CN111876527A - 一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株鉴别检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三组引物和探针，第一组引物和探针与非洲猪瘟病毒B646L基因保守区特定序列完全配对，用于检测非洲猪瘟病毒；第二组引物和探针与非洲猪瘟病毒EP402R基因保守区特定序列完全配对，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株；第三组引物和探针与红色荧光蛋白mCherry基因特定序列完全配对，用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株。在三条探针上分别标记不同的荧光报告基团。本发明的非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株鉴别检测试剂盒，检测灵敏度高，最低可检测出浓度为100个拷贝/μL的目的DNA，特异性好，操作简单方便，能有效地将非洲猪瘟疫苗免疫动物和野毒感染动物进行区分。

Description

一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病。不同品种及年龄的猪均易感，发病率高，致死率可达100％。该病目前没有有效的治疗措施，也没有可用的疫苗。非洲猪瘟于1921年在非洲肯尼亚被首次发现，1957年传入葡萄牙，随后蔓延至其他欧洲国家，到1995年，除了在南撒丁岛还有流行以外，非洲猪瘟在欧洲被根除。1971年非洲猪瘟从西班牙传至南美，1984年在该地区被消灭。2007年非洲猪瘟传入格鲁吉亚并在高加索地区蔓延，迅速扩散至俄罗斯、东欧及亚洲。从2018年8月3日报告第1起非洲猪瘟疫情至今，我国已陆续报告发生170余起疫情，疫情涉及全国，防控形势十分严峻。非洲猪瘟除了导致猪只死亡和扑杀而产生的直接经济损失外，还会引起巨大的经济和社会影响，包括猪及猪肉制品限制调运、猪肉制品供给不足、屠宰交易限制、众多从业人员失业、养殖户返贫以及国际贸易限制等。
非洲猪瘟病毒是一种二十面体的双链DNA病毒，其基因组大小为171kb～193kb，编码151～186个基因。其主要衣壳蛋白p72由B646L基因编码，非洲猪瘟病毒不同基因型毒株间该基因序列较为保守。研究发现，缺失多基因家族成员MGF360/505部分基因或EP402R基因(编码CD2v蛋白)可导致非洲猪瘟病毒毒力的减弱。我国科学家发现同时缺失多基因家族成员MGF360/505部分基因和EP402R基因，能使非洲猪瘟病毒强毒株毒力减弱，能诱导受试猪产生抗体，能对强毒株的攻击产生保护。通常在缺失株中引入红色荧光蛋白mCherry基因用作筛选标记。为了鉴别非洲猪瘟疫苗免疫动物和自然感染动物，有必要建立野毒株和疫苗株的鉴别检测技术。
发明内容
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株鉴别检测试剂盒。本发明提供的试剂盒基于聚合酶链式反应技术，可以快速鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株。
本发明首先提供一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株的分子标记，其中包含有用于检测非洲猪瘟病毒的通用型分子标记，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的分子标记，还包括用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的分子标记。
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型分子标记的核酸序列如下：
5'-CGTTCTCCGGGGTATTCGCAGTAGTAAACCAAGTTTCGGTACGCATTCTTTGTGCCGGGBACAATRGGYCTYCCAAARGGATCYACAAGCGTGTAAACGGCGCCCTCYAARGGTGTTTGGTTGTCCCAGTCATATCCGTTGCGAGGAAACGTTTGAAGC-3'(SEQ ID NO:1)；
序列中兼并碱基B代表碱基T/G/C；R代表碱基G/A；Y代表碱基C/T。
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的分子标记的核酸序列如下：
5'-ACTACCTARTATCCCRYTACYACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCAYGTAGATAGAATTATTTAATATGTACTAYATRTTAATTATTTAACCTTTCAAGCTRGYCTTCATTTAAATTTAAAATCCACTAAT-3'(SEQ ID NO:2)；
序列中兼并碱基R代表碱基G/A；Y代表碱基C/T。
所述用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的分子标记的核酸序列如下：
5'-GAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCTAA-3'(SEQ ID NO:3)；
本发明还提供用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株的引物和探针组，其中包含有用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针组，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针组，还包括用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的引物和探针组；
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针组，其引物P72F3、引物P72R3和探针P72P3的序列信息如下：
引物P72F3：5'-GTTTCGGTACGCATTCTTTGTG-3'(SEQ ID NO:4)；
引物P72R3：5'-CGGATATGACTGGGACAACCA-3'(SEQ ID NO:5)；
探针P72P3：5'-ATCTACAAGCGTGTAAACGGCGCCC-3'(SEQ ID NO:6)
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针组，其引物CD2vF2、引物CD2vR2和探针CD2vP2的序列信息如下：
引物CD2vF2：5'-CCCAATATCCCGCCATTATCT-3'(SEQ ID NO:7)；
引物CD2vR2：5'-AAATGAAGACCAGCTTGAAAGGTT-3'(SEQ ID NO:8)；
探针CD2vP2：5'-TTCGCTTATTCACGTAGATAG-3'(SEQ ID NO:9)；
所述用于检测非洲猪瘟疫苗株的引物和探针组，其引物CheF1、引物CheR1和探针CheP1的序列信息如下：
CheF1：5'-GCCTACAACGTCAACATCAAGTTG-3'(SEQ ID NO:10)；
CheR1：5'-TCGGCGCGTTCGTACTGT-3'(SEQ ID NO:11)；
CheP1：5'-CCTCCCACAACGAGGACTACACCATCG-3'(SEQ ID NO:12)；
所述的P72P3、CD2vP2、CheP1探针分别用荧光基团进行标记。
所述的荧光探针P72P3、CD2vP2、CheP1的5'-端可以标记荧光报告基团FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Cy3、Quasar 570、ROX、TxRd、Cy5、Quasar 670、Cy5.5等，3'-端可以标记荧光淬灭基团BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA等。
所述荧光探针P72P3、CD2vP2、CheP1分别标记三种不同的荧光基团。
本发明再一个方面还提供一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物和探针；
所述试剂盒中包含有用于荧光PCR扩增检测的试剂；
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒通用型阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒或其DNA、含有非洲猪瘟病毒B646L基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒B646L基因片段的DNA样品等。
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒野毒株阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒野毒株或其DNA、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因片段的DNA样品等。
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒疫苗株阳性对照，阳性对照可为***红色荧光蛋白mCherry基因的非洲猪瘟病毒疫苗株或其DNA、含有红色荧光蛋白mCherry基因的质粒、含有mCherry基因片段的DNA样品等。
所述试剂盒还可包括阴性对照，可为去离子水、磷酸缓冲液等。
本发明还提供了用于检测受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的方法，用所述引物和探针或所述试剂盒对受试样品提取的核酸进行PCR扩增反应，收集荧光信号，确定受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株。
所述样品可包括家猪或野猪的组织脏器、全血、血清、粪便、眼拭子、咽拭子、鼻拭子、肛拭子等。所述样品还可包括猪肉制品，如香肠、肉馅、肉丸等。所述样品还可包括环境拭子、车辆拭子等。所述样品还可包括软蜱、蜱、苍蝇、老鼠、蚊子等其他动物样品。
本发明的引物和探针组能特异鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株；敏感性高，可以检测出100拷贝/μL的目的DNA。本发明的试剂盒实用价值高，能有效区分非洲猪瘟病毒野毒株感染和疫苗免疫动物，可应用于动物防疫、市场监管、海关稽查等实验室进行临床兽医检测。
附图说明
图1为实施例1的检测结果图；
图2为实施例2的检测结果图；
图3为实施例3的检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细的描述。这些实施例意图帮助本领域技术人员更好地理解本发明，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
本发明申请人将不同基因型非洲猪瘟病毒的B646L基因核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的我国非洲猪瘟病毒B646L基因核苷酸序列，以及我国科学家用于制备非洲猪瘟病毒重组缺失疫苗株的毒株B646L基因核苷酸序列进行比对，确定其保守区域。结果发现1385-1543位序列最为保守，其对应序列如下：
5'-CGTTCTCCGGGGTATTCGCAGTAGTAAACCAAGTTTCGGTACGCATTCTTTGTGCCGGGBACAATRGGYCTYCCAAARGGATCYACAAGCGTGTAAACGGCGCCCTCYAARGGTGTTTGGTTGTCCCAGTCATATCCGTTGCGAGGAAACGTTTGAAGC-3'(序列中兼并碱基B:T/G/C；R:G/A；Y:C/T)。
按照荧光定量PCR引物和探针设计原则，在上述保守区域不同位置设计多条引物和探针，进行筛选。根据检出的灵敏度最终确定用于非洲猪瘟病毒检测的通用型引物和探针。
表1：用于比对的非洲猪瘟病毒信息表
Figure BDA0002630652040000061
Figure BDA0002630652040000071
申请人将不同基因型非洲猪瘟病毒的EP402R基因核苷酸序列，与申请人所在实验室分离保存的我国非洲猪瘟病毒EP402R基因核苷酸序列，以及我国科学家用于制备非洲猪瘟病毒重组缺失疫苗株的毒株EP402R基因核苷酸序列进行比对，确定其保守区域。结果发现EP402R基因999位至终止子后66位序列最为保守，其对应序列如下：
5'-ACTACCTARTATCCCRYTACYACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCAYGTAGATAGAATTATTTAATATGTACTAYATRTTAATTATTTAACCTTTCAAGCTRGYCTTCATTTAAATTTAAAATCCACTAAT-3'(序列中兼并碱基R:G/A；Y:C/T)。
按照荧光定量PCR引物和探针设计原则，在上述保守区域不同位置设计多条引物和探针，进行筛选。根据检出的灵敏度最终确定用于非洲猪瘟病毒野毒株检测的专用引物和探针。
申请人对红色荧光蛋白mCherry基因核苷酸序列进行分析，确定可用于设计引物探针的区域，其对应序列如下：
5'-GAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCTAA-3'。
按照荧光定量PCR引物和探针设计原则，在上述保守区域不同位置设计多条引物和探针，进行筛选。根据检出的灵敏度最终确定用于非洲猪瘟病毒疫苗株检测的专用引物和探针。
最终确定的三组引物和探针包括引用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的专用引物和探针，还包括用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的专用引物和探针。
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针由引物P72F3、引物P72R3和探针P72P3组成，引物P72F3的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，引物P72R3的核苷酸序列为SEQ IDNO:5；探针P72P3的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针由引物CD2vF2、引物CD2vR2和探针CD2vP2组成，引物CD2vF2的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，引物CD2vR2的核苷酸序列为SEQID NO:8，探针CD2vP2的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
所述用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的引物和探针由引物CheF1、引物CheR1和探针CheP1组成，引物CheF1的核苷酸序列为SEQ ID NO:10，引物CheR1的核苷酸序列为SEQ IDNO:11，探针CheP1的核苷酸序列为SEQ ID NO:12。
所述荧光探针P72P3、CD2vP2、CheP1可以用目前已知或未知的荧光基团进行标记。
所述荧光探针P72P3、CD2vP2、CheP1的5'-端可以标记荧光报告基团FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Cy3、Quasar 570、ROX、TxRd、Cy5、Quasar 670、Cy5.5等，所述荧光探针3'-端可以标记荧光淬灭基团BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA等。
所述荧光探针P72P3、CD2vP2、CheP1分别标记三种不同的荧光基团。
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针与非洲猪瘟病毒B646L基因序列保守区特定序列完全配对，能特异性地识别所有的非洲猪瘟病毒，包括野毒株和疫苗株。
表2：专用引物和探针与非洲猪瘟病毒B646L基因开放阅读框的结合区域
Figure BDA0002630652040000091
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针组与非洲猪瘟病毒EP402R基因序列保守区特定序列完全配对(见表3)，能特异性地识别所有的非洲猪瘟病毒野毒株，但是，不能与缺失EP402R基因的疫苗株配对。
表3：用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针与非洲猪瘟病毒EP402R基因开放阅读框的结合区域
Figure BDA0002630652040000092
所述用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的引物和探针与红色荧光蛋白mCherry基因特定序列完全配对(见表4)，能特异性地识别所有***红色荧光蛋白mCherry基因的非洲猪瘟病毒疫苗株。
表4：专用引物和探针与红色荧光蛋白mCherry基因开放阅读框的结合区域
Figure BDA0002630652040000093
本发明还提供使用所述专用引物和探针组鉴别检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的三重荧光PCR方法。
所述专用引物分别与相应的模板DNA特异性互补配对，在DNA聚合酶的作用下，发生聚合酶链式(PCR)反应，对模板DNA进行扩增。同时，所述荧光探针分别与相应的模板DNA特异性互补配对，在PCR扩增时，探针被酶切降解，释放出各自的报告荧光基团。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，荧光PCR仪可实时检测荧光信号强度，求得Ct值(循环阈值)。起始模板DNA浓度越高，Ct值越小。
如果模板为非洲猪瘟病毒野毒株，可同时检测到探针P72P3和CD2vP2标记的荧光，但是检测不到CheP1标记的荧光。
如果模板为非洲猪瘟病毒疫苗株，可同时检测到探针P72P3和CheP1标记的荧光，但是检测不到CD2vP2标记的荧光。
如果模板中同时存在非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株，可同时检测到探针P72P3、CD2vP2和CheP1标记的荧光。
基于所述引物和探针建立的三重荧光PCR方法可检测到浓度各为100拷贝/μL的B646L基因、EP402R基因和mCherry基因DNA。
本发明还提供使用所述三组引物和探针制备的试剂盒，所述试剂盒可用于辅助鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株，和/或检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株。
所述试剂盒可包括DNA聚合酶和PCR反应缓冲液(含dNTPs和Mg2+)。
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒或其DNA、含有非洲猪瘟病毒B646L基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒B646L基因片段的DNA等。
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒野毒株阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒野毒株或其DNA、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因片段的DNA等。
所述试剂盒还可包括非洲猪瘟病毒疫苗株阳性对照，阳性对照可为***红色荧光蛋白mCherry基因的非洲猪瘟病毒疫苗株或其DNA、含有红色荧光蛋白mCherry基因的质粒、含有mCherry基因片段的DNA等。
所述试剂盒还可包括阴性对照，可为去离子水、磷酸缓冲液等。
本发明还提供了用于检测受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的方法。用所述引物和探针或所述试剂盒对受试样品提取的核酸进行PCR扩增反应，收集荧光信号，确定受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株。
所述样品可包括家猪或野猪的组织脏器、全血、血清、粪便、眼拭子、咽拭子、鼻拭子、肛拭子等。所述样品还可包括猪肉制品，如香肠、肉馅、肉丸等。所述样品还可包括环境拭子、车辆拭子等。所述样品还可包括软蜱、蜱、苍蝇、老鼠、蚊子等其他动物样品。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株三重荧光PCR鉴别检测试剂盒的制备及应用
一、非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株三重荧光PCR鉴别检测试剂盒的制备
1.引物和探针的合成
人工合成以下引物和探针：
引物P72F3：5'-GTTTCGGTACGCATTCTTTGTG-3'；
引物P72R3：5'-CGGATATGACTGGGACAACCA-3'；
探针P72P3：5'-Cy5-ATCTACAAGCGTGTAAACGGCGCCC-BHQ-3-3'
探针P72P3的5'-端标记荧光报告基团Cy5，3'-端标记荧光淬灭基团BHQ-3。
CD2vF2：5'-CCCAATATCCCGCCATTATCT-3'
CD2vR2：5'-AAATGAAGACCAGCTTGAAAGGTT-3'
CD2vP2：5'-VIC-TTCGCTTATTCACGTAGATAG-BHQ1-3'
探针CD2vP2的5'-端标记荧光报告基团VIC，3'-端标记荧光淬灭基团BHQ-1。
CheF1：5'-GCCTACAACGTCAACATCAAGTTG-3'
CheR1：5'-TCGGCGCGTTCGTACTGT-3'
CheP1：5'-CCTCCCACAACGAGGACTACACCATCG-3'
探针CheP1的5'-端标记荧光报告基团FAM，3'-端标记荧光淬灭基团BHQ-1。
2.阳性对照品的制备
根据Genbank公布的非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株基因组序列(序列号：FR682468)，截取其103590至105530位核苷酸序列，即B646L基因序列。截取Georgia 2007/1株基因组序列73369至74650位核苷酸序列，即EP402R基因序列(含开发阅读框序列及终止密码子后200位核苷酸序列)。根据Genbank公布的pG1AK-mCherry质粒序列(序列号：FR682468)，截取4874至5560位核苷酸序列，即红色荧光蛋白mCherry基因序列。人工合成上述B646L基因、EP402R基因和mCherry基因序列，分别***质粒中，如pUC-57质粒。将获得的3种质粒分别转化大肠杆菌，提取质粒，测定浓度并转换为拷贝数。分别获得浓度为1×108拷贝/μL的B646L基因、EP402R基因和mCherry基因重组质粒。将3种质粒分别十倍系列稀释至1×104拷贝/μL，即为阳性对照品，-20℃保存备用。
3.配制荧光PCR反应缓冲液
配制2×荧光PCR反应缓冲液，含dNTPs各0.4mM，MgSO42.8～4mM，DNA聚合酶1U/μL，所述引物P72F3 0.4～1.2μM，所述引物P72R3 0.4～1.2μM，所述荧光探针P72P3 0.2～0.6μM，所述引物CD2vF2 0.4～1.2μM，所述引物CD2vR2 0.4～1.2μM，所述荧光探针CD2vP2 0.2～0.6μM，所述引物CheF1 0.4～1.2μM，所述引物CheR10.4～1.2μM，所述荧光探针CheP10.2～0.6μM。
4.试剂盒的组装
试剂盒由以下物质组成：2×荧光PCR反应缓冲液、阳性对照和双蒸水。
二、非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株三重荧光PCR鉴别检测试剂盒的应用
1.样本的处理
取1头确诊为非洲猪瘟病毒野毒株感染的病猪、1头接种非洲猪瘟病毒ΔCD2vΔMGF疫苗株的免疫猪和1头健康猪，分别采集全血1mL。取200μL全血用商品化的DNA提取试剂盒(Qiagen)提取DNA，所得DNA溶液可直接作为模板使用。
取病猪全血DNA模板2μL至0.2mL离心管中，编号为WT。取免疫猪全血DNA模板2μL至0.2mL离心管中，编号为Vac。取健康猪全血DNA模板2μL至0.2mL离心管中，编号为NC。取双蒸水2μL至0.2mL离心管中，作为阴性对照管(-)。取阳性对照品2μL至0.2mL离心管中，作为阳性对照管(+)。
2.PCR反应
制备反应预混液，25μL反应体系中含有2×PCR反应缓冲液12.5μL，双蒸水10.5μL。
取WT管、Vac管、NC管、阴性对照管和阳性对照管，每管加入23μL反应预混液。
置于荧光PCR仪中进行荧光PCR反应，反应条件为：95℃进行Taq酶的激活5min；45个循环的荧光PCR反应(95℃变性15sec，58℃退火延伸1min)；在每次循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
3.荧光PCR产物的检测
结果见图1。阳性对照(+)出现3种荧光的S型扩增曲线，阴性对照(-)无扩增曲线。健康猪(NC管)无扩增曲线，病猪样品管(WT管)出现Cy5和VIC两种荧光S型扩增曲线(Ct值≤40)，免疫猪样品管(Vac管)出现Cy5和FAM两种荧光S型扩增曲线，且Ct值≤40。
实施例2.非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株三重荧光PCR鉴别检测试剂盒灵敏度的检测
采用实施例1制备的试剂盒进行灵敏度检测。
一、模板DNA的制备
同实施例1的步骤一，分别制备终浓度为3×106拷贝/μL的B646L基因、EP402R基因和mCherry基因阳性标准品，各取100μL至一1.5mL离心管中，获得终浓度各为1×106拷贝/μL的B646L基因、EP402R基因和mCherry基因阳性标准品混合物。用双蒸水对阳性标准品混合物进行10倍系列稀释，分别制备稀释液I(浓度各为1×106拷贝/μL)、稀释液II(浓度各为1×105拷贝/μL)、稀释液III(浓度各为1×104拷贝/μL)、稀释液IV(浓度各为1×103拷贝/μL)、稀释液V(浓度各为1×102拷贝/μL)和稀释液VI(浓度各为10拷贝/μL)。
二、灵敏度的检测
制备反应预混液，25μL反应体系中含有2×PCR反应缓冲液12.5μL，双蒸水10.5μL。
样品I：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液I，再加入23μL预混液。
样品II：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液II，再加入23μL预混液。
样品III：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液III，再加入23μL预混液。
样品IV：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液IV，再加入23μL预混液。
样品V：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液V，再加入23μL预混液。
样品VI：在0.2mL离心管中，加入2μL的稀释液VI，再加入23μL预混液。
阴性对照组：取双蒸水2μL至0.2mL离心管中，加入23μL预混液。
置于荧光PCR仪中进行荧光PCR反应，反应条件为：95℃进行Taq酶的激活5min；45个循环的荧光PCR反应(95℃变性15sec，58℃退火延伸1min)；在每次循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
三、结果
如图2所示。样品I～样品V都有可见的FAM、VIC、Cy5三种荧光的S型扩增曲线，样品VI无扩增曲线。
由于样品V中B646L基因、EP402R基因和mCherry基因阳性标准品的浓度各为1×102拷贝/μL，所以确定非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株三重荧光PCR鉴别检测试剂盒的灵敏度为100拷贝/μL。
实施例3.非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株鉴别检测试剂盒特异性的检测
采用实施例1制备的试剂盒进行特异性检测。
一、样本处理
取非洲猪瘟病毒LNSY野毒株、ΔCD2vΔMGF疫苗候选株、猪瘟病毒疫苗株、***病毒疫苗株的病毒液各200μL，用商品化的病毒核酸提取试剂盒(Qiagen)提取核酸。
二、荧光PCR检测
制备反应预混液，25μL反应体系中含有2×PCR反应缓冲液12.5μL，双蒸水10.5μL。
WT管：在0.2mL离心管中，加入2μL的非洲猪瘟病毒LNSY野毒株核酸，再加入23μL预混液。
Vac管：在0.2mL离心管中，加入2μL的非洲猪瘟病毒ΔCD2vΔMGF疫苗候选株核酸，再加入23μL预混液。
CSF管：在0.2mL离心管中，加入2μL的猪瘟病毒疫苗株核酸，再加入23μL预混液。
FMD管：在0.2mL离心管中，加入2μL的***病毒疫苗株核酸，再加入23μL预混液。
阴性对照管(-)：取双蒸水2μL至0.2mL离心管中。
阳性对照管(+)：取阳性对照品2μL至0.2mL离心管中。
置于荧光PCR仪中进行荧光PCR反应，反应条件为：95℃进行Taq酶的激活5min；45个循环的荧光PCR反应(95℃变性15sec，58℃退火延伸1min)；在每次循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
三、结果
如图3所示。阳性对照(+)出现3种荧光的S型扩增曲线，阴性对照(-)无扩增曲线。猪瘟病毒(CSF管)和***病毒(FMD管)无扩增曲线。非洲猪瘟病毒野毒株管(WT管)出现Cy5和VIC两种荧光S型扩增曲线(Ct值≤40)，ΔCD2vΔMGF疫苗候选株管(Vac管)出现Cy5和FAM两种荧光S型扩增曲线，且Ct值≤40。
上述结果表明本发明的非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株鉴别检测试剂盒能特异鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株；敏感性高，可以检测出100拷贝/μL的目的DNA。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgttctccgg ggtattcgca gtagtaaacc aagtttcggt acgcattctt tgtgccgggb 60
acaatrggyc tyccaaargg atcyacaagc gtgtaaacgg cgccctcyaa rggtgtttgg 120
ttgtcccagt catatccgtt gcgaggaaac gtttgaagc 159
<210> 2
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actacctart atcccrytac yacccaatat cccgccatta tctacccaaa atatttcgct 60
tattcaygta gatagaatta tttaatatgt actayatrtt aattatttaa cctttcaagc 120
trgycttcat ttaaatttaa aatccactaa t 151
<210> 3
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 60
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 120
cgcgccgagg gccgccactc cacctaa 147
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttcggtac gcattctttg tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggatatgac tgggacaacc a 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atctacaagc gtgtaaacgg cgccc 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaatatcc cgccattatc t 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaatgaagac cagcttgaaa ggtt 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcgcttatt cacgtagata g 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcctacaacg tcaacatcaa gttg 24
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcggcgcgtt cgtactgt 18
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctcccacaa cgaggactac accatcg 27

Claims (11)

1.一种检测非洲猪瘟病毒的分子标记，其特征在于，所述的分子标记包含有用于检测非洲猪瘟病毒的通用型分子标记，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的分子标记，用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的分子标记；
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型分子标记，其核酸序列为SEQ ID NO:1；
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的分子标记，其核酸序列为SEQ ID NO:2；
所述用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的分子标记，其核酸序列为SEQ ID NO:3。
2.一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与疫苗株的引物和探针组，其特征在于，所述的引物和探针组中包含有用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针组，用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针组，用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的引物和探针组；
所述用于检测非洲猪瘟病毒的通用型引物和探针组，其引物和探针的序列信息如下：
正向引物序列为SEQ ID NO:4；
反向引物序列为SEQ ID NO:5；
探针序列为SEQ ID NO:6；
所述用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物和探针组，其引物和探针的序列信息如下：
正向引物序列为SEQ ID NO:7；
反向引物序列为SEQ ID NO:8；
探针序列为SEQ ID NO:9；
所述用于检测非洲猪瘟病毒疫苗株的引物和探针组，其引物和探针序列信息如下：
正向引物序列为SEQ ID NO:10；
反向引物序列为SEQ ID NO:11；
探针序列为SEQ ID NO:12。
3.如权利要求2所述的引物和探针组，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒通用型探针、野毒株探针、疫苗株探针分别用不同荧光基团进行标记。
4.如权利要求2或3所述的引物和探针组，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒通用型探针、野毒株探针、疫苗株探针5'-端所标记的标记荧光报告基团为FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Cy3、Quasar 570、ROX、TxRd、Cy5、Quasar 670或Cy5.5，3'端标记荧光淬灭基团BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA。
5.权利要求2-4任一项所述的引物和探针组在制备用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的鉴别检测试剂制品中的应用。
6.一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求2-4任一项所述的引物和探针组。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于荧光PCR扩增检测的试剂。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括非洲猪瘟病毒阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒或其DNA、含有非洲猪瘟病毒B646L基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒B646L基因片段的DNA样品；
所述试剂盒还包含非洲猪瘟病毒野毒株阳性对照，阳性对照可为非洲猪瘟病毒野毒株或其DNA、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因的质粒、含有非洲猪瘟病毒EP402R基因片段的DNA样品；
所述试剂盒还包括非洲猪瘟疫苗株阳性对照，阳性对照可为***红色荧光蛋白mCherry基因的非洲猪瘟病毒疫苗株或其DNA、含有红色荧光蛋白mCherry基因的质粒、含有mCherry基因片段的DNA样品。
9.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括阴性对照，所述阴性对照为去离子水或磷酸缓冲液。
10.一种非疾病诊断治疗目的的检测非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求2-4任一项所述的引物和探针组，或包含权利要求2-4任一项所述的引物和探针组的试剂盒对受试样品提取的核酸进行PCR扩增反应，扩增产物进行检测确定受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的样品包括家猪或野猪的组织脏器、全血、血清、粪便、眼拭子、咽拭子、鼻拭子、肛拭子；所述样品还包括猪肉制品；所述样品还可包括环境拭子、车辆拭子；所述样品还包括软蜱、蜱、苍蝇、老鼠、蚊子等其他动物样品。
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