CN111912917B - 一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法和应用。其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，水相为10‑150mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为5.0～6.2；水相与乙腈的体积比为(95:5)～(85:15)；流动相B为乙腈。本发明检测方法能够同时有效分离缩宫素及其十种杂质，具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测，解决目前国内外药典及文献中没有控制缩宫素特定杂质方法的技术问题。

Description

一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法和应用
技术领域
本发明涉及药物检测领域，更具体地，涉及一种缩宫素及至少十种杂质的检测方法。
背景技术
缩宫素又名催产素，是由8种氨基酸组成的九肽药物，分子式：C43H66N12O12S2，分子量1007.2，结构式：Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。它能够刺激子宫收缩和乳汁排出，临床上主要用于诱导促进分娩、缩短第三产程、控制产后出血等。
缩宫素对温度和pH比较敏感，因环境温度或pH的变化在制备和贮藏中都有可能生成杂质，如脱酰胺杂质、乙酰化杂质、三硫化物，缩宫素纯化过程浓溶液中易生成缩宫素二聚物。缩宫素生产工艺中主要工艺杂质和潜在降解杂质如表1所示。
不同种类的杂质引入药物成品中，将会导致不同的用药安全性问题。因此，在缩宫素原料合成阶段和制剂阶段都需要对这些有关物质的含量进行严格控制。但是，国内外药典(中国药典(2020版)、欧洲药典(EP9.8)、美国药典(USP41)和日本药典(JP17版))收载的缩宫素原料药及其注射液质量标准中，只对单杂和总杂的量有要求，不涉及任何特定杂质，也就是说上述药典中均未涉及表1中特定杂质检测方法或检测限度的要求。
表1缩宫素中潜在的12种有关物质
Figure BDA0002585219830000011
Figure BDA0002585219830000021
缩宫素有关物质相关的文献中，Andrea Hawe等(Andrea Hawe,Robert Poole,Stefan Romeijn,Piotr Kasper,Rob van der Heijden,and Wim Jiskoot.Towards heat-stable oxytocin formulations:Analysis of degradation kinetics andidentification of degradation products[J].Pharmaceutical Research,2009,26(7):1679-1688)考察了缩宫素制剂随温度和pH变化的降解情况，并对降解杂质进行鉴别，文章在磷酸盐缓冲液(pH 5.0)-乙腈的梯度流动相体系下实现缩宫素与脱酰胺缩宫素(杂质2、杂质4和杂质5)、缩宫素三硫化物(杂质10)、缩宫素聚合物(杂质10和杂质11)的分离，但此方法只能将缩宫素与[Glu4]缩宫素(杂质2)、[Gly9OH]缩宫素(杂质4)和[Asp5]缩宫素(杂质5)分离，三种杂质之间不能分离。
Ashenafi等(Ashenafi D,Van Hemelrijck E,Chopra S,et al.Liquidchromatographic analysis of oxytocin and its related substances[J].J PharmBiomed Anal,2009,51(1):24-29)在磷酸二氢钾缓冲液(pH 4.4)-乙腈的梯度流动相体系下考察了对卡贝缩宫素、乙酰化缩宫素和二聚体的分离情况(只涉及缩宫素与Ac-缩宫素(杂质9)、[Cis-dimer]缩宫素(杂质11)和[Trans-dimer]缩宫素(杂质12)的分离)。
上述文献中报道的方法均难以同时有效分离缩宫素中多种有关物质。因此，建立一种能够有效分离且尽可能多的检出缩宫素中有关物质的高效液相色谱法，对于缩宫素的精确质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中难以同时有效分离缩宫素中多种有关物质缺陷，提供了一种能够同时分离缩宫素及其十种杂质的分离方法和应用。本方法具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料药合成工艺和制剂工艺中过程质量控制和终产品的质量评价。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；所述高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，所述水相为10-150mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为5.0～6.2；所述水相与所述乙腈的体积比为(95:5)～(85:15)；流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 90-98 2-10
7 85-92 8-15
10 80-90 10-20
12 70-80 20-30
13 70-80 20-30
13.1 90-98 2-10
16 90-98 2-10
所述十种杂质为“杂质1、杂质2、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、杂质11和杂质12”或者“所述杂质1、所述杂质2、杂质3、杂质4、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质9、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12”；
其中，所述杂质1为[Glu4Asp5]缩宫素，所述杂质2为[Glu4]缩宫素，所述杂质3为[iso-Asp5]缩宫素，所述杂质4为[Gly9OH]缩宫素，所述杂质5为[Asp5]缩宫素，所述杂质6为[+Gly10]缩宫素，所述杂质7为[-Gly9]缩宫素，所述杂质8为缩宫素-Ac，所述杂质9为Ac-缩宫素，所述杂质10为[Trisulfide]缩宫素，所述杂质11为[Cis-dimer]缩宫素和所述杂质12为[Trans-dimer]缩宫素。
本发明中，所述杂质1为[Glu4Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质2为[Glu4]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质3为[iso-Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-iso-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质4为[Gly9OH]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(1,6二硫键)。
所述杂质5为[Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质6为[+Gly10]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质7为[-Gly9]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质8为缩宫素-Ac，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH-Ac(1,6二硫键)。
所述杂质9为Ac-缩宫素，结构式为Ac-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质10为[Trisulfide]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6-三硫键)。
所述杂质11为[Cis-dimer]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,1二硫键/6,6-二硫键)。
所述杂质12为[Trans-dimer]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键/1,6-二硫键)。
本发明，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度可为0.002～0.2mg/mL，优选0.01～0.1mg/mL，例如0.02mg/mL。
本发明，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度可为0.00002～0.2mg/mL，优选0.002～0.1mg/mL，例如0.001mg/mL。
本发明，所述高效液相色谱检测中，色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，例如Waters Xbridge C18色谱柱。所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格优选为150mm×4.6mm，5μm。
本发明中，优选，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 94-96 4-6
7 86-90 10-14
10 84-86 14-16
12 73-77 23-27
13 73-77 23-27
13.1 94-96 4-6
16 94-96 4-6
。
更优选，所述梯度洗脱条件如下所示：
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 95 5
7 88 12
10 85 15
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
。
本发明中，所述水相优选为80～120mmol/L磷酸二氢钠溶液，更优选为100mmol/L磷酸二氢钠溶液。
本发明中，所述水相的pH值优选为5.2～6，例如5.5。
本发明中，所述流动相A中，所述水相与所述有机相的体积分数总计为100份。所述水相与所述乙腈的体积比优选为(92:8)～(88:12)，更优选为90:10。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温可为28℃～40℃；优选为30℃～38℃；更优选为35℃。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速的流速优选为0.5-2.0mL/min，更优选为1.5mL/min。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的进样量可为10～100μL，优选为100μL。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，检测波长可为210-230nm，优选为220nm。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器可为紫外检测器或光电二极管阵列检测器。
在本发明一较佳实施方式中，提供了一种缩宫素及12种杂质的分离方法，所述12种杂质包括所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质9、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12；
所述分离方法包括以下步骤：
a.分别取适量缩宫素、所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12称定，加水溶解并稀释制成12份浓度均约为0.02mg/mL的溶液；取适量所述杂质9称定，加10％的乙腈水溶液溶解并稀释制成浓度约为0.02mg/mL的溶液；
b.每份溶液取100μL，按照所述高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间；所述高效液相色谱法的检测过程中，柱温为30～35℃，pH值为5.5～6.0；
c.配置缩宫素混合溶液，其中，缩宫素浓度为0.02mg/mL，杂质1-12的浓度分别为1μg/mL；
d.所述缩宫素混合溶液取样100μL，按照上述高效液相色谱法进行检测，根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间，观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质，各杂质之间的分离情况。
本发明还提供了一种所述缩宫素及至少十种杂质的分离方法在缩宫素和至少所述十种杂质的分析检测或含量测定中的应用。
本发明中，利用所述高效液相色谱的检测方法，对缩宫素和至少所述十种杂质进行分析检测或含量测定。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明高效液相色谱检测方法能够同时有效分离缩宫素及其十种杂质，具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测，解决目前国内外药典及文献中没有控制缩宫素特定杂质方法的技术问题，实现缩宫素生产工艺中主要工艺杂质和潜在降解杂质的精确控制，提高缩宫素产品的质量。
在优选条件下，本发明能够同时分离缩宫素及其12种杂质。
附图说明
图1和图2分别为对比例1的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图3和图4分别为对比例2的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图5为对比例3的缩宫素混合溶液检测的HPLC图。
图6和图7分别为对比例4的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图8为对比例5的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图9和图10分别为对比例6的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图11和图12分别为实施例1的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图13和图14分别为实施例2的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图15和图16分别为实施例3的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图17和图18分别为实施例4的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图19和图20分别为实施例5的缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。
图21和图22分别为实施例6的缩宫素制剂检测的HPLC完整图、局部放大图。
图23和图24分别为实施例7的缩宫素原料药检测的HPLC完整图、局部放大图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中，产品的来源和型号如下：
乙腈为HPLC级，购自Fisher公司；
无水磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸均为AR级，购自国药集团化学试剂有限公司；
缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp)，批号323838；购于帕尔制药有限公司(Par Pharmaceutical Inc)。
缩宫素原料按照中国专利文献CN 110016072A一种缩宫素的精制方法进行精制获得。
杂质1按照中国专利文献CN 110078796A一种缩宫素[4-Glu,5-Asp]杂质的精制方法进行精制获得。
杂质2按照中国专利文献CN 110078797A一种缩宫素[4-Glu]杂质的精制方法进行精制获得。
杂质3和杂质5按照中国专利文献CN 110041405A一种缩宫素[5-Asp]杂质的精制方法进行精制获得。
杂质4按照中国专利文献CN 110028556A一种缩宫素[-NH2]杂质的精制方法进行精制获得。
杂质6(批号：OP021919YH-018)、杂质7(批号：OP021919YH-017)、杂质8(批号：OP021919YH-010)、杂质9(批号：OP021919YH-009)、杂质10(批号：OP021919YH-021)、杂质11(批号：OP021919YH-019)和杂质12(批号：OP021919YH-020)购自浙江昂拓莱斯生物技术有限公司。
实施例中，所使用的仪器型号及来源如下：
1260Infinity高效液相色谱仪(美国，Agilent)；Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)；XS205DU分析天平(瑞士，Mettler-Toledo)；AL204分析天平(瑞士，Mettler-Toledo)；FiveEasy pH计(瑞士，Mettler-Toledo)。
实施例中，所使用的数据处理软件为Chemstation化学工作站。
对比例1
本对比例采用中国药典(2020版)/欧洲药典(EP9.8)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种杂质的分离情况。
实验条件如下所示。其中，本实验中柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择(在中国药典中并未提及柱温和色谱柱类型，欧洲药典中规定色谱柱长125mm)，其它实验条件均按照中国药典或欧洲药典进行。
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：30℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。中国药典或者欧洲药典中，均未对流动相A进行调节pH值，仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A，其pH值为4.4。
流速：1.0ml/min。
检测波长：220nm
梯度如表2所示：
表2对比例1的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 70 30
30 40 60
30.1 70 30
45 70 30
进样量：100μL。
检测器：紫外检测器
1、样品配制及检测：分别取适量缩宫素原料、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质10、杂质11和杂质12称定，加水溶解并稀释制成12份浓度均约为0.02mg/mL的溶液；取适量杂质9称定，加10％乙腈水溶液溶解并稀释制成浓度约为0.02mg/mL的溶液。
每份溶液取100μL，照对比例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素原料20mg，置于50mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到0.4mg/mL缩宫素溶液；量取0.4mg/mL的缩宫素溶液和步骤1制得的0.02mg/mL的各杂质溶液各1mL，置同一20mL容量瓶中，用水稀释并定容，摇匀，得到每1mL约含缩宫素0.02mg及各杂质分别1μg的溶液，即为缩宫素混合溶液。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图1，其放大图如图2所示。
实验结果：图1和图2分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为8.736min的色谱峰是缩宫素峰，其余8个为杂质峰，其归属如表3所示。杂质2、杂质4和杂质6色谱峰重合；杂质8和杂质10部分重合，分离度为0.5；杂质1和杂质5的保留时间与缩宫素相近，色谱峰与缩宫素重合，未检出。本对比例色谱方法分析时间长，为45min，可检出8种(混合溶液色谱图中有8个色谱峰与单独进样的杂质色谱峰对应，称之为8种杂质可以检出)缩宫素有关物质。
表3缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 6.915 杂质3
2 8.375 杂质2、4、6
3 8.736 缩宫素、杂质1、5
4 9.093 杂质7
5 11.048 杂质8
6 11.203 杂质10
7 13.318 杂质11
8 13.640 杂质9
9 15.407 杂质12
对比例2
本对比例采用美国药典(USP41)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种杂质的分离情况。
实验条件如下所示。其中，本实验柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择，美国药典中并未提及(美国药典中提及柱温用室温，色谱柱用C18色谱柱(5μm，4.6mm×120mm)，流速约1.5ml/min，可作调整)，其它实验条件均按照美国药典进行。
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：25℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。美国药典中，未对流动相A进行调节pH值，仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A，其pH值为4.4。
流速：1.0mL/min。
梯度如表4所示：
表4对比例2的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 70 30
20 50 50
25 0 100
30 0 100
30.1 70 30
40 70 30
进样量：100μL。
检测器：紫外检测器
检测波长：220nm
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图3，其放大图如图4所示。
实验结果：图3和图4分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.909min的色谱峰是缩宫素峰，其余7个为杂质峰，其归属如表5所示。杂质4和杂质6色谱峰重合；杂质8和杂质10色谱峰重合；杂质1、杂质2和杂质5的保留时间与缩宫素相近，色谱峰与缩宫素重合，未检出。本对比例色谱方法分析时间为40min，可检出7种缩宫素有关物质(混合溶液中只检出7个杂质峰)。
表5缩宫素混合溶液色谱峰归属
Figure BDA0002585219830000101
Figure BDA0002585219830000111
对比例3
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A、流动相B采用中国、欧洲或美国药典中公开的流动相以外，其它操作和条件均与实施例1相同，采用如实施例1中的洗脱程序，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种有关物质的分离情况。实验条件如下：
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：35℃
检测波长：220nm
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，其pH值为4.4；流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。
流速：1.5ml/min。
梯度如实施例1的洗脱程序
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图5。
实验结果：
图5为缩宫素混合溶液检测的HPLC图，缩宫素及其12种有关物质均未被检出。本对比例色谱条件下，缩宫素及其12种有关物质均难以从色谱柱中洗脱出来。
对比例4
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝4.4)：乙腈＝90:10的混合溶液以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种有关物质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝4.4)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图6，其放大图如图7所示。
实验结果：图6和图7分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为6.012min的色谱峰是缩宫素峰，其余7个为杂质峰，其归属如表6所示。12种缩宫素有关物质只检出7个色谱峰，杂质4和杂质6色谱峰重合；杂质8和杂质10色谱峰重合；杂质1、杂质2和杂质5的保留时间与缩宫素相近，色谱峰与缩宫素重合，未检出。本对比例色谱方法中流动相A水相pH为4.4，其他条件与实施例1相同，可检出缩宫素中潜在的7种有关物质。
表6缩宫素混合溶液色谱峰归属
Figure BDA0002585219830000121
对比例5
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.5)：乙腈＝80:20的混合溶液以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种有关物质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.5)：乙腈＝80:20的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图8。
实验结果：图8为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为1.888min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个为杂质峰。由于缩宫素及12种有关物质过早的从色谱柱中洗脱出来，保留时间相近，相互间不能有效分离。
对比例6
本对比例中与实施例1相比，除了洗脱程序以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其12种有关物质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：洗脱程序如表7，其他条件与实施例1相同。
表7对比例6的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 88 12
7 84 16
10 82 18
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例6实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例6实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图9，其放大图如图10所示。
实验结果：图9和图10分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为2.865min的色谱峰是缩宫素峰，其余标注保留时间的5个色谱峰为杂质峰，本对比例色谱方法中洗脱程序不在本发明权1范围内，其它均与实施例1相同，可检出缩宫素中潜在的5种有关物质。
实施例1
本实施例为缩宫素及其12种有关物质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)
柱温：35℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.5)：乙腈＝90:10的混合溶液，流动相B为乙腈。
流速：1.5mL/min。
梯度如表8所示：
表8实施例1的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 95 5
7 88 12
10 85 15
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
进样量：100μL。
检测器：紫外检测器
检测波长：220nm
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱11，其放大图如图12所示。
实验结果：图11和图12分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.173min的色谱峰是缩宫素峰，其余12个为杂质峰，其归属如表9所示。12种缩宫素有关物质均被检出，缩宫素与杂质，杂质和杂质均可以有效分开，最小分离度为1.1。本实施例色谱方法分析时间短，为16min，可检出缩宫素中潜在的12种有关物质。
表9缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 4.324 杂质1
2 5.541 杂质2
3 5.705 杂质3
4 5.875 杂质4
5 6.217 杂质5
6 6.761 杂质6
7 7.173 缩宫素
8 7.622 杂质7
9 8.704 杂质8
10 9.008 杂质9
11 9.601 杂质10
12 10.920 杂质11
13 12.459 杂质12
实施例2
本实施例为柱温30℃条件下缩宫素及其12种有关物质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：柱温为30℃，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱13，其放大图如图14所示。
实验结果：图13和图14分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.158min的色谱峰是缩宫素峰，其余12个为杂质峰，其归属如表10所示。12种缩宫素有关物质均被检出，其中杂质2和杂质3分离度最小，为0.7；缩宫素与其他杂质，其他杂质之间均可实现有效分离。本实施例可检出缩宫素中潜在的12种有关物质。
表10缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 4.337 杂质1
2 5.551 杂质2
3 5.672 杂质3
4 5.978 杂质4
5 6.257 杂质5
6 6.760 杂质6
7 7.158 缩宫素
8 7.578 杂质7
9 8.676 杂质8
10 9.132 杂质9
11 9.501 杂质10
12 10.717 杂质11
13 12.344 杂质12
实施例3
本实施例为柱温40℃条件下缩宫素及其12种有关物质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：柱温为40℃，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱15，其放大图如图16所示。
实验结果：图15和图16分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.187min的色谱峰是缩宫素峰，其余11个为杂质峰，其归属如表11所示。12种缩宫素有关物质中可检出11种，其中杂质3和杂质4重合，杂质8和杂质9分离度最小，为0.8；缩宫素与其他杂质，其他杂质之间均可实现有效分离。
本实施例色谱方法柱温为40℃，其他条件与实施例1相同，可检出缩宫素中潜在的11种有关物质。
表11缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 4.294 杂质1
2 5.544 杂质2
3 5.769 杂质3和4
4 6.188 杂质5
5 6.767 杂质6
6 7.187 缩宫素
7 7.660 杂质7
8 8.741 杂质8
9 8.891 杂质9
10 9.694 杂质10
11 11.103 杂质11
12 12.548 杂质12
实施例4
本实施例为流动相A的pH＝5.0条件下缩宫素及其12种有关物质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.0)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱17，其放大图如图18所示。
实验结果：图17和图18分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为6.416min的色谱峰是缩宫素峰，其余11个为杂质峰，其归属如表12所示。12种缩宫素有关物质中可检出11种，其中杂质5和杂质6重合，杂质4和杂质5分离度最小，为0.8；缩宫素与其他杂质，其他杂质之间均可实现有效分离。
本实施例色谱方法中流动相A水相pH为5.0，其他条件与实施例1相同，可检出缩宫素中潜在的11种有关物质。
表12缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 4.858 杂质1
2 5.098 杂质2
3 5.392 杂质3
4 5.748 杂质4
5 5.923 杂质5、6
6 6.416 缩宫素
7 6.743 杂质7
8 7.905 杂质8
9 8.392 杂质9
10 9.040 杂质10
11 9.671 杂质11
12 11.088 杂质12
实施例5
本实施例为流动相A为pH＝6.0条件下缩宫素及其12种有关物质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝6.0)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱19，其放大图如图20所示。
实验结果：图19和图20分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.758min的色谱峰是缩宫素峰，其余12个为杂质峰，其归属如表13所示。12种缩宫素有关物质均被检出，杂质3和杂质4分离度最小，为0.9；缩宫素与其他杂质，其他杂质之间均可实现有效分离。
本实施例色谱方法中流动相A水相pH为6.0，其他条件与实施例1相同，可检出缩宫素中潜在的12种有关物质。
表13缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 保留时间/min 杂质归属
1 4.424 杂质1
2 5.838 杂质2
3 6.066 杂质3
4 6.225 杂质4
5 6.617 杂质5
6 7.323 杂质6
7 7.758 缩宫素
8 8.277 杂质7
9 8.996 杂质8
10 9.321 杂质9
11 10.304 杂质10
12 11.770 杂质11
13 12.829 杂质12
实施例6
本实施例为缩宫素制剂有关物质检测实施例
采用与实施例1相同的实验条件，对缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp)有关物质进行测定。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素制剂(批号323838)100μL(市售缩宫素制剂为10IU/ml，折算成质量浓度约为0.02mg/ml，可直接作为待测样品进样)，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱21，其放大图如图22。
图21和图22分别为缩宫素制剂检测的HPLC完整图、局部放大图。根据实施例1中步骤1中缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间7.149min的色谱峰是缩宫素峰，保留时间5.528min的色谱峰是杂质2，保留时间5.911min的色谱峰是杂质4，保留时间6.218min的色谱峰是杂质5，保留时间9.043min的色谱峰是杂质9。保留时间1～2min的色谱峰峰为溶剂峰(醋酸)，12～14min的色谱峰为三氯叔丁醇(缩宫素制剂中的辅料，防腐剂)，这两个色谱峰不计入积分。按面积归一化法计算，缩宫素制剂有关物质含量结果如表14所示。
表14缩宫素制剂有关物质结果
批号 杂质2(％) 杂质4(％) 杂质5(％) 杂质9(％) 总杂(％)
323838 3.2 3.4 0.7 0.6 7.9
上述百分比为缩宫素制剂中各组分相对于缩宫素的质量百分比。
实施例7
本实施例为缩宫素原料有关物质检测实施例。
采用与实施例1相同的实验条件，对缩宫素原料有关物质进行测定。
1、13份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素原料20mg，置于50mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到0.4mg/mL缩宫素溶液。量取缩宫素溶液1mL，置一20mL容量瓶中，用水稀释并定容，摇匀，得到每1ml约含缩宫素0.02mg的溶液，即缩宫素溶液，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱23，其放大图如图24。
图23和图24分别为缩宫素原料药检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质色谱保留时间，图中保留时间7.102min的色谱峰是缩宫素峰，保留时间9.129min的色谱峰是杂质9，保留时间9.438min的色谱峰是杂质10，保留时间12.318min的色谱峰是杂质12，峰面积小于缩宫素峰面积千分之一的色谱峰不计入积分。按面积归一化法计算，缩宫素原料药有关物质含量结果如表15所示。
表15缩宫素制剂有关物质结果
/ 杂质9(％) 杂质10(％) 杂质12(％) 总杂(％)
缩宫素原料 0.3 0.2 0.2 0.7
上述百分比为缩宫素原料中各组分相对于缩宫素的质量百分比。
实施例8
灵敏度试验
采用与实施例1相同的实验条件进行实验。
1、分别取适量缩宫素原料、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质10、杂质11和杂质12精密称定，加水溶解并稀释制成12份浓度均约为0.02mg/ml的溶液；
2、取适量杂质9精密称定，加浓度为10％乙腈水溶液溶解并稀释制成浓度约为0.02mg/mL的溶液；
3、取浓度为0.02mg/mL的缩宫素原料、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、杂质11和杂质12溶液各1mL，置于同一100mL量瓶中，用水稀释定容，得到缩宫素及各杂质浓度均为0.2μg/mL的混合溶液。将混合溶液用水逐步稀释，得到各组分浓度分别为0.04μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL的混合溶液。
4、照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，获得的色谱图中，杂质峰高约为基线噪音高的3-5倍，则此时溶液的浓度即为组分的检测限；获得的色谱图中，杂质峰高约为基线噪音高的10-20倍，则此时溶液的浓度即为组分的定量限。缩宫素及其12种有关物质的检测限及定量限如表16所示，说明本方法灵敏度高。
表16缩宫素及其12种有关物质的检测限及定量限
组分 检测限ng 定量限ng
杂质1 1.2 2.3
杂质2 1.2 2.3
杂质3 1.0 1.9
杂质4 0.8 1.6
杂质5 1.2 2.4
杂质6 1.3 2.5
缩宫素 1.2 2.5
杂质7 1.0 1.9
杂质8 0.9 1.9
杂质9 1.3 2.5
杂质10 0.8 1.5
杂质11 2.0 4.0
杂质12 3.3 6.5

Claims (14)

1.一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；所述高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，所述水相为10-150 mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为5.0~6.2；所述水相与所述乙腈的体积比为90: 10；流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
Figure 281079DEST_PATH_IMAGE001
；
所述十种杂质为“杂质1、杂质2、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、杂质11和杂质12”或者“所述杂质1、所述杂质2、杂质3、杂质4、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质9、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12”；
其中，所述杂质1为[Glu4Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质2为[Glu4]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质3为[iso-Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-iso-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质4为[Gly9OH]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(1,6二硫键)，所述杂质5为[Asp5]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质6为[+Gly10]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质7为[-Gly9]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-NH2(1,6二硫键)，所述杂质8为缩宫素-Ac，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH-Ac(1,6二硫键)，所述杂质9为Ac-缩宫素，结构式为Ac-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)，所述杂质10为[Trisulfide]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6-三硫键)，所述杂质11为[Cis-dimer]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,1二硫键/6,6-二硫键)和所述杂质12为[Trans-dimer]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键/1,6-二硫键)；
所述高效液相色谱检测中，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
2.如权利要求1所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.002~0.2 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.00002~0.2 mg/mL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，色谱柱为Waters Xbridge C18色谱柱。
3. 如权利要求2所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.01~0.1 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.002~0.1mg/mL。
4. 如权利要求2所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.02 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.001 mg/mL。
5.如权利要求1所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为150mm×4.6mm，5μm。
6. 如权利要求1所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述水相为80~120 mmol/L磷酸二氢钠溶液；
和/或，所述水相的pH值为5.2~6。
7. 如权利要求6所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述水相为100 mmol/L磷酸二氢钠溶液；
和/或，所述水相的pH值为5.5。
8.如权利要求1所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为28℃~40℃；
和/或，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速的流速为0.5-2.0 mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的进样量为10~100 μL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，检测波长为210-230 nm；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器为紫外检测器。
9.如权利要求8所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器为光电二极管阵列检测器。
10.如权利要求8或9所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为30℃~38℃；
和/或，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速的流速为1.5 mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的进样量为100 μL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，检测波长为220 nm。
11.如权利要求10所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为35℃。
12.如权利要求1所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法，其特征在于，所述的缩宫素及12种杂质的分离方法包括以下步骤：
所述12种杂质包括所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质9、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12；
所述分离方法包括以下步骤：
a.分别取适量缩宫素、所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7、所述杂质8、所述杂质10、所述杂质11和所述杂质12称定，加水溶解并稀释制成12份浓度均为0.02 mg/mL的溶液；取适量所述杂质9称定，加乙腈水溶液溶解并稀释制成浓度为0.02 mg/mL的溶液；
b.每份溶液取100 µL，按照所述高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间；所述高效液相色谱法的检测过程中，柱温为30~35℃，pH值为5.5~6.0；
c.配置缩宫素混合溶液，其中，缩宫素浓度为0.02 mg/mL，杂质1-12的浓度分别为1 µg/mL；
d.所述缩宫素混合溶液取样100 µL，按照步骤b中所述高效液相色谱法进行分离检测，根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间，观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质，各杂质之间的分离情况。
13.一种如权利要求1~12任一项所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法在缩宫素和至少所述十种杂质的分析检测中的应用。
14.一种如权利要求1~12任一项所述的缩宫素及至少十种杂质的分离方法在缩宫素和至少所述十种杂质的含量测定中的应用。
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