CN111919536B

CN111919536B - 一种玉米种子活力萌发事件测定方法

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Publication number: CN111919536B
Application number: CN202010815800.4A
Authority: CN
Inventors: 江绪文; 李贺勤
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111919536A

Abstract

本发明首次利用2个相继发生的种子萌发质变事件（果种皮破裂和胚根鞘破裂）进行玉米种子活力萌发事件测定评价体系建设，体系包括研发了配套发芽装备、建立了种子活力评价标准等。本发明可广泛的应用于玉米种子活力测定等相关科研工作，在种子质量管理、种子生物学研究、实现良种化和种子质量标准化等方面具有极其重要的应用前景。

Description

一种玉米种子活力萌发事件测定方法

技术领域

本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种玉米种子活力萌发事件测定方法。

背景技术

种子生理质量是直接影响田间出苗的重要因素之一。种子活力是衡量种子质量的一个重要指标，它反映了种子在各种田间条件下快速、均匀出苗和生长发育的所有潜在能力的总和（AOSA. Seed Vigour Testing Handbook, Association of Official SeedAnalysts, Ithaca, NY, USA. 1983）。目前种子活力测定已被广泛用于种子质量评价中。它的基本目标是在具有商业价值的种子批中，能够精确识别种子批之间生理潜力差异（Marcos-Filho, J. Seed vigour testing: an overview of the past, present andfuture perspective. Scientia Agricola, 2015, 72, 363-374.）。对此，种子科学家不断完善现有方法并创新研究出了许多实用、可靠的活力测定新方法，以更好地解释评价不同种子批活力大小，准确预测田间出苗情况。

玉米是世界上最重要的粮饲作物之一。种子活力高低直接关系其生育后期产量和品质，目前用于玉米种子活力测定的常用方法主要有：标准发芽测定、抗冷测定、加速老化测定等。当然还有一些方法存在误差大，操作不便，费时费资、适用范围受限等问题未能大范围推广应用，其相关技术方法有待优化提升。如：四唑测定需要检验人员具有丰富的专业经验、胚根伸长测定的评价标准目前适用于欧美地区高发芽率标准（95%）下的种子批种子活力测定，但在中国推广受限，这归因于中国国标发芽率目前仅为85%且前期品种选育缺少活力性状关注等，市售许多玉米品种种子批虽其标准发芽率大于85%，但活力偏低、萌发速度慢而出现活力测定时没有或很少出现满足计数条件的种子（如：标准发芽率大于85%、种子活力偏低的郑单958种子批）。故优化创新简单实用、精准广适的种子活力测定新方法非常重要。

据《种子活力测定方法手册》（ISTA，International Seed TestingAssociation）、《种子活力测定手册》（AOSA，North American Association of OfficialSeed Analysts）、《种子活力测定技术手册》（江绪文和王建华.中国农业大学出版社,2018）等书籍所述：一般认为，高活力种子发芽速率快、出苗率高、苗齐苗匀苗壮，而低活力种子发芽速率慢、进程停滞甚至丧失生活力、不能正常出苗而腐烂在土壤内。

种子萌发中伴随着不同萌发事件（量变事件和质变事件）的发生，而种子活力越高萌发事件发生完成时间越短。根据此原理，本发明基于玉米种子萌发事件（质变事件）的选择，建立对应的玉米种子活力萌发事件测定评价体系，包括测定方法研究和根据检测实际需求对配套装备进行不断创新改进等，以弥补现有技术不足，提高种子活力测定结果精准度。

发明内容

针对上述问题，本发明目的是提供一种玉米种子活力萌发事件测定方法，基于萌发事件（质变事件）选择，建立玉米种子活力萌发事件测定体系，包括测定方法研究和配套测定装备研发，以满足种子活力规模化、高精化、广适化检测需要。

为实现上述目的，本发明基于种子萌发伴随不同萌发事件（质变事件）发生率不断变化，不同活力水平种子批单位时间点（范围）萌发事件发生率不同，特别是种子活力越高某特定萌发时间点（范围）对应的萌发事件发生率或连续萌发事件发生率总和越高，从选择种子萌发事件、确定评价条件和时间点（范围）、明确测定操作流程、研发配套测定装备、建立种子活力评价标准等方面开展了***研发工作。本发明采用以下技术方案：一种玉米种子活力萌发事件测定方法，其包括如下作业：（a）种子萌发事件的选择；（b）种子萌发床的选择；（c）种子萌发条件的选择；（d）萌发事件观测时间点（范围）的选择；（e）种子萌发配套装备的研发；（f）萌发事件测定评价体系的建立。所述作业（a）中，选择便于观测的连续质变萌发事件；所述作业（b）中，选择便于观测的萌发床及适宜萌发方式；所述作业（c）中，选择便于观测的萌发条件（如：温度等）；所述作业（d）中，选择萌发事件观测适宜的时间点（范围）；所述作业（e）中，根据新方法实际需求，创新改进配套检测装备，弥补现有技术不足，提高种子活力测定精准度；所述作业（f）中，根据试验结果建立萌发事件测定方法体系并验证。

本发明的有益效果是：基于种子萌发伴随不同萌发事件（质变事件）发生率不断变化，不同活力水平种子批单位时间点（范围）萌发事件发生率不同，选择种子萌发事件、选择种子萌发床、选择种子萌发条件、选择萌发事件观测时间点（范围）、研发种子萌发配套装备、建立萌发事件测定评价体系。本发明可广泛应用于玉米种子活力测定等相关科研工作，在种子质量管理、种子生物学研究、实现良种化和种子质量标准化等方面具有极其重要的应用前景。

附图说明

图1为本发明的作业流程图。

图2为本发明的玉米种子萌发事件果种皮破裂和胚根鞘破裂。

图3为本发明的塑料发芽盒结构示意图。

图4为本发明的塑料发芽盒盒盖和盒体结构示意图。

图5为本发明的置盒底座结构示意图。

图6为本发明的塑料发芽盒安置示意图。

图3-图6中，塑料发芽盒1、盒盖2、盒体3、卡扣4、信息记录区5、密封条6、纸卷放置编号7、卡槽8、纸卷放置槽9、纸卷10、海绵条放置槽11、海绵条12、置盒底座13、置盒槽编号14、置盒槽15、防滑区16、发芽盒顶标识区17、发芽盒侧标识区18。

图7为本发明的4个萌发温度24个种子批萌发事件发生率变化趋势图。

图8为本发明的4个RT指标与MFSE回归分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明涉及的一种玉米种子活力萌发事件测定方法包括种子萌发事件的选择、种子萌发床的选择、种子萌发条件的选择、萌发事件观测时间点（范围）的选择、种子萌发配套装备的研发、萌发事件测定评价体系的建立等作业。

本发明涉及的玉米种子活力萌发事件测定方法具体实施方式如下。

（a）种子萌发事件的选择：在诸多萌发事件（量变事件和质变事件）中的两个质变萌发事件前期备受我们关注。

萌发事件一（果种皮破裂）：果种皮发生了破裂。胚根鞘是禾本科植物特有器官。它围绕在胚根周围，保护幼小胚根免受机械损伤、逆境胁迫等。特别是前期我们对胚根鞘进行了解剖分析、生物力学分析及组学分析，结果表明在果种皮破裂这一事件中胚根鞘伸长膨大起主要作用。其中胚根鞘的长度（伸长能力的一种重要体现）与种子活力大小有关（Jiang, X.W., Tian, B.H., Zhang, W.M., Wang, G.Y. and Wang, J.H. QTL mappingof coleorhiza length in maize (Zea mays L.) under two germinationenvironmental conditions. Plant Breeding, 2011, 130, 625-632.）。

萌发事件二（胚根鞘破裂）：胚根鞘发生了破裂。胚根成熟伸长生长突破胚根鞘或胚根鞘组织弱化破裂成熟的胚根伸出。

如图2所示，玉米种子正常萌发中，果种皮破裂和胚根鞘破裂是2个相继发生的萌发质变事件，非常符合本发明萌发事件测定对萌发质变事件的选择需求。

果种皮破裂和胚根鞘破裂两个萌发事件均涉及组织破裂，故本发明涉及的玉米种子活力萌发事件测定方法又可简称为破裂测定（RT，rupture test）。

本发明基于玉米种子萌发中果种皮破裂和胚根鞘破裂，建立了3个评价指标，包括果种皮破裂率（testa-pericarp rupture percentage，TRP）、胚根鞘破裂率（coleorhizarupture percentage，CRP）和（果种皮破裂+胚根鞘破裂）率（testa-pericarp rupture +coleorhiza rupture) percentage (TRCRP)。

果种皮破裂率 (%) = (果种皮破裂种子数 / 待测种子总数) × 100。

胚根鞘破裂率 (%) = (胚根鞘破裂种子数 / 待测种子总数) × 100。

（果种皮破裂 + 胚根鞘破裂）率(%) = (果种皮破裂种子数+胚根鞘破裂种子数 /待测种子总数) × 100。

（b）种子萌发床的选择：参照ISTA（International Seed Testing Association）手册和农作物种子发芽技术规程（GB/T 3543.4-1995）等书籍记载,玉米种子萌发床主要有3种，包括纸间（BP，between paper）、纸+砂（TPS，top of paper covered with sand）、砂床（S，sand）。鉴于萌发事件测定方便对发生果种皮破裂和胚根鞘破裂的种子进行观测，本发明选择纸间发芽（卷纸发芽）较为适宜。

（c）种子萌发条件的选择：影响破裂测定（RT）的主要萌发条件是温度，本发明选择了4个种子萌发温度以形成一个温度梯度，分别为13±0.5℃、15±0.5℃、20±0.5℃和25±0.5℃。

（d）萌发事件观测时间点（范围）的选择：本发明在4个种子萌发温度下，设定的萌发时间范围为13±0.5℃：0-192 h (hours)；15±0.5℃：0-192 h；20±0.5℃：0-108 h；25±0.5℃：0-168 h；观测时间范围为13±0.5℃：48-192 h；15±0.5℃：48-192 h；20±0.5℃：36-108 h；25±0.5℃：24-168 h；同时在各种子萌发温度下的观测时间范围内分别均匀设定7个时间点：在13 ± 0.5℃和15 ± 0.5℃萌发温度下，每24 h对果种皮突破和胚根鞘突破种子数观测1次并计算TRP，CRP和TRCRP；在20 ± 0.5℃萌发温度下，每12 h观测1次；在25 ± 0.5℃萌发温度下，每隔24 h观测1次。

（e）种子萌发配套装备的研发：本发明采用纸间发芽（卷纸发芽）方式。传统操作方法为将置床后的纸卷放入自封袋中垂直放入发芽箱中进行发芽，但常存在样品标识不便、自封袋垂直放置不稳、取样观测麻烦、发芽条件维护（如：水分控制）困难等不足，一定程度上会影响试验结果的精准度，造成不必要的误差，故有必要对现有种子萌发配套装备改进创新。

因此，针对玉米种子萌发配套装备存在的不足及本发明中玉米种子活力萌发事件测定的需求，开发研制简单、实用的玉米种子萌发配套装备，此装备具有结构简单、便于纸卷标识、垂直放置稳定、取样观测方便、发芽条件易维护等优点，对准确观测玉米种子果种皮破裂和胚根鞘破裂发生率以及开展相关科研工作具有重要实际意义。

本发明的种子萌发配套装备包括塑料发芽盒1、置盒底座13；所述的塑料发芽盒1有盒盖2、盒体3、发芽盒顶标识区17、发芽盒侧标识区18，盒盖2四周边缘有密封条6、侧面有两个卡扣4，盒体3顶部有信息记录区5、纸卷放置编号7（编号为1-12）、内有纸卷放置槽9可放置纸卷10、侧面有两个卡槽8、底部有海绵条放置槽11可放置海绵条12；所述的置盒底座13外侧有置盒槽编号14（编号为1-12）、内有置盒槽15、两边有防滑区16。

本发明的种子萌发配套装备具体实施方式如下。

如图3至图6所示，将塑料发芽盒1打开平放在实验台上，将两个卡扣4分别从两个卡槽8上取下，打开盒盖2，将海绵条12（蒸馏水充分润湿）放入盒体3中的海绵条放置槽11中，将已置床的纸卷10根据纸卷放置编号7放在对应的纸卷放置槽9中（种子发芽测定一般设为3次重复或4次重复，每重复100粒或50粒种子，故编号设为1-12），根据测定需要直接在发芽纸上做信息标识或（和）夹卷标识纸条或（和）在信息记录区5记录相关信息，纸卷10摆放好后（种孔朝下端朝海绵条12，并与海绵条12接触，可有效保水），盖上盒盖2，扣上卡扣4，因盒盖2内有密封条6，故塑料发芽盒1有很好的密封效果；在发芽盒顶标识区17、发芽盒侧标识区18标注必要信息，便于查找等；根据置盒槽编号14将放有纸卷10的塑料发芽盒1垂直放入置盒底座13内对应的置盒槽15中；两边的防滑区16能起到很好的防滑效果，方便置盒底座13搬移；统计TRP，CRP和TRCRP指标时，可方便准确取出指定塑料发芽盒1和目标纸卷10进行观测，观测结束后放回塑料发芽盒1也非常便捷；完成种子活力测定后清洗塑料发芽盒1，擦干备用。

本发明的种子萌发配套装备除了可用于种子萌发事件测定，还可用于相关的科研工作，在种子质量管理、种子生物学研究、实现良种化和种子质量标准化等方面具有很好的市场应用前景。

（f）萌发事件测定评价体系的建立：具体实施方法如下。

试验材料。

随机选取8个玉米品种，分别为：登海605（DengHai605），农大108（NongDa108），隆平206（LongPing206），郑单958（ZhengDan958），迪卡517（DiKa517），迪卡007（DiKa007），先玉335（XianYu335）和先玉047（XianYu047），下文依次缩写为：DH605，ND108，LP206，ZD958，DK517，DK007，XY335和XY047。8个玉米品种，前4个为中国品种，后4个为美国品种。每个品种有3个种子批分别于2016年、2017年和2018年在种子销售市场收集购买，8个品种共24个种子批。所有试验材料每次使用完后，均放回低温冷库中进行保存，保存条件为：10℃、40%RH。

试验方法。

种子重量和种子水分含量测定。

种子重量测定：每个种子批随机数取500粒种子，3个重复，称重后换算成千粒重。

种子水分测定：磨碎的种子样品在130±0.5℃条件下干燥4小时（ISTA，2007），并根据鲜重计算出种子水分百分率。

发芽测定。

发芽测定采用卷纸发芽法。从种子批中取试样100粒，3次重复，用1% NaClO（w/v）进行种子消毒10 min（minutes），然后用蒸馏水清洗3次，用滤纸拭干种子表面浮水，备用（注：包衣种子可不用消毒，本发明使用的包衣种子用蒸馏水稍加清洗并进行消毒）。取2张已灭菌（121℃高压蒸汽灭菌20 min）烘干后的发芽纸（Anchor Paper Co.，USA）叠放后用蒸馏水充分润湿，用无菌纱布拭去多余水分，种子进行交错置床，种孔朝向一致，根据测定需要直接在发芽纸上做信息标识或夹卷标识纸条或在信息记录区5记录相关信息，将纸卷10放入塑料发芽盒1中对应纸卷放置编号7的纸卷放置槽9中（种孔朝下）。纸卷10摆放好后，盖上盒盖2，在发芽盒顶标识区17、发芽盒侧标识区18标注必要信息，最后将装有纸卷10的塑料发芽盒1垂直放入置盒底座13内对应的置盒槽15中，然后将置盒底座13放置在人工气候箱（RLD-450D，宁波市乐电仪器制造有限公司）中25±0.5℃避光发芽。

发芽首次计数（标准发芽势）和标准发芽率分别在置床后4天和7天进行测定。统计发芽率的同时，从每个重复中选取大小均一的种苗植株10株，进行苗长、根长、苗鲜重和根鲜重测定，并计算发芽指数（GI，Germination Index）和活力指数（VI，Vigour Index），公式如下：GI=∑(Gt / Dt)，其中Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数；VI=GI×S，其中GI为发芽指数，S为苗长（cm）。

抗冷测定（CT， Cold Test）和加速老化测定（AAT，Accelerated Aging Test）。

抗冷测定：从种子批中取试样100粒，3次重复，从玉米地里选取足量腐殖质含量低的沙质壤土或壤质沙土（最好含有已知的玉米病原体），用0.5mm筛子过筛后，进行土壤pH和土壤最大持水力测定。符合土壤要求（pH为6-8，土壤最大持水量不低于40%），备用。将土壤铺在发芽纸上，种子置床后，在10 ± 0.5℃下发芽7天，然后转到25 ± 0.5℃发芽7天，最后统计正常幼苗数（王建华. 玉米种子质量评价手册. 中国农业大学出版社，2016）。

加速老化测定：从各种子批中取试样100粒，3次重复，在43 ± 0.3℃, 98% RH(相对湿度)下处理72小时，然后在25 ± 0.5℃进行标准发芽7天，最后统计正常幼苗数。

田间出苗率（FSE，Field Seedling Emergence）测定。

从各种子批中随机取试样100粒，3次重复，于2019年在即墨试验基地（青岛，山东），城阳试验基地（青岛，山东）和南滨农场（三亚，海南）进行田间出苗率测定。采用完全随机区组设计，行间距、株间距、行长分别为0.06、0.06和0.6m。在玉米三叶期统计田间出苗率。

平均田间出苗率（MFSE，Mean Field Seedling Emergence）的计算公式为：MFSE（%）=[FSE-即墨（%）+FSE-城阳（%）+FSE-南滨（%）]/3。

萌发事件测定。

从各种子批中取够量试样，4个萌发温度，分别为13±0.5℃、15±0.5℃、20±0.5℃和25±0.5℃，各萌发条件100粒，3次重复。用1%NaClO（w/v）进行种子消毒10min，然后用蒸馏水清洗3次，用滤纸拭干种子表面浮水，备用（注：包衣种子可不用消毒，本发明使用的包衣种子用蒸馏水稍加清洗并进行消毒）。取2张已灭菌（121℃高压蒸汽灭菌20 min）并烘干的发芽纸（Anchor Paper Co.，USA）叠放后用蒸馏水充分润湿，用无菌纱布拭去多余水分，种子进行交错置床，种孔朝向一致，具体操作同上文发芽测定，将纸卷10放入塑料发芽盒1中的纸卷放置槽9中，最后将装有纸卷10的塑料发芽盒1垂直放入置盒底座13内对应的置盒槽15中，将置盒底座13放置在人工气候箱（RLD-450D，宁波市乐电仪器制造有限公司）中避光发芽。置床后，13±0.5℃：从48 - 192 h每24 h对果种皮破裂和胚根鞘破裂种子数观测1次并计算果种皮破裂率（TRP），胚根鞘破裂率（CRP）和（果种皮破裂+胚根鞘破裂）率（TRCRP）；15±0.5℃：从48 - 192 h每24 h观测1次并计算TRP，CRP和TRCRP；20±0.5℃：从36 - 108 h每12 h观测1次并计算TRP，CRP和TRCRP；25±0.5℃：从24 - 168 h每24 h观测1次并计算TRP，CRP和TRCRP。

果种皮破裂率(%) = (果种皮破裂种子数 / 待测种子总数) × 100。

胚根鞘破裂率(%) = (胚根鞘破裂种子数 / 待测种子总数) × 100。

数据分析。

采用Excel软件对数据进行处理；利用SPSS16.0、SAS统计软件包（SAS Institute，Version9.2）等对相关指标数据进行统计分析，包括相关分析、回归分析、单因素方差分析（LSD法）等。

结果与分析。

种子重量和种子水分含量比较分析。

由表1可见，8个品种24个种子批千粒重范围为306.33 - 388.32 g。同品种不同批次千粒重最大差异为19.07g（隆平206）。24个种子批种子水分含量在11.11 - 11.34%之间，均低于种子安全水分含量（13%）。

表1 24个玉米种子批千粒重和种子水分含量测定结果。

种子批	千粒重（g）	种子水分含量（%）	种子批	千粒重（g）	种子水分含量（%）
						DH605-2018	354.68	11.18	DK517-2018	332.54	11.14
DH605-2017	332.42	11.21	DK517-2017	321.66	11.18
						DH605-2016	347.5	11.22	DK517-2016	319.54	11.17
ND108-2018	324.52	11.19	DK007-2018	288.75	11.12
						ND108-2017	313.46	11.21	DK007-2017	306.33	11.17
ND108-2016	308.63	11.21	DK007-2016	296.67	11.17
						LP206-2018	369.36	11.31	XY335-2018	291.44	11.11
LP206-2017	360.17	11.26	XY335-2017	282.81	11.15
						LP206-2016	379.24	11.28	XY335-2016	278.23	11.16
ZD958-2018	382.62	11.33	XY047-2018	326.17	11.13
						ZD958-2017	388.32	11.3	XY047-2017	317.23	11.13
ZD958-2016	380.43	11.34	XY047-2016	334.54	11.15

种子标准发芽与幼苗生长测定结果。

由表2和表3可见，同品种3个种子批间存在明显差异，包括GI和VI这2项指标8个品种差异显著 (p<0.05) (表2和表3)。综合分析各项指标可见，同品种3个种子批的种子质量顺序是2018种子批 > 2017种子批 > 2016种子批。

表2 24个玉米种子批标准发芽测定结果。

种子批	发芽势（%）	发芽率（%）	种子批	发芽势（%）	发芽率（%）
						DH605-2018	94.67a	94.67a	DK517-2018	94.67a	95.00a
DH605-2017	90.33b	91.33b	DK517-2017	92.67b	93.00a
						DH605-2016	88.67c	89.00b	DK517-2016	87.33c	87.67b
ND108-2018	95.67a	95.67a	DK007-2018	94.67a	94.67a
						ND108-2017	91.67b	91.67b	DK007-2017	92.67b	92.67b
ND108-2016	86.33c	87.00c	DK007-2016	87.67c	88.00c
						LP206-2018	92.33a	93.00a	XY335-2018	98.00a	98.00a
LP206-2017	89.67b	91.00a	XY335-2017	94.33b	94.33b
						LP206-2016	82.00c	84.33b	XY335-2016	91.67c	91.67c
ZD958-2018	94.33a	94.33a	XY047-2018	97.00a	97.33a
						ZD958-2017	89.00b	90.33b	XY047-2017	94.00b	94.00b
ZD958-2016	82.33c	85.67c	XY047-2016	92.33b	92.33c

注：同品种3个种子批间不同小写字母表示两者差异显著(p<0.05)，下同。

表3 24个玉米种子批幼苗生长测定结果。

种子批

苗长（cm）

根长（cm）

苗鲜重（g/10S）

根鲜重（g/10S）

发芽指数

活力指数

DH605-2018

10.07a

13.62a

4.02a

2.23a

33.39a

336.23a

DH605-2017

9.73b

13.01b

3.77b

2.16b

31.80b

209.41b

DH605-2016

9.04c

11.62c

3.56c

2.25b

30.46c

275.37c

ND108-2018

9.57a

13.74a

3.96a

2.28a

32.61a

312.09a

ND108-2017

9.24b

12.62b

3.94a

2.13b

31.39b

290.03b

ND108-2016

8.57c

11.18c

3.56b

2.08b

29.82c

255.53c

LP206-2018

9.34a

11.49a

3.72a

2.14a

31.91a

298.05a

LP206-2017

9.12a

11.02b

3.67a

1.98b

31.00b

282.72b

LP206-2016

8.42b

10.82b

3.53b

1.93b

28.61c

240.89c

ZD958-2018

9.27a

12.63a

3.58a

2.31a

32.42a

300.50a

ZD958-2017

9.03b

11.21b

3.61a

2.04b

31.03b

280.23b

ZD958-2016

8.73c

11.04b

3.52b

1.09b

28.88c

252.16c

DK517-2018

10.30a

12.78a

3.92a

2.20a

33.54a

345.45a

DK517-2017

9.47b

12.23b

3.77b

2.15ab

32.28b

305.67b

DK517-2016

8.86c

11.34c

3.67c

2.04b

30.23c

267.87c

DK007-2018

10.90a

12.14a

3.84a

2.18a

33.61a

366.36a

DK007-2017

9.67b

12.42b

3.72a

2.06b

32.14b

310.78b

DK007-2016

9.13c

11.25c

3.73a

2.05b

29.98c

273.75c

XY335-2018

11.14a

14.56a

4.36a

2.33a

34.75a

387.12a

XY335-2017

10.40b

13.44b

4.14a

2.25ab

33.44b

347.82b

XY335-2016

9.78c

12.34c

3.79b

2.17b

31.75c

310.52c

XY047-2018

11.63a

14.32a

4.23a

2.34a

35.04a

407.50a

XY047-2017

10.70b

13.65b

4.16a

2.23b

33.25b

355.78b

XY047-2016

9.87c

13.06c

3.89b

2.20b

32.39c

319.68c

抗冷测定、加速老化测定。

由表4可见，同品种3个在不同种子批间种子活力不同，其中从抗冷测定发芽率、加速老化测定发芽率2个指标来看，8个品种的3个种子批之间差异均达到了显著水平(p <0.05) (表4)。综合分析4项种子活力指标，表明同品种3个种子批的种子质量顺序是2018种子批 > 2017种子批 > 2016种子批。

表4 24个玉米种子批抗冷测定和加速老化测定结果。

种子批	抗冷发芽率（%）	加速老化发芽率（%）	种子批	抗冷发芽率（%）	加速老化发芽率（%）
						DH605-2018	92.00a	86.33a	DK517-2018	90.33a	85.33a
DH605-2017	89.33b	82.67b	DK517-2017	88.00b	77.00b
						DH605-2016	86.67c	72.33c	DK517-2016	86.00c	69.67c
ND108-2018	92.33a	87.33a	DK007-2018	92.33a	85.67a
						ND108-2017	90.00b	84.33b	DK007-2017	89.67b	81.67b
ND108-2016	87.67c	75.67c	DK007-2016	85.67c	71.00c
						LP206-2018	90.67a	83.67a	XY335-2018	93.00a	86.67a
LP206-2017	86.67b	79.00b	XY335-2017	91.00b	79.33b
						LP206-2016	84.33c	68.33c	XY335-2016	87.00c	74.33c
ZD958-2018	91.33a	81.00a	XY047-2018	93.33a	87.00a
						ZD958-2017	85.33b	76.33b	XY047-2017	90.33b	80.67b
ZD958-2016	82.33c	64.67c	XY047-2016	87.33c	70.67c

田间出苗率测定。

由表5可见，8个品种24个种子批的MFSE均表现出同品种3个种子批的种子质量水平排序为2018年种子批>2017年种子批>2016年种子批的趋势。

表5 24个种子批次田间出苗率测定结果。

种子批	田间出苗率-即墨（%）	田间出苗率-城阳（%）	田间出苗率-南滨（%）	平均田间出苗率（%）
					DH605-2018	90.33a	88.33a	89.33a	89.33a
DH605-2017	86.67b	85.67b	86.00b	86.11b
					DH605-2016	81.33c	79.00c	82.33c	80.89c
ND108-2018	87.67a	88.33a	89.00a	88.33a
					ND108-2017	85.67b	85.33b	87.00b	86.00b
ND108-2016	81.67b	79.67c	82.33c	81.22c
					LP206-2018	86.00a	85.33a	88.67a	86.67a
LP206-2017	84.67a	85.33a	86.33b	85.44a
					LP206-2016	78.33b	73.33b	81.67c	77.78b
ZD958-2018	88.00a	87.33a	86.67a	87.33a
					ZD958-2017	86.67b	85.00b	86.3a	85.99a
ZD958-2016	80.33c	78.33c	76.33b	78.33b
					DK517-2018	89.33a	90.33a	91.60a	90.42a
DK517-2017	87.33b	87.33b	88.00b	87.55b
					DK517-2016	82.67c	79.67c	83.33c	81.89c
DK007-2018	90.00a	89.33a	90.67a	90.00a
					DK007-2017	87.67b	86.00b	87.33b	87.00b
DK007-2016	82.67c	80.67c	83.67c	82.34c
					XY335-2018	92.67a	92.00a	93.67a	92.78a
XY335-2017	89.67b	88.67b	90.67b	89.67b
					XY335-2016	83.67c	82.33c	84.00c	83.33c
XY047-2018	93.33a	91.67a	90.67a	91.89a
					XY047-2017	88.33b	87.33b	87.33b	87.66b
XY047-2016	85.33c	85.00c	86.67b	85.67c

TRP, CRP和TRCRP比较分析。

如图7所示，4个萌发温度下，24个种子批间的TRP, CRP 和TRCRP变化曲线相似。TRP曲线随着萌发时间的增加呈先上升后下降的变化趋势。CRP与TRCRP曲线随着萌发时间的增加呈先不断增加后趋于平稳的变化趋势。

CRP、TRCRP在13±0.5℃，72 - 192 h、15±0.5℃，72 - 192 h、20±0.5℃，48 -108 h和25±0.5℃，48 - 108 h各时间点的数值均与MFSE呈显著或极显著相关（p<0.01）（表6）。从整体来看，CRP、TRCRP均可作为破裂测定种子活力指标。不同萌发温度相关系数不同，其中除13±0.5℃外，其余3个萌发条件在上述时间范围各时间点CRP、TRCRP与MFSE呈显著或极显著正相关（p<0.01）且r>0.9。

实际检测中发现13±0.5℃萌发条件下，耗时较长、萌发后期出现种子长菌发霉等问题，而这些问题在田间条件下可能不会发生，这一定程度影响了CRP、TRCRP与MFSE的相关度；25±0.5℃萌发条件下，萌发事件发生速度较快，特别是在比较同品种不同种子批差异时从TRP转为CRP时间间隔较短，检测要求操作速度更快，特别是影响了双指标联合评价（如：某一时间点同品种两个种子批A和B，二者的TRCRP均为90%，而CRP分别80%和60%故种子批A种子活力大于B，萌发速度过快，这种差异就难以区分）；综合考虑，本发明我们选择15±0.5℃和20±0.5℃作为破裂测定较适宜的萌发温度，其他萌发温度及评测方法还有待深入探索。

表6 TRP，CRP，TRCRP与MFSE相关性分析。

13℃

48h

72h

96h

120h

144h

168h

192h

TRP

0.000

0.476*

0.064

0.177

-0.367

0.063

-0.019

CRP

0.000

0.494*

0.806**

0.821**

0.806**

0.882**

0.896**

TRCRP

0.000

0.500*

0.834**

0.839**

0.740**

0.896**

15℃

48h

72h

96h

120h

144h

168h

192h

TRP

0.435*

0.615**

-0.232

-0.708**

0.000

CRP

0.000

0.752**

0.849**

0.917**

0.931**

TRCRP

0.435*

0.682**

0.916**

0.912**

0.931**

20℃

36h

48h

60h

72h

84h

96h

108h

TRP

0.677**

0.3

-0.552*

-0.321

0.601

0.122

0.000

CRP

0.000

0.589**

0.559**

0.916**

0.918**

0.920**

0.916**

TRCRP

0.677**

0.409**

0.519**

0.909**

0.904**

0.916**

25℃

24h

48h

72h

96h

120h

144h

168h

TRP

0.609**

0.686**

-0.277

-0.232

-0.349

0.000

CRP

0.000

0.827**

0.912**

0.969**

0.951**

0.956**

TRCRP

0.609**

0.750**

0.942**

0.961**

0.953**

0.956**

注: *和**分别表示相关性达到显著水平（p< 0.05）和极显著水平（p< 0.01）。

CRP 和TRCRP评价时间点的选择。

考虑到正常上班工作时间一般为：上午9:00-11:00，下午15:00-17:00，故考虑将萌发事件测定安排在工作时间内开展，包括后期也在工作时间内完成种子活力指标的测定。

故本发明时间安排如下。

1）在15±0.5℃下120 h:在设置测试后120 h±15 min（即5 d±15 min）计数。

2）在20±0.5℃下72 h:在设置测试后72 h±15 min（即3 d±15 min）计数。

在此基础上，结合品种差异、方便评价等因素，我们筛选出4个指标（CRP - 15℃,120 h 、TRCRP - 15℃, 120 h、CRP - 20℃, 72 h 和 TRCRP - 20℃, 72 h）作为萌发事件测定（破裂测定）的种子活力评价指标。

种子活力评价指标体系验证。

围绕上述4个指标（CRP - 15℃, 120 h、 TRCRP - 15℃, 120 h、CRP - 20℃, 72h 和 TRCRP - 20℃, 72 h）利用8个品种24个种子批再次进行破裂测定（RT）验证。

由表7可见，同品种的3个种子批间4个RT指标差异均显著，即同品种3个种子批的种子质量水平排序为2018年种子批>2017年种子批>2016年种子批，这与种子行业公认的其他测定方法测定结果一致。

表7 24个玉米种子批破裂测定结果。

种子批	CRP-15℃,120h(%)	TRCRP-15℃,120h(%)	CRP-20℃,72h(%)	TRCRP-20℃,72h(%)
					DH605-2018	90.00a	93.33a	90.33a	93.00a
DH605-2017	88.33b	89.67b	88.00b	90.33b
					DH605-2016	84.00c	87.00c	86.33c	88.00c
ND108-2018	88.33a	91.67a	90.00a	92.33a
					ND108-2017	85.33b	87.33b	86.33b	90.33b
ND108-2016	81.67c	83.67c	83.67c	87.00c
					LP206-2018	87.67a	90.00a	89.00a	91.33a
LP206-2017	83.33b	87.33b	85.33b	88.00b
					LP206-2016	78.00c	82.67c	80.00c	84.00c
ZD958-2018	87.00a	89.67a	89.67a	92.00a
					ZD958-2017	84.00b	85.00b	85.33b	86.33b
ZD958-2016	80.33c	83.33c	81.67c	83.67c
					DK517-2018	89.00a	90.33a	92.00a	92.00a
DK517-2017	83.67b	86.67b	88.33b	88.67b
					DK517-2016	79.00c	82.33c	85.00c	86.00c
DK007-2018	91.00a	91.67a	91.33a	92.33a
					DK007-2017	87.33b	88.33b	88.00b	90.33b
DK007-2016	83.00c	84.33c	85.67c	87.00c
					XY335-2018	92.67a	94.00a	93.67a	93.67a
XY335-2017	90.00b	90.33b	91.67b	91.33b
					XY335-2016	85.33c	87.67c	89.00c	88.33c
XY047-2018	91.67a	93.33a	92.33a	93.33a
					XY047-2017	88.33b	89.67b	89.00b	91.00b
XY047-2016	86.67c	87.33c	88.33b	88.33c

由表8可见，RT的4项指标与目前行业公认的种子活力指标标准发芽势、抗冷测定发芽率、加速老化发芽率均呈极显著正相关。

表8 4项RT指标及其他种子活力指标与平均田间出苗率相关性分析。

指标

A

B

C

D

E

F

G

A:CRP-15℃,120h

B:TRCRP-15℃,120h

0.961**

C:CRP-20℃,72h

0.935**

0.906**

D:TRCRP-20℃,72h

0.939**

0.956**

0.925**

E:GFC

0.917**

0.910**

0.964**

0.948**

F:CT

0.895**

0.916**

0.877**

0.979**

0.914**

G:AAT

0.841**

0.876**

0.781**

0.926**

0.844**

0.924**

H:MFSE

0.915**

0.890**

0.928**

0.915**

0.951**

0.886**

0.872**

注: *和**分别表示相关性达到显著水平（p<0.05）和极显著水平（p<0.01）。

由图8（A为CRP-15℃, 120 h与MFSE回归分析；B为TRCRP-15℃, 120 h与MFSE回归分析；C为CRP-20℃, 72 h与MFSE回归分析；D为TRCRP-20℃, 72 h与MFSE回归分析）可见，4个RT指标与MFSE关系密切。其中CRP-20℃，72 h与MFSE的R²值（R²=0.928；p<0.01）高于其他3个指标。

CRP和TRCRP联合评价：比较同品种不同种子批活力水平时，如果TRCRP差异不显著则比较同萌发条件下CRP，以进一步提高玉米种子批活力水平评价的精准度。

表9本发明的缩写标注汇总。

缩写	英文全称	中文全程
			AAT	accelerated aging test	加速老化测定
BP	between paper	纸间
			CR	coleorhiza rupture	胚根鞘破裂
CRP	coleorhiza rupture percentage	胚根鞘破裂率
			CT	cold test	抗冷测定
FSE	field seedling emergence	田间出苗率
			GFC	germination first count	发芽首次计数
GI	germination index	发芽指数
			GP	germination percentage	发芽率
MFSE	mean field seedling emergence	平均田间出苗率
			RT	rupture test	破裂测定
TR	testa-pericarp rupture	果种皮破裂
			TRP	testa-pericarp rupture percentage	果种皮破裂率
TRCRP	(testa-pericarp rupture + coleorhiza rupture) percentage	（果种皮破裂+胚根鞘破裂）率
			VI	vigour index	活力指数

综上所述，本发明首次利用2个相继发生的种子萌发质变事件（果种皮破裂和胚根鞘破裂）进行玉米种子活力萌发事件测定评价体系建设，体系包括研发了配套发芽装备、建立了种子活力评价标准等。本发明可广泛的应用于玉米种子活力测定等相关科研工作，在种子质量管理、种子生物学研究、实现良种化和种子质量标准化等方面具有极其重要的应用前景。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种玉米种子活力萌发事件测定方法，其特征在于包括（a）种子萌发事件的选择；（b）种子萌发床的选择；（c）种子萌发条件的选择；（d）萌发事件观测时间点的选择；（e）种子萌发配套装备的研发；（f）萌发事件测定评价体系的建立；所述作业（a）中，萌发事件为果种皮破裂和胚根鞘破裂；所述作业（b）中，选择纸间发芽方式进行种子活力萌发事件测定；所述作业（c）中，种子活力萌发事件测定温度为15℃和20℃；所述作业（d）中，萌发事件观测时间点为：15℃萌发120 h，20℃萌发72 h；所述作业（e）中，种子活力萌发事件测定配套种子萌发装备，其特征包括：塑料发芽盒（1）、盒盖（2）、盒体（3）、卡扣（4）、信息记录区（5）、密封条（6）、纸卷放置编号（7）、卡槽（8）、纸卷放置槽（9）、纸卷（10）、海绵条放置槽（11）、海绵条（12）、置盒底座（13）、置盒槽编号（14）、置盒槽（15）、防滑区（16）、发芽盒顶标识区（17）、发芽盒侧标识区（18）；所述作业（f）中，4个玉米种子活力萌发事件测定指标为：CRP - 15℃,120 h、TRCRP - 15℃, 120 h、CRP - 20℃, 72 h 和 TRCRP - 20℃, 72 h；利用种子萌发配套装备进行种子发芽，并利用4个玉米种子活力萌发事件测定指标中的任一一个或多个指标来评价玉米种子批的种子活力。

2.如权利要求1所述的一种玉米种子活力萌发事件测定方法，其特征在于：种子活力萌发事件测定配套种子萌发装备的塑料发芽盒（1）有盒盖（2）、盒体（3）、发芽盒顶标识区（17）、发芽盒侧标识区（18），盒盖（2）四周边缘有密封条（6）、侧面有两个卡扣（4），盒体3顶部有信息记录区（5）、纸卷放置编号（7）、内有纸卷放置槽（9）可放置纸卷（10）、侧面有两个卡槽（8）、底部有海绵条放置槽（11）可放置海绵条（12）；所述的置盒底座（13）外侧有置盒槽编号（14）、内有置盒槽（15）、两边有防滑区（16）。