CN111870698B - 凝血酶响应性网状聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凝血酶响应性网状聚合物及其在闭环凝血酶抑制剂递送中的应用，属于药物制剂技术领域，所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体、凝血酶可降解肽和血栓靶向配体经聚合反应得到。该聚合物用于包载凝血酶抑制剂，能够自适应的在高浓度凝血酶作用下快速释放荷载的凝血酶抑制剂，而在低浓度下缓慢释放，最终用于闭环凝血酶抑制剂递送，提高其抗血栓活性并降低不良反应。

Description

凝血酶响应性网状聚合物及其应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种凝血酶响应性网状聚合物及其在闭环凝血酶抑制剂递送中的应用。
背景技术
血栓是血液发生凝固时析出、凝集形成的固体物质，主要成分包括红细胞、活化的血小板以及纤维蛋白。异常的血栓形成是许多心脑血管疾病的基础病因，如肺栓塞、心肌梗塞和缺血性脑卒中等。机体的血栓形成是一个复杂的生理过程，多种凝血因子参与凝血级联反应。其中，凝血酶是一种重要的凝血因子，介导了凝血级联反应，将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而形成稳定的血栓凝块。
凝血酶抑制剂能够与凝血酶发生特异性结合，抑制其活性，防止纤维蛋白的沉积和血栓的形成。已报道的凝血酶抑制剂包括水蛭素、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、达比加群酯等，其中一部分已作为药物用于临床抗血栓治疗。相较于肝素，凝血酶抑制剂不激活血小板，不结合血浆蛋白，也不引起肝素诱导的血小板减少，并且具有线性药代动力学。但是，这些药物极易被肾清除或被体内的蛋白酶降解，导致半衰期较短，生物利用度较低。并且，在临床用药过程中发现，凝血酶抑制剂分布并沉积在皮下或是肢端等部位后会诱发局部出血，严重影响患者的健康。例如，冠状动脉内支架手术的病人接收比伐卢定抗凝治疗时，仍有大出血的风险；对具有肝素诱导的血小板减少症的患者使用来匹卢定时，仍有20％的患者发生了大出血。因此，对于这些凝血酶抑制剂而言，不仅需要提高生物利用度，也需要改善药物的体内分布，减少脱靶效应造成的不良反应。
发明内容
为了解决现有凝血酶抑制剂给药后生物利用度较低以及易产生不良反应的技术问题，本发明提供了一种凝血酶响应性网状聚合物，该聚合物用于包载凝血酶抑制剂，能够自适应的在高浓度凝血酶作用下快速释放荷载的凝血酶抑制剂，而在低浓度下缓慢释放，最终用于闭环凝血酶抑制剂递送，提高其抗血栓活性并降低不良反应。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种凝血酶响应性网状聚合物，由聚合物单体、凝血酶可降解肽和血栓靶向配体聚合后得到；
所述聚合物单体选自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、3-(N,N-二甲基氨基)丙基甲基丙烯酰胺或N-(3-(二甲基氨基)丙基)甲基丙烯酰胺；
所述凝血酶可降解肽选自氨基酸序列为LVPRGS、FPRSGG、TPRSFL或PPRSFL的肽段；
所述血栓靶向配体选自纤维蛋白靶向肽CREKA、纤维蛋白靶向肽CR(NMe)KA、纤维蛋白单克隆抗体59D8、糖蛋白受体IIb/IIIa拮抗剂RGD、磷脂酰丝氨酸结合蛋白Annexin V或I型补体。
上述凝血酶响应性网状聚合物在制备凝血酶抑制剂递送载体中的应用。
进一步地，所述凝血酶抑制剂选自水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、达比加群酯、阿加曲班、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、依诺加群、美拉加群、西美加群、RWJ-671818。
一种荷载凝血酶抑制剂的闭环调控式递药***，由上述凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到。
进一步地，所述递药***为单分子蛋白纳米囊，该单分子蛋白纳米囊由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到；
所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体N-异丙基丙烯酰胺、凝血酶可降解肽PPRSFL和血栓靶向肽CREKA经原位界面自由基聚合得到；所述凝血酶抑制剂选自水蛭素、比伐卢定、来匹卢定或地西卢定。
该单分子蛋白纳米囊通过以下步骤制备得到：
步骤1，将凝血酶抑制剂溶于碳酸盐缓冲液，冰浴搅拌下依次加入N-异丙基丙烯酰胺、N端和C端修饰烯丙基甘氨酸的PPRSFL、N端修饰烯丙基甘氨酸的CREKA；
步骤2，在上述水溶液中加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，进行反应；
步骤3，反应结束后，磷酸盐缓冲液反复洗涤，得到负载凝血酶抑制剂的单分子蛋白纳米囊。
进一步地，所述递药***为纳米凝胶，该纳米凝胶由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到；
所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体丙烯酰胺、凝血酶可降解肽LVPRGS和血栓靶向肽CR(NMe)EKA经反相乳液聚合得到；所述凝血酶抑制剂选自水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、达比加群酯、阿加曲班、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、依诺加群、美拉加群、西美加群或RWJ-671818。
该纳米凝胶通过以下步骤制备得到：
步骤1，将凝血酶抑制剂、丙烯酰胺、N端和C端修饰烯丙基甘氨酸的LVPRGS、N端修饰烯丙基甘氨酸的CR(NMe)EKA溶于水中，得到水相；
步骤2，将多库酯钠和月桂醇聚氧乙烯醚溶于正己烷中，得到有机相；
步骤3，冰浴搅拌下将所述水相加入有机相中，再依次加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，进行反应，反应结束后，旋蒸除去正己烷，用无水乙醇洗涤，干燥后即可得到荷载凝血酶抑制剂的纳米凝胶粉末。
进一步地，所述递药***为水凝胶，该水凝胶由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到；
所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体甲基丙烯酰胺、凝血酶可降解肽TPRSFL和血栓靶向肽糖蛋白受体IIb/IIIa拮抗剂RGD经自由基聚合得到；所述凝血酶抑制剂选自水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、达比加群酯、阿加曲班、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮(PPACK)，依诺加群、美拉加群、西美加群或RWJ-671818。
该水凝胶通过以下步骤制备得到：
步骤1，将凝血酶抑制剂、甲基丙烯酰胺、N端和C端修饰烯丙基甘氨酸的TPRSFL、N端修饰烯丙基甘氨酸的RGD溶于磷酸盐缓冲液中；
步骤2，在上述溶液中加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，进行反应，得到荷载凝血酶抑制剂的水凝胶。
本发明通过设计一种由聚合物单体、凝血酶可降解肽和血栓靶向配体聚合制得的凝血酶响应性网状聚合物，该聚合物可用于包载凝血酶抑制剂，作为闭环凝血酶抑制剂递送***。该递送***由于凝血酶可降解肽的作用，能够自适应的在高浓度凝血酶作用下快速释放荷载的凝血酶抑制剂，而在低浓度下缓慢释放，闭环调控凝血酶抑制剂递送的释放，模拟机体维持稳态的负反馈调节过程，提高凝血酶抑制剂的抗血栓活性并降低其不良反应。血栓靶向配体的修饰进一步提高凝血酶抑制剂的血栓靶向效率，发挥增效减毒的作用。
同时，该网状聚合物载体经由“一锅煮”的方法制备得到，在聚合反应发生制备网状聚合物的同时，药物也被包入其中，一步法完成了载体的制备与药物的包载，减少了制备步骤，提高产率和效率。由其制备得到的药物载体不仅实现了闭环式的药物释放行为，还提高了药物的稳定性，延长了药物的半衰期，改善了药物的体内分布，提高了药物的生物利用度。与脂质体和胶束等其他载体相比，这种聚合物载体具有更好的稳定性和更高的药物包封效率。
附图说明
图1为实施例1中Rho-HV/ctNCs在不同浓度的凝血酶下的释放曲线。
图2为实施例1中Rho-HV/ctNCs在交替的含有凝血酶/不含凝血酶的体系中的释放曲线。
图3为实施例1中体外形成的纤维蛋白凝块和Cy7标记的不同纳米囊孵育后的荧光统计图。
图4为实施例1中小鼠肠系膜血栓模型下，罗丹明标记的血栓和FITC标记的不同纳米囊在肠系膜血管中的荧光分布图。
图5为实施例1中小鼠肠系膜血栓模型下，给予不同的药物之后，罗丹明标记的血栓的在肠系膜血管中的荧光分布图。
图6为实施例2中Rho-HV/ctNGs在不同浓度的凝血酶下的释放曲线。
图7为实施例2中Rho-HV/ctNGs在交替的含有凝血酶/不含凝血酶的体系中的释放曲线。
图8为实施例2中Rho-HV和Rho-HV/ctNGs在大鼠体内的药动学曲线。
图9为实施例2中体外形成的纤维蛋白凝块和Cy7标记的不同纳米凝胶孵育后的荧光分布图。
图10为实施例2中小鼠肺栓塞模型下，Cy5.5标记的纤维蛋白和Cy7标记的不同纳米凝胶在肺部的荧光分布图。
图11为实施例2中小鼠颈动脉血栓模型下，罗丹明标记的血栓和FITC-BSA/ctNGs在颈动脉血管中随时间变化的荧光分布图。
图12为实施例2中小鼠肺栓塞模型下，给予不同药物后，Cy5.5标记的纤维蛋白在肺部的荧光分布图。
图13为实施例2中小鼠颈动脉血栓模型下，给予不同药物后，罗丹明标记的血栓在颈动脉血管中随时间变化的荧光分布图。
图14为实施例2中小鼠颈动脉血栓模型下，给予HV或HV/ctNGs后，不同时间诱导下罗丹明标记的血栓在颈动脉血管中的荧光分布图。
图15为实施例2中给予生理盐水或HV/ctNGs24 h后小鼠出血时间统计图。
图16为实施例3中Dab/ctHG成胶前后示意图。
图17为实施例3中Dab/ctHG在不同浓度的凝血酶下的释放曲线。
图18为实施例3中Dab/ctHG在交替的含有凝血酶/不含凝血酶的体系中的释放曲线。
图19为实施例3中小鼠颈动脉血栓模型下，给予水凝胶后罗丹明标记的血栓在颈动脉血管中的明场和荧光分布图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
“闭环调节”式单分子蛋白纳米囊的制备和评价
一、包载肽或蛋白类凝血酶抑制剂的单分子蛋白纳米囊的制备
1、具备血栓靶向性和凝血酶响应性的单分子蛋白纳米囊(ctNCs)的制备
利用固相合成法(Merrifield,R.B.,Solid phase synthesis.Science 1986,232,341-348)，合成得到N端和C端修饰烯丙基甘氨酸(G(allyl))的凝血酶可降解肽G(allyl)-PPRSFL-G(allyl)以及N端修饰G(allyl)的血栓靶向肽G(allyl)-CREKA。
分别将1mg肽或蛋白类凝血酶抑制剂水蛭素(HV)、来匹卢定(Lep)、地西卢定(Des)、比伐卢定(Biv)溶于1mL碳酸盐缓冲液(5mM,pH 9.0)中，在冰浴搅拌下依次加入N-异丙基丙烯酰胺(40mg)、G(allyl)-PPRSFL-G(allyl)(10mg)和G(allyl)-CREKA(5mg)、过硫酸铵(APS,6mg)和四甲基乙二胺(TEMED,20μL)。在冰浴搅拌下反应1h后，采用超滤法，磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)洗涤，制得荷载肽或蛋白类凝血酶抑制剂的ctNCs(HV/ctNCs、Lep/ctNCs、Des/ctNCs和Biv/ctNCs)。
2、具备血栓靶向性的非凝血酶响应性单分子蛋白纳米囊(cNCs)的制备
在处方中将G(allyl)-PPRSFL-G(allyl)替换为非凝血酶响应***联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，制备方法与ctNCs相同，制得HV/cNCs、Lep/cNCs、Des/cNCs和Biv/cNCs。
3、具备凝血酶响应性的非靶向单分子蛋白纳米囊(tNCs)的制备
在处方中不加G(allyl)-CREKA，制备方法与ctNCs相同，制得HV/tNCs、Lep/tNCs、Des/tNCs和Biv/tNCs。
二、单分子蛋白纳米囊的表征
采用ZetaPlus电位粒径仪检测纳米囊的粒径和Zeta电位，并计算包封率。
结果如表1所示，制得的纳米囊的粒径在7～11nm，多分散系数在0.1～0.2，包封率均高于50％。结果证明，制得的纳米囊大小均一，可高效包载肽或蛋白类凝血酶抑制剂。
表1 ctNCs的粒径、多分散系数与包封率
Figure BDA0002650649610000051
三、体外药物释放评价
1、包载罗丹明标记的水蛭素(Rho-HV)的纳米囊(Rho-HV/ctNCs)的制备
将HV溶于碳酸氢钠缓冲液中(100mM,pH 8.5)，然后向其中加入10个当量的罗丹明琥珀酰亚胺酯(Rho-NHS)，在室温搅拌下避光反应2h。之后将反应液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中，在PBS(pH 7.4)中透析过夜，即得Rho-HV。
参照上述纳米囊的制备方法，将HV替换为Rho-HV，制得包载Rho-HV的cNCs(Rho-HV/cNCs)、tNCs(Rho-HV/tNCs)和ctNCs(Rho-HV/ctNCs)。
2、ctNCs的凝血酶响应性药物释放
采用透析法测定纳米囊的药物释放行为。将Rho-HV/ctNCs置于透析袋(MWCO:100kDa)中，然后浸没于含有不同浓度凝血酶(0、0.2和0.5U/mL)的PBS(pH 7.4)透析介质中。在37℃下孵育不同时间后，采用酶标仪测定透析介质中罗丹明的荧光强度(激发波长:552nm；发射波长:585nm)。
结果如图1所示，ctNCs中HV的释放速率随着凝血酶浓度的增加而增加。在0U/mL凝血酶下，Rho-HV的12h释放量约为22.1％，当凝血酶浓度增至0.2和0.5U/mL时，释放量分别增至38.0％和61.3％。结果表明，ctNCs具有凝血酶响应性的释药性能，在高浓度凝血酶作用下可快速释放HV。
3、ctNCs的脉冲式药物释放
将Rho-HV/ctNCs置于透析袋中，先浸没于含有凝血酶(0.5U/mL)的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min，再浸没于不含凝血酶的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min。重复循环4次，采用酶标仪测定透析介质中罗丹明的荧光强度。
结果如图2所示，ctNCs在高浓度凝血酶作用下HV的释放速率增加，而在无凝血酶下释放速率显著降低。结果表明，ctNCs能够自适应地根据凝血酶浓度调控HV的释放速率，可响应血栓部位凝血酶的升高而快速释放荷载的HV，释放的HV作用于凝血酶抑制血栓的形成或增大，而凝血酶被抑制后，其降解ctNCs的活性也随之降低，HV的释放被抑制，达到闭环式按需释放HV的目的。
四、体外血栓靶向能力评价
1、Cy7标记的纳米囊的制备
参照上述纳米囊的制备方法，将HV替换为牛血清白蛋白(BSA)，制得BSA/ctNCs和BSA/tNCs。
在室温搅拌下，向BSA/ctNCs或BSA/tNCs溶液中缓慢滴入10个当量的Cy7-马来酰亚胺(Cy7-Mal)。滴毕，在室温下反应2h。将反应液转移至透析袋中(MWCO:3.5kDa)，在PBS(pH 7.4)中透析过夜，即得Cy7标记的纳米囊Cy7-BSA/ctNCs和Cy7-BSA/tNCs。
2、体外血栓靶向能力评价
取小鼠的抗凝全血，通过差速离心得到富血小板血浆。在96孔板中依次加入100μL富血小板血浆、凝血酶(10U/mL)与氯化钙(40mM)，在37℃下孵育1h，得纤维蛋白凝块。在凝块中分别加入100μL的测试样品溶液：(1)生理盐水；(2)Cy7-BSA/tNCs；(3)Cy7-BSA/ctNCs，在37℃下孵育5min，之后移除溶液，生理盐水洗涤3次。另设对照组(4)即在用Cy7-BSA/ctNCs加入前预先用血栓靶向肽G(allyl)-CREKA溶液孵育5min。
结果如图3所示，相比于Cy7-BSA/tNCs组，Cy7-BSA/tNCs组的Cy7荧光强度更高，并且经G(allyl)-CREKA肽预处理后，Cy7-BSA/ctNCs组的荧光显著降低，证明了ctNCs具有更强的血栓靶向能力。
五、体内血栓靶向能力评价
1、肠系膜血栓模型的构建
采用腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉C57BL/6小鼠后，腹部脱毛，尾静脉注射罗丹明6G(Rho 6G)(0.5mg/kg)。10min后，在腹部做微小切口，分离出肠系膜血管。将三氯化铁(FeCl3)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于肠系膜血管表面，维持1min，取下滤纸，在立体变焦显微镜下，观察荧光强度的变化。对于靶向和药效实验，在诱导后的5min尾静脉注射各制剂，并记录荧光强度。
2、体内血栓靶向能力评价
将BSA分散在100mM的碳酸氢钠缓冲液中(pH 8.5)，然后向其中加入10个当量的FITC，搅拌下室温避光反应2h。将反应液转移至透析袋中(MWCO:3.5kDa)在PBS(pH 7.4)中透析过夜，即得荧光素标记的BSA(FITC-BSA)。
参照上述纳米囊的制备方法，将HV替换为FITC-BSA，分别制得FITC-BSA/cNCs、FITC-BSA/tNCs和FITC-BSA/ctNCs。
C57BL/6小鼠麻醉后，尾静脉注射Rho 6G(0.5mg/kg)。10min后，暴露肠系膜血管，将FeCl3(6％)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于肠系膜血管表面，维持1min。5min后，尾静脉注射FITC-BSA/ctNCs。25min后，用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图4所示，在FeCl3处理的小鼠肠系膜血管部位检测到较强的Rho荧光信号，表明血栓形成。尾静脉注射FITC-BSA/ctNCs后，FITC荧光信号可与Rho荧光信号共定位，而尾静脉注射FITC-BSA/tNCs的小鼠的血栓区域观察到的FITC荧光信号很低。结果证明，FITC-BSA/ctNCs能够高效靶向形成的血栓。
六、体内抗血栓作用评价
C57BL/6小鼠麻醉后，尾静脉注射Rho 6G(0.5mg/kg)。10min后，暴露肠系膜血管，将FeCl3(6％)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于肠系膜血管表面，维持1min。5min后，分别尾静脉注射游离HV、HV/cNCs与HV/ctNCs。在不同时间点采用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图5所示，游离HV组Rho荧光强度显著降低，表明游离HV能够有效抑制血栓形成。HV/cNCs的体内抗血栓作用有限，原因是尽管cNCs对HV的包载作用可保护HV不受血浆蛋白水解，但cNCs不具备凝血酶响应性，无法有效释放HV，限制了其疗效的发挥。相较之下，HV/ctNCs表现出更强的抗血栓作用。
以上结果证明，ctNCs不仅可保护HV，提高其生物利用度，并且能够靶向血栓部位，同时能够响应凝血酶有效释放HV，发挥抗血栓作用。
实施例2
“闭环调节”式纳米凝胶的制备和评价
一、包载凝血酶抑制剂的纳米凝胶的制备
1、具备血栓靶向性和凝血酶响应性的纳米凝胶(ctNGs)的制备
利用固相合成法，合成得到N端修饰G(allyl)的血栓靶向肽G(allyl)-GCR(NMe)EKA和两端修饰G(allyl)的凝血酶可降解肽G(allyl)-GGLVPRGSGG-G(allyl)。
分别将凝血酶抑制剂水蛭素(HV)、来匹卢定(Lep)、地西卢定(Des)、比伐卢定(Biv)、达比加群酯(Dab)、阿加曲班(Arg)、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮(PPACK)，依诺加群(Ino)、美拉加群(Mel)、西美加群(Xim)或RWJ-671818(RWJ)与丙烯酰胺(AAm)、G(allyl)-GCR(NMe)EKA、G(allyl)-GGLVPRGSGG-G(allyl)(60:2:1,mol:mol:mol)与溶于0.5mL水中，得到水相。将多库酯钠(356mg)和月桂醇聚氧乙烯醚(688mg)溶于5mL正己烷，得到有机相。在冰浴搅拌下，将水相缓慢滴入有机相。之后，向混合溶液中加入30μL过硫酸铵(20％)水溶液和20μL四甲基乙二胺，在冰浴下搅拌2h。之后，旋蒸除去有机溶剂，乙醇洗涤。真空干燥过夜，得到纳米凝胶(HV/ctNGs、Lep/ctNGs、Des/ctNGs、Biv/ctNGs、Dab/ctNGs、Arg/ctNGs、PPACK/ctNGs、Ino/ctNGs、Mel/ctNGs、Xim/ctNGs、RWJ/ctNGs)的粉末。称取15mg粉末置于西林瓶中，加入3mL PBS缓冲液(pH 7.4)，冰浴下超声分散，再依次通过0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜，得到纳米凝胶的溶液。
2、具备血栓靶向性的非凝血酶响应性纳米凝胶(cNGs)的制备
在处方中将G(allyl)-GGLVPRGSGG-G(allyl)替换为非凝血酶响应***联剂MBA，制备方法与ctNGs相同，制得HV/cNGs、Lep/cNGs、Des/cNGs、Biv/cNGs、Dab/cNGs、Arg/cNGs、PPACK/cNGs、Ino/cNGs、Mel/cNGs、Xim/cNGs和RWJ/cNGs。
3、具备凝血酶响应性的非靶向纳米凝胶(tNGs)的制备
在处方中不加G(allyl)-GCR(NMe)EKA，制备方法与ctNGs相同，制得HV/tNGs、Lep/tNGs、Des/tNGs、Biv/tNGs、Dab/tNGs、Arg/tNGs、PPACK/tNGs、Ino/tNGs、Mel/tNGs、Xim/tNGs和RWJ/tNGs。
二、纳米凝胶的表征
采用ZetaPlus电位粒径仪检测纳米凝胶的粒径、多分散系数和Zeta电位。
结果如表2所示，制得的纳米凝胶的粒径在50～80nm，多分散系数在0.20～0.25，电位近中性。结果证明，制备得到大小均一的纳米凝胶，可包载多种凝血酶抑制剂。
表2.ctNGs的粒径、多分散系数与电位
Figure BDA0002650649610000091
三、体外药物释放评价
1、包载Rho-HV的纳米凝胶(Rho-HV/ctNGs)的制备
参照上述纳米凝胶的制备方法，将HV替换为Rho-HV，制得包载Rho-HV的cNGs(Rho-HV/cNGs)、tNGs(Rho-HV/tNGs)和ctNGs(Rho-HV/ctNGs)。
2、ctNGs的凝血酶响应性药物释放
采用透析法测定纳米凝胶的药物释放行为。将Rho-HV/ctNGs置于透析袋(MWCO:100kDa)中，然后浸没于含有不同浓度凝血酶(0、0.5和1U/mL)的PBS(pH 7.4)透析介质中。在37℃下孵育不同时间后，采用酶标仪测定透析介质中罗丹明的荧光强度(激发波长:552nm；发射波长:585nm)。
结果如图6所示，ctNGs中HV的释放速率随着凝血酶浓度的增加而增加。在0U/mL凝血酶下，Rho-HV的12h释放量约为36.9％，当凝血酶浓度增至0.5和1U/mL时，释放量分别增至63.0％和92.6％。结果表明，ctNGs具有凝血酶响应性的释药性能，在高浓度凝血酶作用下可快速释放HV。
3、ctNGs的脉冲式药物释放
将Rho-HV/ctNGs置于透析袋中，先浸没于含有凝血酶(1U/mL)的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min，再浸没于不含凝血酶的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min。重复循环四次。采用酶标仪测定透析介质中罗丹明的荧光强度。
结果如图7所示，ctNGs在高浓度凝血酶作用下HV的释放速率增加，而在无凝血酶下释放速率显著降低。结果表明，ctNGs能够自适应地根据凝血酶浓度调控HV的释放速率，可响应血栓部位凝血酶的升高而快速释放荷载的HV，释放的HV作用于凝血酶抑制血栓的形成或增大，而凝血酶被抑制后，其降解ctNGs的活性也随之降低，HV的释放被抑制，达到闭环式按需释放HV的目的。
四、ctNGs的药动学考察
大鼠经尾静脉分别注射Rho-HV和Rho-HV/ctNGs。在不同的时间点，取血并离心。采用酶标仪测定血浆中罗丹明的荧光强度(激发波长:552nm；发射波长:585nm)。
结果如图8所示，随着时间的增加，Rho-HV组和Rho-HV/ctNGs组大鼠血浆中罗丹明的荧光强度均下降。相比于Rho-HV组，Rho-HV/ctNGs组罗丹明的荧光强度下降速度大幅减慢。结果表明，ctNGs显著延长了HV的体内半衰期，提高了其生物利用度。
五、靶向能力评价
1、体外靶向能力评价
参照上述纳米凝胶的制备方法，将凝血酶抑制剂替换为牛血清白蛋白(BSA)，制得BSA/ctNGs和BSA/tNGs。
在室温搅拌下，向BSA/ctNGs或BSA/tNGs溶液中缓慢滴入10个当量的Cy7-马来酰亚胺(Cy7-Mal)。滴毕，在室温下反应2h。将反应液转移至透析袋中(MWCO:3.5kDa)，在PBS(pH 7.4)中透析过夜，即得Cy7标记的纳米凝胶Cy7-BSA/ctNGs和Cy7-BSA/tNGs。
在96孔板中依次加入100μL富血小板血浆、凝血酶(10U/mL)与氯化钙(40mM)，在37℃下孵育1h，得纤维蛋白凝块。在凝块中分别加入100μL的测试样品溶液：(1)生理盐水；(2)Cy7-BSA/tNGs；(3)Cy7-BSA/ctNGs，在37℃下孵育5min，之后移除溶液，生理盐水洗涤3次。另设对照组(4)即在用Cy7-BSA/ctNGs加入前预先用血栓靶向肽G(allyl)-GCR(NMe)EKA溶液孵育5min。
结果如图9所示，相比于Cy7-BSA/tNGs组，Cy7-BSA/ctNGs组的Cy7荧光强度更高，并且经G(allyl)-GCR(NMe)EKA肽预处理后，Cy7-BSA/ctNGs组的荧光显著降低，证明了ctNGs具有更强的血栓靶向能力。
2、肺栓塞模型下的靶向能力评价
将纤维蛋白原溶解在100mM的碳酸氢钠缓冲液中(pH 8.5)，然后向其中加入10个当量的Cy5.5-琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)，在室温搅拌下避光反应2h。之后将反应液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中，在PBS(pH 7.4)中透析过夜，即得Cy5.5标记的纤维蛋白原(Cy5.5-Fib)。
向雌性C57BL/6小鼠的尾静脉中依次注射Cy5.5-Fib(70nmol/kg)、Cy7荧光标记的纳米凝胶(Cy7-BSA/tNGs或Cy7-BSA/ctNGs)和凝血激酶(4mL/kg)，每两次注射之间间隔5min。15min后，对小鼠实施安乐死，取肺组织进行荧光成像。
结果如图10所示，两组实验组肺组织中均可观察到较强的Cy5.5荧光信号，表明肺栓塞的形成。Cy7-BSA/ctNGs组的肺组织中的Cy7荧光信号强度显著高于Cy7-BSA/ctNGs组。结果证明，Cy7-BSA/ctNGs能够高效靶向体内形成的血栓。
3、颈动脉血栓模型下的靶向能力评价
参照上述纳米凝胶的制备方法，将HV替换为FITC-BSA，制得FITC-BSA/ctNGs。
C57BL/6小鼠麻醉后，尾静脉注射Rho 6G(0.5mg/kg)。10min后，暴露颈动脉血管，将FeCl3(10％)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于颈动脉血管表面，维持1min。5min后，尾静脉注射FITC-BSA/ctNGs。在不同时间点采用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图11所示，在FeCl3处理的小鼠颈动脉血管部位检测到较强的Rho荧光信号，表明血栓的形成。尾静脉注射FITC-BSA/ctNGs后，FITC荧光信号可与Rho荧光信号共定位。结果证明，FITC-BSA/ctNGs能够高效靶向体内形成的血栓。
六、体内抗血栓作用评价
1、肺栓塞模型下的抗血栓作用评价
向C57BL/6小鼠的尾静脉中依次注射Cy5.5-Fib(70nmol/kg)、生理盐水(Saline)或不同的HV制剂(HV/tNGs、HV/cNGs、HV、HV/ctNGs)和凝血激酶(4mL/kg)，每两次注射之间间隔5min。15min后，对小鼠实施安乐死，收集肺组织进行活体成像。
结果如图12所示，各组肺组织中均可以观察到Cy5.5的荧光信号，表明肺栓塞的形成。尾静脉注射HV/ctNG后Cy5.5的荧光信号最弱，证明HV/ctNG具有最佳的抗血栓能力。
2、颈动脉血栓模型下的抗血栓作用评价
C57BL/6小鼠麻醉后，尾静脉注射Rho 6G(0.5mg/kg)。10min后，暴露颈动脉血管，将FeCl3(10％)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于颈动脉血管表面，维持1min。5min后，分别尾静脉注射生理盐水、HV/tNGs、HV/cNGs、游离HV和HV/ctNGs。在不同时间点采用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图13所示，Rho荧光强度在用生理盐水处理的小鼠的颈动脉血管中急剧增加，表明FeCl3诱导血栓形成。游离HV组Rho荧光强度显著降低，表明游离HV能够有效抑制血栓形成。HV/tNGs和HV/cNGs的体内抗血栓作用有限，原因是尽管tNGs和cNGs对HV的包载作用可保护HV不受血浆蛋白水解，但tNGs不具备靶向性，无法靶向血栓部位；cNGs不具备凝血酶响应性，无法有效释放HV，限制了其疗效的发挥。相较之下，HV/ctNGs表现出更强的抗血栓作用。结果证明，ctNGs不仅可保护HV，提高其生物利用度，并且能够靶向血栓部位，同时能够响应凝血酶有效释放HV，发挥抗血栓作用。
为了比较HV和HV/ctNGs的治疗效果，对颈动脉进行了二次诱导。在第一次诱导2h后，再次用FeCl3处理小鼠颈动脉1min，并采用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图14所示，在HV治疗组中，FeCl3第二次诱导后，颈动脉内Rho荧光强度明显升高，而在HV/ctNGs治疗组中，两次诱导后Rho荧光强度没有显著差异。并且在第二次诱导后，HV/ctNGs治疗组的荧光强度明显低于HV治疗组，证明了HV/ctNGs比HV具有更好的抗血栓作用。
七、安全性评价
C57BL/6小鼠尾静脉注射生理盐水或HV/ctNGs。24h后，在尾端做切口，记录出血时间。
结果如图15所示，与生理盐水组相比，尾静脉注射HV/ctNGs不会导致出血时间延长。证明纳米凝胶不会造成凝血功能障碍。
实施例3
“闭环调节”式水凝胶的制备和评价
一、包载凝血酶抑制剂的“闭环调节”式水凝胶的构建
1、具备血栓靶向性和凝血酶响应性的水凝胶(ctHG)的制备
分别将1mg凝血酶抑制剂水蛭素(HV)、来匹卢定(Lep)、地西卢定(Des)、比伐卢定(Biv)、达比加群酯(Dab)、阿加曲班(Arg)、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、依诺加群(Ino)、美拉加群(Mel)、西美加群(Xim)、RWJ-671818(RWJ)与甲基丙烯酰胺、凝血酶响应肽G(allyl)-TPRSFL-G(allyl)、糖蛋白受体拮抗剂G(allyl)RGD(60:2:1,mol:mol:mol)混合溶于2mL生理盐水中，然后加入APS(5mg)和TEMED(10μL)，静置5min，即可形成水凝胶(ctHG)。
结果显示，水凝胶可以包载各种凝血酶抑制剂，制得HV/ctHG、Lep/ctHG、Des/ctHG、Biv/ctHG、Dab/ctHG、Arg/ctHG、PPACK/ctHG，Ino/ctHG、Mel/ctHG、Xim/ctHG、RWJ/ctHG。其中，Dab/ctHG如图16所示。
2、具备血栓靶向性的非凝血酶响应性水凝胶(cHG)的制备
在处方中将G(allyl)-TPRSFL-G(allyl)替换为非凝血酶响应***联剂MBA，制备方法与ctHG相同，制得HV/cHG、Lep/cHG、Des/cHG、Biv/cHG、Dab/cHG、Arg/cHG、PPACK/cHG，Ino/cHG、Mel/cHG、Xim/cHG、RWJ/cHG。
二、体外药物释放评价
1、ctHG的凝血酶响应性药物释放
采用透析法测定纳米囊的药物释放行为。将Dab/ctHG置于透析管(MWCO:3kDa)中，然后浸没于在含有不同浓度凝血酶(0、0.5和1U/mL)的PBS(pH 7.4)透析介质中，37℃孵育。在37℃下孵育不同时间后，采用高效液相色谱(HPLC)测定透析介质中Dab的浓度。色谱条件：色谱柱：C18反向键合色谱柱。流动相A：0.01mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 3.5)，流动相B：甲醇。流动相A:B体积比为4:6，流速1.0mL/min。检测光波长为310nm，柱温40℃，进样量20μL。
结果如图17所示，Dab/ctHG中Dab的释放速率随着凝血酶浓度的增加而增加。在0U/mL凝血酶下，Dab的24h释放量约为15.5％，当凝血酶浓度增至0.5和1U/mL时，释放量分别增至28.1％和42.8％。结果表明，ctHG具有凝血酶响应性的释药性能，在高浓度凝血酶作用下可快速释放Dab。
2、ctHG的脉冲式药物释放
将Dab/ctHG置于透析管中，先浸没在含有凝血酶(1U/mL)的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min，再浸没于不含凝血酶的PBS(pH 7.4)中，在37℃下孵育15min。重复循环四次，用HPLC测定透析介质中Dab的浓度。
结果如图18所示，ctHG在高浓度凝血酶作用下Dab的释放速率增加，而在低浓度或无凝血酶下释放速率显著降低。结果表明，ctHG能够自适应的根据凝血酶浓度调控Dab的释放速率，可响应血栓部位凝血酶的升高而快速释放荷载的Dab，释放的Dab作用于凝血酶抑制血栓的形成或增大，而凝血酶被抑制后，其降解ctHG的活性也随之降低，Dab的释放被抑制，达到闭环式按需释放Dab的目的。
三、体内抗血栓作用评价
C57BL/6小鼠麻醉后，尾静脉注射Rho 6G(0.5mg/kg)。10min后，暴露颈动脉血管，将FeCl3(10％)溶液润湿过的滤纸轻轻贴附于颈动脉血管表面，维持1min。5min后，分别在损伤的血管部位敷上水凝胶(Dab/cHG或Dab/ctHG)。25min后，采用立体变焦显微镜对血管成像。
结果如图19所示，相比于生理盐水组和Dab/cHG组，Dab/ctHG组在诱导后30min没有明显的血栓生成，证明Dab/ctHG水凝胶具备较好的抗血栓作用。

Claims (2)

1.一种包载凝血酶抑制剂的闭环调控式递药***，其特征在于：
所述递药***为单分子蛋白纳米囊，该单分子蛋白纳米囊由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到，所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体N-异丙基丙烯酰胺、凝血酶可降解肽PPRSFL和血栓靶向肽CREKA经原位界面自由基聚合得到；
或者，所述递药***为纳米凝胶，该纳米凝胶由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到，所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体丙烯酰胺、凝血酶可降解肽LVPRGS和血栓靶向肽CR(NMe)EKA经反相乳液聚合得到；
或者，所述递药***为水凝胶，该水凝胶由凝血酶响应性网状聚合物包载凝血酶抑制剂得到，所述凝血酶响应性网状聚合物由聚合物单体甲基丙烯酰胺、凝血酶可降解肽TPRSFL和血栓靶向肽糖蛋白受体IIb / IIIa拮抗剂RGD经自由基聚合得到。
2.根据权利要求1所述的递药***，其特征在于：所述凝血酶抑制剂选自水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、达比加群酯、阿加曲班、d-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基精氨酸-氯甲基酮、依诺加群、美拉加群、西美加群或RWJ-671818。
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