CN111855625A - 一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学及核酸化学技术领域,涉及基于Cu‑MOF的CA125检测试剂盒及其应用。该试剂盒是基于利用金属有机骨架材料的荧光淬灭效应及金属MOF与DNA适体较强的吸附力，当DNA适体与MOF共同存在时，DNA适体与MOF结合，荧光淬灭；而当目标蛋白存在的情况下，DNA适体优先与目标蛋白结合或将DNA适体从MOF上置换下来，荧光值恢复。合成特异性针对CA125的DNA适体，加上Cy5.5的荧光标记，序列为：TGCCTTATTACTCTCTCCTGTTAAC‑Cy5.5。利用不同浓度的标准蛋白和DNA适体及MOF共孵育，获得荧光恢复标准曲线，优化反应体系，获得最优检测范围与检测灵敏度，利用不同蛋白标准曲线及检测体系中不同荧光值目标蛋白恢复情况，获得不同目标蛋白浓度。该检测方法快速、低成本、高灵敏、不需复杂的扩增和检测仪器。

Description

一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学及核酸化学技术领域，具体涉及一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用。
背景技术
卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，5年生存率仅40％左右(Siegel RL,MillerKD,Jemal A.Cancer statistics,2018.CA Cancer J Clin 2018；68(1):7-30.)严重威胁女性生命健康。卵巢癌发病隐匿，早期卵巢癌通常没有明显症状，因此约70％的卵巢癌发现时已经是晚期，发生了腹腔大范围的转移，这也是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。有文献报道早期卵巢癌的生存率可达到90％以上，因此提高卵巢癌的早期诊断效率是提高卵巢癌总体生存率的关键问题(参考文献：Kurman RJ.,Visvanathan K.,Roden R.,Wu TC.,Shih IeM.Am J Obstet Gynecol,2008,198(4),351-6.)。目前临床上卵巢癌早期诊断最主要的指标仍然是CA125。
临床上CA125的检测方法主要是ELISA方法，存在耗时长、操作复杂、ELISA试剂盒相对价格较高等弊端。因此，本发明着力于寻找一种操作简单、体系稳定、价格低廉且灵敏度好、响应快速的检测技术。近年来，基于金属MOF和DNA适体的检测方法是当前检测领域的一个热门方向，例如，Yu Chao小组采用了基于Ce-MOF@Au和AuPtRu NPs的三金属信号放大策略，从而利用DNA适体对TSP1进行灵敏检测(参考文献：Xiaoxue Fu.,Junlin He.,Chengli Zhang.,Jun Chen.,Yilin Wen.,Jia Li.,Weiran Mao.,Hangtian Zhong.,JiahaoWu.,Xingduo Ji.,ChaoYu.Biosens Bioelectron,2019,132,302-309.)。YinjiChen小组开发了一种基于有效的Y型DNA探针和纳米金属有机框架(NMOF)来检测多重抗生素的电化学方法(参考文献：Meng Chen.,NingGa.,Tianhua Li.,Ye Wang.,Qing Xu.,Yinji Chen.Anal Chim Acta,2017,968,30-39.)；该小组还报道了一种以金属有机骨架材料(MOFs)为信号示踪剂，以RecJf外切酶催化的靶区循环扩增为基础，研制了一种利用抗ssDNA抗体与适配体同时检测土霉素(OTC)和卡那霉素(KAN)的超灵敏电化学探针。(参考文献：Meng Chen.,Ning Ga.,You Zhou.,Tianhua Li.,Qing Xu.,Yuting Cao.,YinjiChen.Talanta,2016,161,867-874.)；但是，迄今为止，还没有可以基于Cu-MOF的CA125的检测方法。
发明内容
本发明需要解决的问题：基于MOF和DNA适体的检测方法是利用携带荧光的DNA适体与MOF结合的荧光淬灭效应及DNA适体与其靶标蛋白的高亲和力设计出来的一种检测方法，针对现有CA125检测的不足之处，比如耗时长、操作复杂、ELISA试剂盒相对价格较高等。提供一种快速检测CA125的方法，并组装成简单易操作的试剂盒，可对CA125进行快速、低成本、高灵敏度检测。
本发明的总体技术路线：采集样本，与CA125的DNA适体共孵育；加入Cu-MOF,立即在650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。对实验流程中的关键反应条件、试剂成分及浓度进行优化，将CA125适体，Tris-HCl缓冲液，Cu-MOF开发成检测CA125的试剂盒。
本发明的技术方案：(1)将CA125的DNA适体与CA125蛋白进行预孵育，杂交体系：1μL 5μM CA125适体，5μL含CA125的待检样本，补充Tris-HCl至10μL；杂交条件：室温，20min。
(2)预包被的酶标板中，每孔加入90μL用pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释的终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，轻轻混匀后立即650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。
具体内容详述如下：
1.研究CA125的DNA适体与Cu-MOF结合情况及Cu-MOF的最佳浓度
用DMF配制10mg/mL Cu-MOF；加适量TM缓冲液溶解合成的CA125的DNA适体(Cy5.5标记的CA125适体序列：Cy5.5-TGCCTTATTACTCTCTCCTGTTAAC)至5μM的终浓度。取不同浓度的Cu-MOF(终浓度：5μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.1μg/mL，0.02μg/mL)，加入终浓度为0.05μMCA125的DNA适体，室温下孵育0.5h，设置不同的激活光和发射光波长，使用酶标仪检测荧光值的淬灭情况。结果发现当Cu-MOF的终浓度为0.5μg/mL时荧光淬灭效果基本达到平台期，被选为最佳浓度。
2.研究不同条件对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
配制100mM NaCl，300mM NaCl，1μg/μL BSA，pH3.0，pH5.0，pH7.0，pH9.0的缓冲液，准备25℃，37℃，60℃和80℃水浴锅，将Cu-MOF和CA125的DNA适体在上述条件下孵育0.5h后，设置激发光和发射光波长，使用酶标仪检测荧光值的淬灭情况，分析不同盐离子浓度，不同pH和不同浓度对DNA适合和Cu-MOF结合力的影响，检验CA125的DNA适体和BSA蛋白是否存在非特异性结合。结果发现常温和25℃和37℃条件下荧光淬灭效果较好，pH在5-9之间荧光淬灭效果基本相当，100mM NaCl对荧光淬灭效果影响不大，且CA125适体和BSA之间没有明显的非特异性结合作用。
3.研究CA125标准蛋白浓度与荧光强度的线性关系，获得适体检测蛋白的最佳浓度范围
配制不同浓度的CA125标准蛋白(ab164957，abcam，100μL反应体系的终浓度分别为1500ng/mL，1200ng/mL，800ng/mL，400ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL)，并与CA125的DNA适体在室温下孵育20min。然后加入终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，立即进行荧光检测。荧光测量均由F2500荧光光谱仪(日立)实现。Cy5.5在650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。所有激发和发射狭缝宽度均设置为5nm，PMT电压为800V。所有这些检测都记录在室温下。
结果发现基于Cu-MOF的CA125检测范围为：，线性检测范围为，说明基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒具有非常好的检测范围与灵敏度。
本发明所述试剂盒用于体外CA125的检测方法：
(1)将CA125的DNA适体与CA125蛋白进行预孵育，杂交体系：1μL 5μM CA125适体，5μL含CA125的待检样本，补充Tris-HCl至10μL；杂交条件：室温，20min。
(2)预包被的酶标板中，每孔加入90μL用pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释的终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，轻轻混匀后立即650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。
本发明与现有技术相比其有益效果是，本发明建立了一种利用Cu-MOF和CA125的DNA适体检测CA125的检测方法，该方法不需要使用抗体，而是利用荧光标记的DNA适体与CA125蛋白进行杂交，形成DNA蛋白杂合体，从而保护荧光标记的DNA探针，避免其与MOF结合导致的荧光淬灭。本发明针对现有CA125检测的不足之处，比如耗时长、操作复杂、ELISA试剂盒相对价格较高等，提供了一种快速检测CA125的方法，并组装成简单易操作的试剂盒，可对CA125进行快速、低成本、高灵敏度检测。
附图说明
图1：本发明的方法原理图
图2：CA125的DNA适体与Cu-MOF结合情况
图3：不同条件对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
A不同温度对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
B不同pH对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
C盐离子对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
D非特异性蛋白的存在对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
图4：CA125标准蛋白浓度与荧光强度标准曲线及CA125的DNA适体检测CA125蛋白的最佳线性范围分析
A.本发明的应用于检测CA125的特异性分析结果图
B.本发明的应用于检测CA125的线性浓度范围结果图
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1研究CA125的DNA适体与Cu-MOF结合情况及Cu-MOF的最佳浓度
用DMF配制10mg/mL Cu-MOF；加适量TM缓冲液溶解合成的CA125的DNA适体(Cy5.5标记的CA125适体序列：Cy5.5-TGCCTTATTACTCTCTCCTGTTAAC)至5μM的终浓度。取不同浓度的Cu-MOF(终浓度：5μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.1μg/mL，0.02μg/mL)，加入终浓度为0.05μMCA125的DNA适体，室温下孵育0.5h，设置不同的激活光和发射光波长，使用酶标仪检测荧光值的淬灭情况。结果发现当Cu-MOF的终浓度为0.5μg/mL时荧光淬灭效果基本达到平台期，被选为最佳浓度。
实施例2研究不同条件对CA125适体与Cu-MOF结合力的影响
配制100mM NaCl，300mM NaCl，1μg/μL BSA，pH3.0，pH5.0，pH7.0，pH9.0的缓冲液，准备25℃，37℃，60℃和80℃水浴锅，将Cu-MOF和CA125的DNA适体在上述条件下孵育0.5h后，设置激发光和发射光波长，使用酶标仪检测荧光值的淬灭情况，分析不同盐离子浓度，不同pH和不同浓度对DNA适合和Cu-MOF结合力的影响，检验CA125的DNA适体和BSA蛋白是否存在非特异性结合。结果发现常温和25℃和37℃条件下荧光淬灭效果较好，pH在5-9之间荧光淬灭效果基本相当，100mM NaCl对荧光淬灭效果影响不大，且CA125适体和BSA之间没有明显的非特异性结合作用。
实施例3研究CA125标准蛋白浓度与荧光强度的线性关系，获得适体检测蛋白的最佳浓度范围
配制不同浓度的CA125标准蛋白(ab164957，abcam，100μL反应体系的终浓度分别为1500ng/mL，1200ng/mL，800ng/mL，400ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL)，并与CA125的DNA适体在室温下孵育20min。然后加入终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，立即进行荧光检测。荧光测量均由F2500荧光光谱仪(日立)实现。Cy5.5在650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。所有激发和发射狭缝宽度均设置为5nm，PMT电压为800V。所有这些检测都记录在室温下。
结果发现基于Cu-MOF的CA125检测范围为：线性检测范围为，说明基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒具有非常好的检测范围与灵敏度。
本发明所述试剂盒用于体外CA125的检测方法
(1)将CA125的DNA适体与CA125蛋白进行预孵育，杂交体系：1μL 5μM CA125适体，5μL含CA125的待检样本，补充Tris-HCl至10μL；杂交条件：室温，20min；
(2)预包被的酶标板中，每孔加入90μL用pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释的终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，轻轻混匀后立即650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。
<110>南京市妇幼保健院
<120>一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用
<160>1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgccttattactctctcctgttaac

Claims (2)

1.一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒，其特征是试剂盒的组成部分为：
(1)普通96孔板；
(2)探针混合液1：针对荧光标记的CA125的DNA适体，浓度为5μM；
荧光标记的CA125 DNA适体：SEQ ID NO1，序列(5’-3’)：Cy5.5-TGCCTTATTACTCTCTCCTGTTAAC；
(3)Cu-MOF：DMF配Cu-MOF储存液10mg/mL；
(4)缓冲液：10mM pH7.4 Tris-HCl。
2.根据权利要求1所述基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒体外CA125的应用，其特征是由以下步骤构成：
(1)将CA125的DNA适体与CA125蛋白进行预孵育，杂交体系：1μL 5μM CA125适体，5μL含CA125的待检样本，补充Tris-HCl至10μL；杂交条件：室温，20min；
(2)预包被的酶标板中，每孔加入90μL用pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释的终浓度为0.5μg/mL的Cu-MOF，轻轻混匀后立即650nm处激发，在700nm处测量Cy5.5荧光信号。
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