CN111850084B - 一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法，其中涉及一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，包括：检测模块，用于通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；处理模块，用于基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的数值；比较模块，用于将所述得到的数值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。本发明以减少背景噪声的检测过程，下降了该检测方法的使用成本和操作复杂程度。

Description

一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法

技术领域

本发明涉及差异分析技术领域，尤其涉及一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法。

背景技术

线粒体、溶酶体作为亚细胞器结构，其质量的检测手段非常有限，由于亚细胞器大多为动态发展过程，时刻处于***和融合的过程中，一般很难去检测其功能的变化，通常线粒体的质量与功能直接相关，如文献：“Federico A， Cardaioli E， Da Pozzo P，Formichi P， Gallus GN， Radi E. Mitochondria， oxidative stress andneurodegeneration. J Neurol Sci. 2012;322(1-2):254-262. doi:10.1016/j.jns.2012.05.030”、“Youle RJ， Bliek AM van der. Mitochondrial Fission，Fusion， and Stress. Science (New York， NY). 2012;337(6098):1062. doi:10.1126/science.1219855”。

常规检测线粒体、溶酶体的方法主要是使用小分子探针，通过线粒体和溶酶体的自身细胞器特点，富集在细胞器周围或者内膜中，小分子探针中嵌入荧光素基团，通过荧光显微镜进行主观观察，如文献“Spontaneous Changes in Mitochondrial MembranePotential in Culture Neurons. Published online 2001.”、“Chazotte B. Labelingmitochondria with Mito-Tracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(8):990-992. doi:10.1101/pdb.prot5648”。

荧光显微镜中无法直接数量化线粒体和溶酶体的质量变化，仅能通过细胞中荧光标记的线粒体亮度、大小进行主观判断。随着流式细胞技术的进步，目前也有通过流式细胞仪进行线粒体和溶酶体的检测方案，该方案中，需要对检测的靶细胞的线粒体/溶酶体进行小分子的荧光探针的标记，同时还需要使用去极化的化学物质将靶细胞的线粒体和溶酶体处理，以获得背景信号，再用测试结果减去背景结果，以获得质量变化值。如文献“Wei C-W，Zhou T-A， Dzhagalov IL， Hsu C-L. Multicolor Flow Cytometry-basedQuantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. JoVE. 2019;(143):58844. doi:10.3791/58844”、“Clutton G， Mollan K， Hudgens M， Goonetilleke N. AReproducible， Objective Method Using MitoTracker® Fluorescent Dyes to AssessMitochondrial Mass in T Cells by Flow Cytometry. Cytometry. 2019;95(4):450-456. doi:10.1002/cyto.a.23705”、“Xiao B， Deng X， Zhou W， Tan E-K. FlowCytometry-Based Assessment of Mitophagy Using MitoTracker. Front CellNeurosci. 2016;10. doi:10.3389/fncel.2016.00076”。

现有的使用流式细胞仪来做线粒体和溶酶体的质量变化检测过程中，会存在背景噪声的问题；且现有的检测方法仅通过单次实验来评估不同样本的线粒体或者溶酶体质量差异，以此来研究样本的差异性原因，存在本次获得的结果无法与下次实验直接比较的问题。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法，以减少背景噪声的检测过程，下降了该检测方法的使用成本和操作复杂程度。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，包括：

检测模块，用于通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

处理模块，用于基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值；

比较模块，用于将所述得到的损伤值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。

进一步的，所述检测模块中体外检测试剂盒的材料包括T淋巴细胞亚群的特异性抗体CD3、CD8、CD4。

进一步的，所述检测模块中对外周血进行检测包括对线粒体损伤进行检测，所述对线粒体损伤进行检测具体为：采用第一试剂对外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞以及T淋巴细胞的两个亚群、辅助/诱导T淋巴细胞和抑制/毒性T淋巴细胞进行检测。

进一步的，所述对线粒体损伤进行检测的检测指标包括三种细胞群的百分比、绝对计数和线粒体损伤指数；所述三种细胞群包括T淋巴细胞群，辅助/诱导T淋巴细胞群和抑制/毒性T淋巴细胞群。

进一步的，所述检测模块中对外周血进行检测还包括对溶酶体损伤进行检测，所述对溶酶体损伤进行检测具体为：采用第二试剂对外周血淋巴细胞的T淋巴和NK淋巴细胞进行检测，其中NK淋巴细胞包括NK1、NK2、NK3三群细胞。

进一步的，所述对溶酶体损伤进行检测的检测指标包括四种细胞群的百分比、绝对计数和T细胞的溶酶体损伤指数；所述四种细胞群包括T淋巴细胞群，NK1淋巴细胞亚群，NK2淋巴细胞亚群，NK3淋巴细胞亚群。

进一步的，所述第一试剂包括线粒体探针、荧光单克隆抗体以及红细胞裂解液；所述第二试剂包括溶酶体探针、荧光单克隆抗体、以及红细胞裂解液。

进一步的，所述处理模块中采用降维算法，所述与线粒体或溶酶体相对应的损伤值DI表示为：

其中，DI表示与线粒体或溶酶体相对应的损伤值，α表示修正系数；SMFI表示样本检测平均荧光强度值；PMFI表示标准微球检测的平均荧光强度值；Abs.C表示样本的绝对计数值；RL表示试剂批次系数。

进一步的，检测仪器可以为NovoCyte流式细胞仪、UB DiagCyto、BC DxFlex、BDFACSCanto II。进一步的，以NovoCyte流式细胞仪为原型机，其余仪器的修正系数为：

以上，MDI为Mitochodria Damage index，即线粒体损伤的缩写，LDI为 LysosomeDamage index，即溶酶体损伤的缩写。

进一步的，试剂批次系数RL，以标准批试剂的为基础，其余批次的试剂修正系数计算公式如下：

标准批试剂（A）和待测批试剂（B）共同染色标记同一样本，检测结果值经过如下计算即为待测批系数：

试剂批次系数RL=MFI（B）/MFI（A）。

以上MFI为荧光强度值，MFI在流式细胞仪上直接读取。

进一步的，所述比较模块中预设阈值包括T淋巴细胞的阈值、辅助/诱导T淋巴细胞的阈值和抑制/毒性T淋巴细胞的阈值；所述将得到的数值与预设阈值进行比较具体为判断得到的数值是否大于预设阈值，若是，则表示细胞存在线粒体或溶酶体损伤。

相应的，还提供一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的方法，包括：

S1.通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

S2.基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值；

S3.将所述得到的损伤值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过采集特定样本类型和数据分析，确定了线粒体和溶酶体的背景噪声，因此可以减少背景噪声的检测过程，下降了该检测方法的使用成本和操作复杂程度；

2、通过引入a）工艺上将试剂做精确的定量分装和包装，确保试剂的量恒定；b）仪器上使用标准的荧光微球校准仪器确保不同检测时间、不同检测仪器的条件一致性；

3、通过降维算法和仪器校正均在WEB端实现，可集成后端的机器语言学习，疾病诊断的灵敏度和特异性会持续提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例一提供的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***结构图；

图2是实施例一提供的线粒体标准峰值和溶酶体标准峰值；

图3是实施例一提供的ROC曲线分析获得的特异性和灵敏度结果；

图4是实施例二提供的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***及方法。

实施例一

本实施例提供一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，如图1所示，包括：

检测模块11，用于通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

处理模块12，用于基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值；

比较模块13，用于将所述得到的损伤值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。

在检测模块11中，通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据。

在本实施例中，体外检测试剂盒依赖于线粒体特殊染料，它是一种能特异性的结合活细胞线粒体的绿色荧光，该荧光能被633nm激发，并不依赖于线粒体膜电位，以此监测线粒体的质量，线粒体质量的变化与细胞凋亡/损伤相关，同时该染料染色后可进行细胞固定处理，不会导致线粒体探针的消退。

同时，体外检测试剂盒的材料使用到了T淋巴细胞亚群的特异性抗体CD3、CD8、CD4，它们能特异识别外周血的T淋巴细胞（CD3+）及其亚群（CD3+CD4+，CD3+CD8+），以此分析T淋巴细胞及其亚群的线粒体质量。

在本实施例中，通过体外检测试剂盒对外周血进行检测主要包括对线粒体损伤进行检测和对溶酶体损伤进行检测。

线粒体损伤检测：

使用第一试剂对人外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞，以及T淋巴细胞的两个亚群，辅助/诱导T淋巴细胞和抑制/毒性T淋巴细胞进行检测。其中检测的指标内容包括三种细胞群的百分比（相对含量），绝对计数（绝对含量）和线粒体损伤指数。

在本实施例中，第一试剂包括线粒体探针，荧光单克隆抗体CD3 FITC/CD8 PE/CD4PE Cy7/CD45 PerCP Cy5.5，红细胞裂解液NH Lysis Solution 10×。检测的具体步骤如下：

1、从-20℃中取出96孔板的线粒体探针，包裹上铝箔纸避光，放置在室温下3~5分钟，将恢复至室温的96孔试剂板置于离心机中，250g离心1分钟或者使用单手正握96孔板，其孔口朝着手心，顺时针甩板1~2次，完成后查看孔板底部，是否有有色液滴，如无则做标识，后续跳过该孔加样；

2、按照样本信息标记96孔板；

3、取CD3 FITC/CD8 PE/CD4 PE Cy7/CD45 PerCP Cy5.5置于对应的96孔板中；

4、取上下颠倒至少7次的100μL抗凝人外周血样本置于96孔板中，包裹上铝箔纸避光，放置在96孔板混匀器上，速度调至中等速度，室温下避光孵育15分钟；

5、加入400μL 溶血素NH Lysis Solution，10×工作液，其配制方式为：取3份NHLysis Solution 10×，取7份纯化水混合，室温下放置待用；置于96孔板管中，放置在96孔板混匀器上，速度调整至中等速度，室温下避光孵育15分钟；

注：为保证检测结果的准确性，请充分做到充分混匀；

6、上机检测，如不立即检测，将样本放置在2~8℃下避光储存，上机检测前涡旋混匀，该步骤需6小时内完成测试。

注：为保证绝对计数的准确性，所有加样步骤均须反向加样操作。

溶酶体损伤检测：

使用第二试剂对人外周血淋巴细胞的T淋巴和NK淋巴细胞进行检测，其中NK淋巴细胞又分析有NK1、NK2、NK3三群细胞。其中检测的指标包括四种细胞群的百分比，绝对计数和T细胞的溶酶体损伤指数。

在本实施例中，第二试剂包括溶酶体探针，荧光单克隆抗体CD3 FITC/CD56 PE/CD16 PE Cy7/CD45 PerCP Cy5.5，红细胞裂解液NH Lysis Solution 10×，检测的具体步骤如下：

1、从-20℃中取出96孔板的线粒体探针，包裹上铝箔纸避光，放置在室温下3~5分钟，将恢复至室温的96孔试剂板置于离心机中，250g离心1分钟或者使用单手正握96孔板，其孔口朝着手心，顺时针甩板1~2次，完成后查看孔板底部，是否有有色液滴，如无则做标识，后续跳过该孔加样；

2、按照样本信息标记96孔板；

3、取CD3 FITC/CD56 PE/CD16 PE Cy7/CD45 PerCP Cy5.5置于对应的96孔板中；

4、取上下颠倒至少7次的100μL抗凝人外周血样本置于96孔板中，包裹上铝箔纸避光，放置在96孔板混匀器上，速度调至中等速度，室温下避光孵育15分钟；

5、加入400μL 溶血素NH Lysis Solution，10×工作液，其配制方式为：取3份NHLysis Solution 10×，取7份纯化水混合，室温下放置待用；置于96孔板管中，放置在96孔板混匀器上，速度调整至中等速度，室温下避光孵育15分钟；

注：为保证检测结果的准确性，请充分做到充分混匀；

6、上机检测，如不立即检测，将样本放置在2~8℃下避光储存，上机检测前涡旋混匀，该步骤需6小时内完成测试。

注：为保证绝对计数的准确性，所有加样步骤均须反向加样操作。

在处理模块12中，基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的数值。

在本实施例中，检测可以采用 Agilent NovoCyte 流式细胞仪Beckman CoulterDxFlex 流式细胞仪； UB DiagCyto 流式细胞仪。

在本实施例中，降维算法和仪器校正均在WEB端实现。

当检测到的线粒体或溶酶体的原始数据后，通过基于WEB端开发的含降维算法和仪器校正的工具，得到可进行样本间比较的数值。

本实施例主要使用的降维算法为线性降维的方法，损伤指标（线粒体或者溶酶体）中包括了仪器的电压/增益效果、荧光强度结果值、细胞绝对计数含量和仪器/批次差异性效果，降维算法，表示为：

其中，DI表示与线粒体或溶酶体相对应的损伤值，α表示修正系数；SMFI表示样本检测平均荧光强度值；PMFI表示标准微球检测的平均荧光强度值；Abs.C表示样本的绝对计数值；RL表示试剂批次系数。

本实施例采用的仪器校正的工具为定制的标准的荧光微球。

以Ailgent NovoCyte检测样本为例，使用定制的标准微球将仪器校正仪器，确定线粒体标准峰值（Mito Standard，倒数第三个峰图）和溶酶体标准峰值（Lyso Standard，倒数第五个峰图），如图2所示。

再在该电压/增益条件下进行临床样本检测，获取其T细胞及其亚群的线粒体或者溶酶体荧光强度值，通过降维算法进行各临床样本换算。

通过本实施例的降维算法和仪器校正的工具对肿瘤、感染等特定疾病，进行辅助诊断，准确率如下表1：

表1 测试准确率

在比较模块13中，将所述得到的数值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。

本实施例通过制定定性判断阈值来进行判断，其中定性判断阈值包括T淋巴细胞的阈值、辅助/诱导T淋巴细胞的阈值和抑制/毒性T淋巴细胞的阈值。阈值主要是阳性阈值，即超过该值后，则判断该细胞存在线粒体损伤。

将得到的损伤值DI与预设阈值进行比较具体为：

判断得到的损伤值是否大于预设阈值，若是，则表示细胞存在线粒体损伤，可能存在某种疾病的高风险。

如下表2为不同变量的特异性：

表2 不同变量的特异性

表2检测的最终步骤，为检测正常人和不同病理患者时，使用ROC曲线分析获得的特异性和灵敏度结果，即使用CD3阈值进行正常和病理者的区分，灵敏度和特异性分别为0.829和0.438，如图3。

与现有技术相比，本实施例的有益效果为：

1、通过采集特定样本类型和数据分析，确定了线粒体和溶酶体的背景噪声，因此可以减少背景噪声的检测过程，下降了该检测方法的使用成本和操作复杂程度；

2、通过引入a）工艺上将试剂做精确的定量分装和包装，确保试剂的量恒定；b）仪器上使用标准的荧光微球校准仪器确保不同检测时间、不同检测仪器的条件一致性；

3、通过降维算法和仪器校正均在WEB端实现，可集成后端的机器语言学习，疾病诊断的灵敏度和特异性会持续提高。

实施例二

本实施例提供一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的方法，如图3所示，包括：

S11.通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

S12.基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值；

S13.将所述得到的损伤值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果。

需要说明的是，本实施例提供的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的方法与实施例一类似，在此不多做赘述。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过采集特定样本类型和数据分析，确定了线粒体和溶酶体的背景噪声，因此可以减少背景噪声的检测过程，下降了该检测方法的使用成本和操作复杂程度；

2、通过引入a）工艺上将试剂做精确的定量分装和包装，确保试剂的量恒定；b）仪器上使用标准的荧光微球校准仪器确保不同检测时间、不同检测仪器的条件一致性；

3、通过降维算法和仪器校正均在WEB端实现，可集成后端的机器语言学习，疾病诊断的灵敏度和特异性会持续提高。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (9)

1.一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，包括：

检测模块，用于通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

处理模块，用于基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值；

比较模块，用于将得到的与线粒体或溶酶体相对应的损伤值与预设阈值进行比较，得到线粒体或溶酶体质量差异分析结果;

所述与线粒体或溶酶体相对应的损伤值DI表示为：

其中，DI表示与线粒体或溶酶体相对应的损伤值，α表示修正系数；

SMFI表示样本检测平均荧光强度值；

PMFI表示标准微球检测的平均荧光强度值；

Abs.C表示样本的绝对计数值；

RL表示试剂批次系数，以标准批试剂为基础，其余批次的试剂修正系数计算公式如下：标准批试剂A和待测批试剂B共同染色标记同一样本，试剂批次系数计算公式为RL=MFI（B）/MFI（A），所述MFI为荧光强度值，可在流式细胞仪上直接读取。

2.根据权利要求1所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述检测模块中体外检测试剂盒的材料包括T淋巴细胞亚群的特异性抗体CD3、CD8、CD4。

3.根据权利要求1所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述检测模块中对外周血进行检测包括对线粒体损伤进行检测，所述对线粒体损伤进行检测具体为：采用第一试剂对外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞以及T淋巴细胞的两个亚群、辅助/诱导T淋巴细胞和抑制/毒性T淋巴细胞进行检测。

4.根据权利要求3所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述对线粒体损伤进行检测的检测指标包括三种细胞群的百分比、绝对计数和线粒体损伤指数。

5.根据权利要求3所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述检测模块中对外周血进行检测还包括对溶酶体损伤进行检测，所述对溶酶体损伤进行检测具体为：采用第二试剂对外周血淋巴细胞的T淋巴和NK淋巴细胞进行检测，其中NK淋巴细胞包括NK1、NK2、NK3三群细胞。

6.根据权利要求5所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述对溶酶体损伤进行检测的检测指标包括四种细胞群的百分比、绝对计数和T细胞的溶酶体损伤指数。

7.根据权利要求5所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述第一试剂包括线粒体探针、荧光单克隆抗体以及红细胞裂解液；所述第二试剂包括溶酶体探针、荧光单克隆抗体、以及红细胞裂解液。

8.根据权利要求1所述的一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的***，其特征在于，所述比较模块中预设阈值包括T淋巴细胞的阈值、辅助/诱导T淋巴细胞的阈值和抑制/毒性T淋巴细胞的阈值；

用于将得到的与线粒体或溶酶体相对应的损伤值与预设阈值进行比较，具体为判断得到的数值是否大于预设阈值，若是，则表示细胞存在线粒体或溶酶体损伤。

9.一种用于线粒体或溶酶体质量差异分析的方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述的***，包括以下步骤：

S1.通过体外检测试剂盒对外周血进行检测，得到线粒体或溶酶体的原始数据；

S2.基于降维算法和仪器校正工具对得到的线粒体或溶酶体的原始数据进行处理，得到与线粒体或溶酶体相对应的损伤值。

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