CN111855881B - 一种阿齐沙坦中盐酸羟胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阿齐沙坦中盐酸羟胺的含量的检测方法,所述的方法采用苯甲醛对羟胺进行衍生化处理,所述的色谱柱为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相A为10mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸),流动相B为乙腈,采用梯度洗脱,无需对样品进行特殊处理,无基质影响。所述的检测方法采用阿齐沙坦为供试品经***适用性、专属性、检测限、耐用性等项目验证,均符合相关要求。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域,具体涉及一种采用高效液相色谱法检测样品中盐酸羟胺杂质含量,更具体的是采用高效液相色谱法法检测阿齐沙坦中盐酸羟胺杂质含量。
背景技术
盐酸羟胺(分子式NH2OH·HCl,CAS:5470-11-1)是阿齐沙坦(分子式C25H20N4O5,CAS: 147403-03-0)合成工艺中使用到的物料,文献(Synthesis of Azilsartan and ItsSelected Potential Impurities[J]. Journal of Heterocyclic Chemistry,2013,50(4).)报道了采用盐酸羟胺合成制备得到阿齐沙坦,故盐酸羟胺有可能会残留至阿齐沙坦成品中。
目前未见针对阿齐沙坦原料药中盐酸羟胺含量的检测方法,发明人对盐酸羟胺在阿齐沙坦中的检测是通过自主开发的液相色谱方法实现的,并参考ICH Q2及《中国药典》四部9101指导原则对此方法进行了验证,符合相关的要求。
文献(M. Song, P. Lu, S.Wu, Y. Qiao and T. Hang , Anal. Methods, 2016,DOI: 10.1039/C6AY02675C.)报道了采用HPLC方法对齐留通(zileuton)和伏立诺他(vorinonstat)中遗传毒性杂质羟胺进行痕量分析的方法,此方法基于使用UV检测的常规9-芴基甲基氯甲酸酯的柱前衍生化方法。为了避免在衍生化过程中API的降解,提出了在衍生化之前利用沉淀进行预处理,该方法显示了可靠的回收率和出色的抗干扰能力。
专利CN105628824B报道了采用HPLC方法对阿齐沙坦原料药中可能存在的杂质进行检测,色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶,流动相A为0.1%磷酸水溶液:乙腈=80:20,流动相B为0.1%磷酸水溶液:乙腈=20:80,柱温为30℃~40℃,检测波长为208nm~212nm。但是用于阿齐沙坦中盐酸羟胺的检测,基质影响大,回收率不符合标准。另外发明人还研究了其他多种流动相的,如采用流动相A为0.05%甲酸水溶液、流动性B为0.05%甲酸乙腈溶液,采用苯甲醛对盐酸羟胺进行衍生化,采用多种流动性比例进行研究,但是基质影响大,回收率难以符合标准。最终,发明人意外发现,无需对待测样品进行特殊处理回收率即可符合标准的条件,并对该检测方法进行了方法学验证,符合相关的标准。
发明内容
本发明提供了一种阿齐沙坦中盐酸羟胺的含量的检测方法,本发明人经过对液相色谱条件的深入研究,获得了无需对待测阿齐沙坦样品进行特殊处理回收率即可符合标准的条件,并对方法进行了方法学验证,符合相关的要求。所述的检测方法采用液相色谱(LC),该方法灵敏度高、准确性高、重复性好,可用于阿齐沙坦样品中盐酸羟胺的检测。
本发明提供的一种阿齐沙坦中盐酸羟胺杂质含量的检测方法,其特征在于采用HPLC进行检测,包括如下步骤:
溶液配制:分别配制空白溶液、对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液;
其中,所述的对照品溶液和灵敏度溶液均为采用盐酸羟胺溶解于甲醇,在衍生介质、衍生剂的条件下经过衍生化配制而成;供试品溶液采用供试样品溶解于衍生介质、加甲醇、衍生剂配制而成;所述的空白溶液为采用甲醇、衍生介质、衍生剂配制而成;
所述的衍生介质为氢氧化钠的甲醇溶液,优选浓度为0.25mol/L;
所述的衍生剂为苯甲醛的甲醇溶液,浓度优选0.5mg/ml;
所述的供试样品为阿齐沙坦。
进样:待***稳定后,进空白溶液1针,灵敏度溶液1针,对照品溶液6针,供试品溶液1针,记录谱图;
其中,
所述的检测方法采用的色谱条件为:色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如:Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×150mm,5.0µm或效能相当的色谱柱);流速:0.8ml/min;检测波长:254nm;进样量:10μl;柱温:40℃;进样盘温度:8℃;
流动相A:10mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸);流动相B:乙腈;
梯度如表1:
所述对照品溶液中盐酸羟胺的浓度为150 ng/ml~350ng/ml,优选300ng/ml;所述灵敏度溶液中盐酸羟胺的浓度为100ng/ml~200ng/ml,优选150ng/ml;所述供试品溶液浓度为2 mg/ml~15mg/ml,优选6 mg/ml~10mg/ml,更优选8mg/ml;
所述的空白溶液配制方法,精密量取甲醇、衍生介质、衍生剂,同置离心管中,涡旋振摇2min,加甲醇稀释,摇匀;
盐酸羟胺储备液①:取盐酸羟胺适量,精密称定,置适量量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀;
盐酸羟胺储备液②:精密量取盐酸羟胺储备液①适量,置适量量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;
盐酸羟胺储备液③:精密量取盐酸羟胺储备液①适量,置适量量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;精密量取上述溶液适量,置适量量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;
灵敏度溶液:精密量取盐酸羟胺储备液③适量、衍生介质适量、衍生剂适量,同置适量离心管中,涡旋振摇2min,加甲醇稀释,摇匀;
对照品溶液:精密量取盐酸羟胺储备液②适量、衍生介质适量、衍生剂适量,同置适量离心管中,涡旋振摇2min,加适量甲醇稀释,摇匀;
供试品溶液:取供试品适量,置适量离心管中,加衍生介质适量溶解,加甲醇适量,衍生剂适量,涡旋振摇2min,加适量甲醇稀释,摇匀。
所述的衍生介质为氢氧化钠甲醇溶液,其配制方法为取氢氧化钠适量,加甲醇适量溶解制备得到;
所述的衍生剂为苯甲醛甲醇溶液,其配制方法为取苯甲醛适量,置适量量瓶中,加甲醇稀释至刻度制备得到;
其中所采用的试剂及级别:甲酸铵为AR及以上;甲酸为HPLC;乙腈:HPLC;水:超纯水;甲醇:HPLC;氢氧化钠:AR及以上;苯甲醛:AR及以上;盐酸羟胺:AR及以上。
更优选的,本发明所述的检测方法,包括以下步骤:
(1)溶液配制:
衍生介质:0.25mol/L氢氧化钠甲醇溶液(取氢氧化钠约2g,加甲醇200ml溶解)
衍生剂:0.5mg/ml苯甲醛甲醇溶液(取苯甲醛约50mg,置100ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度)
空白溶液:精密量取甲醇0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
盐酸羟胺储备液①:取盐酸羟胺约20mg,精密称定,置200ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。
盐酸羟胺储备液②:精密量取盐酸羟胺储备液①3.0ml,置100ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。
盐酸羟胺储备液③:精密量取盐酸羟胺储备液①3.0ml,置20ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;精密量取上述溶液1.0ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。
灵敏度溶液:精密量取盐酸羟胺储备液③0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
对照品溶液:精密量取盐酸羟胺储备液②0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
供试品溶液:取供试品约40mg,置10ml离心管中,加衍生介质1.0ml溶解,加甲醇0.5ml,衍生剂0.5ml,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
所述的供试样品阿齐沙坦原料药。
其中所采用的试剂及级别:甲酸铵为AR及以上;甲酸为HPLC;乙腈:HPLC;水:超纯水;甲醇:HPLC;氢氧化钠:AR及以上;苯甲醛:AR及以上;盐酸羟胺:AR及以上。
(2)进样:待***稳定后,进空白溶液1针,灵敏度溶液1针,对照品溶液6针,供试品溶液1针,记录色谱图。
其中,
所述的检测方法采用的色谱条件为:色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如:Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×150mm,5.0µm或效能相当的色谱柱);流速:0.8ml/min;检测波长:254nm;进样量:10μl;柱温:40℃;进样盘温度:8℃;
流动相A:10mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸);流动相B:乙腈;采用梯度洗脱的方式,其中流动相梯度表见表1;
其中灵敏度溶液中盐酸羟胺的S/N值应≥10;6针对照品溶液中盐酸羟胺峰面积计RSD应不大于10.0%。
计算:
含量(ppm)=(Ru/Rs)×(Cs/Cu)×1000
其中:Ru:供试品溶液图谱中盐酸羟胺的峰面积;
Rs:6针对照品溶液中盐酸羟胺的平均峰面积;
Cs:对照品溶液中盐酸羟胺的浓度(μg/ml);
Cu:供试品溶液的浓度(mg/ml)。
其中盐酸羟胺在阿齐沙坦中的限度为不大于37.5ppm。
所述的检测方法采用阿齐沙坦为供试品进行方法学验证,验证结果表明,符合相关要求,其测试结果如下:
本发明所述的HPLC为高效液相色谱。
本发明所提供的用于检测阿齐沙坦中盐酸羟胺含量的方法,具有灵敏度高,定量限低,根据相关指导原则,按照从严控制杂质含量,盐酸羟胺在阿齐沙坦中的限度为37.5ppm,所述的检测方法采用阿齐沙坦为供试品经***适用性、专属性、检测限、耐用性等项目验证,均符合相关要求,无需对样品进行特殊处理,无基质影响。
附图说明
图1 实施例2中灵敏度溶液谱图
图2 实施例2对照品溶液谱图
图3实施例3中盐酸羟胺定位溶液谱图
图4实施例3中供试品溶液谱图
图5实施例3中选择性溶液谱图
图6 实施例4中供试品溶液(加标)谱图
图7实施例5中LOQ-1溶液谱图
图8实施例5中LOD溶液谱图
图9 实施例6中线性-100%溶液谱图
图10 实施例7中准确度 100%-1溶液谱图
图11 实施例8中对照品34hr谱图
图12 实施例8中供试品溶液29hr谱图
图13 实施例8中选择性溶液29hr谱图
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为:本发明的实施例仅仅是用于说明本发明,而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。
本发明实施例所采用的仪器、色谱柱、试剂、对照品、供试品等信息如表3、表4、表5所示。
实施例1 检测方法
仪器条件及试剂
仪器:高效液相色谱仪配置紫外检测器、电子分析天平。
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如:Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×150mm,5.0µm或效能相当的色谱柱);
流速:0.8ml/min; 检测波长:254nm;
进样量:10μl; 柱温:40℃;
进样盘温度:8℃;
流动相A:10mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸);
流动相B:乙腈;
梯度表如表1所示。
(1)溶液配制:
衍生介质:0.25mol/L氢氧化钠甲醇溶液(取氢氧化钠约2g,加甲醇200ml溶解)
衍生剂:0.5mg/ml苯甲醛甲醇溶液(取苯甲醛约50mg,置100ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度)
空白溶液:精密量取甲醇0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
盐酸羟胺储备液①:取盐酸羟胺约20mg,精密称定,置200ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。
盐酸羟胺储备液②:精密量取盐酸羟胺储备液①3.0ml,置100ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。
盐酸羟胺储备液③:精密量取盐酸羟胺储备液①3.0ml,置20ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀;精密量取上述溶液1.0ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。
灵敏度溶液:精密量取盐酸羟胺储备液③0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
对照品溶液:精密量取盐酸羟胺储备液②0.5ml、衍生介质1.0ml、衍生剂0.5ml,同置10ml离心管中,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
供试品溶液:取供试品约40mg,置10ml离心管中,加衍生介质1.0ml溶解,加甲醇0.5ml,衍生剂0.5ml,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀。
(2)进样:待***稳定后,进空白溶液1针、灵敏度溶液1针,对照品溶液6针、供试品溶液1针,记录色谱图。
其中待***稳定后,进空白溶液1针、灵敏度溶液1针,对照品溶液6针、供试品溶液1针,记录色谱图;
计算:
结果(ppm)=(Ru/Rs)×(Cs/Cu)×1000
其中:Ru:供试品溶液图谱中盐酸羟胺的峰面积;
Rs:6针对照品溶液中盐酸羟胺的平均峰面积;
Cs:对照品溶液中盐酸羟胺的浓度(μg/ml);
Cu:供试品溶液的浓度(mg/ml)。
实施例2 ***适用性
***适用性是通过测定灵敏度溶液中盐酸羟胺的S/N值及6针对照品溶液中盐酸羟胺峰面积的RSD而实现的。要求灵敏度溶液中盐酸羟胺的S/N值应≥10;6针对照品溶液中盐酸羟胺峰面积的RSD应不大于10.0%。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表6。
实施例3 专属性
方法的专属性是通过测定空白溶液对检测无干扰;选择性溶液中盐酸羟胺与相邻峰之间的分离度而实现的。要求空白溶液对检测应无干扰;选择性溶液中盐酸羟胺与相邻峰之间的分离度应不小于1.5。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表7。
结论:空白溶液对检测无干扰;选择性溶液中盐酸羟胺与相邻峰之间的分离度均为2.1,符合标准规定。
实施例4 精密度
精密度是通过测定6份供试品溶液(加标)测定结果的RSD而实现的。要求6份供试品溶液(加标)测定结果的RSD应不大于10.0%。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表8。
实施例5 定量限和检测限
定量限和检测限是通过检测响应信号与噪声之比而实现的,定量限的信噪比应不小于10:1,检测限的信噪比应不小于3:1;在定量限浓度水平下,重复考察6份定量限溶液。要求LOQ盐酸羟胺应不大于37.5ppm,S/N≥10;6份LOQ溶液中盐酸羟胺峰面积的RSD应不大于10.0%;LOD<LOQ,S/N≥3。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表9、10。
实施例6线性和范围
LOQ~150%浓度范围内,取5个浓度点,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标画曲线。要求在LOQ~150%浓度范围内应呈线性,要求曲线的线性相关系数R的平方(R2)应不小于0.99,y轴截距的绝对值在100%浓度响应值的25%以内。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表11。
实施例7 准确度
准确度是通过各被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率及盐酸羟胺回收率的RSD(n=9)而实现的。要求各浓度点各准确度溶液中,盐酸羟胺的回收率应在80.0%~120.0%之间,RSD(n=9)应不大于10.0%。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表12。
实施例8 耐用性(溶液稳定性)
考察对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液在8℃条件下放置一段时间后进样,检测结果随时间变化的规律,为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供依据。要求与0hr相比较,对照品溶液在8℃条件下放置一段时间盐酸羟胺的回收率应在90.0%~110.0%之间,则溶液稳定;供试品溶液在8℃条件下放置一段时间内测定结果的变化值在限度的20%以内,则溶液稳定;选择性溶液在8℃条件下放置一段时间内盐酸羟胺的回收率应在80.0%~120.0%之间,则溶液稳定。
溶液配制,按照实施例1条件进样,测试结果见表13-15。
Claims (6)
1.一种阿齐沙坦中盐酸羟胺杂质含量的检测方法,其特征在于采用HPLC方法进行检测,其中,所述的检测方法采用的色谱条件为:色谱柱为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流速为0.8ml/min,流动相A为10mmol/L甲酸铵溶液,所述流动相A含0.1%甲酸,流动相B为乙腈,采用梯度洗脱,供试品阿齐沙坦采用苯甲醛进行衍生化处理;
其中所述的梯度洗脱如下:
。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
溶液配制:分别配制空白溶液、对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液;
进样:待***稳定后,进空白溶液1针,灵敏度溶液1针,对照品溶液6针,供试品溶液1针,记录谱图;
其中所述的对照品溶液和灵敏度溶液均为采用盐酸羟胺溶解于甲醇,在衍生介质、衍生剂的条件下经过衍生化配制而成;供试品溶液采用供试样品溶解于衍生介质、加甲醇、衍生剂配制而成;所述的空白溶液为采用甲醇、衍生介质、衍生剂配制而成;所述的衍生介质为氢氧化钠的甲醇溶液;所述的衍生剂为苯甲醛的甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,对照品溶液中盐酸羟胺的浓度为150ng/ml~350ng/ml;所述灵敏度溶液中盐酸羟胺的浓度为100ng/ml~200ng/ml;所述供试品溶液浓度为2mg/ml~15mg/ml。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,衍生介质为0.25mol/L氢氧化钠甲醇溶液,衍生剂为0.5mg/ml苯甲醛甲醇溶液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,供试品溶液的配制方法为,取供试品约40mg,置10ml离心管中,加衍生介质1.0ml溶解,加甲醇0.5ml,衍生剂0.5ml,涡旋振摇2min,加3.0ml甲醇稀释至5ml,摇匀即得。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述的检测方法采用的色谱条件为:色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,所述色谱柱为:Agilent ZORBAX SB-C184.6×150mm,5.0μm;流速:0.8ml/min;检测波长:254nm;进样量:10μl;柱温:40℃;进样盘温度:8℃;流动相A:10mmol/L甲酸铵溶液,所述流动相A含0.1%甲酸;流动相B:乙腈;采用梯度洗脱的方式。
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