CN111868085A - 微芯片毛细管电泳测定法及试剂 - Google Patents
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Abstract
提供用于评估蛋白质药物产品样品的纯度以及鉴别所述蛋白质药物产品样品中的杂质的MCE测定法和试剂。提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。
Description
技术领域
本发明的各方面总体涉及毛细管电泳领域,具体地讲涉及微芯片毛细管电泳。
背景技术
实施稳健、可重复、用户友好的技术对于满足当今质量控制(QC)实验室对生物产品的测试需求至关重要。必须进行技术升级以利于提高产出,同时继续生成高质量的分析数据,并尝试最大程度地减少无效测试结果和与仪器相关的调查的数量。尽管电泳历来用于产品纯度和片段化分析的QC,但该方法已经从基于凝胶转变为基于毛细管,最近又转变为微芯片。微芯片毛细管电泳(MCE)可大幅缩短样品分析时间,同时维持QC分析所需的性能和可重复性标准(Ouimet,C.等人,Expert Opin Drug Discov.,12(2):213–224(2017))。
尽管MCE已经成为一种很有前途的技术,在制药工业中越来越多地用于表征生物医药、质量控制以及用于药物发现,但其可容易受到测定法干扰。
因此,本发明的一个目的是提供改善的MCE测定法以及减少测定法干扰的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于改善蛋白质药物产品中杂质的检测的MCE测定法和组合物。
发明内容
提供用于评估蛋白质药物产品样品的纯度以及鉴别该蛋白质药物产品样品中的杂质的MCE测定法和试剂。提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。优选的蛋白质药物包括(但不限于)抗体及其抗原结合片段、融合蛋白和重组蛋白。该测定法采用MCE技术来分离、鉴别和量化蛋白质产品以及蛋白质产品中的杂质。杂质包括(但不限于)蛋白质聚集体、蛋白质片段、蛋白质多聚体和测定法污染物。还提供还原性缓冲液和非还原性缓冲液。
一个实施方案提供了一种非还原性水性电泳样品缓冲液,其含有烷化剂,例如155mM至175mM 2-碘乙酰胺;0.50%至1.5%十二烷基硫酸锂;和65mM至95mM磷酸钠,其中水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为6。在另一个实施方案中,该水性缓冲液含有166mM 2-碘乙酰胺、0.81%十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
还提供还原性缓冲液。在一个实施方案中,该还原性缓冲液是含有0.5%至1.5%十二烷基硫酸锂、55mM至85mM磷酸钠和还原剂的水性电泳样品缓冲液,其中该水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为9。在一个实施方案中,该还原性缓冲液含有135mM至155mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.69%十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
HEPES基缓冲液也可以与所公开的方法一起使用。一个实施方案提供了一种非还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液,其含有烷化剂,例如55mM至75mM 2-碘乙酰胺;0.1%至1.0%十二烷基硫酸锂;5mM至85mM HEPES,和5mM至115mM氯化钠,其中该水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。在另一个实施方案中,该缓冲液的pH为8。在另一个实施方案中,该水性缓冲液含有66.4mM 2-碘乙酰胺、0.32%十二烷基硫酸锂、16.2mM HEPES和48.6mM氯化钠。
另一个实施方案提供一种还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液,其含有0.05%至0.75%十二烷基硫酸锂、5mM至115mM氯化钠、5mM至115mM HEPES和还原剂,其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为8。在一个实施方案中,该还原性缓冲液含有35mM至50mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.28%十二烷基硫酸锂、41.5mM氯化钠、13.8mM HEPES和42.5mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
一个实施方案提供一种用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的非还原性MCE方法,其包括将该蛋白质样品添加至上述非还原性缓冲液以形成缓冲蛋白质药物样品的步骤。将该缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟,以形成变性的缓冲蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中,将该缓冲蛋白质药物样品加热至70℃持续10分钟。
将该蛋白质药物样品与可检测标记混合并在30℃至40℃下加热20至40分钟,以形成变性的经标记蛋白质药物样品。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等,以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些,该专利全文以引用方式并入本文。在一个优选的实施方案中,将具有所添加标记的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器,从样品中移除多余的标记。
将该变性的经标记蛋白质药物产品稀释并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离该稀释的蛋白质药物样品,从而产生电泳图。在一个实施方案中,从0.5mg/ml开始然后在微芯片上注射的样品的最终浓度是9μg/ml至MCE。电泳图含有对应于蛋白质药物产品和杂质的峰。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
另一个实施方案提供用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的还原性MCE方法。该方法开始于将该蛋白质样品添加至上述还原性缓冲液中的任一种中以形成缓冲蛋白质药物样品。通过将该缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃,优选加热至70℃持续10分钟来使该缓冲蛋白质药物样品变性,以形成变性的蛋白质药物样品。将该蛋白质药物样品与可检测标记混合并在30℃至40℃下加热20至40分钟,以形成变性的经标记蛋白质药物样品。在一个优选的实施方案中,将具有所添加标记的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器,从样品中移除多余的标记。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等,以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些,该专利全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中,样品浓度的所确立测定范围是0.4mg/ml至0.6mg/ml,对应于约7μg/ml至11μg/ml的最终分析浓度,其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
附图说明
图1A示出了典型的非还原性样品分析的电泳图。图1B示出了典型的还原性样品分析的电泳图。X轴表示以分钟为单位的时间,Y轴表示相对荧光单位(RFU)。增加的迁移时间对应于增加的蛋白质大小。
具体实施方式
I.定义
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一”、“一个”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数,除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明,否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法,并且将每个单独的值并入本说明书中,就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10%的范围内高于或低于所述值的值;在其它实施方案中,值的数值范围可以在大约+/-5%的范围内高于或低于所述值;在其它实施方案中,值的数值范围可以在大约+/-2%的范围内高于或低于所述值;在其它实施方案中,值的数值范围可以在大约+/-1%的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚,并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾,否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明,否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明,而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽,并且可还包括修饰,诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学价值或商业价值,包括基于蛋白质的药物,并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。蛋白质是使用众所周知的细胞培养方法通过各种类型的重组细胞产生的,并且通常通过基因工程技术(例如,诸如编码嵌合蛋白的序列,或者密码子优化的序列、无内含子序列等)引入细胞中,其中其可以作为附加体存在或整合到细胞基因组中。
“抗体”是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域即CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括指任何同种型或亚型的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子,诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体也包括双特异性抗体,其包括可结合至不止一个不同表位的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体在美国专利No.8,586,713中进行了一般性描述,该专利申请以引用方式并入本申请中。
“Fc融合蛋白”包含在自然界中原本不在一起的两种或更多种蛋白质的一部分或全部,其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分。包含与抗体衍生多肽的各种部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由以下进行描述:Ashkenazi等人,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)88:10535,1991;Byrn等人,《自然》(Nature)344:677,1990;和Hollenbaugh等人,“免疫球蛋白融合蛋白的构造(Construction ofImmunoglobulin Fusion Proteins)”,《免疫学实验室指南》(Current Protocols inImmunology),增刊4,第10.19.1-10.19.11页,1992。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域,在一些实施方案中,所述Fc部分包含免疫球蛋白的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中,Fc融合蛋白包含可结合至一种或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如,Fc融合蛋白是陷井蛋白(trap),诸如IL-1陷井蛋白或VEGF陷井蛋白。
术语“MCE”或“微芯片毛细管电泳”是指被分析物基于微芯片的毛细管电泳(CE)分离。
II.MCE测定法和缓冲液
提供用于分析蛋白质药物样品中的被分析物的方法。优选的蛋白质药物包括(但不限于)抗体及其抗原结合片段、融合蛋白和重组蛋白。该测定法采用MCE技术来分离、鉴定和量化蛋白质产品以及该蛋白质产品中的杂质。杂质包括(但不限于)蛋白质聚集体、蛋白质片段、蛋白质多聚体和测定法污染物。还提供还原性缓冲液和非还原性缓冲液。
A.缓冲液
1.非还原性缓冲液
一个实施方案提供了一种非还原性水性电泳样品缓冲液,其含有155mM至175mM烷化剂,例如2-碘乙酰胺或NEM;0.50%至1.5%十二烷基硫酸锂;75mM至95mM磷酸钠,其中水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为6。在另一个实施方案中,该水性缓冲液含有166mM 2-碘乙酰胺、0.81%十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
2.还原性缓冲液
还提供还原性缓冲液。在一个实施方案中,该还原性缓冲液是含有0.5%至1.5%十二烷基硫酸锂、65mM至95mM磷酸钠和还原剂的水性电泳样品缓冲液,其中该水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为9。
还原剂是本领域已知的。示例性的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT,CAS3483-12-3)、β-巯基乙醇(BME、2BME、2-ME、b-mer,CAS 60-24-2)、2-氨基乙硫醇(2-MEA-HCl,也称为半胱胺-HCl,CAS 156-57-0)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,CAS 5961-85-3)、半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCl,CAS 52-89-1)或2-巯基乙磺酸钠盐(MESNA)。用于还原蛋白质键的其他方法为本领域已知,诸如含有树脂的固定化还原剂柱,基于硫醇的还原剂已经固定至该树脂上,以实现肽和蛋白质二硫键的固相还原。还设想适用于还原多肽之间的化学相互作用的还原剂,包括氧化剂。
在一个实施方案中,还原性缓冲液含有135mM至155mM二硫苏糖醇。
另一个实施方案提供含有0.69%十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
3.HEPES基非还原性缓冲液
HEPES基缓冲液也可以与所公开的方法一起使用。一个实施方案提供了一种非还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液,其含有烷化剂,例如55mM至75mM 2-碘乙酰胺;0.1%至1.0%十二烷基硫酸锂;5mM至85mM HEPES,和5mM至115mM氯化钠,其中该水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为8。在另一个实施方案中,水性缓冲液含有66.4mM 2-碘乙酰胺、0.32%十二烷基硫酸锂、16.2mM HEPES和48.6mM氯化钠。
4.HEPES基还原性缓冲液
另一个实施方案提供一种还原性HEPES基水性电泳样品缓冲液,其含有0.05%至0.75%十二烷基硫酸锂、5mM至115mM氯化钠、5mM至115mM HEPES和还原剂,其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。在一个优选的实施方案中,该缓冲液的pH为8。在一个实施方案中,该还原性缓冲液含有35mM至50mM二硫苏糖醇。另一个实施方案提供含有0.28%十二烷基硫酸锂、41.5mM氯化钠、13.8mM HEPES和42.5mM二硫苏糖醇的还原性缓冲液。
B.测定法
1.非还原性测定法
一个实施方案提供了一种用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的非还原MCE方法,该方法包括将该蛋白质样品添加至上述非还原性缓冲液以形成缓冲蛋白质药物样品的步骤。将该缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟,以形成变性的缓冲蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中,将该缓冲蛋白质药物样品加热至70℃持续10分钟。然后将可检测标记添加至该变性的缓冲蛋白药物样品并在30℃至40℃下加热20至40分钟,以形成变性的经标记蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中,将具有所添加标记的变性的蛋白质药物样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器,从样品中移除多余的标记。
优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等,以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些,该专利全文以引用方式并入本文。
将该变性的经标记蛋白质药物产品稀释并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离该稀释的蛋白质药物样品,从而产生电泳图。在一个实施方案中,从0.5mg/ml开始然后在微芯片上注射的样品的最终浓度是9μg/ml至MCE。在另一个实施方案中,样品起始浓度为0.2mg/ml。电泳图含有对应于蛋白质药物产品和杂质的峰。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
2.还原性测定法
另一个实施方案提供用于鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的还原性MCE方法。该方法开始于将该蛋白质药物样品添加至上述还原性缓冲液中的任一种中以形成缓冲蛋白质药物样品。通过将该缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃,优选加热至70℃持续10分钟来使该缓冲蛋白质药物样品变性,以形成变性的蛋白质药物样品。然后将具有所添加标记的蛋白药物样品在30℃至40℃下加热20至40分钟,以形成变性的经标记蛋白药物样品。在一个优选的实施方案中,将具有所添加标记的蛋白质药物产品样品加热至35℃持续30分钟。任选例如通过使用旋转过滤器,从样品中移除多余的标记。优选的可检测标记包括但不限于Dyomics DY-631 NHS酯。可以使用的其他可检测标记包括其他染料、荧光团、发色团、质量标签、量子点等,以及在美国专利No.6,924,372中公开的那些,该专利全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中,样品浓度的所确立测定范围是0.4mg/ml至0.6mg/ml,对应于约7μg/ml至11μg/ml的最终分析浓度,其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图。该方法通过鉴定电泳图中与污染物或杂质相对应的峰而得出结论。
C.仪器
用于进行所公开的MCE测定法的仪器是可商购的。在一个优选的实施方案中,使用LabChip GXII或LabChip GXII Touch HT和HT蛋白质表达芯片(HTProtein Express Chip)进行所公开的MCE测定法。
III.所关注的蛋白质
用所公开的MCE测定法和试剂测定的所关注的蛋白质,例如蛋白质药物产品,可以是适合在原核或真核细胞中表达的任何所关注的蛋白质,并且可以用于所提供的工程宿主细胞***中。例如,所关注的蛋白质包括(但不限于)抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。所关注的蛋白质可为由单个亚基组成的简单多肽或为由两个或更多个亚基组成的复杂多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂或任何受纯化和质量标准约束的蛋白质产品。
在一些实施方案中,蛋白质药物产品(所关注的蛋白质)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中,抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中,抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中,抗体是IgG4抗体。在一个实施方案中,抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中,抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中,抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施方案中,该抗体选自抗程序化细胞死亡1抗体(例如,如美国专利申请公开No.US2015/0203579A1中所述的抗PD1抗体)、抗程序化细胞死亡配体1(例如,如美国专利申请公开No.US2015/0203580A1中所述的抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素2抗体(例如,如美国专利No.9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例,如美国专利No.9,018,356中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如,如美国专利No.9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如,如美国专利No.9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如,如美国专利申请公开No.US2015/0313194A1中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如,如美国专利No.9,132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利申请公开No.US2015/0259423A1中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如,如美国专利No.8,062,640或美国专利No.9,540,449中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如,抗GDF8抗体,也称为抗肌生长抑制素抗体,如美国专利No.8,871,209或No.9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如,如美国专利申请公开No.US2015/0337045A1或No.US2016/0075778A1中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如,如美国专利申请公开No.US2014/0271681A1或美国专利No.8,735,095或No.8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如,如美国专利No.7,582,298、No.8,043,617或No.9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如,如美国专利No.9,453,072或No.9,637,535中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如,如美国专利No.9,447,173中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如,如在美国专利No.9,447,173和No.9,447,173以及在美国申请No.62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如,如美国专利No.9,657,102和No.US20150266966A1以及在美国专利No.7,879,984中所述的抗CD20)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如,如美国专利No.9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Feld1抗体(例如,如美国专利No.9,079,948中所述的)、抗中东呼吸综合征病毒(例如,如美国专利申请公开No.US2015/0337029A1中所述抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如,如美国专利申请公开No.US2016/0215040中所述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如,抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如,如美国专利申请公开No.US2016/0017029以及美国专利No.8,309,088和No.9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗蛋白Y抗体。在一些实施方案中,双特异性抗体选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1中所述的)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如,抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如,抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中,所关注的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、fasinumab、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
在一些实施方案中,所关注的蛋白质是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白质(例如Fc融合蛋白)。在一些实施方案中,Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白,其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中,Fc部分包含IgG的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中,受体Fc融合蛋白含有结合至单种配体或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如,Fc融合蛋白是TRAP蛋白,诸如例如IL-1陷阱蛋白(例如,rilonacept,其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区;参见美国专利No.6,927,004,该专利全文以引用的方式并入本文)或VEGF陷阱蛋白(例如,aflibercept或ziv-aflibercept,其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2;参见美国专利No.7,087,411和No.7,279,159)。在其他实施方案中,Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白,其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(诸如可变重链片段和可变轻链片段)中的一者或多者。
IV.细胞培养
用所公开的MCE测定法和试剂测定的蛋白质药物产品是所制备的细胞培养物。细胞培养是“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”,其是指分批培养,其中在最初将细胞和培养基供应至培养容器,并且在培养期间将另外的培养营养物以不连续的增量缓慢地供料至培养物,在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”,其中定期移出整个培养物(可能包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”,而是在分批培养中用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都在培养过程的开始就提供至培养容器。补料分批培养在以下方面可与“灌流培养”不同:在标准补料分批过程中未从培养容器中移出上清液,而是在灌流培养中,通过例如过滤将细胞限制在培养物中,并连续或间歇地将培养基引入培养容器并从培养容器移出。但是,设想了在补料分批细胞培养过程中移出样品以用于测试目的。补料分批过程持续进行直至确定达到最大工作体积和/或蛋白质产量,随后收获蛋白质。
细胞培养可以是“连续细胞培养”,其为一种用于连续培养细胞(通常是处于特定生长期)的技术。例如,如果需要持续供应细胞,或者需要制备所关注的特定蛋白质,则细胞培养物可能需要维持在特定的生长期。因此,必须连续地监测并相应地调节条件,以将细胞维持在该特定生长期。
细胞是在细胞培养基中培养。术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于培养哺乳动物细胞的营养液,其通常提供必要的营养以增强细胞的生长,诸如碳水化合物能源、必需氨基酸(如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可含有提取物,例如血清或蛋白胨(水解产物),其可提供支持细胞生长的原料。培养基可含有源自酵母的提取物或大豆提取物,而不是源自动物的提取物。化学限定培养基是指其中所有化学组分均已知(即具有已知化学结构)的细胞培养基。化学限定培养基完全不含源自动物的组分(诸如源自血清或源自动物的蛋白胨)。在一个实施方案中,培养基是化学限定培养基。
该溶液还可以含有增强生长和/或存活率高于最低速率的组分,包括激素和生长因子。可以将溶液配制成对于所培养的特定细胞的存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。
“细胞系”是指通过细胞的连续传代或继代培养而衍生自特定谱系的一个或多个细胞。术语“细胞”可与“细胞群体”互换使用。
术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞,诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物,诸如例如杂交瘤或四重杂交瘤。在某些实施方案中,细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他实施方案中,细胞选自以下细胞:中国仓鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如,HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、淋巴细胞例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)、A431(表皮细胞)、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中,细胞包含一种或多种病毒基因,例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如,细胞)。在一些实施方案中,细胞是CHO细胞。在其他实施方案中,细胞是CHOK1细胞。
V.试剂盒
一个实施方案提供了一种试剂盒,其包括一种或多种所公开的缓冲液或用于制备所公开的缓冲液的成分。该试剂盒可以包括用于所述缓冲液或成分的容器。缓冲液可以是溶液或冻干形式。该试剂盒任选还包括第二容器,该第二容器容纳有用于冻干制剂的稀释剂或重构溶液;以及任选容纳有关于所述溶液或所述重构的使用和/或所述冻干缓冲液或粉状成分的使用的说明。
该试剂盒可还包括进行所公开的MCE测定法所需的其他试剂,包括缓冲液、稀释剂和过滤器中的一种或多种。缓冲液和试剂可处于瓶子、小瓶或试管中。
实施例
实施例1:用于治疗性蛋白质的纯度和杂质分析的MCE测定法.
方法和材料:
材料:
将LabChip GXII或LabChip GXII Touch HT和HT蛋白质表达芯片用于毛细管电泳分离和数据收集(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))。将上面公开的非还原性和还原性变性缓冲液用于MCE测定法。
方法:
表1示出了准备供MCE测定的样品的工作流程。简而言之,将蛋白质样品稀释至0.5mg/ml。将1μl非还原性变性缓冲液(NR)或还原性变性缓冲液(R)和4μl稀释样品添加至96孔板。将样品混合、离心并在产品规定的温度(通常为75℃)下加热10分钟。然后用5μM市售的染料(例如Dyomics DY-631 NHS酯)标记样品。将样品混合、离心并然后在35℃加热30分钟。然后用105μl的稀释终止溶液稀释经标记的样品。用LabChip GXII或LabChip GXIITouch HT分离样品。
缓冲液
制备200mM磷酸二氢钠一水合物、200mM磷酸氢二钠七水合物和10%十二烷基硫酸锂(LDS)的储备溶液。使用该储备溶液和水,制备100mM磷酸钠1%LDS pH 6和100mM磷酸钠1%LDS pH 9的溶液。
通过添加34μL 1M碘乙酰胺(IAM)(新鲜制备于水中)+166μL 100mM磷酸钠1%LDS pH 6+5μL水,制备非还原性缓冲液。最终浓度为166mM 2-碘乙酰胺、0.81%十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
通过添加68μL 10×还原剂(500mM二硫苏糖醇(DTT)+166μL 100mM磷酸钠1%LDSpH 9+6μL水,制备还原性缓冲液。最终浓度为0.69%十二烷基硫酸锂;69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇。
表1.MCE测定法的样品制备方法.
结果:
微芯片毛细管电泳(MCE)可大幅缩短样品分析时间,同时维持QC分析所需的性能和可重复性标准。使用本文所公开的非还原性和还原性变性缓冲液发展了MCE测定法。图1A-1B示出了代表性的电泳图,其显示了非还原性样品和还原性样品中的蛋白质的分析。
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明,并且出于说明的目的已经提出了许多细节,但是对于本领域技术人员来说显而易见的是,本发明容易受其他实施方案的影响,并且在不脱离本发明的基本原理的情况下,本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下,本发明可以以其他特定形式来体现,并且因此,应参考所附权利要求,而不是前述说明书,来指示本发明的范围。
Claims (25)
1.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
155mM至175mM 2-碘乙酰胺;
0.50%至1.5%十二烷基硫酸锂;和
75mM至95mM磷酸钠,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于7的pH。
2.根据权利要求1所述的水性缓冲液,其中所述pH为6。
3.根据权利要求1或2所述的水性缓冲液,其包含166mM 2-碘乙酰胺、0.81%十二烷基硫酸锂和81mM磷酸钠。
4.一种水性电泳样品缓冲液,其由以下组成:
166mM 2-碘乙酰胺,
0.81%十二烷基硫酸锂,和
81mM磷酸钠,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有6.0的pH。
5.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
0.50%至1.5%十二烷基硫酸锂;
45mM至75mM磷酸钠,和
还原剂,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于8的pH。
6.根据权利要求5所述的水性缓冲液,其中所述pH为9。
7.根据权利要求5或6所述的水性缓冲液,其包含135mM至155mM二硫苏糖醇。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的水性缓冲液,其包含0.69%十二烷基硫酸锂、69mM磷酸钠和142mM二硫苏糖醇。
9.一种水性电泳样品缓冲液,其由以下组成:
0.69%十二烷基硫酸锂;
69mM磷酸钠,和
142mM二硫苏糖醇,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有9.0的pH。
10.一种鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的方法,所述方法包括以下步骤:
将所述蛋白药物样品添加至根据权利要求1-4中任一项所述的缓冲液中以形成缓冲蛋白药物样品;
将所述缓冲蛋白药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟以形成变性的缓冲蛋白药物样品;
将可检测标记添加至所述变性的缓冲蛋白药物样品并在30℃至40℃下将其加热20至40分钟以形成变性的经标记蛋白药物样品;
稀释所述变性的经标记蛋白药物样品并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE以分离所述稀释的蛋白质药物样品,从而产生电泳图;以及
鉴定所述电泳图中与污染物或杂质相对应的峰。
11.根据权利要求10所述的方法,其中将所述缓冲蛋白药物样品在70℃下加热10分钟。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中将所述经标记蛋白质药物样品在35℃下加热30分钟。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法,其中所述稀释的蛋白质药物样品为9μg/ml。
14.一种鉴定蛋白质药物样品中的污染物或杂质的方法,所述方法包括以下步骤:
将蛋白样品添加至根据权利要求5-9中任一项所述的缓冲液中以形成缓冲蛋白药物样品;
将所述缓冲蛋白质药物样品加热至65℃至85℃持续5至15分钟以形成变性的蛋白质药物样品;
将可检测标记添加至所述变性的蛋白药物样品并在30℃至40℃下将其加热20至40分钟以形成变性的经标记蛋白药物样品;
稀释所述变性的经标记蛋白药物样品并使其在微芯片毛细管电泳***上接受MCE分析以产生电泳图;以及
鉴定所述电泳图中与污染物或杂质相对应的峰。
15.根据权利要求14所述的方法,其中将所述缓冲蛋白药物样品在70℃下加热10分钟。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中将所述样品在35℃下加热30分钟。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法,其中所述稀释的蛋白质药物样品为9μg/ml。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法,其中所述可检测标记是DY-631N-羟基琥珀酰亚胺酯。
19.一种试剂盒,其包括根据权利要求1至9中任一项所述的缓冲液,和
在所述缓冲液中制备用于电泳的样品的书面说明。
20.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
55mM至75mM 2-碘乙酰胺;
0.1%至1.0%十二烷基硫酸锂;
5mM至115mM氯化钠,和
5mM至85mM HEPES,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。
21.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
66.4mM 2-碘乙酰胺;
0.32%十二烷基硫酸锂;
48.6mM NaCl,和
16.2mM HEPES,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有小于9的pH。
22.根据权利要求20或21所述的水性缓冲液,其中所述pH为8。
23.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
0.05%至0.75%十二烷基硫酸锂;
5mM至115mM NaCl;
5mM至85mM HEPES,和
35mM至50mM二硫苏糖醇,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。
24.一种水性电泳样品缓冲液,其包含:
0.28%十二烷基硫酸锂;
41.5mM NaCl
13.8mM HEPES,和
42.5mM二硫苏糖醇,
其中所述水性电泳样品缓冲液具有大于7的pH。
25.根据权利要求23或24所述的水性缓冲液,其中所述pH为8。
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---|---|---|---|---|
WO2019182901A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
US20210333235A1 (en) * | 2018-03-19 | 2021-10-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
US20210293749A1 (en) * | 2018-03-19 | 2021-09-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
CN115398236B (zh) * | 2020-01-21 | 2024-06-11 | 瑞泽恩制药公司 | 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法 |
KR20230134117A (ko) | 2021-01-20 | 2023-09-20 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 세포 배양물에서 단백질 역가를 개선시키는 방법 |
CN113189184B (zh) * | 2021-04-28 | 2022-09-09 | 浙江大学 | 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液 |
MX2023014246A (es) * | 2021-06-01 | 2024-01-17 | Regeneron Pharma | Ensayos y reactivos de microchips de electroforesis capilar. |
CA3232463A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Philip Mellors | Methods of controlling antibody heterogeneity |
KR20240097864A (ko) | 2021-10-26 | 2024-06-27 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 상이한 온도에서 실험실 용수를 생성하고 실험실 용수를 분배하는 시스템 및 방법 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006020498A2 (en) * | 2004-08-11 | 2006-02-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Therapeutic agents and methods for cardiovascular disease |
WO2014055936A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Integenx Inc. | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
WO2014116596A1 (en) * | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Abbvie, Inc. | Methods for optimizing domain stability of binding proteins |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4424575B2 (ja) * | 1998-05-18 | 2010-03-03 | ユニバーシティー カレッジ ロンドン | 新規ポリペプチドホルモン・フォスファトニン |
US7087411B2 (en) | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
CZ20033143A3 (en) | 2001-05-21 | 2004-04-14 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
JP2003114216A (ja) | 2001-10-05 | 2003-04-18 | Advance Co Ltd | 電気泳動装置 |
AU2003217612A1 (en) | 2002-02-21 | 2003-09-09 | Wyeth | GASP1: a follistatin domain containing protein |
US6927004B2 (en) | 2002-03-08 | 2005-08-09 | Asml Netherlands B.V. | Mask for use in lithography, method of making a mask, lithographic apparatus, and device manufacturing method |
DE10258150A1 (de) | 2002-12-10 | 2004-07-08 | Dyomics Gmbh | Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen |
AU2003903317A0 (en) * | 2003-06-27 | 2003-07-10 | Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd | Method of isolating a protein |
AU2004296829A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Risk markers for cardiovascular disease |
DK2374818T3 (da) | 2006-06-02 | 2013-01-21 | Regeneron Pharma | Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor |
US7608693B2 (en) | 2006-10-02 | 2009-10-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity human antibodies to human IL-4 receptor |
JP5604111B2 (ja) | 2007-02-12 | 2014-10-08 | エー1エム ファーマ エービー | 子癇前症の診断及び治療 |
US8609423B2 (en) * | 2007-05-18 | 2013-12-17 | Life Technologies Corporation | Rapid protein labeling and analysis |
CA2695199C (en) | 2007-07-31 | 2016-07-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to human cd20 and method of using thereof |
US8309088B2 (en) | 2007-08-10 | 2012-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF |
AU2009312532B2 (en) | 2008-11-06 | 2013-05-16 | Ichnos Sciences SA | Treatment with anti-alpha2 integrin antibodies |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
KR20120027055A (ko) | 2009-06-26 | 2012-03-20 | 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
WO2011031497A2 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-17 | Life Technologies Corporation | Quantitative fluorescent protein standards |
JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
JO3340B1 (ar) | 2010-05-26 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري |
JOP20190250A1 (ar) | 2010-07-14 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب |
AR083044A1 (es) | 2010-09-27 | 2013-01-30 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos |
EP3733711A1 (en) | 2010-10-06 | 2020-11-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies |
JO3756B1 (ar) | 2010-11-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون |
JO3412B1 (ar) | 2011-06-17 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها |
AU2012339722B2 (en) | 2011-11-14 | 2017-09-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and/or Activin A |
WO2013112438A1 (en) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies |
JO3820B1 (ar) | 2012-05-03 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها |
TWI641619B (zh) | 2012-06-25 | 2018-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗-egfr抗體及其用途 |
US9540449B2 (en) | 2012-08-13 | 2017-01-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics |
JOP20200236A1 (ar) | 2012-09-21 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها |
NZ629700A (en) * | 2012-12-24 | 2017-01-27 | Cell Ideas Pty Ltd | Vaccines for the treatment of cancer and compositions for enhancing vaccine efficacy |
JO3405B1 (ar) | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
JO3532B1 (ar) | 2013-03-13 | 2020-07-05 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها |
TWI659968B (zh) | 2013-03-14 | 2019-05-21 | 再生元醫藥公司 | 針對呼吸道融合病毒f蛋白質的人類抗體及其使用方法 |
US9637535B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | IL-33 antagonists and uses thereof |
TWI641620B (zh) | 2013-08-21 | 2018-11-21 | 再生元醫藥公司 | 抗-prlr抗體及其用途 |
TWI681969B (zh) | 2014-01-23 | 2020-01-11 | 美商再生元醫藥公司 | 針對pd-1的人類抗體 |
TWI680138B (zh) | 2014-01-23 | 2019-12-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗pd-l1之人類抗體 |
JP6632984B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-01-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗EGFRvIII抗体およびその使用 |
TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
EP3636073B1 (en) | 2014-05-05 | 2023-11-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized c5 and c3 animals |
JO3701B1 (ar) | 2014-05-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي |
EP3194441A1 (en) | 2014-09-16 | 2017-07-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-glucagon antibodies and uses thereof |
TWI710573B (zh) | 2015-01-26 | 2020-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006020498A2 (en) * | 2004-08-11 | 2006-02-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Therapeutic agents and methods for cardiovascular disease |
WO2014055936A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Integenx Inc. | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
WO2014116596A1 (en) * | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Abbvie, Inc. | Methods for optimizing domain stability of binding proteins |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PETER WESTERMANN 等: "The [alpha] and [gamma] subunits of initiation factor elF-2 can be cross-linked to 18S ribosomal RNA within the quaternary initiation complex, elF-2-Met-tRNA f GDPCP small ribosomal subunit", NUC AC RES, vol. 8, no. 14, pages 3065 - 3071 * |
SINCLAIR J F等: "Improved retention of heme with increased resolution of microsomal proteins in polyacrylamide gel electrophoresis", ANAL BIOCHEM, vol. 114, no. 2, pages 316 - 321, XP024818513, DOI: 10.1016/0003-2697(81)90487-5 * |
Also Published As
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---|---|---|
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US20230110712A1 (en) | System and method for characterizing protein dimerization | |
US20230273216A1 (en) | Methods for identifying free thiols in proteins | |
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US20210333235A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
US20210293749A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
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EA045662B1 (ru) | Водный электрофоретический буфер (варианты), способ выявления загрязнений или примесей в образце белкового лекарственного средства, набор для микрочипового капиллярного электрофореза |
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