CN111909155A - 蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及应用。该技术方案基于ribociclib衍生物和CRBN配体，开发了一种新型PROTAC降解剂化合物。小分子能同时有效地降解恶性黑色素瘤中CDK2/4/6及其复合物；还能迅速重置细胞周期，诱导各种癌细胞，特别是黑色素瘤细胞凋亡。其机制应解释为在该化合物存在下，CDK 2/4/6缺乏可能导致恶性黑色素瘤的合成致死作用。这些结果表明，CDK2/4/6的结合有望成为治疗实体肿瘤的激酶靶点。此外，本发明还首次开发了一种口服生物利用度高的前药，便于动物试验中的口服给药。它为具有CRBN配体PROTAC分子的口服给药提供了通用的解决方案。

Description

蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及 应用

技术领域

本发明涉及化学技术领域，进一步涉及化学合成技术及药物化学技术，具体涉及一种蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及应用。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)是调节真核细胞***和细胞增殖的关键细胞酶。CDKs催化单元被调节亚基，即细胞周期蛋白激活。目前已鉴定出16种哺乳动物细胞周期蛋白，其中Cyclin B/CDK1、Cyclin A/CDK2、Cyclin E/CDK2、Cyclin D/CDK4和Cyclin D/CDK6是细胞周期进展的重要调控因子。细胞周期蛋白/CDKs的其他功能(如转录调节、DNA修复、分化和凋亡)也被报道。

CDKs活性增强或暂时异常激活导致多种肿瘤的发生。因此，细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂在治疗癌症中已被认为是很有效的。具体而言，CDK4/6抑制剂作为单一药物或与其他治疗药物联合使用，在特定的乳腺癌等癌症中表现出显著的疗效。例如，palbociclib和ribociclib已被FDA批准用于联合芳香化酶抑制剂治疗HR阳性和HER2阴性晚期或转移性乳腺癌。但是，随着原发性或获得性耐药性的发展，CDK4/6抑制剂的使用受到限制。

最近的研究表明，CDK2及其与细胞周期蛋白复合物的过度表达与细胞周期的异常调控密切相关。cyclin E/CDK2复合物是调节G1/S转变、组蛋白生物合成和中心体复制的关键。通过cyclin D/CDK4/6和cyclin E/CDK2对Rb的进行磷酸化，释放G1转录因子E2F，可显著促进进入S期。S期早期cyclin A/CDK2的激活也促进DNA复制和E2F失活以完成S期。Cyclin E是指具有CDK2的调节性细胞周期蛋白。最近的研究也报道了cyclin E/CDK2抑制恢复乳腺癌细胞对三苯氧胺或CDK4/6抑制剂的敏感性。CDK2的扩增或过表达长期以来与乳腺癌和其他类型的癌症中的不良预后有关。

众所周知，目前尚无批准的靶向CDK2的药物。但是，临床上仅有正在开发抑制CDK1/2/5/9的Dinaciclib(MK-7965)和CDK2/7/9的Seliciclib(CYC202)用于治疗晚期肿瘤的单一试剂和联合化疗。最近，辉瑞公司的PF069736(一种CDK2/4/6抑制剂)已进入I期临床研究。总之，针对CDK2的联合疗法在医药领域引起了极大的关注。在这一阶段，一种新的化疗策略被提出，即同时化学敲除CDK2/4/6来***。

Craig.Crews最早提出了PROTAC概念。PROTAC(蛋白水解靶向嵌合体)是通过适当的Linker缀合的异双功能小分子。它们可以将靶蛋白拖至接近E3连接酶的位置，从而导致蛋白酶体降解靶蛋白。到目前为止，PROTAC技术已成为化学降解特定蛋白质以***的重要工具。例如FLT3，AR，MDM2，CDK6，CDK9，BRD，BET，ALK，PARP-1等，已经开发成为PROTAC分子。

然而，大多数先前报道的PROTAC分子只降解一个靶点。PROTAC分子能够同时减轻多个蛋白质的蛋白酶体下调，目前还很少有文献报道。此外，具有CRBN配体的PROTAC分子的口服生物利用度普遍较差，导致此类药物难以通过口服方式给药。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及应用，以解决目前PROTAC分子无法同时降解CDK2/4/6并诱导癌细胞凋亡的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是，如何开发一种对黑色素瘤具有显著疗效的新型PROTAC分子。

本发明要解决的再一技术问题是，具有CRBN配体的PROTAC分子，其口服生物利用度普遍较差。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

蛋白水解靶向嵌合体，其分子结构如式(1)所示：

式(I)中，Linker为任一化学上可行的连接结构。

提高蛋白水解靶向嵌合体口服生物利用度的前药分子，其分子结构如式(II)所示：

式(II)中，Linker为任一化学上可行的连接结构；

R基团为磷酸基衍生物或氧羰基衍生物。

作为优选，Linker为饱和脂肪链、不饱和脂肪链、饱和聚醚链、不饱和聚醚链或脂肪酸链。

作为优选，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIa)所示：

式(IIa)中，n＝0、1、2、3、4、5或6。

作为优选，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIb)所示：

式(IIb)中，n＝1、2、3、4、5或6。

作为优选，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIc)所示：

式(IIc)中，n＝1、2、3、4、5或6；

X为O、N或S。

作为优选，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(III)所示：

作为优选，该前药分子的分子结构如式(IV)所示：

式(IV)中，R选自以下任一基团：氢，碳原子数为1～8的烷基，碳原子数为5～8的环烷基，碳原子数为2～7的烷基炔基，碳原子数为1～3的烷基酯基，取代芳基，烷基-C(O)-NH-芳基，-CH＝CH-烷基，-CH＝CH-烷基-二甲胺基，-CH＝CH-酯基，-CH＝C-(Ph)2，-CH＝CH-芳基，-NH-芳基，-C(O)-NH-(CH2)-NH-S(O)-NH-芳基。

作为优选，该前药分子的分子结构如式(V)所示：

在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述蛋白水解靶向嵌合体或上述前药分子用于制备癌症治疗药物的应用。

在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述蛋白水解靶向嵌合体的任一药学上可接受的盐或上述前药分子的任一药学上可接受的盐用于制备癌症治疗药物的应用。

作为优选，所述癌症为黑色素瘤。

作为优选，所述药物的剂型为口服剂。

本发明合成并筛选了一种新的化合物，该化合物是通过将ribociclib的衍生物与pomalidomide连接得到的。这种PROTAC分子可以在各种癌细胞中降解。它还下调了Rb的磷酸化，在体外和体内都表现出有效的抗恶性黑色素瘤的增殖作用。

本发明基于ribociclib衍生物结构所开发的新型PROTAC分子，作为降解剂，在恶性黑色素瘤细胞中，不仅能有效降解CDK2/4/6，而且能显著诱导黑色素瘤细胞周期重置和凋亡。此外，本发明首次开发了可口服生物利用的前药，它为具有CRBN配体PROTAC分子的口服给药提供了通用的解决方案，便于动物实验。

本发明提供了一种蛋白水解靶向嵌合体、提高其口服生物利用度的前药分子及应用。该技术方案基于ribociclib衍生物和CRBN配体，开发了一种新型PROTAC降解剂化合物。小分子能同时有效地降解恶性黑色素瘤中CDK2/4/6及其复合物；还能迅速重置细胞周期，诱导各种癌细胞，特别是黑色素瘤细胞凋亡。其机制应解释为在该化合物存在下，CDK 2/4/6缺乏可能导致恶性黑色素瘤的合成致死作用。这些结果表明，CDK2/4/6的结合有望成为治疗实体肿瘤的激酶靶点。此外，本发明还首次开发了一种口服生物利用度高的前药，便于动物试验中的口服给药。它为具有CRBN配体PROTAC分子的口服给药提供了通用的解决方案。

附图说明

图1是本发明化合物3的¹H NMR光谱图；

图2是本发明化合物3的¹³C NMR光谱图；

图3是本发明化合物3通过阻断E3泛素连接酶CRBN而减轻CDK2/4/6蛋白降解和抑制下游Rb信号传导的试验结果图；

图4是本发明化合物3对恶性黑色素瘤细胞菌落形成的抑制作用试验结果图；

图5是本发明化合物3诱导恶性黑色素瘤癌细胞凋亡的试验结果图；

图6是本发明化合物3以半胱氨酸蛋白酶依赖性的方式诱导细胞凋亡的试验结果图；

图7是化合物3对肿瘤细胞周期进展的影响试验结果图；

图8是本发明化合物11的¹H NMR光谱图；

图9是本发明化合物11的¹³C NMR光谱图；

图10是本发明化合物11在大鼠体内的PK研究结果图；

图11是本发明化合物11和化合物3对B16F10肿瘤生长延迟和体内回归的影响试验结果图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

1、PROTAC分子设计与化合物3的合成

ribociclib1的结构被认为是CDKs的结合部分，因为它对CDK4/6具有很高的结合能力。然而，ribociclib1对CDK2无抑制作用。在合成和筛选合适的类似物方面做出了很大的努力。幸运的是，通过对ribociclib的直接结构修饰所得的核心结构2，展示了CDK2的增强效力。激酶活性测定结果表明，化合物2虽然与CDK4/6的亲和力略有下降，但对CDK2的结合能力有显著提高。因此，假设以酰胺基形式连接的扩展连接体对CDK2/4/6的结合作用最小。以下分别为ribociclib 1和其衍生物2的结构：

表1.ribociclib 1和类似物2的激酶活性

按照设计PROTAC分子的原理，合成了23种化合物。经过仔细筛选，化合物3被证明是降解多种肿瘤细胞中CDK 2/4/6最有效的化合物，具有显著的肿瘤生长抑制作用。对照实验表明，ribociclib、沙利度胺或它们在等当量时的联合作用不能诱导癌细胞CDK 2/4/6断裂或诱导癌细胞凋亡。

化合物3的合成方法简单、高效。一方面，主核2是商用材料4和5在Buchwald耦联条件下得到的。再通过甲酯水解反应得到羧酸6作为偶联前体。另一方面，由市售起始原料7和8制备的2-氟-沙利度胺9在碱性条件下与正-Boc-己烷-1,6-二胺反应生成酰胺10。通过TFA去除Boc保护基，然后与中间体6进行酰胺偶联，得到了中等收率的化合物3。其合成路线如下：

反应试剂和条件:a Pd(OAc)₂,BINAP,Cs₂CO₃,dioxane,reflux,79％；b LiOH,THF/H₂O,rt,98％；c AcONa,HOAc,reflux,80％；d N-Boc-hexane-1,6-diamine,DIPEA,DMF,80℃,55％；e TFA,CH₂Cl₂,0℃ to rt；f compound 6,EDCI,HOBt,DIPEA,MeCN,rt,43％over2steps。

化合物3的¹H NMR光谱和¹³C NMR光谱分别如图1、图2所示。

2、化合物3性能试验

对于所有的PROTACs，用标准MTT法检测对一组癌细胞系中细胞活力的影响。以Ribociclib(RIB)、pomalidomide(POM)及其混合物作为对照。化合物3对广谱人类癌细胞系(如以下表2所示)具有显著的抗增殖活性，尤其是对黑色素瘤(如以下表3所示)。B16F10和A375的IC₅₀分别为0.09761±0.021和0.1659±0.150。

表2.化合物3对癌细胞系增殖的影响

表3.化合物3对黑色素瘤细胞的细胞毒性活性

IC50>10μmol/L无明显抑制作用；IC₅₀由三个独立实验测定。MTT法检测化合物3在

72h后的细胞毒作用。

随后，测试化合物3在黑色素瘤细胞中的CDK2/4/6降解(图3)。据报道，化合物3以浓度依赖和时间依赖的方式诱导所有CDK 2、CDK 4和CDK 6蛋白的显著细胞内裂解(图3A和3B)。它还有效地减轻了黑色素瘤细胞下游p-Rb信号通路的激活(图3A和3B)。为了验证化合物3处理的CDK2/4/6的裂解作用是否为PROTAC介导的降解，首先用泊马度胺、MG132和化合物2预处理B16F10细胞(图3C)。CDK2、4和6的降解作用完全受阻。值得注意的是，用ribociclib预处理后，CDK4/6降解被显著抑制，而CDK2则正常下调。这些结果与本发明最初的发现和设计是一致的。

图3中，(A)化合物3显著下调CDK2/4/6蛋白水平，并以浓度依赖方式抑制Rb下游信号传导。B16F10和A375细胞用DMSO或化合物3的系列稀释液处理12h。(B)化合物3下调CDK2/4/6蛋白，并以时间依赖方式抑制p-Rb下游信号传导。用DMSO或化合物3处理B16F10和375细胞，使其达到指定的时间长度。(C)化合物3诱导的CDK2/4/6蛋白降解为蛋白酶体降解。在用100nm化合物3处理6h前，用DMSO、Pomalidomide(10μM)、MG132(20μM)预处理2h，westernblot检测CDK2/4/6蛋白。

为了从生物学上评估化合物3对两个黑色素瘤癌细胞(A375和B16F10)的抗增殖活性，进行了菌落形成试验(图4)。化合物3在低纳摩尔浓度下对两种恶性黑色素瘤细胞A375和B16F10的集落形成有明显的抑制作用。

图4通过菌落形成试验验证了化合物3对A375和B16F10细胞增殖能力的影响。其中，(A)化合物3连续作用7天后A375和B16F10细胞长期生长测定的代表性图像。(B)克隆形成性生长的定量分析：学生的T-test；平均值±SD，n＝3。**p<0.01；***p<0.001。

在显微镜下观察到化合物3对A375和B16F10细胞凋亡的影响，将B16F10和A375细胞单独用载体作为对照，用不同浓度的3处理48小时；然后用FITC膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色。通过流式细胞术确定凋亡的B16F10和A375细胞的百分比。图5A和5B表明化合物3以剂量依赖性的方式显著诱导A375和B16F10细胞凋亡。

图5中，(A)不同浓度化合物3诱导的凋亡A375和B16F10细胞的流式细胞术分析。(B)凋亡定量分析图示A.学生的T-test；平均值±SD,n＝3.*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

为探讨化合物3诱导细胞凋亡的可能机制，用westernblot方法检测了A375和B16F10细胞中与细胞死亡相关的几种蛋白(如PARP、Caspase-3、Bax、Bcl-2和P53)。图6表明，细胞凋亡的两个重要标志是Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP，在剂量依赖性的情况下被显著上调.同时，化合物3还显著诱导P-53和Bax的前蛋白水平上调。而化合物3治疗后Bcl-2的抗凋亡蛋白水平下调。总的来说，化合物3通过常见的P53/Bcl-2/Bax凋亡途径诱导黑色素瘤细胞Caspase依赖性凋亡。

图6中，将A375和B16F10细胞与化合物3共孵育48h，Western blot实验检测了Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2及P-53的表达量。以β-肌动蛋白作为内对照。

为了验证化合物3的细胞毒性活性是否源于通过降解CDK2/4/6诱导的细胞周期停滞，然后通过用化合物3处理这些癌症细胞系来研究包括A375和B16F10细胞在内的人类癌症细胞系的细胞周期动力学(图7)。肿瘤细胞在不同浓度的化合物3和DMSO的完全培养基中孵育48h，然后用流式细胞仪测定细胞周期某一阶段的细胞比例。如图7所示，用DMSO处理肿瘤细胞，DMSO在细胞周期的各个阶段均呈正态分布。相比之下，化合物3处理增加了G0/G1期中A375细胞群的积累，而B16F10细胞的G2/M期增加。这些结果表明化合物3可通过降解肿瘤细胞中细胞周期相关蛋白CDK2/4/6而诱导细胞周期阻滞。

图7中，(A)碘化丙啶染色后A375和B16F10细胞DNA含量的流式细胞图.(B)条形图分别说明了肿瘤细胞在G0/G1、S和G2/M期的比例。T-检验；平均值±SD,n＝3.*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

3、前药11的合成

尽管以上实验结果表明化合物3具有优异的生物学性能，然而，与大多数报道的含有CRBN配体的PROTAC分子相似，降解剂3由于其两性性，几乎没有口服生物利用度(<1％)。因此，假设解决方案是通过在CRBN配体的活性位点添加亲脂基团来制备前药。在动物实验中，它可能为PROTAC分子的口服提供方便。在化学上，前药的修饰是非常简单的。如以下路线所示，在温和条件下与特戊酸氯甲酯进行一步反应，将降解剂3转化为前药11。

反应试剂和条件：a Chloromethyl pivalate,Cs2CO3,DMF,TBAI,rt,65％。

化合物11的¹H NMR光谱和¹³C NMR光谱分别如图8、图9所示。

对于前药11的单剂量PK研究，将大鼠分为两组：(A)PO(200mg/kg)，(B)IV(10mg/kg)。对于IV研究，在2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1小时，4小时，6小时和8小时时，从不同大鼠中收集了200μL血液。对于PO研究，在5分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，8小时和12小时时，从不同大鼠中收集了200uL血液。血样用肝素处理以防止凝结。将血样在台式离心机中以13000rpm离心10分钟以收集血浆。将50μL血浆样品与200μL内标(丁螺环酮100ng/mL)在乙腈/MeOH(1：1，v/v)中合并，并在4℃下以15000rpm离心10分钟。收集上清液(100μL)，并与5份50％MeOH/水混合。通过LC/MS-MS测定血浆药物浓度。支持信息中提供了LC/MS-MS方法的摘要。使用非房室分析来分析处理后的血浆浓度-时间数据。实验结果如表4所示。

表4.合成化合物的PK参数

根据初步PK研究的结果，化合物11的口服生物活性可达68％。化合物3在4-8小时内暴露于大鼠血浆中。据了解，这是第一次成功开发基于CRBN配体的口服生物利用PROTAC前药。

4、化合物11性能试验

化合物11在大鼠单次剂量后的血浆浓度-时间曲线如图10所示。基于这一结果，化合物11的PO给药(PO，图10B)可稳定地转化为大鼠血浆中的活性成分3，其血药浓度迅速达到峰值，然后在5小时内显著降低。还通过尾静脉注射研究化合物11的药代动力学(IV，图10A)。用非室模型确定的药代动力学参数见表5。

图10中，(A)单次静脉给药(10mg/Kg，n＝3)后SD大鼠中化合物11和3的血浆浓度-时间曲线)；(B)单次PO给药(200mg/Kg，n＝3)后SD大鼠化合物11和3的血浆浓度-时间曲线)。

表5.化合物11和3的初步药代动力学参数PK

前药11的令人鼓舞的PK参数，本发明又对其抑制B16F10肿瘤生长的体内抗癌活性进行了评价。如图11所示，与口服给药的对照组相比，化合物11对小鼠的肿瘤大小有明显的抑制作用，而对化合物3则没有明显的抑制作用。此外，三组体重无明显差异。这些结果表明，口服化合物11能明显抑制B16F10肿瘤的生长，介导CDK2/4/6在体内的降解。

图11中，用B16F10细胞静脉注射C57BL/6J小鼠。其中，(A)B16F10异种移植物肿瘤体积的变化。(B)在第15天称重肿瘤。(C)动物的体重.(D)从载体和化合物3和11处理小鼠中解剖的具有代表性的肿瘤图像。T-检验；平均值±SD,n＝6,**P<0.001.(E)用CDK2/4/6单克隆抗体对B16F10异种移植模型的肿瘤组织病变(n＝5)进行染色，然后拍照(100X)。

综上所述，基于ribociclib衍生物和CRBN配体，开发了一种新型的PROTAC降解剂化合物3。小分子能同时有效地降解恶性黑色素瘤中CDK2/4/6及其复合物。这种化合物还能迅速重置细胞周期，诱导各种癌细胞，特别是黑色素瘤细胞凋亡。其机制应解释为在化合物3存在下，CDK 2/4/6缺乏可能导致恶性黑色素瘤的合成致死作用。这些结果表明，CDK2/4/6的结合将成为治疗实体肿瘤的有前途的激酶靶点。此外，还首次开发了一种口服生物利用度高的前药11，用于动物试验中的口服给药。它也可能为从CRBN配体衍生的PROTAC分子的口服给药提供一个通用的解决方案。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.蛋白水解靶向嵌合体，其分子结构如式(1)所示：

式(I)中，Linker为任一化学上可行的连接结构。

2.提高蛋白水解靶向嵌合体口服生物利用度的前药分子，其分子结构如式(II)所示：

式(II)中，Linker为任一化学上可行的连接结构；

R基团为磷酸基衍生物或氧羰基衍生物。

3.根据权利要求1所述的蛋白水解靶向嵌合体或权利要求2所述的前药分子，其特征在于，Linker为饱和脂肪链、不饱和脂肪链、饱和聚醚链、不饱和聚醚链或脂肪酸链。

4.根据权利要求1所述的蛋白水解靶向嵌合体，其特征在于，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIa)所示：

式(IIa)中，n＝0、1、2、3、4、5或6。

5.根据权利要求1所述的蛋白水解靶向嵌合体，其特征在于，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIb)所示：

式(IIb)中，n＝1、2、3、4、5或6。

6.根据权利要求1所述的蛋白水解靶向嵌合体，其特征在于，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(IIc)所示：

式(IIc)中，n＝1、2、3、4、5或6；

X为O、N或S。

7.根据权利要求1所述的蛋白水解靶向嵌合体，其特征在于，该蛋白水解靶向嵌合体的分子结构如式(III)所示：

8.根据权利要求2所述的前药分子，其特征在于，该前药分子的分子结构如式(IV)所示：

式(IV)中，R选自以下任一基团：氢，碳原子数为1～8的烷基，碳原子数为5～8的环烷基，碳原子数为2～7的烷基炔基，碳原子数为1～3的烷基酯基，取代芳基，烷基-C(O)-NH-芳基，-CH＝CH-烷基，-CH＝CH-烷基-二甲胺基，-CH＝CH-酯基，-CH＝C-(Ph)2，-CH＝CH-芳基，-NH-芳基，-C(O)-NH-(CH2)-NH-S(O)-NH-芳基。

9.根据权利要求2所述的前药分子，其特征在于，该前药分子的分子结构如式(V)所示：

10.权利要求1、4、5、6、7任一项所述蛋白水解靶向嵌合体或权利要求2、8、9任一项所述前药分子用于制备癌症治疗药物的应用。

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