CN111875817A - 一种中空微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子材料和生物医学工程技术领域，涉及一种中空微球的制备方法和应用。本发明采用与有机溶剂和水分别互溶的醇(尤其是乙醇)作为致孔剂，通过一步乳化法制备出聚乳酸‑羟基乙酸微球。通过该方法制得的微球具有内部中空、密度较小、直径在100～500μm且直径分布较窄的特点；通过调节醇的用量还可以制得不同内部结构的微球，在表面修饰具有生物活性的材料(如明胶)后，使其在组织工程、细胞载体方面具有较大的应用价值。醇作为致孔剂既可与油相形成稳定溶液，不分层，得到内部中空的均一微球；同时，所得微球密度较小，直径在100～500μm，符合三维细胞培养微载体要求，适于细胞培养。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料和生物医学工程技术领域，涉及一种中空微球的制备方法，通过该方法制备的中空微球，以及该中空微球的应用。
背景技术
聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种由两种单体——乳酸 (LA)和羟基乙酸(GA)无规共聚而成的、生物可降解的、安全无毒的高分子材料，在体内降解后分解成CO2和H2O。PLGA具有良好的生物相容性，1997年被美国FDA批准作为药用辅料，在组织工程领域具有广泛的应用。
由于实心PLGA微球在体内和体外的降解时间均很长，使其应用范围受限，因此制备多孔微球，加速微球降解成为近几年研究的热点。目前已经报道的用于制备PLGA多孔微球的致孔剂种类繁多，如碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、聚乙烯醇(PVA)、普朗尼克(Pluronic)F-127、明胶(gelatin)等。 Chung H.J.等人用明胶作为致孔剂，采用微流控的方式，制备了多孔PLGA微球，并用于 C2C12-成肌细胞的培养[1]。KimH.K.等人用F-127作为致孔剂，制备了装载重组人生长激素的PLGA微球，但是微球的直径小，仅限用于药物缓释，并且F-127有毒，大量生产时残留较多，毒性大，生物相容性差[2]。Qutachi O.等人用PBS作为致孔剂，制备了多孔PLGA 支架，并应用于3T3-小鼠成纤维细胞的培养[3]。但是，PLGA属于疏水性材料，只能溶于二氯甲烷、丙酮等有机溶剂，而上述致孔剂大多为水溶性物质，油相与水相混合后很快就会发生分层现象，导致所得的PLGA多孔微球的孔洞不均一，同时给大规模工业化生产也带来很大的难题。
CN108348646A公开了一种用于预防或治疗软组织疾病的多孔聚合物微球的制造方法，该方法即以明胶作为致孔剂，所得载药微球则存在形貌不均一的情况。CN105982862A公开了一种多孔微球的制备方法，该方法通过静电喷丝的方式，利用两种溶剂的饱和蒸气压差值进行致孔，最终获得多孔微球。虽然该方法本身使用均相体系，避免了两相溶剂发生分层现象，但对于生产设备的要求较高，在一定程度上限制了该方法的应用范围。
据报道，较为适于细胞培养的微载体的尺寸约为100-300μm[4,5]。在目前已经报道的用于PLGA微球的制造方法中，有人将PLGA溶于二氯甲烷和乙醇的混合溶剂，然后将药物溶于带有乳化剂的水相中，再与PLGA溶液共混超声，最后加入PVA溶液乳化，得到直径小于10μm的微球，甚至纳米球。混合溶剂可以改变药物的分布形态，提高药物的包载效率，但是此方式制备出的球直径较小，多数应用于药物缓释，没有细胞培养等方面的应用。GravesR.A.等(2006)用乙醇作为共溶剂制备的PLGA微胶囊(microcapsules)其直径小于100μm，可提高脑啡肽的装载和缓慢释放[6]；但由于其尺寸小，该PLGA微胶囊仍不适于细胞增殖。
发明内容
发明要解决的问题
为解决制备微球的乳化过程中油水两相易分层，微球内部结构不均一，进而导致微球密度大、降解时间长等问题，本发明以PLGA为原料，先将PLGA溶解在有机溶剂中，后与醇混合，再以乳化法制得内部中空的，直径为100～500μm的PLGA微球。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供了一种中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球的制备方法，其包括下列步骤：
1)将聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到聚乳酸-羟基乙酸溶液；
2)将致孔剂加入到步骤1)中的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，并均质，形成混合溶液；
3)将步骤2)中的混合溶液在液面以下加入到聚乙烯醇水溶液中，并搅拌成乳液，待去除致孔剂和有机溶剂后，得到剩余物；
4)将步骤3)中的剩余物收集，洗涤，得到直径为100～500μm的中空聚乳酸-羟基乙酸微球；
5)将步骤4)中的中空聚乳酸-羟基乙酸微球表面活化，得到活化的中空聚乳酸-羟基乙酸微球；
6)将步骤5)中的活化的中空聚乳酸-羟基乙酸微球与明胶溶液混合并反应，经收集、洗涤和干燥，获得中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球。
进一步地，在上述制备方法中，步骤1)中聚乳酸-羟基乙酸中的两种单体单元-乳酸和羟基乙酸的摩尔比为85:15～50:50。
进一步地，在上述制备方法中，步骤1)中聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为 3000～200000Da。
进一步地，在上述制备方法中，步骤1)中有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、已烷、石油醚、苯、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜和苯甲醇中的至少一种，优选二氯甲烷。
进一步地，在上述制备方法中，步骤1)中聚乳酸-羟基乙酸溶液的质量浓度为1～35 g/100mL，优选2～10g/100mL。
进一步地，在上述制备方法中，步骤2)中致孔剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇中的至少一种，优选乙醇。
进一步地，在上述制备方法中，步骤2)中致孔剂和有机溶剂的体积比为1:1～1:40，优选1:2～1:20。
进一步地，在上述制备方法中，步骤2)中均质采用均质机来完成。
进一步地，在上述制备方法中，均质机的转速为3000～30000rpm，优选10000～15000 rpm。
进一步地，在上述制备方法中，步骤2)中均质的时间为5～600s，优选30～100s。
进一步地，在上述制备方法中，步骤3)中混合溶液的加入采用注射来完成。
进一步地，在上述制备方法中，步骤3)中注射的速度为1～100mL/min，优选10～20mL/min。
进一步地，在上述制备方法中，步骤3)中聚乙烯醇水溶液的质量浓度为0.1～2g/100 mL，优选0.5～1g/100mL。
进一步地，在上述制备方法中，步骤3)中有机溶剂和聚乙烯醇水溶液的体积比为1:10～1:300，优选1:25～1:100。
进一步地，在上述制备方法中，步骤3)中的搅拌采用搅拌机来完成。
进一步地，在上述制备方法中，搅拌机的转速为30～600rpm，优选150～250rpm。
进一步地，在上述制备方法中，步骤5)中活化所使用的NHS和EDC的摩尔比 (NHS:EDC)为1:10～10:1，优选为1:8～8:1，更优选为1:5～5:1。
进一步地，在上述制备方法中，步骤5)中活化的时间为1～120min，优选5～60min，更优选15～30min。
进一步地，在上述制备方法中，步骤6)中明胶溶液为明胶水溶液，其中明胶的质量浓度(即100mL水中的明胶质量)为0.1～20％，优选为0.5～10％，更优选为1～8％。
进一步地，在上述制备方法中，步骤6)中明胶与活化的中空PLGA微球之间的反应在搅拌下进行；反应时间为1～24h，优选为4～18h，更优选为6～12h；反应温度为20～50℃，优选为33～37℃。
第二方面，本发明提供了一种中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球，其通过第一方面中的制备方法制得。
进一步地，上述聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球的直径为100～500μm，优选100～300 μm。
进一步地，上述聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球的密度为0.9～1.4g/cm3，优选1.0～1.1 g/cm3。
第三方面，本发明提供了以上述中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球作为细胞培养微载体的培养体系和培养方法。
发明的效果
通过上述技术方案的实施，能够获得如下技术效果：
(1)通过向有机溶剂-水体系中添加与二者皆可互溶的致孔剂，本发明的方法克服了乳化过程中极易出现的油水分层问题，进而避免了制得的微球密度大、降解慢等问题；又因其密度较小，直径在100～500μm，优选100～300μm，符合三维细胞培养微载体的要求，适用于细胞培养；
(2)通过调控致孔剂的用量，本发明的方法还可以获得不同壁厚直径在100～300μm 之间的微球，且制备工艺简单，易于工业化生产；
(3)通过本发明的方法制得的PLGA微球上的羧基可以连接明胶等生物相容性材料，且由于微球内部中空，密度较小，非常适合用作细胞培养载体，可广泛应用于组织工程和再生医学领域。
附图说明
图1A-1B示出了实施例一的PLGA微球的显微照片(100×)和SEM照片。
图2示出了实施例二的PLGA微球的显微照片(100×)。
图3A-3B示出了实施例二的PLGA微球的SEM照片。
图4A-4B示出了实施例三的PLGA微球的显微照片(100×)和SEM照片。
图5示出了实施例四的PLGA微球的显微照片(100×)。
图6A-6B示出了实施例五的PLGA微球的显微照片(100×)和SEM照片。
图7A-7B示出了实施例六的PLGA微球的显微照片(100×)和SEM照片。
图8A-8B示出了实施例七的PLGA微球的显微照片(100×)和SEM照片。
图9A-9B示出了实施例十一的PLGA-明胶复合微球上活细胞染色的荧光照片。
具体实施方式
[术语定义]
除非另有说明，本文中所使用的“数值A～数值B”是指包括作为端点的数值A和B在内的数值范围。
除非另有说明，本文中所使用的“可以”是指既包括进行某种行为、操作或处理，也包括不进行相应的动作。
除非另有说明，本文中所使用的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可以存在于其它实施方案中。另外，应当理解，所述要素均可以采用任何合适的方式组合在各种实施方案中。
除非另有说明，本文中所使用的术语“微球”是指任选吸附药物的高分子聚合物微粒。按照高分子聚合物基质的不同可分为天然高分子微球(如淀粉微球、明胶微球等)和合成高分子微球(如聚乳酸微球、聚乳酸-羟基乙酸微球等)。
除非另有说明，本文中所使用的术语“聚合”是指通过聚合反应将小分子化合物结合成高分子化合物的过程，此处作为反应物的“小分子化合物”通常被称为“单体”，与之对应的作为产物的“高分子化合物”通常被称为“聚合物”。
除非另有说明，本文中所使用的术语“均质”(或称“匀浆”)是指使悬浮或乳化体系中的分散质微粒化和均匀化的过程，可以同时降低分散质的尺寸和提高分散物的分布均匀性。
除非另有说明，本文中所使用的术语“注射”是指借助注射器等可定量的流体转移设备进行流体定量转移的过程。
除非另有说明，本文中所使用的术语“乳化”是指将两种互不相溶的液体混合均匀的过程。从本质上讲，乳化是通过破碎和混合的方式，使一种液体以微小液滴(分散相/内相)的形式均匀分散在另一种液体(连续相/外相)中。常见的乳化操作为机械强制乳化 (例如搅拌)。
除非另有说明，本文中所使用的术语“搅拌”是指通过人工或机器的方式在以固体或液体物料为主的混合物中转动，使其均匀分散的过程。
中空PLGA微球及其制备方法
本发明提供了一种中空PLGA微球的制备方法。该方法包括下列步骤：
1)将PLGA溶于有机溶剂中，得到PLGA溶液；
2)将致孔剂加入到步骤1)中的PLGA溶液中，并均质，形成混合溶液；
3)将步骤2)中的混合溶液在液面以下加入到PVA水溶液中，并搅拌成乳液，待去除致孔剂和有机溶剂后，得到剩余物；
4)将步骤3)中的剩余物收集，洗涤，得到直径为100～500μm的中空PLGA微球；
5)将步骤4)中的中空PLGA微球表面活化，得到活化的中空PLGA微球；
6)将步骤5)中的活化的中空PLGA微球与明胶溶液混合并反应，经收集、洗涤和干燥，获得中空PLGA-明胶复合微球。
在本发明的一些实施方案中，步骤1)中PLGA包含两种单体单元-乳酸(lacticacid， LA)(或称2-羟基丙酸)和羟基乙酸(glycolic acid，GA)(或称乙醇酸、甘醇酸)，二者之间按照一定的摩尔比进行缩聚，所得PLGA具有一定的分子量，末端基团可以为羧基封端或酯基封端。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中PLGA中的两种单体-LA和GA的摩尔比为 85:15～50:50；换言之，PLGA由85％～50％的LA和15％～50％的GA组成，二者之和为100％。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中PLGA的重均分子量为3000～200000Da。
在一些更优选的实施方案中，步骤1)中PLGA中的两种单体-LA和GA的摩尔比为85:15～50:50，且PLGA的重均分子量为3000～200000Da。
在通过乳化法制备PLGA微球的制法当中，需要使用有机溶剂来溶解PLGA，作为乳化法中的油相。
在本发明的一些实施方案中，步骤1)中的有机溶剂选自二氯甲烷(DCM)、丙酮(ACT)、氯仿(CLF)、乙酸乙酯(EA)、已烷(HEX)、石油醚(PE)、苯(BZN)、甲苯(TOL)、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)和苯甲醇(BA)中的至少一种。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中的有机溶剂为DCM。
在本发明的一些实施方案中，步骤1)中PLGA在有机溶剂中需要维持一定的浓度。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中PLGA溶液的质量浓度为1～35g/100mL；换言之，每100mL的溶液中含有1～35g的PLGA。
在一些更优选的实施方案中，步骤1)中PLGA溶液的质量浓度为2～10g/100mL。
为了避免制备微球的乳化过程中出现油水两相分离，进而避免了制得的微球结构不均一，且有可能部分微球密度过大、降解慢等问题，本发明开创性地将作为致孔剂的醇按照一定的比例加入到油相中，均质后形成混合溶液，然后再加入到PVA水溶液中，搅拌后形成复乳，并通过固化、洗涤、离心等操作，最终成功制得，直径为100～500μm(优选100～300μm)，内部中空的PLGA微球。
在本发明的一些实施方案中，步骤2)中致孔剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇中的至少一种。
在一些优选的实施方案中，步骤2)中致孔剂为乙醇。
在一些更优选的实施方案中，步骤2)中致孔剂为无水乙醇。
在本发明的一些实施方案中，步骤2)中致孔剂的用量需要与步骤1)中有机溶剂的用量相匹配。
在一些优选的实施方案中，步骤2)中致孔剂和步骤1)中有机溶剂的体积比为 1:1～1:40；换言之，每1mL的致孔剂对应1～40mL的有机溶剂。
在一些优选的实施方案中，步骤2)中致孔剂和步骤1)中有机溶剂的体积比为 1:2～1:20。
在一些更优选的实施方案中，步骤2)中致孔剂和步骤1)中有机溶剂的体积比为1:2～1:10。
致孔剂与有机相之间的混合可以通过均质操作来实现。在本发明的一些实施方案中，步骤2)中的均质采用均质机来完成。控制均质机的转速和工作时间可以完成特定的均质化。
在一些优选的实施方案中，采用均质机进行步骤2)中均质时的转速为3000～30000 rpm。
在一些更优选的实施方案中，采用均质机进行步骤2)中均质时的转速为 10000～15000rpm。
在一些优选的实施方案中，采用均质机进行步骤2)中均质时的时间为5～600s。
在一些更优选的实施方案中，采用均质机进行步骤2)中均质的时间为30～100s。
在一些最优选的实施方案中，采用均质机进行步骤2)中均质时的转速为 10000～15000rpm，时间为30～100s。
目前，PLA/PLGA型微球大多采用O/W型(或W/O/W型)制备方法进行制备[7-10]，需要将油相(或包含内水相的油相)加入到水相(或外水相)当中，并且通常以定量或定速加入(例如注射)的方式进行。在本发明的一些实施方案中，步骤3)中注射采用注射泵来完成。
在一些优选的实施方案中，采用注射泵进行步骤3)中注射时的速度为1～100mL/min。
在一些更优选的实施方案中，采用注射泵进行步骤3)中注射时的速度为10～20mL/min。
在一些优选的实施方案中，采用注射泵进行步骤3)中注射出口针头的内径为0.10～0.50mm。
在通过乳化法制备PLGA微球的制法当中，需要使用水或含水的混合溶剂来溶解PVA，作为乳化法中的水相。
在一些优选的实施方案中，步骤3)中PVA水溶液的质量浓度为0.1～2g/100mL；换言之，每100mL的溶液中含有0.1～2g的PVA。
在一些更优选的实施方案中，步骤3)中PVA水溶液的质量浓度为0.5～1g/100mL。
在通过乳化法制备PLGA微球的制法当中，油相与水相的比例直接影响最终结果。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中有机溶剂和步骤3)中PVA水溶液的体积比为1:10～1:300；换言之，每1mL的有机溶剂对应10～300mL的PVA水溶液。
在一些优选的实施方案中，步骤1)中有机溶剂和步骤3)中PVA水溶液的体积比为1:25～1:100。
搅拌是实现油水两相完成乳化的一种有效手段。在本发明的一些实施方案中，步骤 3)中的搅拌采用搅拌机来完成。搅拌机依靠搅拌部件(例如搅拌桨)在搅拌容器中的转动对内容物进行搅拌，是将气体、液体或固体颗粒分散于液体中的常用方法。
乳化条件对乳化结果有很大影响，因素之一就是搅拌速度。适宜的搅拌速度能够使油相与水相充分混合，而过低的搅拌速度，则无法达到充分混合的目的，但过高的搅拌速度，又会将气泡引入搅拌体系，使之形成三相体系，进而使乳液不稳定。
在一些优选的实施方案中，搅拌机进行步骤3)中搅拌时的转速为30～600rpm。
在一些更优选的实施方案中，搅拌机进行步骤3)中搅拌时的转速为150～250rpm。
在一些优选的实施方案中，步骤3)中有机溶剂的去除通过挥发在常温常压下进行。
在一些优选的实施方案中，步骤3)中有机溶剂的去除通过挥发在常温真空下进行。
在一些优选的实施方案中，步骤4)中水为重蒸水，即经过两次蒸馏的水。
在一些优选的实施方案中，步骤4)中洗涤的次数为2～5次。
在一些优选的实施方案中，步骤5)中活化所使用的NHS和EDC的摩尔比(NHS:EDC)为1:8～8:1。
在一些更优选的实施方案中，步骤5)中活化所使用的NHS和EDC的摩尔比 (NHS:EDC)为1:5～5:1。
在一些优选的实施方案中，步骤5)中活化的时间为1～120min。
在一些优选的实施方案中，步骤5)中活化的时间为5～60min。
在一些更优选的实施方案中，步骤5)中活化的时间为15～30min。
在一些优选的实施方案中，步骤6)中明胶溶液为明胶水溶液，其中明胶的质量浓度为0.1～20％；换言之，每100mL的溶液中含有0.1～20g的明胶。
在一些更优选的实施方案中，步骤6)中明胶溶液中明胶的质量浓度为0.5～10％。
在一些更优选的实施方案中，步骤6)中明胶溶液中明胶的质量浓度为1～8％。
在一些优选的实施方案中，步骤6)中明胶与活化的中空PLGA微球之间的反应在搅拌下进行；反应时间为1～24h，优选为4～18h，更优选为6～12h；反应温度为20～50℃，优选为33～37℃。
本发明还提供了一种中空PLGA-明胶复合微球。该中空PLGA-明胶复合微球通过上述制备方法制得。
在本发明的一些实施方案中，上述中空PLGA-明胶复合微球的直径为100～500μm。
在一些优选的实施方案中，上述中空PLGA-明胶复合微球的直径为100～300μm。
在本发明的一些实施方案中，上述中空PLGA-明胶复合微球的密度为0.9～1.4g/cm3。
在一些优选的实施方案中，上述中空PLGA-明胶复合微球的密度为1.0～1.1g/cm3。
在一些更优选的实施方案中，上述中空PLGA-明胶复合微球的直径为100～300μm，且密度为1.0～1.1g/cm3。
中空PLGA-明胶复合微球的应用
通过上述制备方法制得的中空PLGA-明胶复合微球不仅可以在平面孔板中进行细胞培养，还可以在摇瓶、生物反应器等三维培养容器中进行细胞培养。上述中空PLGA- 明胶复合微球具有较大的表面积，且内部中空，密度较小，能够提高细胞扩增效率，尤其是在培养干细胞时，能够使干细胞正常生长。
在实施例中，通过调节乙醇的用量还可以调节所得微球的结构，调整孔径或微球壁厚。微球壁越薄，微球的密度越小，降解速度越快。在三维培养时，仅需很低的转速就能搅拌微球，减少对细胞的剪切力，减少细胞的损伤和死亡。但是微球壁也不能过薄，在细胞培养搅拌的过程中，过薄的微球刚性不够，容易破损，其表面积就会减小，对细胞的培养效率就会下降。在一个实施例中，所制得的中空PLGA-明胶复合微球在细胞培养时，即使受到很大的剪切力也不会破碎，同时注入体内又能快速降解。
因此，本发明提供了上述中空PLGA-明胶复合微球用作细胞培养载体的应用。
下面将结合具体实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限定本发明的保护范围。此外，除非另有说明，下列实施例中使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。
实施例一：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(50:50，Mw＝30000～50000Da，羧基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中。加入无水乙醇(10mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图1A-1B所示的中空PLGA微球。
所得中空PLGA微球直径为100μm，密度为1.00-1.10g/cm3。
实施例二：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(10mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图2所示的中空PLGA微球。
由图3A-3B可知，通过上述方法制得的中空PLGA微球的直径约为150μm，尺寸分布均一，表面较光滑(1.50kX放大视图下)，外壁较薄，内部中空(400X放大视图下)，密度大约在1.00-1.10g/cm3之间。
实施例三：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(10mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为120rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图4A-4B所示的中空PLGA微球。
通过上述方法制得的PLGA微球的直径约为200μm，尺寸分布均一，表面较光滑，内部中空，密度大约在1.00-1.10g/cm3之间。
实施例四：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(10mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以5mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图5所示的中空PLGA微球。
通过上述方法制得的PLGA微球的直径约为250μm，尺寸分布均一，表面较光滑，内部中空，密度大约在1.00-1.10g/cm3之间。
实施例五：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(6.66mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图6A-6B所示的中空PLGA微球。
通过上述方法制得的PLGA微球的直径约为200μm，表面较光滑，内部中空，密度大约在1.00-1.10g/cm3之间，但微球的外壁有所增厚，大于实施例二中微球的壁厚。
实施例六：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(5mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径 0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到中空如图7A-7B所示的PLGA微球。
通过上述方法制得的PLGA微球的直径约为250μm，表面较光滑，内部中空，密度大约在1.00-1.10g/cm3之间，且微球的外壁进一步增厚，壁厚大于实施例五中的微球。
实施例七：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(2mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径 0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到如图8A-8B所示的中空PLGA微球。
通过上述方法制得的PLGA微球的直径约为300μm，表面较光滑，密度大约在 1.00-1.10g/cm3之间，内部中空结构进一步缩小，壁厚大于实施例六中的微球。
通过比较实施例二以及实施例五至七可知，随着乙醇用量的减少(无水乙醇与二氯甲烷的体积比依次为1:2、1:3、1:4和1:10)，所得PLGA微球的内部中空结构大致也随之变小，表明乙醇确实发挥致孔剂的作用。并且可以通过调节乙醇的用量来调节微球的内部结构，得到所需的中空PLGA微球。
实施例八：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(75:25，Mw＝66000～105000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(20mL)中，加入无水乙醇(1mL)，均质机均质60s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径 0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为0.5％的 PVA水溶液(2L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到中空PLGA微球。
实施例九：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(85:15，Mw＝50000～120000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(10mL)中，加入无水乙醇(5mL)，均质机均质100s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以10mL/min的速度注射到质量浓度为1％的 PVA水溶液(1L)中，机械搅拌速度为250rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到中空PLGA微球。
实施例十：中空PLGA微球的制备。
称取PLGA(85:15，Mw＝50000～120000Da，酯基封端)(1g)，溶于二氯甲烷(10mL)中，加入无水乙醇(0.5mL)，均质机均质100s，均质速度为13000rpm。用带有25G，内径0.25mm的注射针头的注射泵将混合溶液以20mL/min的速度注射到质量浓度为1％的PVA水溶液(1L)中，机械搅拌速度为200rpm，搅拌12h，挥发除去二氯甲烷。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到中空PLGA微球。
实施例十一：中空PLGA-明胶复合微球的制备。
将实施例一中制得的中空PLGA微球(1g)浸泡在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(8mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.66mM)的水溶液(50mL)中，采用脱色摇床(200rpm)活化羧基15min。重蒸水洗涤3次，离心收集，得到羧基活化的中空PLGA微球。
用1M氢氧化钠水溶液将质量浓度为4％的明胶水溶液(40mL)的pH值调节至8.0-9.0，然后加入到上述羧基活化的中空PLGA微球中，在200rpm和35℃条件下摇床振荡过夜，次日重蒸水反复洗涤，离心收集，得到中空PLGA-明胶复合微球。
选用BCA法测量中空PLGA-明胶复合微球中明胶含量。操作步骤：称取50mg的中空PLGA-明胶复合微球溶于完全溶于0.5mL二甲亚砜溶液中，用重蒸水稀释10倍作为样品溶液1；将中空PLGA基础微球用相同处理方法作为溶液2，用作检测时的背景。将一系列浓度的明胶溶于二甲亚砜：水＝1:9(v/v)的混合溶液中，用于建立标准曲线。将上述几种溶液分别与BCA工作液按照25μL：200μL的比例混合，37℃培养箱中孵育30分钟后，检测其吸光度，将样品溶液1的吸光度减去样品溶液2的吸光度，再根据明胶溶液的标准曲线，即可得到明胶浓度。根据上述方法，中空PLGA-明胶复合微球中明胶质量含量为4％。
实施例十二：利用中空PLGA-明胶复合微球的细胞培养。
称取实施例十一中制得的中空PLGA-明胶复合微球(0.1g)，灭菌后用50mL磷酸盐缓冲液(PBS)充分漂洗，并置于细胞培养转瓶中，然后加入干细胞培养基(天津灏洋)(50mL)，并置于细胞培养箱中，在5％CO2和37℃条件下预培养，转速设定为35rpm，使得微球能够在转瓶中均匀悬浮。预培养24h后接种干细胞，细胞接种量为1×105个细胞，每搅拌5min静置30min，共计重复6个循环，细胞始终保持悬浮状态进行培养，并于次日用FDA染色，并观察细胞粘附及增殖情况，其结果如图9A-9B所示。
由图9A-9B可知，经转瓶培养24h后，即可观察到经干细胞染色后发出的荧光，表明中空PLGA-明胶微球对干细胞粘附良好，可以用作细胞培养载体以提高细胞增殖倍数。
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Claims (21)
1.一种中空聚乳酸-羟基乙酸微球的制备方法，其包括下列步骤：
1)将聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到聚乳酸-羟基乙酸溶液；
2)将致孔剂加入所述聚乳酸-羟基乙酸溶液中，并均质，形成混合溶液；
3)将所述混合溶液在液面以下加入到聚乙烯醇水溶液中，并搅拌成乳液，待去除所述致孔剂和有机溶剂后，得到剩余物；
4)将所述剩余物收集，洗涤，得到直径为100～500μm的中空聚乳酸-羟基乙酸微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸中的乳酸单体单元和羟基乙酸单体单元的摩尔比为85:15～50:50，且所述聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为3000～200000Da。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、已烷、石油醚、苯、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜和苯甲醇中的至少一种；所述致孔剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述致孔剂为乙醇。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸溶液的质量浓度为1～35g/100mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述致孔剂和所述有机溶剂的体积比为1:1～1:40。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述致孔剂和所述有机溶剂的体积比为1:2～1:20。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述均质由均质机完成，均质机的转速为3000～30000rpm；所述均质的时间为5～600s。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液通过注射形式加入至所述聚乙烯醇水溶液中，其中注射的速度为1～100mL/min；所述搅拌的转速为30～600rpm。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度为0.1～2g/100mL；所述有机溶剂和所述聚乙烯醇水溶液的体积比为1:10～1:300。
11.一种中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球的制备方法，其包括下列步骤：
1)将权利要求1中所述中空聚乳酸-羟基乙酸微球的表面活化，得到活化的中空聚乳酸-羟基乙酸微球；
2)将所述活化的中空聚乳酸-羟基乙酸微球与明胶溶液混合并反应，经收集、洗涤和干燥，获得中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球，所述复合微球表面与明胶通过共价键结合，所述明胶的质量不高于所述复合微球的总质量的10％，且所述复合微球的直径为100～500μm。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述活化所使用的NHS和EDC的摩尔比为1:10～10:1。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述活化的时间为1～120min。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液为明胶水溶液，其中明胶的质量浓度为0.1～20％。
15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述反应在搅拌下进行，反应时间为1～24h，反应温度为20～50℃。
16.一种中空聚乳酸-羟基乙酸微球，其通过根据权利要求1-10中任一项所述的制备方法制得。
17.一种中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球，其通过根据权利要求11-15中任一项所述的制备方法制得。
18.根据权利要求17所述的中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球，其特征在于，所述中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球的密度为1.0～1.1g/cm3。
19.一种培养细胞的方法，其特征在于，该方法采用根据权利要求16所述的中空聚乳酸-羟基乙酸微球或根据权利要求17所述的中空聚乳酸-羟基乙酸-明胶复合微球作为微载体培养细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细胞为贴壁细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述贴壁细胞为293、HEK293、HEK-293T、293T、293TN、293FT、AAV-293、HUVEC、ECV-304、L929、WB-F344、L-02、THP-1、D407、CHO、间充质干细胞、胚胎干细胞或IPS。
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