CN111868085A - 微芯片毛细管电泳测定法及试剂 - Google Patents
微芯片毛细管电泳测定法及试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111868085A CN111868085A CN201980020003.2A CN201980020003A CN111868085A CN 111868085 A CN111868085 A CN 111868085A CN 201980020003 A CN201980020003 A CN 201980020003A CN 111868085 A CN111868085 A CN 111868085A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- buffer
- protein drug
- aqueous
- drug sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 title claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 62
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 80
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 51
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 51
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 33
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 claims description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 20
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 20
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 20
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 18
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 24
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 abstract description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 14
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 4
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 4
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 2
- XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M Mesna Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCS XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 2
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 2
- 229950000321 benralizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229950008516 olaratumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002633 ramucirumab Drugs 0.000 description 2
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000044594 Interleukin-1 Receptor Accessory Human genes 0.000 description 1
- 101710180389 Interleukin-1 receptor accessory protein Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003540 anti-differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002942 anti-growth Effects 0.000 description 1
- 230000000781 anti-lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000001263 anti-prolactin effect Effects 0.000 description 1
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 108010008730 anticomplement Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYLIXCKOHOHGKQ-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O PYLIXCKOHOHGKQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229960004910 raxibacumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229960001886 rilonacept Drugs 0.000 description 1
- 108010046141 rilonacept Proteins 0.000 description 1
- 229950005978 rinucumab Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 229950006348 sarilumab Drugs 0.000 description 1
- 229960004540 secukinumab Drugs 0.000 description 1
- 229960003323 siltuximab Drugs 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960004914 vedolizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
- G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44743—Introducing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44791—Microapparatus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
- G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供用于评估蛋白质药物产品样品的纯度以及鉴别所述蛋白质药物产品样品中的杂质的MCE测定法和试剂。提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。
Description
技术领域
本发明的各方面总体涉及毛细管电泳领域，具体地讲涉及微芯片毛细管电泳。
背景技术
实施稳健、可重复、用户友好的技术对于满足当今质量控制(QC)实验室对生物产品的测试需求至关重要。必须进行技术升级以利于提高产出，同时继续生成高质量的分析数据，并尝试最大程度地减少无效测试结果和与仪器相关的调查的数量。尽管电泳历来用于产品纯度和片段化分析的QC，但该方法已经从基于凝胶转变为基于毛细管，最近又转变为微芯片。微芯片毛细管电泳(MCE)可大幅缩短样品分析时间，同时维持QC分析所需的性能和可重复性标准(Ouimet,C.等人，Expert Opin Drug Discov.,12(2):213–224(2017))。
尽管MCE已经成为一种很有前途的技术，在制药工业中越来越多地用于表征生物医药、质量控制以及用于药物发现，但其可容易受到测定法干扰。
因此，本发明的一个目的是提供改善的MCE测定法以及减少测定法干扰的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于改善蛋白质药物产品中杂质的检测的MCE测定法和组合物。
发明内容
提供用于评估蛋白质药物产品样品的纯度以及鉴别该蛋白质药物产品样品中的杂质的MCE测定法和试剂。提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。优选的蛋白质药物包括(但不限于)抗体及其抗原结合片段、融合蛋白和重组蛋白。该测定法采用MCE技术来分离、鉴别和量化蛋白质产品以及蛋白质产品中的杂质。杂质包括(但不限于)蛋白质聚集体、蛋白质片段、蛋白质多聚体和测定法污染物。还提供还原性缓冲液和非还原性缓冲液。
一个实施方案提供了一种非还原性水性电泳样品缓冲液，其含有烷化剂，例如155mM至175mM 2-碘乙酰胺；0.50％至1.5％十二烷基硫酸锂；和65mM至95mM磷酸钠，其中水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为6。在另一个实施方案中，该水性缓冲液含有166mM 2-碘乙酰胺、0.81％十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
还提供还原性缓冲液。在一个实施方案中，该还原性缓冲液是含有0.5％至1.5％十二烷基硫酸锂、55mM至85mM磷酸钠和还原剂的水性电泳样品缓冲液，其中该水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为9。在一个实施方案中，该还原性缓冲液含有135mM至155mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.69％十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
HEPES基缓冲液也可以与所公开的方法一起使用。一个实施方案提供了一种非还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液，其含有烷化剂，例如55mM至75mM 2-碘乙酰胺；0.1％至1.0％十二烷基硫酸锂；5mM至85mM HEPES，和5mM至115mM氯化钠，其中该水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。在另一个实施方案中，该缓冲液的pH为8。在另一个实施方案中，该水性缓冲液含有66.4mM 2-碘乙酰胺、0.32％十二烷基硫酸锂、16.2mM HEPES和48.6mM氯化钠。
另一个实施方案提供一种还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液，其含有0.05％至0.75％十二烷基硫酸锂、5mM至115mM氯化钠、5mM至115mM HEPES和还原剂，其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为8。在一个实施方案中，该还原性缓冲液含有35mM至50mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.28％十二烷基硫酸锂、41.5mM氯化钠、13.8mM HEPES和42.5mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
一个实施方案提供一种用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的非还原性MCE方法，其包括将该蛋白质样品添加至上述非还原性缓冲液以形成缓冲蛋白质药物样品的步骤。将该缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟，以形成变性的缓冲蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中，将该缓冲蛋白质药物样品加热至70℃持续10分钟。
将该蛋白质药物样品与可检测标记混合并在30℃至40℃下加热20至40分钟，以形成变性的经标记蛋白质药物样品。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等，以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些，该专利全文以引用方式并入本文。在一个优选的实施方案中，将具有所添加标记的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器，从样品中移除多余的标记。
将该变性的经标记蛋白质药物产品稀释并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离该稀释的蛋白质药物样品，从而产生电泳图。在一个实施方案中，从0.5mg/ml开始然后在微芯片上注射的样品的最终浓度是9μg/ml至MCE。电泳图含有对应于蛋白质药物产品和杂质的峰。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
另一个实施方案提供用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的还原性MCE方法。该方法开始于将该蛋白质样品添加至上述还原性缓冲液中的任一种中以形成缓冲蛋白质药物样品。通过将该缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃，优选加热至70℃持续10分钟来使该缓冲蛋白质药物样品变性，以形成变性的蛋白质药物样品。将该蛋白质药物样品与可检测标记混合并在30℃至40℃下加热20至40分钟，以形成变性的经标记蛋白质药物样品。在一个优选的实施方案中，将具有所添加标记的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器，从样品中移除多余的标记。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等，以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些，该专利全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，样品浓度的所确立测定范围是0.4mg/ml至0.6mg/ml，对应于约7μg/ml至11μg/ml的最终分析浓度，其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
附图说明
图1A示出了典型的非还原性样品分析的电泳图。图1B示出了典型的还原性样品分析的电泳图。X轴表示以分钟为单位的时间，Y轴表示相对荧光单位(RFU)。增加的迁移时间对应于增加的蛋白质大小。
具体实施方式
I.定义
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一”、“一个”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且可还包括修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学价值或商业价值，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。蛋白质是使用众所周知的细胞培养方法通过各种类型的重组细胞产生的，并且通常通过基因工程技术(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或者密码子优化的序列、无内含子序列等)引入细胞中，其中其可以作为附加体存在或整合到细胞基因组中。
“抗体”是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域即CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括指任何同种型或亚型的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体也包括双特异性抗体，其包括可结合至不止一个不同表位的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体在美国专利No.8,586,713中进行了一般性描述，该专利申请以引用方式并入本申请中。
“Fc融合蛋白”包含在自然界中原本不在一起的两种或更多种蛋白质的一部分或全部，其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分。包含与抗体衍生多肽的各种部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由以下进行描述：Ashkenazi等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)88:10535,1991；Byrn等人，《自然》(Nature)344:677，1990；和Hollenbaugh等人，“免疫球蛋白融合蛋白的构造(Construction ofImmunoglobulin Fusion Proteins)”，《免疫学实验室指南》(Current Protocols inImmunology)，增刊4，第10.19.1-10.19.11页，1992。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施方案中，所述Fc部分包含免疫球蛋白的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白包含可结合至一种或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如，Fc融合蛋白是陷井蛋白(trap)，诸如IL-1陷井蛋白或VEGF陷井蛋白。
术语“MCE”或“微芯片毛细管电泳”是指被分析物基于微芯片的毛细管电泳(CE)分离。
II.MCE测定法和缓冲液
提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。优选的蛋白质药物包括(但不限于)抗体及其抗原结合片段、融合蛋白和重组蛋白。该测定法采用MCE技术来分离、鉴定和量化蛋白质产品以及该蛋白质产品中的杂质。杂质包括(但不限于)蛋白质聚集体、蛋白质片段、蛋白质多聚体和测定法污染物。还提供还原性缓冲液和非还原性缓冲液。
A.缓冲液
1.非还原性缓冲液
一个实施方案提供了一种非还原性水性电泳样品缓冲液，其含有155mM至175mM烷化剂，例如2-碘乙酰胺或NEM；0.50％至1.5％十二烷基硫酸锂；75mM至95mM磷酸钠，其中水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为6。在另一个实施方案中，该水性缓冲液含有166mM 2-碘乙酰胺、0.81％十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
2.还原性缓冲液
还提供还原性缓冲液。在一个实施方案中，该还原性缓冲液是含有0.5％至1.5％十二烷基硫酸锂、65mM至95mM磷酸钠和还原剂的水性电泳样品缓冲液，其中该水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为9。
还原剂是本领域已知的。示例性的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT，CAS3483-12-3)、β-巯基乙醇(BME、2BME、2-ME、b-mer，CAS 60-24-2)、2-氨基乙硫醇(2-MEA-HCl，也称为半胱胺-HCl，CAS 156-57-0)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，CAS 5961-85-3)、半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCl，CAS 52-89-1)或2-巯基乙磺酸钠盐(MESNA)。用于还原蛋白质键的其他方法为本领域已知，诸如含有树脂的固定化还原剂柱，基于硫醇的还原剂已经固定至该树脂上，以实现肽和蛋白质二硫键的固相还原。还设想适用于还原多肽之间的化学相互作用的还原剂，包括氧化剂。
在一个实施方案中，还原性缓冲液含有135mM至155mM二硫苏糖醇。
另一个实施方案提供含有0.69％十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
3.HEPES基非还原性缓冲液
HEPES基缓冲液也可以与所公开的方法一起使用。一个实施方案提供了一种非还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液，其含有烷化剂，例如55mM至75mM 2-碘乙酰胺；0.1％至1.0％十二烷基硫酸锂；5mM至85mM HEPES，和5mM至115mM氯化钠，其中该水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为8。在另一个实施方案中，水性缓冲液含有66.4mM 2-碘乙酰胺、0.32％十二烷基硫酸锂、16.2mM HEPES和48.6mM氯化钠。
4.HEPES基还原性缓冲液
另一个实施方案提供一种还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液，其含有0.05％至0.75％十二烷基硫酸锂、5mM至115mM氯化钠、5mM至115mM HEPES和还原剂，其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。在一个优选的实施方案中，该缓冲液的pH为8。在一个实施方案中，该还原性缓冲液含有35mM至50mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.28％十二烷基硫酸锂、41.5mM氯化钠、13.8mM HEPES和42.5mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
B.测定法
1.非还原性测定法
一个实施方案提供了一种用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的非还原MCE方法，该方法包括将该蛋白质样品添加至上述非还原性缓冲液以形成缓冲蛋白质药物样品的步骤。将该缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟，以形成变性的缓冲蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中，将该缓冲蛋白质药物样品加热至70℃持续10分钟。然后将可检测标记添加至该变性的缓冲蛋白药物样品并在30℃至40℃下加热20至40分钟，以形成变性的经标记蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中，将具有所添加标记的变性的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器，从样品中移除多余的标记。
优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等，以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些，该专利全文以引用方式并入本文。
将该变性的经标记蛋白质药物产品稀释并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离该稀释的蛋白质药物样品，从而产生电泳图。在一个实施方案中，从0.5mg/ml开始然后在微芯片上注射的样品的最终浓度是9μg/ml至MCE。在另一个实施方案中，样品起始浓度为0.2mg/ml。电泳图含有对应于蛋白质药物产品和杂质的峰。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
2.还原性测定法
另一个实施方案提供用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的还原性MCE方法。该方法开始于将该蛋白质药物样品添加至上述还原性缓冲液中的任一种中以形成缓冲蛋白质药物样品。通过将该缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃，优选加热至70℃持续10分钟来使该缓冲蛋白质药物样品变性，以形成变性的蛋白质药物样品。然后将具有所添加标记的蛋白药物样品在30℃至40℃下加热20至40分钟，以形成变性的经标记蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中，将具有所添加标记的蛋白质药物产品样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器，从样品中移除多余的标记。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等，以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些，该专利全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，样品浓度的所确立测定范围是0.4mg/ml至0.6mg/ml，对应于约7μg/ml至11μg/ml的最终分析浓度，其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
C.仪器
用于进行所公开的MCE测定法的仪器是可商购的。在一个优选的实施方案中，使用LabChip GXII或LabChip GXII Touch HT和
HT蛋白质表达芯片(
HTProtein Express Chip)进行所公开的MCE测定法。
III.所关注的蛋白质
用所公开的MCE测定法和试剂测定的所关注的蛋白质，例如蛋白质药物产品，可以是适合在原核或真核细胞中表达的任何所关注的蛋白质，并且可以用于所提供的工程宿主细胞***中。例如，所关注的蛋白质包括(但不限于)抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。所关注的蛋白质可为由单个亚基组成的简单多肽或为由两个或更多个亚基组成的复杂多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂或任何受纯化和质量标准约束的蛋白质产品。
在一些实施方案中，蛋白质药物产品(所关注的蛋白质)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施方案中，该抗体选自抗程序化细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203579A1中所述的抗PD1抗体)、抗程序化细胞死亡配体1(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203580A1中所述的抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利No.9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例，如美国专利No.9,018,356中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利No.9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0313194A1中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利申请公开No.US2015/0259423A1中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如，如美国专利No.8,062,640或美国专利No.9,540,449中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌生长抑制素抗体，如美国专利No.8,871,209或No.9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337045A1或No.US2016/0075778A1中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271681A1或美国专利No.8,735,095或No.8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利No.7,582,298、No.8,043,617或No.9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利No.9,453,072或No.9,637,535中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利No.9,447,173中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如，如在美国专利No.9,447,173和No.9,447,173以及在美国申请No.62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利No.9,657,102和No.US20150266966A1以及在美国专利No.7,879,984中所述的抗CD20)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利No.9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Feld1抗体(例如，如美国专利No.9,079,948中所述的)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337029A1中所述抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0215040中所述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0017029以及美国专利No.8,309,088和No.9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗蛋白Y抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1中所述的)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中，所关注的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、fasinumab、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
在一些实施方案中，所关注的蛋白质是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白质(例如Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中，Fc部分包含IgG的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，受体Fc融合蛋白含有结合至单种配体或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，诸如例如IL-1陷阱蛋白(例如，rilonacept，其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利No.6,927,004，该专利全文以引用的方式并入本文)或VEGF陷阱蛋白(例如，aflibercept或ziv-aflibercept，其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2；参见美国专利No.7,087,411和No.7,279,159)。在其他实施方案中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(诸如可变重链片段和可变轻链片段)中的一者或多者。
IV.细胞培养
用所公开的MCE测定法和试剂测定的蛋白质药物产品是所制备的细胞培养物。细胞培养是“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”，其是指分批培养，其中在最初将细胞和培养基供应至培养容器，并且在培养期间将另外的培养营养物以不连续的增量缓慢地供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中定期移出整个培养物(可能包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，而是在分批培养中用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都在培养过程的开始就提供至培养容器。补料分批培养在以下方面可与“灌流培养”不同：在标准补料分批过程中未从培养容器中移出上清液，而是在灌流培养中，通过例如过滤将细胞限制在培养物中，并连续或间歇地将培养基引入培养容器并从培养容器移出。但是，设想了在补料分批细胞培养过程中移出样品以用于测试目的。补料分批过程持续进行直至确定达到最大工作体积和/或蛋白质产量，随后收获蛋白质。
细胞培养可以是“连续细胞培养”，其为一种用于连续培养细胞(通常是处于特定生长期)的技术。例如，如果需要持续供应细胞，或者需要制备所关注的特定蛋白质，则细胞培养物可能需要维持在特定的生长期。因此，必须连续地监测并相应地调节条件，以将细胞维持在该特定生长期。
细胞是在细胞培养基中培养。术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于培养哺乳动物细胞的营养液，其通常提供必要的营养以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源、必需氨基酸(如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解产物)，其可提供支持细胞生长的原料。培养基可含有源自酵母的提取物或大豆提取物，而不是源自动物的提取物。化学限定培养基是指其中所有化学组分均已知(即具有已知化学结构)的细胞培养基。化学限定培养基完全不含源自动物的组分(诸如源自血清或源自动物的蛋白胨)。在一个实施方案中，培养基是化学限定培养基。
该溶液还可以含有增强生长和/或存活率高于最低速率的组分，包括激素和生长因子。可以将溶液配制成对于所培养的特定细胞的存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。
“细胞系”是指通过细胞的连续传代或继代培养而衍生自特定谱系的一个或多个细胞。术语“细胞”可与“细胞群体”互换使用。
术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞，诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，诸如例如杂交瘤或四重杂交瘤。在某些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他实施方案中，细胞选自以下细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、淋巴细胞例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)、A431(表皮细胞)、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，
细胞)。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在其他实施方案中，细胞是CHOK1细胞。
V.试剂盒
一个实施方案提供了一种试剂盒，其包括一种或多种所公开的缓冲液或用于制备所公开的缓冲液的成分。该试剂盒可以包括用于所述缓冲液或成分的容器。缓冲液可以是溶液或冻干形式。该试剂盒任选还包括第二容器，该第二容器容纳有用于冻干制剂的稀释剂或重构溶液；以及任选容纳有关于所述溶液或所述重构的使用和/或所述冻干缓冲液或粉状成分的使用的说明。
该试剂盒可还包括进行所公开的MCE测定法所需的其他试剂，包括缓冲液、稀释剂和过滤器中的一种或多种。缓冲液和试剂可处于瓶子、小瓶或试管中。
实施例
实施例1：用于治疗性蛋白质的纯度和杂质分析的MCE测定法.
方法和材料：
材料：
将LabChip GXII或LabChip GXII Touch HT和
HT蛋白质表达芯片用于毛细管电泳分离和数据收集(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))。将上面公开的非还原性和还原性变性缓冲液用于MCE测定法。
方法：
表1示出了准备供MCE测定的样品的工作流程。简而言之，将蛋白质样品稀释至0.5mg/ml。将1μl非还原性变性缓冲液(NR)或还原性变性缓冲液(R)和4μl稀释样品添加至96孔板。将样品混合、离心并在产品规定的温度(通常为75℃)下加热10分钟。然后用5μM市售的染料(例如Dyomics DY-631 NHS酯)标记样品。将样品混合、离心并然后在35℃加热30分钟。然后用105μl的稀释终止溶液稀释经标记的样品。用LabChip GXII或LabChip GXIITouch HT分离样品。
缓冲液
制备200mM磷酸二氢钠一水合物、200mM磷酸氢二钠七水合物和10％十二烷基硫酸锂(LDS)的储备溶液。使用该储备溶液和
水，制备100mM磷酸钠1％LDS pH 6和100mM磷酸钠1％LDS pH 9的溶液。
通过添加34μL 1M碘乙酰胺(IAM)(新鲜制备于
水中)+166μL 100mM磷酸钠1％LDS pH 6+5μL
水，制备非还原性缓冲液。最终浓度为166mM 2-碘乙酰胺、0.81％十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
通过添加68μL 10×还原剂(500mM二硫苏糖醇(DTT)+166μL 100mM磷酸钠1％LDSpH 9+6μL
水，制备还原性缓冲液。最终浓度为0.69％十二烷基硫酸锂；69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇。
表1.MCE测定法的样品制备方法.
结果：
微芯片毛细管电泳(MCE)可大幅缩短样品分析时间，同时维持QC分析所需的性能和可重复性标准。使用本文所公开的非还原性和还原性变性缓冲液发展了MCE测定法。图1A-1B示出了代表性的电泳图，其显示了非还原性样品和还原性样品中的蛋白质的分析。
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明容易受其他实施方案的影响，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。
Claims (25)
1.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
155mM至175mM 2-碘乙酰胺；
0.50％至1.5％十二烷基硫酸锂；和
75mM至95mM磷酸钠，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。
2.根据权利要求1所述的水性缓冲液，其中所述pH为6。
3.根据权利要求1或2所述的水性缓冲液，其包含166mM 2-碘乙酰胺、0.81％十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
4.一种水性电泳样品缓冲液，其由以下组成：
166mM 2-碘乙酰胺，
0.81％十二烷基硫酸锂，和
81mM磷酸钠，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有6.0的pH。
5.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
0.50％至1.5％十二烷基硫酸锂；
45mM至75mM磷酸钠，和
还原剂，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。
6.根据权利要求5所述的水性缓冲液，其中所述pH为9。
7.根据权利要求5或6所述的水性缓冲液，其包含135mM至155mM二硫苏糖醇。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的水性缓冲液，其包含0.69％十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇。
9.一种水性电泳样品缓冲液，其由以下组成：
0.69％十二烷基硫酸锂；
69mM磷酸钠，和
142mM二硫苏糖醇，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有9.0的pH。
10.一种鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述蛋白药物样品添加至根据权利要求1-4中任一项所述的缓冲液中以形成缓冲蛋白药物样品；
将所述缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟以形成变性的缓冲蛋白药物样品；
将可检测标记添加至所述变性的缓冲蛋白药物样品并在30℃至40℃下将其加热20至40分钟以形成变性的经标记蛋白药物样品；
稀释所述变性的经标记蛋白药物样品并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离所述稀释的蛋白质药物样品，从而产生电泳图；以及
鉴定所述电泳图中与污染物或杂质相对应的峰。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述缓冲蛋白药物样品在70℃下加热10分钟。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中将所述经标记蛋白质药物样品在35℃下加热30分钟。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述稀释的蛋白质药物样品为9μg/ml。
14.一种鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的方法，所述方法包括以下步骤：
将蛋白样品添加至根据权利要求5-9中任一项所述的缓冲液中以形成缓冲蛋白药物样品；
将所述缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟以形成变性的蛋白质药物样品；
将可检测标记添加至所述变性的蛋白药物样品并在30℃至40℃下将其加热20至40分钟以形成变性的经标记蛋白药物样品；
稀释所述变性的经标记蛋白药物样品并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图；以及
鉴定所述电泳图中与污染物或杂质相对应的峰。
15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述缓冲蛋白药物样品在70℃下加热10分钟。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中将所述样品在35℃下加热30分钟。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述稀释的蛋白质药物样品为9μg/ml。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是DY-631N-羟基琥珀酰亚胺酯。
19.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至9中任一项所述的缓冲液，和
在所述缓冲液中制备用于电泳的样品的书面说明。
20.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
55mM至75mM 2-碘乙酰胺；
0.1％至1.0％十二烷基硫酸锂；
5mM至115mM氯化钠，和
5mM至85mM HEPES，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。
21.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
66.4mM 2-碘乙酰胺；
0.32％十二烷基硫酸锂；
48.6mM NaCl，和
16.2mM HEPES，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。
22.根据权利要求20或21所述的水性缓冲液，其中所述pH为8。
23.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
0.05％至0.75％十二烷基硫酸锂；
5mM至115mM NaCl；
5mM至85mM HEPES，和
35mM至50mM二硫苏糖醇，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。
24.一种水性电泳样品缓冲液，其包含：
0.28％十二烷基硫酸锂；
41.5mM NaCl
13.8mM HEPES，和
42.5mM二硫苏糖醇，
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。
25.根据权利要求23或24所述的水性缓冲液，其中所述pH为8。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862644933P | 2018-03-19 | 2018-03-19 | |
| US62/644,933 | 2018-03-19 | ||
| PCT/US2019/022525 WO2019182901A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-03-15 | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111868085A true CN111868085A (zh) | 2020-10-30 |
Family
ID=65952203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980020003.2A Pending CN111868085A (zh) | 2018-03-19 | 2019-03-15 | 微芯片毛细管电泳测定法及试剂 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11054389B2 (zh) |
| EP (2) | EP3768709B1 (zh) |
| JP (3) | JP7315565B2 (zh) |
| KR (2) | KR102503356B1 (zh) |
| CN (1) | CN111868085A (zh) |
| AR (1) | AR117402A1 (zh) |
| AU (1) | AU2019239633A1 (zh) |
| BR (1) | BR112020015291B1 (zh) |
| CA (1) | CA3089655A1 (zh) |
| DK (1) | DK3768709T3 (zh) |
| EA (1) | EA202092203A1 (zh) |
| ES (1) | ES2969882T3 (zh) |
| FI (1) | FI3768709T3 (zh) |
| HU (1) | HUE065344T2 (zh) |
| IL (2) | IL277264B2 (zh) |
| MX (1) | MX2020009696A (zh) |
| PL (1) | PL3768709T3 (zh) |
| SG (1) | SG11202007011YA (zh) |
| TW (2) | TWI779177B (zh) |
| WO (1) | WO2019182901A1 (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019182901A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
| US20210333235A1 (en) * | 2018-03-19 | 2021-10-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
| US20210293749A1 (en) * | 2018-03-19 | 2021-09-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
| CN115398236B (zh) * | 2020-01-21 | 2024-06-11 | 瑞泽恩制药公司 | 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法 |
| KR20230134117A (ko) | 2021-01-20 | 2023-09-20 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 세포 배양물에서 단백질 역가를 개선시키는 방법 |
| CN113189184B (zh) * | 2021-04-28 | 2022-09-09 | 浙江大学 | 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液 |
| MX2023014246A (es) * | 2021-06-01 | 2024-01-17 | Regeneron Pharma | Ensayos y reactivos de microchips de electroforesis capilar. |
| CA3232463A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Philip Mellors | Methods of controlling antibody heterogeneity |
| KR20240097864A (ko) | 2021-10-26 | 2024-06-27 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 상이한 온도에서 실험실 용수를 생성하고 실험실 용수를 분배하는 시스템 및 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006020498A2 (en) * | 2004-08-11 | 2006-02-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Therapeutic agents and methods for cardiovascular disease |
| WO2014055936A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Integenx Inc. | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
| WO2014116596A1 (en) * | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Abbvie, Inc. | Methods for optimizing domain stability of binding proteins |
Family Cites Families (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4424575B2 (ja) * | 1998-05-18 | 2010-03-03 | ユニバーシティー カレッジ ロンドン | 新規ポリペプチドホルモン・フォスファトニン |
| US7087411B2 (en) | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
| CZ20033143A3 (en) | 2001-05-21 | 2004-04-14 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
| JP2003114216A (ja) | 2001-10-05 | 2003-04-18 | Advance Co Ltd | 電気泳動装置 |
| AU2003217612A1 (en) | 2002-02-21 | 2003-09-09 | Wyeth | GASP1: a follistatin domain containing protein |
| US6927004B2 (en) | 2002-03-08 | 2005-08-09 | Asml Netherlands B.V. | Mask for use in lithography, method of making a mask, lithographic apparatus, and device manufacturing method |
| DE10258150A1 (de) | 2002-12-10 | 2004-07-08 | Dyomics Gmbh | Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen |
| AU2003903317A0 (en) * | 2003-06-27 | 2003-07-10 | Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd | Method of isolating a protein |
| AU2004296829A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Risk markers for cardiovascular disease |
| DK2374818T3 (da) | 2006-06-02 | 2013-01-21 | Regeneron Pharma | Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor |
| US7608693B2 (en) | 2006-10-02 | 2009-10-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity human antibodies to human IL-4 receptor |
| JP5604111B2 (ja) | 2007-02-12 | 2014-10-08 | エー１エム ファーマ エービー | 子癇前症の診断及び治療 |
| US8609423B2 (en) * | 2007-05-18 | 2013-12-17 | Life Technologies Corporation | Rapid protein labeling and analysis |
| CA2695199C (en) | 2007-07-31 | 2016-07-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to human cd20 and method of using thereof |
| US8309088B2 (en) | 2007-08-10 | 2012-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF |
| AU2009312532B2 (en) | 2008-11-06 | 2013-05-16 | Ichnos Sciences SA | Treatment with anti-alpha2 integrin antibodies |
| JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
| KR20120027055A (ko) | 2009-06-26 | 2012-03-20 | 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
| WO2011031497A2 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-17 | Life Technologies Corporation | Quantitative fluorescent protein standards |
| JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
| JO3340B1 (ar) | 2010-05-26 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري |
| JOP20190250A1 (ar) | 2010-07-14 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب |
| AR083044A1 (es) | 2010-09-27 | 2013-01-30 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos |
| EP3733711A1 (en) | 2010-10-06 | 2020-11-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies |
| JO3756B1 (ar) | 2010-11-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون |
| JO3412B1 (ar) | 2011-06-17 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها |
| AU2012339722B2 (en) | 2011-11-14 | 2017-09-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and/or Activin A |
| WO2013112438A1 (en) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies |
| JO3820B1 (ar) | 2012-05-03 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها |
| TWI641619B (zh) | 2012-06-25 | 2018-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途 |
| US9540449B2 (en) | 2012-08-13 | 2017-01-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics |
| JOP20200236A1 (ar) | 2012-09-21 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها |
| NZ629700A (en) * | 2012-12-24 | 2017-01-27 | Cell Ideas Pty Ltd | Vaccines for the treatment of cancer and compositions for enhancing vaccine efficacy |
| JO3405B1 (ar) | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
| JO3532B1 (ar) | 2013-03-13 | 2020-07-05 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها |
| TWI659968B (zh) | 2013-03-14 | 2019-05-21 | 再生元醫藥公司 | 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法 |
| US9637535B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | IL-33 antagonists and uses thereof |
| TWI641620B (zh) | 2013-08-21 | 2018-11-21 | 再生元醫藥公司 | 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途 |
| TWI681969B (zh) | 2014-01-23 | 2020-01-11 | 美商再生元醫藥公司 | 針對ｐｄ-１的人類抗體 |
| TWI680138B (zh) | 2014-01-23 | 2019-12-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體 |
| JP6632984B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-01-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその使用 |
| TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
| EP3636073B1 (en) | 2014-05-05 | 2023-11-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized c5 and c3 animals |
| JO3701B1 (ar) | 2014-05-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي |
| EP3194441A1 (en) | 2014-09-16 | 2017-07-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-glucagon antibodies and uses thereof |
| TWI710573B (zh) | 2015-01-26 | 2020-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體 |
| WO2019182901A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
-
2019
- 2019-03-15 WO PCT/US2019/022525 patent/WO2019182901A1/en active Application Filing
- 2019-03-15 MX MX2020009696A patent/MX2020009696A/es unknown
- 2019-03-15 HU HUE19714055A patent/HUE065344T2/hu unknown
- 2019-03-15 BR BR112020015291-9A patent/BR112020015291B1/pt active IP Right Grant
- 2019-03-15 TW TW108108839A patent/TWI779177B/zh active
- 2019-03-15 IL IL277264A patent/IL277264B2/en unknown
- 2019-03-15 KR KR1020207026013A patent/KR102503356B1/ko active IP Right Grant
- 2019-03-15 KR KR1020237006012A patent/KR20230031987A/ko active Application Filing
- 2019-03-15 EP EP19714055.1A patent/EP3768709B1/en active Active
- 2019-03-15 DK DK19714055.1T patent/DK3768709T3/da active
- 2019-03-15 EP EP23210273.1A patent/EP4317959A3/en active Pending
- 2019-03-15 PL PL19714055.1T patent/PL3768709T3/pl unknown
- 2019-03-15 JP JP2020542113A patent/JP7315565B2/ja active Active
- 2019-03-15 US US16/355,050 patent/US11054389B2/en active Active
- 2019-03-15 SG SG11202007011YA patent/SG11202007011YA/en unknown
- 2019-03-15 IL IL307577A patent/IL307577A/en unknown
- 2019-03-15 FI FIEP19714055.1T patent/FI3768709T3/fi active
- 2019-03-15 TW TW111141525A patent/TW202323813A/zh unknown
- 2019-03-15 CN CN201980020003.2A patent/CN111868085A/zh active Pending
- 2019-03-15 AU AU2019239633A patent/AU2019239633A1/en active Pending
- 2019-03-15 CA CA3089655A patent/CA3089655A1/en active Pending
- 2019-03-15 ES ES19714055T patent/ES2969882T3/es active Active
- 2019-03-15 EA EA202092203A patent/EA202092203A1/ru unknown
- 2019-03-19 AR ARP190100686A patent/AR117402A1/es unknown
-
2023
- 2023-04-24 JP JP2023070686A patent/JP7486637B2/ja active Active
-
2024
- 2024-05-07 JP JP2024075118A patent/JP2024097873A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006020498A2 (en) * | 2004-08-11 | 2006-02-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Therapeutic agents and methods for cardiovascular disease |
| WO2014055936A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Integenx Inc. | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
| WO2014116596A1 (en) * | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Abbvie, Inc. | Methods for optimizing domain stability of binding proteins |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PETER WESTERMANN 等: "The [alpha] and [gamma] subunits of initiation factor elF-2 can be cross-linked to 18S ribosomal RNA within the quaternary initiation complex, elF-2-Met-tRNA f GDPCP small ribosomal subunit", NUC AC RES, vol. 8, no. 14, pages 3065 - 3071 * |
| SINCLAIR J F等: "Improved retention of heme with increased resolution of microsomal proteins in polyacrylamide gel electrophoresis", ANAL BIOCHEM, vol. 114, no. 2, pages 316 - 321, XP024818513, DOI: 10.1016/0003-2697(81)90487-5 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7486637B2 (ja) | マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬 | |
| US20230110712A1 (en) | System and method for characterizing protein dimerization | |
| US20230273216A1 (en) | Methods for identifying free thiols in proteins | |
| KR20200115485A (ko) | 약물 생성물 불순물을 특성화하기 위한 시스템 및 방법 | |
| US20210333235A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
| US20210293749A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
| CN115398236A (zh) | 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法 | |
| TW202314240A (zh) | 微晶片毛細管電泳分析及試劑 | |
| CN117651860A (zh) | 微芯片毛细管电泳测定和试剂 | |
| EA045662B1 (ru) | Водный электрофоретический буфер (варианты), способ выявления загрязнений или примесей в образце белкового лекарственного средства, набор для микрочипового капиллярного электрофореза |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |