CN111888333A - 一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用 - Google Patents

一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用，其中，所述纳米胶束包括TfT‑T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT‑T12短肽连接的聚乙二醇‑聚乳酸。本发明利用TfT‑T12‑PEG‑PLA良好的生物安全性、生物相容性等特点及其含有亲水部分和疏水部分，故在水中可自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束具有较强的转铁蛋白靶向性，可作为药物载体携带药物跨过血脑屏障，因此，所述纳米胶束可作为转铁蛋白靶向载体，广泛应用到脑胶质瘤的治疗领域。

Description

一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物载体技术领域，特别涉及一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质瘤是一种常见的颅内原发性肿瘤，由于脑胶质瘤的恶性程度高、侵袭性强、复发率高，尽管通过手术、放疗、化疗等综合治疗，患者的中位生存期仍小于14个月，5年死亡率高达95％。对于这种恶性程度高的胶质瘤，临床上采取的一线治疗方案是手术切除后联合放疗和化疗，术后化疗是脑胶质瘤的重要治疗手段，但由于血脑屏障(Blood brainbarrier， BBB)的存在以及疏水性化疗药物耐药性的出现，严重影响化疗的效果，因此脑胶质瘤的治疗仍是世界公认的难题。血脑屏障是保护脑部组织免受代谢产物损伤、维持中枢神经***稳态的天然屏障。然而，在保护神经***的同时，血脑屏障也阻碍了几乎100％的大分子药物和98％的小分子药物有效到达脑组织，导致大部分中枢神经***疾病，如恶性脑瘤得不到有效的治疗。因此，对于恶性脑瘤等脑内疾病来说，目前临床治疗面临的最大挑战就是如何有效地使药物穿过血脑屏障。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用，旨在解决现有药物无法有效穿过血脑屏障的问题。
本发明的技术方案如下：
一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其中，包括TfT-T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT-T12短肽连接的聚乙二醇-聚乳酸。
所述的转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其中，所述TfT-T12短肽的氨基酸结构序列为THRPPMWSPVWP。
所述的转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其中，所述纳米粒径的粒径为 100-200nm。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其中，包括步骤：
将聚乙二醇-聚乳酸溶于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐和苯并三氮唑进行活化处理，得到活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液；
向所述活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液中加入TfT-T12短肽和三乙胺，反应生成所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其中，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其中，所述活化处理时间为2-3h。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其中，将所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束用于包载疏水性化疗药物。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其中，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束载药量为1-10％。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其中，所述疏水性化疗药物为紫杉醇。
所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其中，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束与紫杉醇的质量比为10:1。
有益效果：本发明提供了一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其包括 TfT-T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT-T12短肽连接的聚乙二醇-聚乳酸。本发明利用TfT-T12-PEG-PLA良好的生物安全性、生物相容性等特点及其含有亲水部分和疏水部分，故在水中可自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束具有较强的转铁蛋白靶向性，可作为药物载体携带药物跨过血脑屏障，因此，所述纳米胶束可作为转铁蛋白靶向载体，广泛应用到脑胶质瘤的治疗领域。
附图说明
图1为实施例1中TfR-T12-PEG-PLA的氢谱结果图。
图2a为实施例2中纳米胶束的粒径测试结果图。
图2b为实施例2中纳米胶束的TEM表征结果图
图3为实施例2中纳米胶束的体外释放结果
图4a为实施例3中通过流式细胞术评估细胞对纳米胶束的摄取结果图。
图4b为实施例3中通过共聚焦激光扫描显微镜评估细胞对纳米胶束的摄取结果图。
图5为实施例4中纳米胶束对肿瘤细胞增殖抑制结果图。
图6为实施例5中纳米胶束穿过血脑屏障效应的结果图。
图7a为实施例6中纳米胶束对荷瘤小鼠(皮下模型)肿瘤生长抑制作用量化结果图。
图7b为实施例6中纳米胶束对荷瘤小鼠(皮下模型)肿瘤生长抑制作用直观结果图。
图8为实施例7中纳米胶束对荷瘤小鼠血管生成的抑制作用结果图。
图9为实施例8中纳米胶束对荷瘤小鼠(原位模型)生存周期的延长作用结果图。
图10为实施例9中研究纳米胶束安全性时，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色显微图。
具体实施方式
本发明提供一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
转铁蛋白受体(Trabsferrin Receptor，TfR)是一类存在于细胞表面的糖蛋白，是一种最具代表性的转胞吞作用受体，其在人体各种细胞上均有表达，特别是某些肿瘤细胞表面，如在脑肿瘤细胞、肝肿瘤细胞TfR受体的表达明显高于正常细胞。除此以为，TfR等受体在脑内皮细胞上同时高表达，理论上靶向TfR的药物既可以穿越血脑屏障，又可以特异性识别脑胶质瘤细胞，富集至脑内恶性脑瘤部位。基于以上理论，TfR配体修饰的药物，与TfR受体结合后，会通过脑内皮细胞的转胞吞作用穿过血脑屏障，而在恶性脑瘤细胞中，在受体TfR的介导下，TfR配体的修饰的药物能够特异性地被脑胶质瘤细胞摄取，使得治疗药物特异性地富集到肿瘤区域并抑制恶性脑瘤的生长，达到靶向递送的作用。因此，TfR配体修饰的载体是一种理想的能穿越血脑屏障并特异性被脑胶质瘤细胞摄取的药物载体，用于疏水性化疗药物的靶向递送。
聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米胶束由两亲性的嵌段聚合物组成，即同时具有亲脂性的疏水聚乳酸段(PLA)和亲水的聚乙二醇(PEG)片段，聚乙二醇-聚乳酸在自组装的条件下形成胶束后，疏水性内核可以包载亲脂性药物如紫杉醇，而亲水性外壳部分具有较好的生物相容性，同时可以提高胶束在水溶液中的稳定性，延长药物在体内的循环时间。另外，由于纳米级的载药胶束粒径较小，有利于提高实体瘤的高通透性和滞留效应，即所谓的EPR效应(enhanced permeability and retention effect)，EPR效应是实体瘤组织特有的高通透性和滞留性效应,其中实体瘤中毛细血管内皮细胞裂隙的存在造成大分子药物具有高通透性,另外由于实体瘤内毛细***结构完整性和淋巴***受损特征，导致大分子药物滞留性，促使大分子或微粒在肿瘤组织中的选择性分布。由此可见，PEG-PLA纳米胶束不仅可以解决难溶性药物溶解度问题，还可以利用肿瘤组织特有的EPR效应产生的对肿瘤的被动靶向效应来增强药物在肿瘤组织的蓄积，提高疏水性化疗药物的生物利用度，增强疏水性化疗药物对肿瘤的杀伤性。
基于此，本发明提供了一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其包括 TfT-T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT-T12短肽连接的聚乙二醇-聚乳酸。
本发明提供的纳米胶束可特异性识别TfR，因此可穿过血脑屏障，其具有良好的靶向脑胶质瘤的效果，并具有良好的安全性，生物相容性以及体内稳定性，在模拟内环境的条件下释药缓慢；所述纳米胶束与疏水性化疗药物形成稳定性良好的纳米制剂，具有药理活性和良好的脑胶质瘤靶向效果。
在一些实施方式中，所述TfT-T12短肽由由12个氨基酸组成，其分子量为1490，其氨基酸结构序列为THRPPMWSPVWP，其受体高表达于脑内皮细胞和脑胶质瘤细胞上，因此，由所述TfR-T12短肽修饰的纳米胶束，可顺利穿过血脑屏障，并特异性识别脑胶质瘤细胞。
在一些具体的实施方式中，所述纳米粒径的粒径为100-200nm。
在一些实施方式中，还提供一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其包括步骤：
将聚乙二醇-聚乳酸溶于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐和苯并三氮唑进行活化处理，得到活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液；向所述活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液中加入TfT-T12短肽和三乙胺，反应生成所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束。
具体地，将带有羧基端的PEG-PLA溶于有机溶剂中，加入1-乙基-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和苯并三氮唑为活化剂，室温活化2-3h,得到活化的PEG-PLA，然后加入TfR-T12短肽和少量三乙胺，继续反应24h, 去离子水中透析48h,冷冻干燥24h,即制得TfR-T12-PEG-PLA，合成路线如下：
Figure BDA0002627706160000061
进一步地，将所述TfR-T12-PEG-PLA溶解于有机溶剂中，根据载体材料与化疗药物质量比加入相应的化疗药物，在轻微搅拌条件下，将混合液缓慢滴入50ml去离子水中，并透析24h,用0.45μm的微孔滤膜除去未包载的药物，冻干24h,即得载药纳米胶束。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，但不限于此。
在一些实施方式中，还提供一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其中，将所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束用于包载疏水性化疗药物。
在一些实施方式中，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束载药量为 1-10％。
在一些具体的实施方式中，所述疏水性化疗药物为紫杉醇，较佳地，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束与紫杉醇的质量比为10:1。本实施例中，所述紫杉醇可与所述纳米胶束形成稳定性良好的纳米制剂，具有药理活性和良好的脑胶质瘤靶向效果。
下面通过具体实施例对本发明一种转铁蛋白的纳米胶束的制备方法及其性能做进一步的解释说明：
实施例1
TfR-T12-PEG-PLA的合成及表征
50mg HOOC-PEG-PLA共聚物用EDC/NHS(10mg EDC/5.8mg NHS)活化3h，将TfR-T12肽加入到DMSO溶液中，在中等搅拌速度下再保持反应24h。然后，将反应后的混合物在蒸馏水中透析48h(透析袋截留分子量3500Da)，以除去未结合的TfR-T12肽，透析液冷冻干燥24h。用1H-核磁共振图谱表征了TfR-T12-PEG-PLA的结构，结果如图1所示，在3.65ppm的信号中检测到PEG-PLA的亚甲基，并且来自PLA的CH和CH3的信号分别显示在5.3 和1.6ppm位置。7.0-8.0ppm的化学位移被认为是TfR-T12肽链中的氢质子。结果表明，TfR-T12肽成功地与PEG-PLA结合。
实施例2
纳米胶束的制备及表征
将100mg的TfR-T12-PEG-PLA共聚物和10mg PTX溶解在2mlDMSO中，然后在适度搅拌下滴加到50ml水中，混合物在室温下搅拌30min，并在蒸馏水中透析48h(分子量截止3500Da)。使用0.45μM过滤器，过滤除去未被包载的PTX。
用透射电镜观察了载药胶束的表面形态。将载药胶束的样品溶液制备成1mg/ml的浓度，精确测量为20μL，并将其置于铜网上，将铜网置于灯下10min使其干燥，然后用透射电镜观察载药胶束的表面形态。
以游离PTX和未被TfR-T12修饰的纳米胶束作为对照，在生理条件下评价PTX在体外释放48h。简而言之，将含有0.45mg的PTX的纳米胶束样品加入透析袋中。然后，将透析袋浸入50mLPBS(pH 7.4，含0.1％吐温80) 中，在37℃下缓慢搅拌，在预定的时间点，从培养基中取出0.2mL样品，并加入相同体积的新鲜培养基，用紫外分光光度计分析PTX的浓度。
TfR-T12-PMs的平均粒径为110nm(多分散指数:0.217)(如图2a所示)， PEG-PMs和TfR-T12-PMs的电动电位分别为-7.91和-4.77，由于聚乙二醇末端的羧基，PEG-PMs带负电荷，而随着TfR-T12的修饰，TfR-T12-PMs的电动电位略有增加。从透射电镜形态图像(图2B)来看，TfR-T12-PMs呈球形，分布均匀。与37℃下pH 7.4的PBS中的游离PTX相比，PEG-PMs和TfR-T12-PMs的PTX缓慢释放，约50％的PTX在24h内从纳米胶束中释放， 70％的游离PTX在同一时间点释放。因此，TfR-T12的修饰对纳米胶束的释药没有明显影响(如图3所示)。
实施例3
纳米胶束的摄取实验
为了评估纳米胶束被肿瘤细胞的摄取情况和细胞内定位，制备了包载 DiR的纳米胶束，DiR是一种疏水性的荧光物质，它替代PTX被包裹在载体中。将U87MG细胞以6×104细胞/孔的密度接种到12孔板中，并在37℃下培养过夜，然后用含有各种制剂处理细胞，培养4h。用流式细胞术和共聚焦显微镜研究了U87MG细胞对PEG-PMs和TfR-T12-PMs的摄取，并以DiR 作为探针评价制剂的细胞摄取。在37℃下用不同配方的纳米胶束处理细胞 6h后，TfR-T12-PMs的摄取显著高于PEG-PMs(如图4a所示)。这表明TfR-T12 的存在有效地增加了U87MG细胞对PMs的摄取。这些结果表明，TfR-T12的存在对纳米胶束的摄取能力有明显的影响。共聚焦显微镜还研究了纳米胶束在U87MG细胞内的分布情况(如图4b所示)。U87MG细胞在37℃下用各种制剂处理4h，PEG-PMs组可见微弱的红色胞内荧光，而TfR-T12-PMs组的摄取和吸收增强。
实施例4
CCK8实验
将U87MG细胞接种在96孔板中，接种密度6000/孔，并培养过夜以进行融合。然后除去介质，加入纳米胶束或游离PTX。孵育24h后，加入10 μL CCK8工作溶液孵育1-4h，计算每孔的存活率。PTX对U87MG细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性。随着PTX浓度的增加，细胞活力显著下降。与空白组相比，所有的制剂，包括游离PTX、PEG-PMs和TfR-T12-PMs，均显示出对U87MG细胞增加的增殖抑制作用(如图5所示)。这些细胞中增加的细胞毒性被认为是PTX治疗效果的有希望的改善，当PTX被包载在TfR-T12 修饰的纳米胶束中，这种特征可能归因于对癌细胞的更高PTX传递和细胞内稳定释放PTX的组合。因此，TfR-T12-PMs的PTX毒性增加可归因于U87MG 癌细胞对PTX的较高摄取。总之，该制剂对U87MG细胞的抗增殖作用顺序为:TfR-T12-PMs>PEG-PMs>PTX。
实施例5
体外血脑屏障模型的构建及评价
建立HUVEC/U87MG共培养模型。简而言之，将5×103HUVEC和2.5×104 个U87MG细胞共培养72h，将HUVEC接种到上腔室中，将U87MG接种到下腔室中。将上面的***物转移到另一个24孔的平板上，该平板预先接种有浓度为5×104的U87MG细胞，然后用游离DiR和不同DiR制剂处理细胞。孵育1h后取出上端小室，流式细胞仪检测U87MG细胞中的DiR的摄取情况。据报道，肿瘤细胞刺激人脐静脉内皮细胞，赋予内皮细胞一些血管生成的特性，因此人脐静脉内皮细胞与U87MG细胞共培养3天后，表现出较高的增殖率。建立人脐静脉内皮细胞/U87MG共培养模型作为BBTB模型，以评估纳米胶束的BBTB细胞转运效率。结果表明(如图6所示)，经TfR-T12-PMs 的人脐静脉内皮细胞的细胞活力略有下降。孵育一段时间后，TfR-T12-PMs 组U87MG细胞的摄取明显高于PEG-PMs组，并且在TfR-T12-PMs组中也观察到明显的凋亡现象，表明TfR-T12修饰PMs通过TfR-T12肽和TfR之间的相互作用促进跨BBTB和靶向肿瘤细胞的转运。
实施例6
皮下脑胶质瘤模型的构建及纳米胶束肿瘤抑制效果评价
雄性裸鼠(4-6周)在右腿皮下植入1×107U87MG细胞。2周后，当实体瘤大小达到约80mm3时，将裸鼠随机分成4组(n＝5)，并接受静脉注射生理盐水、PTX、未修饰的纳米胶束和TfR-T12修饰的纳米胶束，PTX剂量为 5mg/kg。每2天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，并根据以下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积＝(长度)×(宽度)2/2。图7a和图7b中用异种移植模型说明了纳米胶束的抗肿瘤功效。与对照组相比，在连续静脉注射PTX制剂后，肿瘤生长被显著抑制，特别是，用TfR-T12-PMs治疗的组，肿瘤生长呈现更显著的降低。它证明了将TfR-T12肽与纳米制剂的相结合的优越性。相比之下，来自生理盐水组的未处理小鼠显示出肿瘤快速生长。
实施例7
血管形成抑制实验
将荷瘤小鼠的肿瘤组织固定在4.0％多聚甲醛溶液中，包埋在石蜡中并切片。免疫组化的方式检测肿瘤组织中CD31的表达，CD31是肿瘤组织中血管生成的标志。采用免疫组化的方式测量了肿瘤组织中CD31的表达情况，用来衡量纳米胶束抑制肿瘤组织血管生成效果，与生理盐水组、PTX组和 PEG-PMs组相比，TfR-T12-PMs明显抑制血管生成(如图8所示)。
实施例8
原位脑胶质瘤模型的构建及生存周期评价
建立原位脑胶质瘤模型。简而言之，雄性裸鼠(6-8周)用水合氯醛麻醉，用立体定向仪(Stoteling)将5×105U87MG细胞约4-5μL植入右脑(短突旁2.0毫米，深度3.5毫米)。肿瘤细胞接种后14天，将荷瘤小鼠随机分为4组(n＝5)，静脉注射生理盐水、PTX、未修饰的纳米胶束(PEG-PMs)和 TfR-T12修饰的纳米胶束(TfR-T12-PMs)。给药共5次，剂量为5mg/kg，5次给药后观察荷瘤小鼠的存活率。荷瘤小鼠生存周期结果显示，PTX组和 PEG-PMs组的存活率比生理盐水组略有提高。但是TfR-T12-PMs组的中位生存期长于PEG-PMs组，PEG-PMs组的中位生存期为46天，而TfR-T12-PMs 组的中位生存期为63天(如图9所示)。
实施例9
纳米胶束安全性评价
为了评估纳米胶束对荷瘤小鼠的安全性，在给药后，对荷瘤小鼠实施安乐死，并对重要器官的组织切片进行H&E染色以进行组织化学分析。结合以上数据，TfR-T12-PMs的抗肿瘤活性显著提高，并且没有明显的副作用。心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色也被可用于安全评估。PTX组出现肝脏坏死和肺损伤现象，聚PEG-PMs组出现轻微的心脏损伤，而TfR-T12-PMs 组未出现器官损伤现象(如图10所示)。当PTX被载体包裹后，它的副作用减少了。因此，TfR-T12修饰的纳米胶束有望开发脑肿瘤靶向制剂，为今后临床应用奠定理论基础。
综上所述，本发明提供了一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其包括 TfT-T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT-T12短肽连接的聚乙二醇-聚乳酸。本发明利用TfT-T12-PEG-PLA良好的生物安全性、生物相容性等特点及其含有亲水部分和疏水部分，故在水中可自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束具有较强的转铁蛋白靶向性，可作为药物载体携带药物跨过血脑屏障，因此，所述纳米胶束可作为转铁蛋白靶向载体，广泛应用到脑胶质瘤的治疗领域。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其特征在于，包括TfT-T12短肽以及通过酰胺键与所述TfT-T12短肽连接的聚乙二醇-聚乳酸。
2.根据权利要求1所述的转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其特征在于，所述TfT-T12短肽的氨基酸结构序列为THRPPMWSPVWP。
3.根据权利要求1所述的转铁蛋白受体靶向的纳米胶束，其特征在于，所述纳米粒径的粒径为100-200nm。
4.一种如权利要求1-3所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将聚乙二醇-聚乳酸溶于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和苯并三氮唑进行活化处理，得到活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液；
向所述活化后的聚乙二醇-聚乳酸溶液中加入TfT-T12短肽和三乙胺，反应生成所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束。
5.根据权利要求4所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
6.根据权利要求4所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述活化处理时间为2-3h。
7.一种如权利要求1-3任一所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其特征在于，将所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束用于包载疏水性化疗药物。
8.根据权利要求7所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其特征在于，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束载药量为1-10％。
9.根据权利要求7所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其特征在于，所述疏水性化疗药物为紫杉醇。
10.根据权利要求9所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束的应用，其特征在于，所述转铁蛋白受体靶向的纳米胶束与紫杉醇的质量比为10:1。
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