废产物。在进一步的实施方式中，处理容器108进一步包括与第二废物导管(未示出)连接的无菌通气口192。该实施方式允许从处理容器108中移除废产物。所述无菌通气口192的示例性位置可以在例如图1和2中看到。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括给需要的受试者施用可有效治疗受试者疾病剂量的收获的活化细胞群或收获的转导细胞群。人类T细胞的基因修饰是治疗性活细胞为基础的治疗方法(例如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞)的开发和生产中日益重要的一步。CAR-T细胞，比如FDA批准的首个用于治疗急性淋巴细胞白血病的KYMRIAH(Tisagenlecleucel)，是患者自己的(自体的)T淋巴细胞，其可被制备成可杀死癌症的细胞。因此，在一个实施方式中，所述受试者患有癌症，包括但不限于淋巴细胞性白血病、包括白血病和淋巴瘤在内的血液***癌症、恶性黑色素瘤、实体瘤或转移性癌症，并且所述方法包括给受试者施用收获的转导细胞以治疗癌症。可以使用任何合适的给药途径，包括但不限于静脉输注。主治医务人员可使用其认为任何合适剂量的收获的转导细胞；在一个实施方式中，CAR-T细胞的治疗剂量可以是0.2×106至2.5×108个活的CAR-表达T细胞。
CAR-T细胞制造仅仅是本发明中的方法是高效且有利的过程的一个示例。其他示例包括目前正在开发的不同类型的自体T细胞或B细胞基因工程技术，用于治疗除血液***癌症以外的疾病，包括ADA免疫缺陷病毒、维斯科特-奥尔德里奇综合征免疫缺陷、肿瘤/黑色素瘤、艾滋病、自身免疫性疾病、糖尿病、血友病、葡萄膜炎和脑脊髓炎。
本发明的另一方面提供了一种分离的细胞悬浮液，其包括通过本文公开的任何实施方式的方法或实施方式组合的方法产生的收获的活化细胞群体或收获的转导细胞群体。在一个实施方式中，所述收获的转导细胞群体包含CAR-T细胞或由CAR-T细胞组成。在另一方面，本发明提供了用于治疗有此需要的受试者的方法，包括给受试者施用治疗受试者体内疾病(包括但不限于癌症)的有效剂量的分离的细胞悬浮液(例如CAR-T细胞)。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含以下的任意组合：
(a)用于靶细胞类型的激活和转导的微泡，其中所述试剂盒包括下述中的一种：
(i)人造试剂，其中提供的微泡和抗体已经彼此附着，任选的通过中间接头，或
(ii)分别将微泡和抗体与互补接头包装，当其添加至宿主液体中时，其自发组装成有抗体结合的微泡；
(b)美国专利No.9,695,394中公开的类型的一个或多个套筒；
(c)适合与所提供的试剂和套筒一起使用以激活和转导靶细胞的缓冲液；
(d)适用于在所提供的套筒内激活的靶细胞的病毒转导的缓冲液；和
(e)适合在所提供的套筒内转导活化的靶细胞的病毒载体。
实施例1
微泡/漂浮试剂对T淋巴细胞的分离和活化
为了比较通过本发明的方法或常规方法分离和活化的CD3+T细胞的性能，采用了如下方案：
CD3/28 BACS试剂对细胞的分离和活化：
1.健康的人外周血单核细胞(PBMC)制剂是通过在‘394专利的套筒中处理新鲜血液，在不采用Ficoll离心法的情况下离心制备得到。简而言之，其包括：
a.将170ml外周血放入套筒的主室中，并将10ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水加1％人血清白蛋白和2mM EDTA(DPBS-AE，指三者的混合液)放入收获室(harvest chamber)中。
b.所述血液在2000×g条件下离心20min分层，在50×g条件下离心5min去除红细胞，在1000×g条件下离心5min重新分层，在50×g条件下离心1min去除剩余红细胞。然后，通过轻柔的手动搅拌将主室中剩余的细胞重新悬浮，所述单核细胞在1000×g条件下离心沉淀1min，然后转移到收获室中在50×g条件下离心2min，产生总体积为13ml的单核细胞悬浮液。
2.使用血液分析仪对所得PBMC制剂的等分试样进行计数，并将剩余的MNCs在DPBS-AE中稀释至每ml 30×106个MNCs。
3.将两个2ml稀释的PBMC等分试样转移到5ml锥形基管中。
4.通过‘111专利中概述的一般方法，通过浮力激活细胞分选从PBMC样品中分离CD3+T细胞，具体如下：
a.向每个试管中加入5μg生物素化的抗CD3抗体(克隆OKT3)和20μg生物素化的抗CD28抗体(克隆CD28.2)；
b.将细胞/抗体混合物在室温下轻轻摇动孵育20min；
c.向每个试管中添加直径>2μm(Bracco)的4×108链霉亲和素包被的气核脂质壳微泡，并在室温下进一步轻轻摇动孵育额外的20min；
d.所述试管在室温下在400×g条件下离心5min，使CD3+细胞漂浮，并沉淀所有其他细胞；
e.将CD3+漂浮细胞/浮泡转移到15ml锥形底管中，用DPBS-AE调节至总体积为3ml，重新悬浮，并立即施加约2个大气压的高压以使微泡发生不可逆的破裂(使用手动注射器施加刚好足够的气压以澄清乳白色气泡悬浮液)。
5.通过将分离的CD3+细胞以0.5×106个细胞/ml的密度接种在含有6ml RPMI-1640加10％胎牛血清(FBS)，30U/ml的IL-2，100IU/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的T25烧瓶中进行细胞激活，并在37℃和5％CO2的条件下孵育24小时。
6.孵育24小时后，通过用荧光标记的抗CD25和抗CD69抗体或同型对照对染色细胞等分试样进行流式细胞分析。
7.同样在孵育24小时后，将0.5×106个细胞接种在1ml孔板中，添加培养基至1ml。通过在37℃和5％CO2的条件下孵育来扩增细胞。根据需要***生长的细胞，并使用血液分析仪间隔收集细胞计数。
用CD3/28磁珠进行常规细胞的分离和活化：
1.使用Ficoll沉淀法从用于BACS细胞分离的同一单元新鲜血液中制备PBMC制剂，包括：
a.用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)将30ml血液稀释至60ml；
b.向两个50ml的锥形管中分别加入15ml的Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)，并将30ml稀释血液小心地分层放置于每个管中的Ficoll液顶部。然后将试管在400×g条件下离心35min，关闭制动器。
c.小心地移除并丢弃上部的血浆/血小板层，小心地移除MNC(单个红细胞)层，并将其合并在单个50ml锥形管中，用DPBS+0.5％人血清白蛋白(DPBS-A)稀释至45ml。
d.用DPBS-A(45ml，400×g的条件下离心10min)洗涤所述MNC悬浮液两次，并在MACS缓冲液(DPBS-A+2mM EDTA)中重新悬浮至最终体积为5ml。
2.使用血液分析仪在等分的MNC悬浮液中对MNC进行计数，并将50×106个MNCs转移到5ml锥形管中。
3.将MACS缓冲液中的MNCs在300×g的条件下离心10min，移除上清液并用4℃的MACS缓冲液替换补充至最终体积为400μl，并向其中加入100μl的Miltenyi Biotec抗CD3微珠。然后将细胞/微珠悬浮液在4℃孵育15min。
4.向试管中加入4℃的MACS缓冲液7ml，试管在300×g的条件下离心10min，完全除去上清液，将细胞/微珠重新悬浮于500μl4℃的MACS缓冲液中。
5.通过用3mlMACS缓冲液冲洗分选柱，制备得到在midi-MACS磁铁(MiltenyiBiotec)中的LS分选柱。所述细胞/微珠悬浮液被吸至分选柱上，随后吸取3×3ml MACS缓冲液。
6.从磁铁上取下分选柱，用5ml MACS缓冲液冲洗收集阳性细胞部分，最后用柱子柱塞完成。
7.将3×106个分离的CD3+细胞分别添加到2个T25烧瓶中。
8.将250μl CD3/CD28人T-激活剂磁珠放入15ml锥形管中，向其中加入750μl MACS缓冲液。然后将试管放在Dynamag装置上。1min后，完全除去上清液，加入250μl MACS缓冲液，从Dynamag中取出试管，将磁珠悬浮液充分混合。
9.向每个T25细胞烧瓶中加入75μl的磁珠悬浮液，并充分混合(大约1微珠/细胞)。
10.采用培养基(RPMI-1640加10％胎牛血清(FBS)，30U/ml的IL-2，100IU/ml的青霉素和100μg/ml链霉素)将每个细胞悬浮液补充至6ml，然后将烧瓶在37℃，5％CO2的条件下下孵育24小时。24小时后，取0.5ml溶液用于细胞分析(采用荧光标记的抗CD69和抗CD25抗体的流式细胞术)。
11.同样在孵育24小时后，将0.5×106个细胞接种在1ml孔板中，添加培养基至1ml。通过在37℃和5％CO2的条件下下孵育来扩增细胞。根据需要***生长的细胞，并使用血液分析仪间隔收集细胞计数。
12.在进行细胞分析之前，通过将磁珠/细胞等分试样悬浮在0.5ml DPBS溶液中，充分混合，并在Dynamag设备上将磁珠与细胞分离，从细胞中取出磁珠。
结果：
在治疗性细胞制造的背景下，细胞扩增是幼稚T细胞活化的一个特别相关的措施，因为必须大量扩增少量患者来源的起始细胞才能提供治疗剂量。图9示出了用本发明的方法采用CD3/CD28微泡(实线)或通过常规手段采用CD3/CD28 Dynabeads(虚线)活化的CD3+T细胞在培养16天后的生长曲线。在这个实验中，BACS介导的扩增大大超过了磁珠介导的扩增，扩增结果分别为90倍和33倍。这是一个令人惊讶的结果，因为常规实践和制造商的说明都规定Dynabeads应与细胞保持1-3天的接触以有效将其活化，而此处使用的不稳定微泡在细胞分离后立即通过施加压力进行破裂，并且在细胞进入37℃的培养时不再能在细胞上观察到。在不受任何机制束缚的情况下，发明人推测不稳定的BACS微泡有效激活细胞扩增的能力可能源于塌陷的气泡脂质壳，其结合的抗体在培养过程中长时间与分离的细胞表面保持紧密接触。
本实施例的实验还揭示了微泡是细胞表面免疫表型的替代量度的有效活化剂，特别是标志物CD69(被认为是活化的早期标志物)和标志物CD25(被认为是后期的标志物)的活化诱导表面表达。77％的BACS激活细胞表达CD69，而91％的Dynabead激活细胞表达CD69，而66％的BACS激活细胞表达CD25，而88％的Dynabead激活细胞表达CD25。
实施例2
微泡本身不会非特异性的激活T细胞
为了测试BACS试剂对T细胞的激活是否可能是分子非特异性的(即脂壳气核微泡本身的功能，不考虑其与T细胞结合的抗体)，我们比较了使用抗CD3/CD28微泡和使用抗CD4/CD8微泡对T细胞的分离/激活。CD4和CD8是不参与触发T细胞活化的T细胞表面抗原。
如实施例1中所述，采用BACS试剂(来自供体，其不同于实施例1)对健康人T细胞进行分离、激活和扩增，以进行采用抗CD3/CD28抗体相关的微泡或采用抗CD4/CD8抗体相关的微泡的分离/活化步骤。培养14天后，用CD3/CD28微泡分离的T细胞扩增了2247倍，而用CD4/CD8微泡分离的同一供体的T细胞仅扩增了7倍(图2)，这表明只有前一种细胞被其BACS试剂充分激活。同样的，用抗CD4/CD8分离的细胞活化后显示了非常低水平的CD69和CD25表达(分别为3％和8％的细胞)，而用抗CD3/CD28分离的细胞分别有87％和71％是CD69+和CD25+。因此，微泡本身并不会激活T细胞。
在本实验的对照组(图10中未显示)中，用抗CD4/CD8 Dynabeads分离T细胞，然后在去除磁珠(Dynabeads)后与抗CD3/CD28微泡接触，在相同的潜伏期后，细胞扩增1625倍，证明CD4+CD8+T细胞包括相对于CD3/CD28 BACS试剂具有活化能力的T细胞。
实施例3
微泡/浮力试剂激活的T淋巴细胞的病毒转导
激活CD3+T细胞以产生CAR-T细胞的目的是使T细胞对合成嵌合抗原受体基因的病毒转导敏感。在本实施例中，用病毒载体转导通过实施例1中概述的方法分离和活化的CD3+T细胞因此用这种情况下带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的载体进行转导，以确认BACS活化的细胞与传统的磁珠活化的细胞相似。
1.如实施例1所述，采用CD3/CD28 BACS微泡或CD3/CD28 Dynabeads对健康人CD3+T细胞(来自不同于实施例1和2中的供体)进行分离和激活。在37℃和5％CO2的条件下的T25烧瓶中孵育36小时后，活化的细胞以0.5×106个细胞/ml的密度接种到涂有反向连接蛋白(Retronectin，10μg/cm2)的1ml孔中。
2.将携带绿色荧光蛋白转基因的慢病毒载体pMNDU3-LUC-PGK-EGFP-WPRE(在HEK293T细胞中产生)以5的感染复数(MOI)添加到每个孔中。
3.病毒/细胞悬浮液在37℃和5％CO2的条件下孵育48小时。
4.孵育48小时后，收获细胞，用新鲜培养基洗涤游离病毒两次，并将细胞以0.5×106个/ml的密度接种到1ml孔中，用于如实施例1所述的扩增研究。
5.添加病毒后大约96小时，通过流式细胞术分析细胞的等分试样的GFP荧光(门控在前向和侧向散射的细胞)。
结果：
在添加病毒后96小时，发现48％的用磁性CD3微珠和CD3/CD28 Dynabeads常规分离/活化的细胞表达绿色荧光蛋白，与通过CD3/CD28 BACS微泡分离/转导的表达绿色荧光蛋白的47％的细胞相似。这一结果证实了BACS处理的细胞与Dynabeads激活的细胞一样被完全激活(因此易受慢病毒转导的影响)。
与实施例1的供体细胞相比，使用这种供体经Dynabead处理的细胞显示出更接近于BACS处理的细胞的扩增水平(通过7天的扩增分别为116倍和124倍)，但是Dynabead激活的细胞扩增仍然没有超过BACS微泡激活的扩增数量。同样的，如图11所示，通过CD69和CD25表达测量得到的细胞活化情况在两种活化方法之间几乎是等同的。通过流式细胞术7-AAD排除法测定的转导细胞的细胞活力也几乎相同(BACS激活细胞为96％，Dynabead激活细胞为93％)。
这些结果进一步强调了本发明的令人惊讶的性质：即仅与完整的充气CD3/CD28微泡短暂接触(约1-2小时)就实现了与转导能力相关的T细胞活化，其等于或超过了CD3/CD28Dynabead活化通常需要1-3天的细胞/磁珠接触所能达到的效果。
实施例4
“一锅法”中的靶细胞分离、活化、转导和孵育
为了证明本发明的“一锅”细胞制造方法的可行性和实用性，将CD3+T细胞分离、活化、转导并进一步在‘394专利的套筒装置中孵育，而该套筒仍保持功能性封闭的***。简而言之，其包括：
1.基本上通过实施例1中方法的步骤1-2，由全血(来自与实施例1至3的供体不同的供体)制备健康的人外周血单核细胞(PBMC)制剂。下面列出的所有后续步骤(仅细胞等分试样的分析除外)均是在‘394专利的套筒设备中进行的。
2.从宿主液体中分离CD3+T细胞，并按如下方式活化：
a.将抗CD3和抗CD28生物素化抗体以2：1的比例加入到套筒处理容器中的15mlDPBS-AE中的PBMC悬浮液中，并轻轻摇动孵育30min。
b.接着向套筒中的细胞/抗体悬浮液中加入6ml链霉亲和素包被的微泡(Bracco)，其包含直径>2μm的微泡1.4×108个微泡/ml。然后，通过添加DPBS-AE将细胞悬浮液补足至80ml，在轻轻摇动的情况下，将套筒内的所得悬液孵育20min。
c.在400×g条件下将套筒离心5min，沉淀阴性细胞部分(无CD3的非微泡结合细胞)，在套筒控制器的程序控制下将其转移至套筒的废物室，留下40ml阳性细胞部分(靶细胞)的悬浮液。
d.通过短暂施加约3个大气压的空气压力，永久性的塌陷和/或破坏微泡，由此可将套筒处理容器中分离出的阳性细胞部分(与微泡结合的浮动CD3+T细胞)中完整的微泡被清除。然后通过添加RPMI 1640+10％胎牛血清+30IU IL-2使靶细胞在主室中重新悬浮，添加至最终体积为120ml。
3.通过在37℃下孵育仍在套筒处理容器中的细胞44小时，使靶细胞完全活化。在孵育过程中，5％的二氧化碳短暂缓慢地通过套筒中的的一个0.2μm过滤器向顶部空间流动，从而使处理容器的顶部空间每2小时更新一次。在20小时和44小时的时候取出待分析的等分细胞。
4.然后通过将靶细胞沉淀在套筒的主室底部，通过套筒的中心管除去上清液，并通过向套筒中加入新鲜培养基使靶细胞重悬至约1×106个细胞/ml的最终浓度，来洗涤靶细胞一次。
5.通过将实施例3步骤2中所述的慢病毒载体以MOI为5加入到主室中的细胞悬浮液中，从而在套筒中转导细胞。
6.如上述步骤4所述，通过将细胞/慢病毒悬浮液(仍在套筒中)在37℃下温育48小时，以允许细胞进行转导，每4小时短暂清洗顶部空间，并温和混合。
结果：
在这项试点研究中，在一个功能封闭的套筒装置中一锅法分离、活化和转导CD3+T细胞被证明是可行和成功的。使用抗CD3/抗CD28连接的微泡在套筒内分离CD3+T细胞后，立即破坏微泡，虽然活化标记的基线表达较低，但通过流式细胞术已经可检测到(8.4％CD25+细胞；0.0％CD69+)。在分离后20小时，CD25表达达到39.2％，CD25表达达到35.7％。在分配的44小时激活期结束时，CD25表达下降(27.4％CD25+)，而CD69表达增加到67.5％CD69+细胞。
在相同的套筒中，随后也实现了活化细胞的转导，在加入腺病毒48小时后，25.2％的转导细胞表达了可检测的GFP荧光。在平行对照(套筒+不添加腺病毒载体的细胞)中，0％的细胞在同一时间点表达GFP荧光。
本实验的结果令人惊讶，因为它们与已发表的T细胞转导方案中反映的普遍表达的观点相矛盾，即细胞和抗CD3/抗CD28载体微体(Dynabeads、囊泡、脂质体等)之间延长的接触(多天)是慢病毒转导之前和转导期间有效激活细胞所必需的。在此处使用的条件下，完整的抗CD3/抗CD28微泡与靶CD3+T细胞接触的时间不超过分离CD3+细胞并通过瞬间施加升高气压使微泡塌陷和/或破裂所需的约30min，但仍实现了有效的转导。这种对多日接触的依赖的缺乏使得一锅分离、活化和转导BACS分离细胞成为可能，因为在37℃的细胞和培养基存在下，完整的BACS微泡的寿命只有几个小时，而不是几天。
实施例5
BACS介导的靶细胞分离的最小实际接触时间
像大多数其他物理化学结合反应一样，结合反应的时间过程(其中抗体和微泡与宿主液体中的靶细胞结合以在一定程度上实现BACS介导的靶细胞分离)可能由粗略的渐近曲线来描述，其中相对高(但不完全)百分比的靶细胞快速结合，随后较慢的以接近100％的靶细胞结合完成结合反应。为了更好地确定含有靶细胞的宿主液体与抗体和微泡接触所需的实际最小时间间隔，进行了以下实验，对下列所有条件进行了重复测试：
1.将5ml健康人未稀释血液的等分试样加入加盖的15ml塑料试管中，然后向每个试管中加入100μl浓度为0.025μg/μl生物素化抗CD3抗体溶液；
2.将含有血液和抗体的试管在室温或4℃下轻轻摇动孵育10、15或30min；
3.抗体孵育期结束后，立即向每个试管中加入600μl链霉亲和素包被的微泡悬浮液(Bracco)，所述悬浮液含有直径>2μm的微泡0.8×108个。然后通过手动倒置快速混合试管，并进一步孵育30秒或0秒；
4.试管在400×g的条件下离心5min，以将CD3靶细胞与非靶细胞分离。阳性(漂浮)细胞和阴性(沉淀)细胞分别通过手动吸移液体弯液面处的浮泡进行收集，CD3+靶细胞回收率通过流式细胞术测定。
结果：
CD3+靶细胞平均回收率作为抗体孵育时间和温度的函数(N＝2；RT＝室温)：
(注意：室温下孵育30min的抗体而没有随后的30s微泡孵育，产生的靶细胞回收率为55％)
本实验的结果支持这样的假设：有效的抗体/微泡复合物与靶细胞的实质性结合最初是快速但不完全的，在进一步孵育下逐渐渐近完成：在4℃或室温下，大约有50％的靶细胞仅需要10min的抗体孵育，然后再进行0秒或30秒的微泡孵育即可回收，而室温下的抗体孵育回收率在15min和30min的孵育后进一步分别提高至61％和76％。在4℃时，渐近方法完成的速度实质上慢得多。

Claims (20)

1.一种用于分离和激活靶细胞的方法，包括：
(a)在密闭容器中使包含所述靶细胞和脂质壳气核微泡的宿主液体与一种或多种结合到靶细胞上的细胞表面分子的抗体进行接触，其中一种或多种抗体结合到所述靶细胞或所述微泡上，其中所述接触通过一种或多种抗体产生与微泡连接的靶细胞；
(b)在所述密闭容器中将所述与微泡连接的靶细胞与宿主液体中的其他细胞分离，以产生分离的与微泡相连的靶细胞；
(c)在步骤(a)中启动所述接触后1至180分钟，在所述密闭容器中使所述分离的与微泡相连的靶细胞的微泡成分塌陷和/或破裂，其中所述塌陷和/或破裂产生分离的与微泡残余物相连的靶细胞；和
(d)在所述密闭容器中培养所述分离的与微泡残余物相连的靶细胞，通过将一种或多种抗体与微泡残余物相连产生活化的靶细胞。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)后，在密闭容器中浓缩所述分离的与微泡相连的靶细胞。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述分离的与微泡相连的靶细胞的微泡成分的塌陷和/或破裂发生在开始接触后2min-60min内。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述分离的与微泡相连的靶细胞的微泡成分的塌陷和/或破裂发生在开始接触后5min-30min内。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述接触包括在密闭容器中接触宿主液体，所述宿主液体包括(i)与一种或多种抗体或其他配体结合的所述靶细胞，和(ii)能够通过接头直接或间接与一种或多种抗体结合的所述微泡。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括用包括转基因的载体转导活化的靶细胞，以生成转导的靶细胞，其中所述转导包括在适于转导活化的靶细胞的条件下，将活化的靶细胞与包括转基因载体的基因转导试剂接触。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述转导在密闭容器中进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述转导包括将活化的CD3+靶细胞与基因工程病毒载体接触，所述基因工程病毒载体包括编码嵌合跨膜融合蛋白的人工基因构建体，所述融合蛋白包括细胞外抗CD19单链抗体片段和细胞内T细胞信号传导蛋白和共刺激结构域，并且其中所得的转导靶细胞是CAR-T细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中开始接触的时间点和通过将活化的CD3+靶细胞与基因工程病毒载体接触而开始转导的时间点之间的时间间隔为12h-36h。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括扩增活化的靶细胞或转导的靶细胞，其中扩增包括在适于促进活化的靶细胞或转导的靶细胞增殖的条件下培养活化的靶细胞或转导的靶细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述扩增在密闭容器中进行。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞包括CD3+T细胞，并且其中一种或多种抗体包括抗CD3和抗CD28抗体。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主液体包括血液、白细胞分离产品，或血液、白细胞分离产品的稀释液或其他加工处理液。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主液体包括外周血单核细胞(PBMC)制剂。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述方法进一步包括获得扩增的活化靶细胞或转导的靶细胞，以生成获得的活化细胞群体或获得的转导细胞群体；其中所述获得过程在密闭容器中进行。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括洗涤获得的活化细胞群或获得的转导细胞群；其中所述洗涤在封闭的容器中进行。
17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法进一步包括将获得的活化细胞群或获得的转导细胞群转移到适于输注的培养基中，或转移到冷冻保存培养基中；其中所述转移在密闭容器中进行。
18.如权利要求1所述的方法，其中在活化步骤之前，宿主液体中的非靶细胞被部分耗尽。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述密闭容器包括：
(a)套筒，包括
(i)包括至少一个输入口、第一出口和第二出口的处理容器；
(ii)包括输入口的第二容器；
(iii)包括输入口和第一出口的第三容器；
(iv)连接处理容器的第一出口和第二容器的输入口的第一导管，其中第一导管包括第一可逆关闭装置，其中第二容器与处理容器瞬时流体地连接，使得当第一可逆关闭装置打开时，流体仅从处理容器流向第二容器；
(v)连接处理容器的第二出口和第三容器的输入口的第二导管，其中第二导管包括第二可逆关闭装置，其中第三容器与处理容器瞬时流体地连接，使得当第二可逆关闭装置打开时，流体仅从处理容器流向第三容器；
(b)包括至少一个端口的转移容器；
(c)至少第三导管，其
(i)将第三容器的第一出口连接至转移容器的至少一个端口，和
(ii)将转移容器的至少一个端口连接至处理容器的至少一个输入口；
其中所述至少第三导管包括至少第三可逆关闭装置，使得(A)第三容器与转移容器瞬时流体地连接，和(B)转移容器与处理容器瞬时流体地连接；其中所述至少第三导管被配置成使得以下仅一项成立：
(I)当所述至少第三可逆关闭装置打开时，仅可发生从第三容器向转移容器的流体流动；或
(II)当所述至少第三可逆关闭装置打开时，仅可发生从转移容器向处理容器的流体流动；和
(d)控制模块，其被配置成控制在至少所述套筒以及第一和第二导管中的活动。
20.如权利要求6所述的方法，其中转导的靶细胞是CAR-T细胞。
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