CN1118568C - 抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤其制备方法及肿瘤检测用途 - Google Patents
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Abstract
本发明抗癌基因neu/c-erbB-2产物P185neu/c-erbB-2的单克隆抗体杂交瘤及其制备方法和在肿瘤检测上的用途，特征是采用细胞表面表位包埋法免疫，即用neu/c-erbB-2转基因NIH/3T3细胞T6-17经小鼠抗NIH/3T3抗血清包埋后免疫小鼠；得到的抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤，所分泌的单抗其亚类都为IgG1，都能专一性地与癌细胞膜上P185neu/c-erbB-2的膜外区结合，而与生长因子受体无交叉反应，与良性组织细胞也无反应；所得单抗结合特异性强，对人乳腺癌病理切片阳性染色为膜着色，背景低，可发展成诊断试剂盒用于临床检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平。
Description
本发明涉及生物学中单克隆抗体杂交瘤及其免疫学制备方法、以及肿瘤检测方法技术领域。
Neu/c-erbB-2癌基因的产物P185neu/c-crbB-2是一个受体酪氨酸激酶。美国《科学》杂志(Science，1989.244：707-712)报导，使用抗p185neu/c-erbB-2的特异性抗体，通过免疫组化方法检测了688例乳腺癌患者乳腺组织和120例卵巢癌患者卵巢组织中的p185neu/c-erbB-2的表达水平。在显微镜下观测比较组织中细胞的抗体特异性染色强度，将组织中的表达水平分为四个等级：即①阴性到很弱；②1+；③2+；④3+，并将①定为非过量表达，判为阴性，其余均为不同程度的overexpression即过量表达或高表达，判为阳性。以此标准，约有30％以上的乳腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织的细胞出现P185neu/c-erbB-2过量表达，该类病人肿瘤恶性程度高，预后差。美国《基因》杂志(Gene，1995.159：19-27)综述大量临床研究结果后指出，当细胞膜P185neu/c-erbB-2高表达即overexoression时，说明该肿瘤的恶性程度高，术后易发生转移和复发。因此制备临床诊断肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2表达水平的单克隆抗体具有很重要的意义。
现有制备单克隆抗体杂交瘤的方法主要包括免疫、细胞融合、筛选与克隆四个步骤。经检索得知，现有制备抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤过程中所用的免疫方法主要有以下三种：A法，如美国杂志《癌基因》(oncogene，1989，4：543-548)报导的减法免疫法。但这种免疫方法不仅操作步骤多，并且由于使用了免疫抑制剂环磷酰胺，降低了动物的免疫能力，使动物易感染致死。B法，可参见美国杂志《肿瘤研究》(Cancer Research，1990，50：1550-1558)，文中涉及的免疫方法为先用转Neu/c-erbB-2癌基因的小鼠成纤维细胞NIH/3T3免疫小鼠四次，再用经麦胚凝集素纯化的P185neu/c-erbB-2膜抽提物免疫两次，最后一次用纯化的P185neu/c-erbB-2蛋白进行免疫。这种免疫方法步骤繁琐，免疫时间长达近四个月，并要粗提膜蛋白，操作复杂；使用的麦胚凝集素亲和层析柱以及纯的P185neu/c-erbB-2蛋白等试剂价格昂贵。C法，如美国《生物化学杂志》(The Journal ofBiological Chemistry，1992，267：15160-15167)涉及的免疫方法，用高表达P185neu/c-erbB-2的人乳腺癌细胞株SKBR 3进行免疫，因为SKBR 3细胞膜上含有多种与P185neu/c-erbB-2属同一家族的生长因子受体类蛋白，这种免疫方法容易产生与其它生长因子受体类蛋白有交叉反应的抗体，大大增加了筛选抗P185neu/c-erbB-2特异性抗体的困难。
本发明的目的是提供一种能专一性针对P185neu/c-erbB-2并可用于临床诊断肿瘤组织P185neu/c-erbB-2表达水平的抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤及其制备方法，以及这种抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤分泌的抗体在肿瘤检测上的用途。
本发明抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤，其特征在于包括三株分别命名为A18、A21和A22的杂交瘤，它们分别分泌的抗体A18、A21和A22，其亚类都为IgG1；都能专一性地结合癌细胞膜上的P185neu/c-erbB-2，而与生长因子受体无交叉反应，与良性组织细胞也不结合，从而都能用于检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平；其中A21和A22能分别与来自P185neu/c-erbB-2的两段多肽99-109的DPLNNTTPVTG和614-625的DLDDKGCPAEQR与牛血清白蛋白BSA的偶联产物有专一性结合。
本发明抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤的制备方法，包括免疫、细胞融合、筛选与克隆四个步骤，其特征在于所述免疫采用细胞表面表位包埋法，即：先用抗未转neu/c-erbB-2癌基因的NIH/3T3细胞的抗血清包埋转neu/c-erbB-2癌基因的NIH/3T3细胞T6-17表面上除P185neu/c-erbB-2以外的其它抗原后再免疫小鼠；检测免疫小鼠的抗血清滴度，选择抗血清滴度最高的小鼠末次免疫后，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，进行细胞融合；再按酶联免疫分析法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，继续筛选，重复不少于2次，得到能分泌抗P185neu/c-ereB-2单克隆抗体的杂交瘤。
本发明抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤在肿瘤检测上的用途，其特征在于用抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤A18、A21和A22分泌的抗体A18、A21和A22检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平，当细胞膜P185neu/c-erbB-2高表达时，说明该肿瘤的恶性程度高，术后易发生转移和复发。
本发明与现有技术相比具有以下优点和特异性：
将本发明抗P185neu/c-erbB-2杂交瘤所分别分泌的单克隆抗体A18、A21和A22采用间接免疫过氧化物酶染色法、免疫荧光法、流式细胞仪(FACS)法和免疫沉淀方法进行分析，结果表明这些抗体都能与P185neu/c-erbB-2特异性结合；其中测得单抗A21和A22能够与来自P185neu/c-erbB-2的两段多肽99-109的DPLNNTTPVTG和614-625的DLDDKGCPAEQR与牛血清白蛋白的偶联产物特异性结合(注：A18的结合特异性还未测定)。使用本发明的三株杂交瘤分别分泌的单抗A18、A21和A22对乳腺癌组织及良性乳腺肿瘤组织进行了免疫组化染色，检测结果表明该三株抗体的阳性染色具有良好的膜定位，且与肿瘤分级密切相关，肿瘤组织分化差和有较多***或血道转移的乳腺癌，其P185neu/c-erbB-2阳性率呈上升趋势。据此可知，这些单克隆抗体可发展成诊断试剂盒用于检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平，具有临床诊断和指导选择治疗方案的意义。
本发明抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤的制备方法，由于采用了细胞表面区域表位包埋法的免疫方法，与现有技术相比较具有以下优点：相对于A法而言，本方法具有操作简单、快速易行的优点；相对于B法而言，本方法具有所用的试剂简单易得、价格低廉的优点；相对于C法而言，本方法能使筛选获得分泌目的抗体杂交瘤的难度大大降低；因为本发明所使用的方法只需用两种细胞先后免疫，而不用进一步提纯膜蛋白，所以操作过程简化，制备成本相对便宜；且由于不须使用免疫抑制剂环磷酰胺，从而不易使免疫动物致死；并且用抗NIH/3T3的抗血清结合转P185neu/c-erbB-2基因后的T6-17后，可大大提高免疫的特异性而降低筛选目的杂交瘤的难度。
采用本发明方法得到的抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤A18、A21和A22所分泌的抗体A18、A21和A22，用于检测肿瘤组织上P185neu/c-erbB-2的表达水平，其单抗的特异性强，阳性染色为膜着色，背景低，适宜用于临床病理切片的免疫组化检测，也可能发展到病人血清的检测。
本发明实施方式举例如下：
一、抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤的制备：
制备过程主要包括免疫、细胞融合、筛选和克隆四个步骤。
具体操作可分为以下五步：
1、用细胞表面表位包埋法进行免疫：
取6-8周品系为BaLb/C的小鼠八只，收集小鼠成纤维细胞NIH/3T3，洗涤后，悬浮于缓冲液中进行免疫，剂量为0.5×106至5×107/次/只小鼠，免疫次数以三次或四次为宜；取小鼠抗血清，即为小鼠抗NIH/3T3抗血清；收集转neu基因的NIH/3T3细胞T6-17，用1∶20至1∶100稀释的鼠抗NIH/3T3抗血清悬浮；温育过夜后，收集细胞，再悬浮于缓冲液中；
另取6-8周的BaLb/C小鼠八只，注射经过NIH/3T3抗血清温育的T6-17细胞，免疫次数不少于两次，剂量为0.5×106至5×107/次/只小鼠；
2、用酶联免疫分析法(ELISA)测定小鼠抗血清的滴度：
收集数瓶长满的T6-17细胞，用低渗缓冲液(10mMTris，10mMKCl，5mMEDTA，pH8.0)悬浮、4℃温育半小时，超声破碎，18000rpm离心，取上清，测其总蛋白含量，稀释至200ug/ml，即为抗原；按50ul/孔加于酶标板中，4℃包被过夜；在孔中加满封闭缓冲液(含0.25％小牛血清白蛋白(BSA)和0.05％吐温(Tween)的磷酸缓冲液(PBS))，室温放置2小时以上；用同样处理过的NIH/3T3细胞做为阴性对照；弃去封闭缓冲液，用蒸馏水洗后，分别加入各只小鼠的抗血清50ul/孔作为一抗，在37℃温育1.5小时；蒸馏水洗3次后，加入绵羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)作为酶标二抗，37℃温育1小时；蒸馏水洗3次后，加入OPD显色，492nm测吸光度(OD)值；若以T6-17为抗原时OD492＞1.0，而以NIH/3T3为抗原时OD492＜0.2者，即为阳性；选择抗血清滴度最高的小鼠(＞1∶104)，用同样处理过的T6-17细胞进行末次免疫。
3、按常规方法进行细胞融合：
在融合前一周左右复苏骨髓瘤细胞SP2/0，在融合前一天换新鲜培养基。在融合当天，取末次免疫后小鼠的脾脏细胞，用D-hanks缓冲液洗涤，收集SP2/0，混合，使得脾细胞：SP2/0为5∶1，再次洗涤。将1ml灭好菌的50％的聚乙二醇4000(PEG4000，溶于无血清RPMI-1640培养基中)在1分钟内滴加于细胞中，静置10分钟后，将细胞悬浮于HAT选择培养基，分加于96孔细胞培养板中，培养两周左右，直至杂交瘤细胞克隆肉眼可见。
4、用ELISA法进行阳性克隆筛选：
按上述的ELISA法，将其中一抗改为杂交瘤上清，筛选出分泌抗P185neu/c-erbB-2的抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、按照常规的有限稀释法进行单克隆化：
将阳性孔中的杂交瘤细胞按1∶10000左右稀释后，加入细胞培养板中，使克隆率保持在1/3至1/2；待克隆长大后，用ELISA法测定，计算稀释后克隆的阳性率，挑出反应最强的克隆继续进行稀释，重复多次，直至阳性率达100％。得到分泌抗P185neu/c-erbB-2的单克隆抗体的杂交瘤，即为本实验所要得到的目的产物。
本次实验得到三株分泌抗P185neu/c-erbB-2的单克隆抗体的杂交瘤，根据克隆编号，将其分别命名为A18、A21和A22，它们分泌的抗体也相应分别命名为A18、A21和A22。
二、单克隆抗体A18、A21和A22的性质鉴定
1、将上述按ELISA法筛选阳性克隆得到的三株杂交瘤A18、A21和A22分别扩增后种入8周的BaLb/C小鼠的腹腔中，待长腹水后，取出腹水，即为粗制的单克隆抗体。
2、以ELISA检测试剂盒测定所得抗体亚类：
在酶标板各孔中分别加入20ug/ml的兔抗各种小鼠IgG亚类抗体(如兔抗鼠IgG1抗体、兔抗鼠IgG2a抗体、兔抗鼠IgG2b抗体)50ul，在湿盒中室温温育2小时或过夜；移去上清，在孔中加满3％BSA/PBS，室温封闭2小时或过夜；用PBS洗三次，加入各种杂交瘤上清和腹水50ul，湿盒中室温温育2小时，弃上清，用PBS洗三次，加入羊抗兔IgG-辣根过氧化酶，室温温育2小时，加入OPD底物溶液显色，492nm测OD值。结果测得抗体A18、A21和A22的亚类均为IgG1。
3、用间接免疫过氧化物酶染色法对所得单抗A18、A21和A22与细胞表面P185neu/c-erbB-2的特异性结合进行检测：
将NIH/3T3、T6-17、SKBR3、MCF7(为低表达P185neu/c-erbB-2的人乳腺癌细胞)、NE91(为转生长因子受体EGFR基因的NR-6细胞，其细胞膜上高表达EGFR)细胞分别传至小培养皿中的盖玻片上，继续培养2-3天；取出盖玻片，用PBS洗两次，用冰冷的3％***固定10分钟；在盖玻片上各滴加50ul用封闭缓冲液稀释的腹水A18、A21和A22，在湿盒中室温放置1-1.5小时；PBS洗3次，5分钟/次；滴加50ul羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1000)，湿盒温育1小时；以PBS洗三次，5分钟/次；滴加DAB显色液，室温温育10分钟左右；镜下观察，发现对于这三种腹水来说，T6-17和SKBR3有强的膜阳性反应，而NIH/3T3、MCF7和NE91无反应，说明杂交瘤A18、A21和A22分泌的抗体A18、A21和A22都与表达于细胞膜上的P185neu/c-erbB-2的膜外区有特异性结合；由于这几株单抗与细胞膜上高表达EGFR的细胞NE91无结合，说明它们与EGFR无交叉反应。
4、用免疫沉淀检测所得单抗与P185neu/c-erbB-2蛋白的特异结合性：
首先，配制试剂：
(1)4mM Na3VO4；
(2)50mM NaF；
(3)细胞洗涤缓冲液：含0.4mM Na3VO4和5mM NaF的PBS；
(4)细胞裂解缓冲液：含1％NP40、1％去氧胆酸纳盐、0.1％十二烷基磺酸钠、0.15M NaCl、0.01M磷酸氢钠盐(pH7.4)、1％蛋白酶抑制剂Tracyrol(Aprotinin 200U/ml)、1mM PMSF、2mM EDTA、10mMNaF、10mM焦磷酸钠、0.4mM Na3VO4和10mM C2H4INO，最后调pH至8.0；
(5)凝胶洗涤液：pH为7.4的PBS中含0.5M NaCl、0.4mM Na3VO4、0.1％NP40、10mM NaF和10mM焦磷酸钠。
具体操作步骤如下：
SKBR3细胞在15cm培养皿上长至汇合后，用细胞洗涤缓冲液在冰上洗两次，按1.5mL/皿加入细胞裂解缓冲液，4℃温育30分钟，将细胞刮至1.5mL的离心管中，在4℃以14,000转/分离心15分钟，取上清，测蛋白浓度，调至1-3mg/mL用于免疫沉淀；各加入2ul腹水A18、A21和A22，混匀后，冰上放置1-2小时，加入40uL连有protein A的凝胶Sepharose，在4℃摇晃1小时，再以7500转/分钟低速离心3分钟；用凝胶洗涤液将凝胶洗三次；弃上清，加入20ul SDS-聚丙烯酰胺电泳样品缓冲液，煮沸3分钟，在冰上冷却，离心甩下珠子，将上清进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，浓缩胶为胶浓度5％，分离胶为胶浓度7.5％，电转移到硝酸纤维素膜上；用封闭缓冲液封闭膜；加入以1∶5000稀释的兔抗P185多抗，37℃温育1.5小时；洗涤，加入羊抗兔-HRP，37℃温育1小时；洗涤，荧光底物显色，用X光片曝光30秒；结果显示，这三株单抗所结合的蛋白是分子量为185kd的P185neu/c-erbB-2蛋白。
5、用FACS法检测所得单抗与细胞膜上P185neu/c-erbB-2的特异性结合：
配制FACS缓冲液：含0.5％BSA和0.05％叠氮钠的PBS；
分别收集SKBR3细胞和NIH/3T3细胞，每个样品为105细胞，用FACS缓冲液洗涤；在每个样品中加入2ul腹水和4ul FACS缓冲液，冰浴30分钟；用FACS缓冲液洗涤；在每个样品中加入羊抗鼠IgG-荧光素(FITC)0.5ul和40ul FACS缓冲液，冰浴30分钟；用FACS缓冲液洗涤后，用流式细胞仪检测其荧光强度，其中SKBR3细胞有强荧光，而NIH/3T3细胞的荧光很弱，与此同时说明了这三种腹水都与SKBR3细胞膜上的P185neu/c-erbB-2特异性结合，而与不表达P185neu/c-erbB-2的NIH/3T3细胞不结合。
6、单抗A21、A22和来源于P185neu/c-erbB-2分子的多肽的结合特性：
用戊二醛将来自P185neu/c-erbB-2的两段多肽，即99-109的DPLNNTTPVTG和614-625的DLDDKGCPAEQR，与牛血清白蛋白偶联后，包被在酶标板上作为抗原，用ELISA法测得腹水A21和A22与它们有阳性反应，从而说明A21、A22能与这两段多肽有特异性结合。
三、采用免疫组化法测定单克隆抗体A18、A21和A22用于人乳腺癌组织P185neu/c-erbB-2表达水平检测的最佳工作浓度：
将上述A18、A21和A22单抗的腹水，以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800的滴度，对已知P185阳性的人乳腺癌组织石蜡病理切片用链亲和素过氧化酶(S-P)法免疫组化进行染色，以明显的细胞膜着色做为P185阳性标准，测试最佳工作浓度。即：将石蜡切片脱蜡至水，用PBS洗；滴加含3％H2O2的甲醇，室温温育10分钟；用PBS洗后，滴加10％的非免疫动物血清，室温温育10分钟，吸去多余液体；将腹水A18、A22以1∶800，A21以1∶600稀释，滴加于切片上，37℃温育60分钟或4℃过夜；用PBS洗3次，5分钟/次；加生物素标记的羊抗鼠二抗室温温育10分钟；PBS洗3次，5分钟/次；滴加链亲和素-HRP溶液，室温温育10分钟；用PBS洗，加入新鲜配置的DAB溶液，显色3-10分钟，自来水冲洗；苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察病理切片染色结果，切片中高表达P185neu/c-erbB-2的部位膜染色清晰而背景弱的，所对应的最大稀释度为最佳工作浓度：A18和A22为1∶800，A21为1∶600。
四、临床肿瘤检测试验
采用上述方法用所得抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤分泌的单抗对安徽医科大学附属医院40例人乳腺癌病理组织切片及12例良性乳腺组织切片进行了免疫组化染色，结果显示阳性染色具有良好的膜定位，且与肿瘤分级密切相关。以A18为例，良性乳腺导管小叶的P185neu/c-erbB-2染色均为阴性，乳腺癌组织中有***或血道转移状况记载的为33例；P185neu/c-erbB-2阳性率依次为***阴性者57％(4/7)，***转移＜4枚者62％(8/15)；***转移＞4枚及血道转移者69％(9/13)。P185neu/c-erbB-2阳性率在组织学I级者为50％(6/12)，在组织学II-III级者为64％(18/28)，显示肿瘤组织分化差、有较多***或血道转移的乳腺癌，其P185neu/c-erbB-2阳性率呈上升趋势。临床实验结果说明了P185neu/c-erbB-2可做为乳腺癌诊断、分化程度和生物学行为的标志之一，同时说明了本发明抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤分泌的单克隆抗体A18、A21和A22具有实际检测肿瘤组织P185neu/c-erbB-2的作用；这些单克隆抗体可发展成诊断试剂盒用于检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平。
Claims (3)
1、一种抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤，其特征在于包括三株分别命名为A18、A21和A22的杂交瘤；它们分别分泌的抗体A18、A21和A22，其亚类都为IgG1；都能专一性地结合癌细胞膜上的P185neu/c-erbB-2，而与生长因子受体无交叉反应，与良性组织细胞也不结合；其中A21和A22能分别与来自P185neu/c-erbB-2的两段多肽99-109的DPLNNTTPVTG与614-625的DLDDKGCPAEQR与牛血清白蛋白的偶联产物有专一性结合。
2、一种抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤的制备方法，包括免疫、细胞融合、筛选与克隆四个步骤，其特征在于所述免疫采用细胞表面表位包埋法，即：先用抗未转neu/c-erbB-2癌基因的NIH/3T3细胞的抗血清包埋转neu/c-erbB-2癌基因的NIH/3T3细胞T6-17表面上除P185neu/c-erbB-2以外的其它抗原后再免疫小鼠；检测免疫小鼠的抗血清滴度，选择抗血清滴度最高的小鼠末次免疫后，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，进行细胞融合；再按酶联免疫分析法筛选阳性克隆后，用有限稀释法进行克隆，继续筛选，重复不少于2次，得到能分泌抗P185neu/c-crbB-2单克隆抗体的杂交瘤。
3、抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤在肿瘤检测上的用途，其特征在于用抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤A18、A21和A22分泌的抗体A18、A21和A22检测肿瘤组织中P185neu/c-erbB-2的表达水平，当癌细胞膜上P185neu/c-crbB-2高表达时，说明该肿瘤的恶性程度高，术后易发生转移和复发。
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1998
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