CN111876406B - 磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 - Google Patents

磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了磁性纳米粒‑脂肪酶‑金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用，该复合催化材料以金属有机框架作为一种新型的固定化酶材料，将脂肪酶和磁性纳米粒包裹在其内部形成。本发明制备得到磁性纳米粒‑脂肪酶‑金属有机框架复合催化材料后，将其加入植物甾醇和酯化试剂的混合溶液中，催化酯化反应得到植物甾醇酯产品。本发明的复合催化材料能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性，并且因为添加了磁性纳米粒从而简化了分离步骤。

Description

磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及催化剂技术领域，具体涉及一种磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用。
背景技术
植物甾醇作为一类天然功能活性物质，广泛存在于植物细胞与组织中，但是其低油溶性极大地限制了其在现实中的应用，然而植物甾醇酯却很好的解决了这个问题，作为一个人工合成的天然物质，不仅无毒副作用而且保留了植物甾醇的生物活性，具有降低胆固醇、消炎、抗癌以及调节机体内生理激素水平等功能，可以作为一种功能性成分广泛应用于医药、食品等行业中，但是其水溶性、脂溶性较差，生物利用率较低，大大限制了植物甾醇的应用。然而植物甾醇酯则在保留了植物甾醇活性的同时，提高了其脂溶性，从而大大提高了植物甾醇在人体中的利用率。
目前国内外合成的植物甾醇主要为长链饱和与不饱和脂肪酸酯，最常用的为化学法合成和酶法合成。化学法合成步骤过于复杂，且使用试剂不环保，酶法合成相对于化学法合成更为环保绿色，酶法合成的反应条件更为温和、酯化率高、副产物少、对环境危害小等特点，但是使用游离酶进行催化，难以维持酶的活性以重复利用，催化成本较高，酶易受pH、温度等环境因素影响，从而影响反应的酯化率，需要对酶进行保护以维持其生物活性。因此急需一种新型复合催化材料则可以在绿色环保的基础上，极大程度的维持酶的活性以重复利用，降低酯化成本。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，本发明的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料具有易磁性吸附分离、高多孔性、比表面积大、可调控的孔径、良好的热稳定性和化学稳定性等优点，可对酶进行保护，使酶能够耐受一定程度的变性条件，如温度、PH及有机溶剂等，维持酶的活性且实现酶的多次重复利用，解决了酯化反应中，酶易溶于水且易被环境影响其活性，难以收集以重复利用，催化成本高的问题，同时磁性纳米粒的增加，可以使复合催化材料更易于后续磁性吸附分离，简化后续催化材料的分离步骤。
本发明还提供了磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法和应用，通过使用本发明的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料作为催化剂，解决脂肪酶催化合成植物甾醇酯的过程中，存在的脂肪酶溶于水且活性易被环境影响，难以收集以多次重复利用的问题。
技术方案：本发明所述一种磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，所述复合催化材料以Zn基MOFs材料作为载体，将磁性纳米粒与脂肪酶包裹在其内部形成。
其中，所述Zn基MOFs材料为ZIF-8、ZIF-90或MAF-7。
作为优选，所述脂肪酶为脂肪酶(Lipase from Pseudomonas fluorescens)、Lipozyme 435脂肪酶或者脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)。
本发明所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备聚多巴胺(PDA)包裹的磁性纳米粒(MNPs)：首先将Fe3O4放入氯仿中超声分散，然后将盐酸多巴胺加入二甲基亚砜溶液后加入含Fe3O4磁性纳米粒的氯仿溶液，搅拌均匀后振荡反应；
(2)反应结束后冷却至室温，在步骤(1)的得到反应液中加入正己烷后，以离心后取固体，干燥，得到粉状PDA-MNPs；
(3)制备磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料：将制备的PDA-MNPs粉末加入二甲基甲酰胺溶液中进行溶解，搅拌混匀后加入到脂肪酶液、硝酸锌溶液、咪唑溶液的混合溶液中搅拌均匀，反应后得到含有复合催化材料的反应液；
(4)将步骤(3)的反应液进行离心洗涤、晾干，得到磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料。
其中，步骤(1)所述超声分散时间为4～6min，Fe3O4与盐酸多巴胺摩尔为1:3～1:6，所述振荡反应为水浴恒温振荡温度为70～80℃，转速为100～200rpm，反应时间为1～1.5h，其中Fe3O4为商业化的磁性纳米四氧化三铁。
其中，步骤(2)中正己烷与步骤(1)的反应液体积比为1:1；离心转速为10,000～13,000rpm；离心15～20min。
其中，步骤(3)将0.3～1mg PDA-MNPs粉末加入到0.6mL二甲基甲酰胺溶液中溶解，所述搅拌反应在35-45℃搅拌反应15～25h得到含有复合催化材料的反应液。
作为优选，所述搅拌反应在37℃、500rpm条件下反应24h得到含有复合催化材料的反应液。
其中，步骤(4)所述离心条件为8,000～12,000rpm、4～6min。
本发明所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料在制备在植物甾醇酯中的应用。
其中，所述的应用，包括如下步骤：
(1)将植物甾醇和酯化试剂混合后加入有机溶剂，充入氮气密封后振荡混合；
(2)待植物甾醇溶解后，加入磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及脱水剂，充入氮气密封后振荡反应；
(3)将步骤(2)的反应液离心，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化剂，洗涤以重复利用，上层油状物冷却后过滤，随后用碳酸氢钠溶液洗涤，再用乙醇洗涤去除过量的酯化试剂和植物甾醇，随后与环己酮混匀后加热至溶解后停止加热，自然冷却至室温结晶，再进行重结晶后过滤，最后对产品进行干燥，得到植物甾醇酯。
其中，步骤(1)所述植物甾醇包括胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、或者菜油甾醇，所述酯化试剂包括丙酮酸，共轭亚油酸或者乙酸；所述有机溶剂包括叔丁醇、丁酮、叔戊醇、环己烷或者正己烷，其中植物甾醇与酯化试剂摩尔比为1:2～1:5。
其中，步骤(1)所述密封后在35～40℃水浴中振荡混合，转速为100～300rpm，时间20-40min。
其中，步骤(2)所述磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料加入量为底物(植物甾醇和酯化试剂)质量的5％～10％；所述振荡反应为50～60℃水浴振荡反应，转速为100～300rpm，反应时间为38～45h。
进一步地，所述脱水剂为分子筛，其添加量为40mg/mL。
其中，步骤(3)所述的离心条件为9,000～12,000rpm、4～6min，干燥温度为70～90℃、1～2h。
其中，充入氮气为充满氮气对反应体系进行惰性气体保护。
其中，步骤(1)和(2)所述的酶复合催化材料催化反应路线为：
Figure BDA0002545119500000031
本发明中的植物甾醇主要包括包含植物甾醇乙酸酯和植物甾醇亚油酸酯为油状固体。
具体地，本发明的制备优选包括三个部分：
第一部分：聚多巴胺包裹的磁性纳米粒(MNPs)的制备
首先将Fe3O4磁性纳米粒放入氯仿溶液中超声分散4～6min，以解除其因磁性吸引和范德华力作用产生的聚沉现象。然后将盐酸多巴胺加入二甲基亚砜溶液后加入含Fe3O4磁性纳米粒的氯仿溶液(盐酸多巴胺与Fe3O4摩尔比为3:1～6:1)，搅拌均匀后放至水浴恒温振荡中，在70～80℃下、100～200rpm反应1～1.5h，在反应中多巴胺容易被氧化成多巴醌，多巴醌与剩余多巴胺易交联聚合，从而形成聚多巴胺(PDA)包裹的Fe3O4磁性纳米粒。反应结束后冷却至室温，然后加入正己烷(正己烷与反应液体积比为1:1)，10,000～13,000rpm转速离心15～20min后过滤，干燥，得到粉状PDA-MNPs；
第二部分：磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备
1、MNPs-Lip@ZIF-8
取制备的0.3mg PDA-MNPs粉末加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和脂肪酶(Lipase from Pseudomonas fluorescens)(0.1-0.5mg/ml)混合溶液中，再加入2-methyl-imidazole(HmIm,640mM)溶液并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
2、MNPs-Lip@ZIF-90
取制备的0.3mg PDA-MNPs粉末加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和脂肪酶(Lipase from Pseudomonas fluorescens)(0.1-0.5mg/ml)混合溶液中，再加入2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)溶液并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、MNPs-Lip@MAF-7
取制备的0.3mg PDA-MNPs粉末加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到Zn(NO3)2·6H2O(40mM)，和脂肪酶Pseudomonas(0.1-0.5mg/ml)混合溶液中，在制备MNPs-Lip@MAF-7时优选还加入了10％NH3·H2O(60μL)再加入3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz，120mM)溶液并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
第三部分：磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料(MNPs-Lip@MOFs)催化植物甾醇的酯化反应。
将摩尔比为1:2～1:5的植物甾醇和酯化试剂(丙酮酸、共轭亚油酸等)混合后加入三口烧瓶中，再加入适量的有机溶剂，充入氮气密封后放入35～40℃的水浴振荡器中，100～300rpm转速下混合20～40min。然后加入底物质量的5％～10％MNPs-Lip@MOFs催化材料和分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入50～60℃的水浴振荡器中，100～300rpm转速下反应38～45h后结束反应。将产物离心，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的酯化试剂和植物甾醇，随后与环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后停止加热，自然冷却至室温结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后70～90℃下干燥1～2h除水，得到较纯的植物甾醇酯。
采用上述组合工艺，使得脂肪酶被包裹在金属有机框架材料中，使得环境对酶的影响变小，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，并且因为添加了磁性纳米粒，从而使得催化剂与反应产物的分离更为容易，简化了后续分离纯化步骤。本发明的复合催化材料能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性。
本发明通过金属有机框架材料对脂肪酶、磁性纳米粒进行包裹形成磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，再使用复合催化材料对植物甾醇进行酯化，最后对复合催化材料进行收集以重复利用。使用MOF材料对脂肪酶进行包裹，保护酶免受外界环境影响，可使酶耐受温度、PH及有机溶剂的变化维持了酶的活性，提高酶的重复利用率，具体可以重复利用于植物甾醇酯化反应，降低植物甾醇的酯化反应成本。此外，复合磁性纳米粒(MNPs)的加入，更加有利于简化催化剂与反应物的分离步骤，提高复合催化剂复合催化材料的机械性能，提高操作的简便性，进而降低反馈抑制实现复合催化剂复合催化材料的重复利用。
本发明使用金属有机框架材料(Metal-Organic Frameworks,MOFs)，是一种以金属离子为连接点，有机配体为支撑，通过金属离子和有机配体之间通过自组装形成的具有二维或三维晶体结构。在酶催化反应中，用金属有机框架材料将酶进行包裹固定，形成酶-金属有机框架材料复合物相比于游离酶来说有以下优点：反应过程中，能够耐受一定程度的变性条件，如温度、pH及有机溶剂等；金属有机框架材料的多孔特性可以促进酶与底物的接触，提高反应速率。在酶-金属有机框架材料复合物的基础上复合磁性纳米粒(MNPs)，更加有利于简化催化剂与反应物的分离步骤，提高复合催化材料的机械性能，提高操作的简便性，进而降低反馈抑制实现复合催化材料的重复利用。
有益效果：与现有技术相比，1、本发明制备的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料是一种易磁性吸附分离、具有高孔隙率、高比表面积、结构可调控的稳定材料，在对脂肪酶进行包裹形成复合催化材料后，可极大程度的保持酶原有的高效、温和及专一的酶催化活性，同时克服了游离酶的不足，使酶的存储稳定性提高，易于后续回收，简化复合催化材料回收步骤、提高重复利用率，并且降低反应成本。
2、本发明将脂肪酶、磁性纳米粒包裹在金属有机框架材料中，使得环境对酶活性的影响变小，维持了酶的活性，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，也加快了酶促反应的效率。本发明的复合催化材料能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，而且因为添加了磁性纳米粒，可以简化复合催化材料的后续分离步骤，进而可以更为简便的回收利用进一步降低生产成本。
3、本发明制备简单，使用方便，原料来源广泛，制备得到的植物甾醇酯保留了植物甾醇活性的同时，提高了其脂溶性，从而大大提高了植物甾醇在人体中的利用率，可广泛应用于医药、食品等行业中。
附图说明
图1为Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图2为Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图3为Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图4为脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的不同环境下酶活示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中，Lipozyme 435脂肪酶(购买于诺维信生物技术有限公司)、脂脂肪酶(Lipasefrom Pseudomonas fluorescens)(购自阿拉丁试剂有限公司，产品编号L299014，实施例中简称脂肪酶Pseudomonas)，脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)(sigma公司，L1754)；Fe3O4(购自阿拉丁试剂有限公司，≤30nm，产品编号：140494)为Fe3O4磁性纳米粒；胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇(购买于阿拉丁试剂有限公司)，共轭亚油酸(购买于国药集团化学试剂有限公司)；分子筛(
Figure BDA0002545119500000071
购自国药集团化学试剂有限公司)；盐酸多巴胺(购买于国药集团化学试剂有限公司)；2-methyl-imidazole(2-甲基咪唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)、Imidazole-2-carboxaldehyde(咪唑-2-甲醛，购买于阿拉丁试剂有限公司)、3-methyl-1,2,4-triazole(3-甲基-1,2,4-三氮唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)。
实施例1
PDA包裹的磁性纳米粒(MNPs)的制备：
将(20mg，86.38mmol)Fe3O4磁性纳米粒放入25ml氯仿溶液中超声分散5min，以解除其因磁性吸引和范德华力作用产生的聚沉现象。然后将(81.9mg，431.89mmol)盐酸多巴胺加入70ml DMF溶液后加入含Fe3O4磁性纳米粒的氯仿溶液(盐酸多巴胺与Fe3O4摩尔比为5:1)，搅拌均匀后放至水浴恒温振荡中，在75℃下、150rpm反应1h。反应结束后冷却至室温，然后加入正己烷混匀(正己烷与反应液体积比为1:1)，12,000rpm转速离心15min后取固体，干燥，得到粉状PDA-MNPs。
实施例2
MNPs-Lip@MOFs的制备：
1、MNPs-Lip@ZIF-8
取0.3mg PDA-MNPs粉末(实施例1)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和2mL脂肪酶Pseudomonas(0.33mg/ml)混合溶液中，再加入5mL 2-methyl-imidazole(HmIm，640mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在37℃、500rpm条件下反应24h。反应结束后，10,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
2、MNPs-Lip@ZIF-90
取0.3mg PDA-MNPs粉末(实施例1)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和2mL脂肪酶Pseudomonas(0.33mg/ml)混合溶液中，再加入5mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在37℃、500rpm条件下反应24h。反应结束后，10,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、MNPs-Lip@MAF-7
取0.3mg PDA-MNPs粉末(实施例1)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)，1mL质量分数10％NH3·H2O(60μL)和2mL脂肪酶Pseudomonas(0.33mg/ml)混溶液中，再加入5mL3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz，120mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在37℃、500rpm条件下反应24h。反应结束后，10,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
实施例3
MNPs-Lip@MOFs催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯的制备方法：
1、MNPs-Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，谷甾醇(4.44g，10.70mmol)混合后(总质量约为13.44g)，按摩尔比(正己烷：共轭亚油酸为1:5)加入正己烷，充入氮气密封后放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下混合30min。然后加入实施例2制备的1.3g MNPs-Lip@ZIF-8催化材料和
Figure BDA0002545119500000081
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入55℃的水浴振荡器中，150rpm转速下反应40h后结束反应。将产物离心，条件为10000rpm、5min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用质量分数5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的共轭亚油酸和植物甾醇，随后与15mL环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后，自然冷却至25℃结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后75℃下干燥1h，得到植物甾醇亚油酸酯。
通过紫外分光光度计对植物甾醇亚油酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到81.0％，使用上述相同的酯化方法，对MNPs-Lip@ZIF-8复合催化材料进行重复利用率评价，重复利用4次时其转化率仍可达到75％以上。
本实施例酯化反应结束后将产物离心，取上层油状物，对其余溶液进行收集，在收集后的溶液中放入磁铁，对复合催化材料进行吸附，随后将吸附的颗粒物取下，并用超纯水洗涤、干燥后重复进行植物甾醇酯化反应，并对酯化转化率进行计算，因为添加了磁性纳米粒，可以简化复合催化材料的后续分离步骤，进而可以更为简便的回收利用进一步降低生产成本。
2、MNPs-Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，谷甾醇(4.44g，10.70mmol)混合后按摩尔比(正己烷：共轭亚油酸为1:5)加入正己烷，充入氮气密封后放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下混合30min。然后加入实施例2制备的1.3g MNPs-Lip@ZIF-90催化材料和
Figure BDA0002545119500000091
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入55℃的水浴振荡器中，150rpm转速下反应40h后结束反应。将产物离心，条件为10000rpm、5min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的共轭亚油酸和植物甾醇，随后与15ml环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后，自然冷却至25℃结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后75℃下干燥1h，得到植物甾醇亚油酸酯。
通过紫外分光光度计对植物甾醇亚油酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到82.0％，使用上述相同的酯化方法，对MNPs-Lip@ZIF-90复合催化材料进行重复利用率评价，重复利用6次时其转化率仍可达到75％以上。
3、MNPs-Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，谷甾醇(4.44g，10.70mmol)混合后按摩尔比(正己烷：共轭亚油酸为1:5)加入正己烷，充入氮气密封后放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下混合30min。然后加入实施例2制备的1.3g MNPs-Lip@MAF-7催化材料和
Figure BDA0002545119500000092
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入55℃的水浴振荡器中，150rpm转速下反应40h后结束反应。将产物离心，条件为10000rpm、5min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的共轭亚油酸和植物甾醇，随后与15ml环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后，自然冷却至25℃结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后75℃下干燥1h，得到植物甾醇亚油酸酯。
通过紫外分光光度计对植物甾醇亚油酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到82.9％，使用上述相同的酯化方法，对MNPs-Lip@MAF-7复合催化材料进行重复利用率评价，重复利用6次时其转化率仍可达到75％以上。
实施例4
实施例4与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：盐酸多巴胺与Fe3O4摩尔比为3:1，搅拌均匀后放至水浴恒温振荡中，在70℃下、100rpm反应1.5h。反应结束后冷却至室温，然后加入正己烷，10,000rpm转速离心20min后过滤，干燥，得到粉状PDA-MNPs。
实施例5
实施例4与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：盐酸多巴胺与Fe3O4摩尔比为6:1，搅拌均匀后放至水浴恒温振荡中，在80℃下、200rpm反应1h。反应结束后冷却至室温，然后加入正己烷，13,000rpm转速离心15min后过滤，干燥，得到粉状PDA-MNPs。
实施例6
MNPs-Lip@MOFs的制备：
1、MNPs-Lip@ZIF-8
取1mg PDA-MNPs粉末(实施例4)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和2mL脂肪酶Pseudomonas(0.1mg/ml)混合溶液中，再加入5mL2-methyl-imidazole(HmIm,640mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在35℃、500rpm条件下反应25h。反应结束后，8000rpm离心6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
2、MNPs-Lip@ZIF-90
取0.5mg PDA-MNPs粉末(实施例5)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和2mL脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)(0.5mg/ml)混合溶液中，再加入5mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在45℃、500rpm条件下反应12h。反应结束后，12,000rpm离心6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、MNPs-Lip@MAF-7
取0.3mg PDA-MNPs粉末(实施例1)加入0.6mL DMF溶液进行溶解，搅拌混匀后加入到2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)，1mL质量分数10％NH3·H2O(60μL)和2mL脂肪酶Lipozyme435(0.3mg/ml)混合溶液中，再加入5mL3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz，120mM)溶液并加入超纯水定容至15mL。在37℃、500rpm条件下反应24h。反应结束后，10,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
实施例7
MNPs-Lip@MOFs催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯的制备方法：
1、MNPs-Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，胆甾醇(4.14g，10.70mmol)混合后(总质量约为13.14g)，按摩尔比(叔丁醇：共轭亚油酸为1:5)加入叔丁醇，充入氮气密封后放入35℃的水浴振荡器中，100rpm转速下混合40min。然后加入底物质量的5％实施例2制备的MNPs-Lip@ZIF-8催化材料和
Figure BDA0002545119500000112
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入50℃的水浴振荡器中，100rpm转速下反应45h后结束反应。将产物离心，条件为9000rpm、6min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用质量分数5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的共轭亚油酸和植物甾醇，随后与15mL环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后，自然冷却至25℃结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后70℃下干燥2h，得到植物甾醇亚油酸酯。
2、MNPs-Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，谷甾醇(4.44g，10.70mmol)混合后按摩尔比(丁酮：共轭亚油酸为1:5)加入丁酮，充入氮气密封后放入40℃的水浴振荡器中，300rpm转速下混合20min。然后加入底物质量的10％实施例2制备的MNPs-Lip@ZIF-90催化材料和
Figure BDA0002545119500000111
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气后封闭放入60℃的水浴振荡器中，300rpm转速下反应45h后结束反应。将产物离心，12000rpm、4min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。上层油状物冷却后过滤，随后用5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用乙醇洗涤去除过量的共轭亚油酸和植物甾醇，随后与15ml环己酮混匀后加入到烧瓶，加热至溶解后，自然冷却至25℃结晶，再进行3次重结晶后过滤，最后90℃下干燥1h，得到植物甾醇亚油酸酯。
实施例8
实施例8采用实施例3中3相同的制备方法，不同之处在于，为MNPs-Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯，其中共轭亚油酸替换成丙酮酸，谷甾醇与丙酮酸摩尔比为1:2，有机溶剂为叔戊醇，催化材料采用实施例6制备的MNPs-Lip@MAF-7。
实施例9
实施例9采用实施例3中1相同的制备方法，不同之处在于，共轭亚油酸替换成乙酸，谷甾醇与乙酸摩尔比为1:5，有机溶剂为环己烷，催化材料采用实施例6制备的MNPs-Lip@ZIF-90，MNPs-Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯。
实施例10
测试本发明实施例2中不同脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的不同环境下酶活，对比为未被MOFs材料包裹的游离的脂肪酶的酶活。结果如图4所示(图中从左到右按顺序为游离脂肪酶以及MNPs-Lip@MAF-7、MNPs-Lip@ZIF-90、MNPs-Lip@ZIF-8包裹的脂肪酶)。
将实施例2中三种脂肪酶-金属有机框架复合催化材料以及游离酶分别置于不同温度、有机溶剂和不同pH的溶液中处理2小时。将处理后得到的三种复合催化材料及游离酶用于植物甾醇的酯化反应，然后通过紫外分光光度计对植物甾醇酯进行定量分析，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，酶活性比值(相对活性％)为处理后的复合催化材料及游离酶进行酯化反应的转化率与原有游离酶催化的转化率之比。从图4的实验结果进行分析可以得出，MNPs-Lip@ZIF-8、MNPs-Lip@ZIF-90、MNPs-Lip@MAF-7包裹的脂肪酶与游离酶相比都对酶具有很好的保护作用，并且MNPs-Lip@MAF-7对酶的保护效果对比来说最好。

Claims (9)

1.一种磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述复合催化材料以Zn基MOFs材料作为载体，将磁性纳米粒与脂肪酶包裹在其内部形成，所述Zn基MOFs材料为MAF-7；
所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备聚多巴胺 (PDA)包裹的磁性纳米粒 (MNPs)：首先将Fe3O4放入氯仿中超声分散，然后将盐酸多巴胺加入二甲基亚砜溶液后加入含Fe3O4的氯仿溶液，搅拌均匀后振荡反应；
（2）反应结束后冷却至室温，在步骤（1）的得到反应液中加入正己烷后，以离心后取固体，干燥，得到粉状PDA-MNPs；
（3）制备磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料：将制备的PDA-MNPs粉末加入二甲基甲酰胺溶液中进行溶解，搅拌混匀后加入到脂肪酶液、硝酸锌溶液、3-甲基-1,2,4-三氮唑溶液混合液中搅拌均匀，反应后得到含有复合催化材料的反应液；所述硝酸锌和3-甲基-1,2,4-三氮唑的摩尔比为1：7.5；
（4）将步骤（3）的反应液进行离心洗涤、晾干，得到磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述脂肪酶为脂肪酶Lipase from Pseudomonas fluorescens、Lipozyme 435 脂肪酶或者脂肪酶 Lipase from Candida rugosa。
3.一种权利要求1所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备聚多巴胺 (PDA)包裹的磁性纳米粒 (MNPs)：首先将Fe3O4放入氯仿中超声分散，然后将盐酸多巴胺加入二甲基亚砜溶液后加入含Fe3O4的氯仿溶液，搅拌均匀后振荡反应；
（2）反应结束后冷却至室温，在步骤（1）的得到反应液中加入正己烷后，以离心后取固体，干燥，得到粉状PDA-MNPs；
（3）制备磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料：将制备的PDA-MNPs粉末加入二甲基甲酰胺溶液中进行溶解，搅拌混匀后加入到脂肪酶液、硝酸锌溶液、3-甲基-1,2,4-三氮唑溶液混合液中搅拌均匀，反应后得到含有复合催化材料的反应液；所述硝酸锌和3-甲基-1,2,4-三氮唑的摩尔比为1：7.5；
（4）将步骤（3）的反应液进行离心洗涤、晾干，得到磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述超声分散时间为4～6min，Fe3O4与盐酸多巴胺摩尔为1:3～1:6，所述振荡反应为水浴恒温振荡，温度为70～80℃，转速为100～200 rpm，反应时间为1～1.5 h；步骤（2）中正己烷与步骤（1）的反应液体积比为1:1；步骤（3）将0.3～1mg PDA-MNPs粉末加入到0.6 mL二甲基甲酰胺溶液中溶解，所述搅拌反应为在35-45℃搅拌反应15～25 h得到含有复合催化材料的反应液。
5.一种权利要求1所述的磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料在制备植物甾醇酯中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将植物甾醇和酯化试剂混合后加入有机溶剂，充入氮气密封后振荡混合；
（2）待植物甾醇溶解后，加入磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及脱水剂，充入氮气密封后振荡反应；
（3）将步骤（2）的反应液离心，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化剂，洗涤以重复利用，上层油状物冷却后过滤，随后用碳酸氢钠溶液洗涤，再用乙醇洗涤去除过量的酯化试剂和植物甾醇，随后与环己酮混匀后加热至溶解后停止加热，自然冷却至室温结晶，再进行重结晶后过滤，最后对产品进行干燥，得到植物甾醇酯。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述植物甾醇包括胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、或者菜油甾醇；所述酯化试剂包括丙酮酸，共轭亚油酸或者乙酸；所述有机溶剂包括叔丁醇、丁酮、叔戊醇、环己烷或者正己烷，其中植物甾醇与酯化试剂摩尔比为1:2～1:5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述密封后在35～40 ℃水浴中振荡混合，转速为100～300 rpm，时间20-40min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述磁性纳米粒-脂肪酶-金属有机框架复合催化材料加入量为底物质量的5%～10%；所述振荡反应为50～60 ℃水浴振荡反应，转速为100～300 rpm，反应时间为38～45 h。
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